MX2014008898A - Produccion de diterpeno. - Google Patents

Produccion de diterpeno.

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Abstract

La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican: un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno oxidasa; y un polipéptido que tiene actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, por lo cual la expresión de la secuencia ( o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviol. El microorganismo recombinante también puede expresar una o más UDP-glucosiltransferasas de tal manera que el microorganismo puede producir uno o más glucósidos de esteviol.

Description

PRODUCCIÓN DE DITERPENO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un microorganismo recombinante que puede producir un diterpeno y/o un diterpeno glucosilado y a un procedimiento para la producción de un diterpeno y/o un diterpeno glucosilado mediante el uso de dicha célula. La invención también se refiere a un caldo de fermentación que comprende un diterpeno y/o diterpeno glucosilado obtenible mediante dicho proceso.
ESTADO DE LA INVENCIÓN La demanda mundial de edulcorantes de alta intensidad aumenta y la combinación con diferentes edulcorantes artificiales se convierte en una práctica habitual. Sin embargo, se espera que aumente la demanda de alternativas. Las hojas de la planta herbácea perenne Stevia rebaudiana Bert . , acumula cantidades de compuestos sumamente dulces conocidos como glucósidos de esteviol. Aunque la función biológica de estos compuestos es incierta, tienen trascendencia comercial como edulcorantes alternativos de alta intensidad, con la ventaja añadida de que los edulcorantes de la Stevia son productos vegetales naturales.
Estos glucósidos de esteviol dulces tienen propiedades funcionales y sensoriales que parecen ser superiores a las de muchos edulcorantes de alta intensidad. Además, estudios realizados sugieren que el esteviósido puede reducir los niveles glucémicos en la diabetes de Tipo II y puede reducir la presión arterial en pacientes ligeramente hipertensos.
Los glucósidos de esteviol se acumulan en las hojas de Stevia donde pueden comprender del 10 al 20 % del peso seco de la hoja. Tanto el esteviósido como el rebaudiósido A son estables al calor y al pH y son adecuados para su uso en bebidas gaseosas y en muchos otros alimentos. El esteviósido es entre 110 y 270 veces más dulce que la sacarosa, el rebaudiósido A es entre 150 y 320 veces más dulce que la sacarosa. Asimismo, el rebaudiósido D también es un edulcorante glucósido de diterpeno de alta intensidad que se acumula en las hojas de la Stevia. Puede ser aproximadamente 200 veces más dulce que la sacarosa.
Actualmente, los glucósidos de esteviol se extraen de la planta Stevia. En la Stevia, el ácido (-)- kaurenóico, un compuesto intermedio en la biosintesis del ácido gibelérico (AG) , se convierte en el esteviol diterpeno tetraciclico, y después continúa a través de una ruta de glucosilación multietapa para formar los diversos glucósidos de esteviol. Sin embargo, los rendimientos pueden ser variables y verse afectados por la agricultura y condiciones ambientales. Además, el cultivo de la Stevia requiere terrenos sustanciales, un largo periodo de tiempo antes de su cosecha, una elevada carga de trabajo y costes adicionales para la extracción y purificación de los glucósidos.
Ahora, se requieren fuentes de glucósidos más estandarizadas, composiciones sencillas asépticas, sin regusto, que cumplan con la creciente demanda comercial de los edulcorantes naturales de alta intensidad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la Stevia, el esteviol se sintetiza a partir de GGPP, que se forma por la ruta de la desoxixilulosa 5- fosfato. La actividad de dos diterpeno ciclasas (-)-copalil difosfato sintasa (CPS) y (-)-kaureno sintasa (KS) da como resultado la formación de (-)- aureno que después se oxida en una reacción de tres etapas por la (-)-kaureno oxidasa (KO) para formar ácido (-) -kaurenóico.
En las hojas de Stevia, el ácido ent-kaurenóico 13-hidroxilasa (KAH) hidroxila después el ácido (-) -kaurenóico para formar esteviol. Después, una serie de UDP-glucosiltransferasas (UGT) glucosilan el esteviol.
La invención se refiere a un microorganismo que puede producir un diterpeno, tal como esteviol, o un diterpeno glucosilado (es decir, un glucósido de diterpeno) , tal como esteviolmonósido, esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rubusósido o dulcósido A.
Según la invención, se proporciona un microorganismo recombinante que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican: un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa (CPS) ; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno sintasa (KS) ; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno oxidasa (KO) ; y un polipéptido que tiene actividad ácido Kaurenóico 13-hidroxilasa (KAH) , por lo que la expresión de la secuencia (o secuencias) nucleotidica confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviol.
La invención también proporciona un microorganismo recombinante de la invención, en que el microorganismo comprende una o más secuencias nucleotidicas que codifican uno o más polipéptidos que tienen actividad UDP-glucosiltranferasa (UGT) , mediante la cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos uno de esteviolmonósido, esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rubusósido o dulcósido A.
La invención también proporciona: - un proceso para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado que comprende fermentar un microorganismo recombinante de la invención en un medio de fermentación adecuado, y opcionalmente recuperar el diterpeno o diterpeno glucosilado; - un proceso para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado cuyo proceso comprende fermentar un microorganismo recombinante que puede producir un diterpeno o diterpeno glucosilado en un medio de fermentación adecuado a una temperatura de aproximadamente 29 °C o menor, y opcionalmente recuperar el diterpeno o diterpeno glucosilado; - un caldo de fermentación que comprende un diterpeno o diterpeno glucosilado obtenible mediante el proceso de la invención; - un diterpeno o diterpeno glucosilado obtenido mediante un proceso según la invención u obtenible a partir de un caldo de fermentación según la invención; - un diterpeno o diterpeno glucosilado según la invención que es rebaudiósido A o rebaudiósido D; y - un producto alimenticio, un alimento o una bebida que comprende un diterpeno o diterpeno glucosilado según la invención .
La invención también proporciona un método para convertir un primer diterpeno glucosilado en un segundo diterpeno glucosilado, cuyo método comprende: poner en contacto dicho primer diterpeno glucosilado con un microorganismo según la invención, con un extracto acelular derivado de dicho microorganismo o con una preparación enzimática derivada de cualquier de estos, convirtiendo de esta manera el primer diterpeno glucosilado en el segundo diterpeno glucosilado.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática del plásmido pUG7-EcoRV.
La Figura 2 muestra una representación esquemática del método mediante el cual los casetes de sobreexpresión ERG20, tHMGl y BTS1 se diseñan (A) e integran (B) en el genoma de levadura. (C) muestra la situación final después de que la recombinasa Cre elimine el marcador KAN X.
La Figura 3 muestra una representación esquemática de la construcción ERG9 de expresión disminuida. Ésta consta de una parte 3' de 500 pb de longitud de ERG9, 98 pb del promotor de TRP1, la fase de lectura abierta TRP1 y el terminador, seguido de una secuencia aguas abajo de ERG9 con una longitud de 400 pb. Debido a la introducción del sitio Xbal en la fase de lectura abierta ERG9 los últimos aminoácidos cambian en Ser y el codón de terminación en Arg. Un nuevo codón de terminación se localiza en el promotor de TPR1, dando como resultado una extensión de 18 aminoácidos.
La Figura 4 muestra una representación esquemática de cómo la UGT2 se integra en el genoma. A. Diferentes fragmentos utilizados en la transformación; B. situación después de la integración; C. situación después de la expresión de la recombinasa Cre.
La Figura 5 muestra una representación esquemática de cómo se integra en el genoma la ruta de GGPP al Esteviol. A. diferentes fragmentos utilizados en la transformación; B. situación después de la integración.
La Figura 6 muestra una representación esquemática de cómo se integra en el genoma la ruta de GGPP al RebA. A. diferentes fragmentos utilizados en la transformación; B. situación después de la integración.
La Figura 7 muestra la producción de esteviol en la cepa STV018. Después de 7 días se tomaron muestras de matraces agitadores, se trataron con calor y acetonitrilo y las concentraciones de esteviol se determinaron con LC/MS.
La Figura 8 muestra la producción de RebA en la cepa STV006. Después de 7 días se tomaron muestras de matraces agitadores, se trataron con calor y acetonitrilo, y las concentraciones de Esteviol se determinaron con LC/MS.
La Figura 9 muestra la producción de RebA en las cepas STV006, STV012, STV016 y STV017. Después de 7 días se tomaron muestras de matraces agitadores, se trataron con calor y acetonitrilo, y las concentraciones de RebA se determinaron con LC/MS.
La Figura 10 muestra la producción de esteviosido y RebA en las cepas STV018, STV019 y STV020. Después de 7 dias se tomaron muestras de matraces agitadores, se trataron con calor y acetonitrilo, y las concentraciones de esteviosido y RebA se determinaron con LC/MS.
La Figura 11 muestra una representación esquemática del plásmido MB6754.
La Figura 12 muestra una representación esquemática del plásmido MB6761.
La Figura 13 muestra una representación esquemática del plásmido MB6762.
La Figura 14 muestra una representación esquemática del plásmido MB6775.
La Figura 11 muestra una representación esquemática de cómo se integra en el genoma la ruta de GGPP al RebD. A. diferentes fragmentos utilizados en la transformación; B. situación después de la integración.
La Figura 16 muestra la producción de RebD y RebA en las cepas STV006 y STV015. Después de 7 dias se tomaron muestras de matraces agitadores, se trataron con calor y acetonitrilo, y las concentraciones de RebD y RebA se determinaron con LC/MS.
La Figura 17 muestra un diagrama esquemático de las posibles rutas que conducen a la biosintesis de los glucósidos de esteviol.
DESCRIPCIÓN DEL LISTADO SE SECUENCIAS En la Tabla 1 se muestra una descripción de las secuencias. Las secuencias descritas en este documento pueden definirse con referencia a un listado de secuencias o con referencia a los números de acceso de la base de datos también mostrada en la Tabla 1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender", "incluir" y "tener" y variaciones tales como "que comprende", "comprendiendo" e "incluyendo" deben interpretarse de modo inclusivo. Es decir, estas palabras pretenden transmitir la posible inclusión de otros elementos o números enteros no específicamente indicados, cuando el contexto lo permita.
En este documento los artículos "uno", "un" y "una" se usan en este documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a uno o al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Como ejemplo, "un elemento" puede significar un elemento o más de un elemento.
La invención se refiere a un microorganismo recombinante que puede producir un diterpeno o un diterpeno glucosilado, típicamente esteviol o un glucósido de esteviol respectivamente. Para los fines de esta invención, un diterpeno típicamente significa un compuesto orgánico formado de cuatro unidades de isopreno. Dicho compuesto puede derivar de geranilgeranil pirofosfato. Un diterpeno glucosilado o glucósido de diterpeno es un diterpeno en el que un azúcar está unido, típicamente, a un resto no carbohidrato. Típicamente, en un glucósido de diterpeno, el grupo azúcar puede unirse a través de su carbono anomérico con otro grupo mediante un enlace glucosídico. Un diterpeno y glucósido de diterpeno preferido es esteviol y glucósido de esteviol respectivamente. Por tanto, en particular, la invención se refiere a un microorganismo recombinante que puede producir esteviol o un glucósido de esteviol.
Según la invención, se proporciona un microorganismo recombinante. El microorganismo recombinante comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican: un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent- Kaureno oxidasa; y un polipéptido que tiene actividad ácido Kaurenoico 13-hidroxilasa, por lo cual la expresión de la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviol.
Para los fines de la presente invención, un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa (EC 5.5.1.13) puede catalizar la reacción química: Esta enzima tiene un sustrato, geranilgeranil pirofosfato, y un producto, ent-copalil pirofosfato. Esta enzima participa en la biosíntesis de la giberelina. Esta enzima pertenece a la familia de isomerasa, específicamente a la clase de liasas intramoleculares. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ent-copalil difosfato liasa (desciclada) . Otros nombres en uso común incluyen ent-copalil pirofosfato sintasa, ent-kaureno sintasa A y ent-Kaureno sintetasa A.
Para los fines de la presente invención, un polipéptido que tiene actividad ent-kaureno sintasa (EC 4.2.3.19) es un polipéptido que puede catalizar la reacción química: ent-copalil difosfato r-ent-kaureno + disfosfato Por tanto, esta enzima tiene un sustrato, ent-copalil difosfato y dos productos, ent-caureno y difosfato.
Esta enzima pertenece a la familia de las liasas, específicamente a las carbono-oxigeno liasas que actúan sobre fosfatos. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es ent-copalil-disfosfato difosfato-liasa (ciclada, formando ent-Kaureno) . Otros nombres en uso común incluyen ent-kaureno sintasa B, ent-kaureno sintetasa B y ent-copalil-disfosfato difosfato-liasa (ciclada) . Esta enzima participa es la biosintesis de diterpenoides .
Las ent-copalil-disfosfato sintasas también pueden tener una actividad ent-kaureno sintetasa distinta asociada con la misma molécula de proteina. La reacción catalizada por la ent-kaureno sintetasa es la siguiente etapa en la ruta biosintética de las giberelinas. Los dos tipos de actividad enzimática son distintos, y la mutagénesis dirigida que suprime la actividad ent-kaureno sintetasa de la proteina conduce a la generación de ent-copalil pirofosfato.
Por consiguiente, una sola secuencia de nucleótidos utilizada en la invención puede codificar un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa y actividad ent-Jcaureno sintasa. Como alternativa, las dos actividades pueden estar codificadas por dos secuencias de nucleótidos distintas, separadas.
Para los fines de la invención, un polipéptido que tiene actividad ent-kaureno oxidase (EC 1.14.13.78) es un polipéptido que puede catalizar tres oxidaciones sucesivas del grupo 4-metilo del ent-kaureno para dar ácido kaurenóico. Dicha actividad requiere típicamente la presencia de un citocromo P450.
Para los fines de la invención, un polipéptido que tiene actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa (EC 1.14.13) es uno que puede catalizar la formación de esteviol (ácido ent-kaur-16-en-13-ol-19-oico) utilizando NADPH y 02. Dicha actividad también puede denominarse actividad ent-ka 13-hidroxilasa.
Un microorganismo recombinante de la invención puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad UDP-glucosiltransferasa (UGT) , por lo cual la expresión de la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos uno de esteviolmonósido, esteviolbiósido, esteviósido o rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rubusósido o dulcósido A.
Para los fines de esta invención, un polipéptido que tiene actividad UGT es uno que tiene actividad glucosiltransferasa (EC 2.4), es decir, que puede actuar como un catalizador para la transferencia de una unidad de monosacárido de un azúcar de nucleótido activado (conocido también como "donador glucosilico" ) a una molécula aceptora de glucosilo, normalmente un alcohol. El donador de glucosilo de una UGT es típicamente la uridín difosfato glucosa del azúcar de nucleótido (uracil-difosfato glucosa, UDP-glucosa) .
Las UGT utilizadas pueden seleccionarse para producir un glucósido de diterpeno deseado, tal como un glucósido de esteviol. En Humphrey et al., Plant Molecular Biology (2006) 61: 47-62 y Mohamed et al., J. Plant Physiology 168 (2011) 1136-1141 se muestran diagramas esquemáticos de la formación del glucósido de esteviol. Asimismo, la Figura 17 muestra un diagrama esquemático de la formación de glucósido de esteviol .
La biosíntesis de rebaudiósido A implica la glucosilacion del esteviol aglucona. Específicamente, un rebaudiósido A puede formarse por glucosilacion del 13-OH de esteviol que forma el 13-O-esteviolmonósido, por glucosilacion del C-2' del 13-O-glucosa del esteviolmonósido que forma esteviol-1 , 2-biósido, por glucosilacion del C-19 carboxilo de esteviol-1 , 2-biósido que forma esteviósido, y por glucosilacion del C-3' del C-13-O-glucosa de esteviósido. El orden en el que se produce cada reacción de glucosilacion puede variar - véase la Figura 17. Como se muestra en este esquema una UGT puede catalizar más de una conversión.
Se ha demostrado que la conversión de esteviol a rebaudiósido A o a rebaudiósido D puede realizarse en un huésped recombinante por la expresión de un gen (o genes) que codifica las siguientes UGT funcionales: UGT74G1, UGT85C2 , UGT76G1 y UGT2. Por tanto, un microorganismo recombinante que exprese estas cuatro UGT puede formar rebaudiósido A si éste produce esteviol o cuando se suministra esteviol al medio. Típicamente, uno o más de estos genes son genes recombinantes que se han transformado en un microorganismo que no los posee de manera natural. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de todas estas enzimas. Un microorganismo de la invención puede comprender cualquier combinación de una UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1 y UGT2. En la Tabla 1, las secuencias UGT64G1 se indican como secuencias UGT1, las secuencias UGT74G1 se indican como secuencias UGT3 y las secuencias UGT76G1 se indican como secuencias UGT4. En la Tabla 1 las secuencias UGT2 se indican como secuencias UGT2.
Un microorganismo recombinante de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C-13 glucosa al esteviol.
Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que puede catalizar una reacción en la cual el esteviol se convierte a esteviolmonósido . Por consiguiente, la expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviolmonósido .
Dicho microorganismo de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga la actividad mostrada por la UDP-glucosiltransferasa (UGT) UGT85C2, por lo cual después de la transformación del microorganismo, la secuencia de nucleótidos confiere a la célula la capacidad de convertir esteviol en esteviolmonósido .
La actividad de UGT85C2 es transferir una unidad glucosa al 13-OH del esteviol. Por tanto, una UGT85C2 adecuada puede actuar como una uridina 5'-difosfo glucosil: esteviol 13-OH transferasa, y una uridina 5'-difosfo glucosil: esteviol 19-0 glucósido 13-OH transferasa. Un polipéptido UGT85C2 funcional también puede catalizar reacciones glucosil transferasa que utilizan sustratos de glucósido de esteviol distintos del esteviol y del esteviol-19-0-glucósido . Dichas secuencias se indican como secuencias UGT1 en la Tabla 1.
Un microorganismo recombinante de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C-13-glucosa al esteviol o al esteviolmonósido . Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que puede catalizar una reacción en la que el esteviolmonósido se convierte en esteviolbiósido . Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir el esteviolmonósido en esteviolbiósido. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviolbiósido.
Un microorganismo de la invención también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga la actividad mostrada por la UDP-glucosiltransferasa (UGT) UGT74G1, por lo cual después de la transformación del microorganismo la secuencia de nucleótidos confiere a la célula la capacidad de convertir esteviolmonósido en esteviolbiósido.
Un microorganismo de la invención también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga la actividad mostrada por la UDP-glucosiltransferasa (UGT) UGT2, por lo cual después de la transformación del microorganismo la secuencia de nucleótidos confiere a la célula la capacidad de convertir esteviolmonósido en esteviolbiósido .
Un polipéptido UGT2 adecuado actúa como una uridina 5'-difosfo glucosil: esteviol-13-0-glucósido transferasa (denominada también esteviol-13-monoglucósido 1,2-glucosilasa) , transfiriendo una fracción de glucosa al C-2' de la 13-0-glucosa de la molécula aceptora, esteviol-13-0-glucósido. Típicamente, un polipéptido UGT2 adecuado también actúa como una uridina 5'-difosfo glucosil: rubusósido transferasa transfiriendo una fracción de glucosa al C-2' de la 13-0 glucosa de la molécula aceptora, rubusósido.
Los polipéptidos UGT2 funcionales también puede catalizar reacciones que utilicen sustratos de glucósido de esteviol distintos del esteviol- 13-0-glucósido y rubusósido, por ejemplo, los polipéptidos UGT2 funcionales pueden utilizar esteviósido como sustrato, transfiriendo una fracción de glucosa al C-2' del resto 19-0-glucosa para producir Rebaudiósido E. Los polipéptidos UGT2 funcionales también pueden utilizar Rebaudiósido A como sustrato, transfiriendo una fracción de glucosa al C-2' del resto 19-0-glucosa para producir Rebaudiósido E. Sin embargo, un polipéptido UGT2 funcional no transfiere típicamente una fracción de glucosa a compuestos de esteviol que tienen una glucosa 1,3-unida en la posición C-13, es decir, la transferencia de una fracción de glucosa a esteviol 1,3- biósido y 1, 3-esteviósido no se produce. Los polipéptidos UGT2 funcionales también pueden transferir fracciones de azúcar de donadores distintos de uridina difosfato glucosa. Por ejemplo, un polipéptido UGT2 funcional puede actuar como una uridina 5'-difosfo D-xilosil: esteviol- 13-0- glucósido transferasa, transfiriendo una fracción de xilosa al C-2' de la 13-0-glucosa de la molécula aceptora, esteviol- 13-0-glucósido. Como otro ejemplo, un polipéptido UGT2 funcional puede actuar como una uridina 5'-difosfo L-rhamnosil: esteviol- 13-0- glucósido transferasa, transfiriendo una fracción de rhamnosa al C-2' de la 13-0-glucosa de la molécula aceptora, esteviol-13-0-glucósido . Dichas secuencias se indican como secuencias UGT2 en la Tabla 1.
Un microorganismo recombinante de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C-19-glucosa al esteviolbiósido . Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que puede catalizar una reacción en la que el esteviolbiósido se convierte en esteviósido. Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir esteviolbiósido en esteviósido. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviósido.
Un microorganismo de la invención también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga la actividad mostrada por la UDP-glucosiltransferasa (UGT) UGT74G1, por lo cual después de la transformación del microorganismo la secuencia de nucleótidos confiere a la célula la capacidad de convertir esteviolbiósido en esteviósido.
Los polipéptidos UGT74G1 adecuados pueden transferir una unidad de glucosa al 13-OH o al 19-COOH, respectivamente, del esteviol. Un polipéptido UGT74G1 adecuado puede actuar como una uridina 5'-disfosfo glucosil: esteviol 19-COOH transferasa y una uridina 5'-disfosfo glucosil: esteviol- 13-O-glucósido 19-COOH transferasa. Los polipéptidos UGT74G1 funcionales también puede catalizar reacciones glucosil transferasa que utilizan sustratos de glucósido de esteviol distintos de esteviol y esteviol- 13-O-glucósido, o que transfieran fracciones de azúcar a donadores distintos de uridina difosfato glucosa. Dichas secuencias se indican como secuencias UGT1 en la Tabla 3.
Un microorganismo recombinante de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 del esteviósido. Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que puede catalizar una reacción en la que el esteviósido se convierte en rebaudiósido A. Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir esteviósido en rebaudiósido A. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido A.
Un microorganismo de la invención también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga la actividad mostrada por la UDP-glucosiltransferasa (UGT) UGT76G1, por lo cual después de la transformación del microorganismo la secuencia de nucleótidos confiere a la célula la capacidad de convertir esteviósido en rebaudiósido A.
Una UGT76G1 adecuado añade una fracción de glucosa al C-3' de la C-13-0-glucosa de la molécula aceptora, un esteviol 1,2 glucósido. Por tanto, la UGT76G1 actúa, por ejemplo, como una uridina 5'-difosfo glucosil: esteviol 13-0-1,2 glucósido C-3' glucosil transferasa y una uridina 5'-difosfo glucosil: esteviol- 19-0-glucosa, 13-0-1,2 biósido C-3' glucosil transferasa. Los polipéptidos UGT76GL funcionales también pueden catalizar reacciones glucosil transferasa que utilizan sustratos de glucósido de esteviol que contienen azúcares distintos de glucosa, por ejemplo, rhamnósidos de esteviol y xilósidos de esteviol. Dichas secuencias se indican como secuencias UGT4 en la Tabla 1.
Un microorganismo de la invención también puede comprender secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos que tengan una o más de las cuatro actividades UGT descritas anteriormente. Preferentemente, un microorganismo de la invención puede comprender secuencias de nucleótidos que codifiquen polipéptidos que tengan las cuatro actividades UGT descritas anteriormente. Un ácido nucleico determinado puede codificar un polipéptido que tenga una o más de las actividades anteriores. Por ejemplo, un ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene dos, tres o cuatro de las actividades indicadas anteriormente. Preferentemente, un microorganismo recombinante de la invención comprende actividad UGT1, UGT2 y UGT3. Más preferentemente, dicho microorganismo recombinante también comprenderá actividad UGT4.
Un microorganismo de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A. Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que pueda catalizar una reacción en la que el esteviósido o rebaudiósido A se convierta en rebaudiósido B. Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir esteviósido o rebaudiósido A en rebaudiósido B. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido D. Se ha demostrado que un microorganismo que exprese una combinación de polipéptidos UGT85C2 , UGT2, UGT74G1 y UGT76G1 puede producir rebaudiósido D.
Un microorganismo de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación de esteviósido. Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que puede catalizar una reacción en la que el esteviósido se convierte en rebaudiósido E. Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir esteviósido en rebaudiósido E. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido E.
Un microorganismo de la invención que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad UGT puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación de rebaudiósido E. Es decir, un microorganismo de la invención puede comprender una UGT que pueda catalizar una reacción en la que el rebaudiósido E se convierte en rebaudiósido D. Por consiguiente, dicho microorganismo puede convertir esteviósido o rebaudiósido A en rebaudiósido D. La expresión de dicha secuencia de nucleótidos puede conferir al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido D.
Un microorganismo recombinante de la invención puede expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad NADPH-citocromo p450 reductasa. Es decir, un microorganismo recombinante de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad NADPH-citocromo p450 reductasa.
Para los fines de la invención, un polipéptido que tiene actividad NADPH-citocromo p450 reductasa (EC 1.6.2.4; conocida también como NADPH : ferrihemoprotein oxidoreductasa, NADPH: hemoprotein oxidoreductasa, NADPH: P450 oxidoreductasa, P450 reductasa, POR, CPR, CYPOR) es típicamente uno que es una enzima unida a membrana que permite la transferencia de electrones al citocromo P450 en el microsoma de la célula eucariota desde una enzima NADPH: citocromo P450 reductasa (POR; EC 1.6.2.4) que contiene FAD- y FMN Preferentemente, un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, es uno que puede expresar una o más de: a. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad NADPH-citocromo p450 reductasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad NADPH- citocromo p450 reductasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 54, 56, 58 o 78; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 53, 55, 57 o 77; iii. una secuencia de nucleotidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleotidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
Preferentemente, un microorganismo recombinante de la nción es uno que puede expresar una o más de: a . una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-copalil pirofosfato sintasa, donde dicha secuencia de nucleotidos comprenda: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-copalil pirofosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente una identidad 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 18, 20, 60 o 62; ii. una secuencia de nucleotidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleotidos de las SEC ID Nos: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59 o 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 o 184; iii. una secuencia de nucleotidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleotidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, b. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-Kaureno sintasa, donde dicha secuencia de nucleotidos comprenda: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-Kaureno sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 64 o 66; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 o 184; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, c. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-Kaureno oxidasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-Kaureno oxidasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 22, 24, 26, 68 u 86; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 o 186; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético; o d. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ácido kaurenóico 13- hidroxilasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 28, 30, 32, 34, 70, 90, 92, 94, 96 o 98; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 o 185; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
En un microorganismo recombinante de la invención, que pueda expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C-13-glucosa al esteviol, dicho nucleótido puede comprender: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C- 13-glucosa al esteviol, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 36, 38 o 72; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 35, 37, 71, 147, 168, 169 o 189; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
En un microorganismo recombinante de la invención, que pueda expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 del esteviolmonósido (esto indica típicamente la glucosilación del C-2' de la C-13-glucosa/13- O-glucosa del esteviolmonósido) , dicha secuencia de nucleotidos puede comprender: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una C- 13-glucosa al esteviol o esteviolmonósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110 o 112; ii. una secuencia de nucleotidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleotidos de las SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; iii. una secuencia de nucleotidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleotidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
En un microorganismo recombinante de la invención, que pueda expresar una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-19 del esteviolbiósido, dicha secuencia de nucleotidos puede comprender: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-19 del esteviolbiósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 40, 42, 44, 46, 48 o 74; ii. una secuencia de nucleotidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleotidos de las SEC ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 73, 148, 170, 171, 172, 173, 174 o 190; iii. una secuencia de nucleotidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleotidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
En un microorganismo recombinante de la invención, que exprese una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 del esteviósido, dicha secuencia de nucleotidos puede comprender: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 del esteviósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 50, 52 o 76; ii. una secuencia de nucleotidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 %, con la secuencia de nucleotidos de las SEC ID Nos: 49, 51, 75, 149, 175, 176 o 191; iii. una secuencia de nucleotidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleotidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
En un microorganismo recombinante de la invención, que exprese una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar uno o más de: la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A en rebaudiósido D; la glucosilación de esteviósido en rebaudiósido E; o la glucosilación de rebaudiósido E en rebaudiósido D, dicha secuencia de nucleotidos puede comprender: i. una secuencia de nucleotidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar uno o más de: la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A en rebaudiósido D; la glucosilación de esteviósido en rebaudiósido E; o la glucosilación de rebaudiósido E en rebaudiósido D, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112; ii. una secuencia de nucleotidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
Un microorganismo según la invención, puede ser uno en el que la capacidad de microorganismo para producir geranilgeranil pirofosfato (GGPP) está regulada positivamente. La regulación positiva en el contexto de la presente invención implica que el microorganismo produce más GGPP que una cepa equivalente no transformada.
Por consiguiente, un microorganismo de la invención puede comprender una o más secuencias de nucleótidos que codifiquen hidroximetilglutaril-CoA reductasa, farnesil-pirofosfato sintetasa y geranilgeranil difosfato sintasa, por lo cual, después de la transformación del microorganismo, la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir niveles elevados de GGPP.
Preferentemente, un microorganismo según la invención es que puede expresar uno o más de: a. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad hidroxilmetilglutaril- CoA reductasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad hidroxilmetilglutaril-CoA reductasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 80; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°:79; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, b. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad farnesil pirofosfato sintasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad farnesil-pirofosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 82; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° : 81; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético; o c. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad geranilgeranil difosfato sintasa, donde dicha secuencia de nucleótidos comprenda: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad geranilgeranil difosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 84; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°:83; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
La invención se refiere a un microorganismo recombinante . Un microorganismo o microbio, para los fines de la presente invención, es típicamente un organismo que no es visible al ojo humano (es decir, es microscópico) . Un microorganismo puede ser una bacteria, hongo, arqueobacteria o protista. Típicamente, un microorganismo puede ser un organismo de una sola célula o unicelular.
Como se utiliza en este documento un microorganismo recombinante se define como un microorganismo que está genéticamente modificado o transíormado/transfectado con una o más de las secuencias de nucleótidos como las definidas en este documento. La presencia de una o más de dichas secuencias de nucleótido modifica la capacidad del microorganismo para producir un diterpeno o un glucósido de diterpeno, en particular esteviol o glucósido de esteviol. Un microorganismo que no está transformado/transfectado o genéticamente modificado, no es un microorganismo recombinante y típicamente no comprende una o más de las secuencias de nucleótidos que permiten a la célula producir un diterpeno o un glucósido de diterpeno. Por tanto, un microorganismo no transformado/no transfectado es típicamente un microorganismo que no produce de manera natural un diterpeno, aunque un microorganismo que produce de manera natural un diterpeno o un glucósido de diterpeno y que se ha modificado según la invención (y que por tanto tiene una capacidad modificada para producir un diterpeno/glucósido de diterpeno) se considera un microorganismo recombinante según la invención.
En este documento, la identidad de secuencia se define como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptido o proteína) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótido) , determinada por comparación de secuencias. Normalmente, las identidades o similitudes de secuencias se comparan sobre la longitud completa de las secuencias comparadas. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, según sea el caso, determinado por el emparejamiento entre cadenas de dichas secuencias. La "identidad" y "similitud" pueden calcularse fácilmente por diversos métodos conocidos por los expertos en la materia. Para proporcionar el mayor emparejamiento entre las secuencias ensayadas Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad. Después, típicamente se calculan las identidades y similitudes sobre toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos disponibles al público. Como métodos de programación informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias se incluyen, por ejemplo, BestFit, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), disponibles al público del NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894) . Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de aminoácidos utilizando BLAST son apertura de hueco 10,0, extensión de hueco 0,5, matriz Blosum 65. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de ácidos nucleicos utilizando BLASTP son apertura de hueco 10,0, extensión de hueco 0,5, matriz de ADN completa (matriz de identidad de ADN) .
Las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas expresadas en las células de la invención también pueden definirse por su capacidad para hibridarse con las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos: 1, 3, 5, 1, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 o 84 o con cualquier otra secuencia mencionada en este documento respectivamente, en condiciones de hibridación moderadas o preferentemente rigurosas. En este documento las condiciones de hibridación rigurosas se definen como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 25, preferentemente de aproximadamente 50 nucleótidos, 75 o 100 y más preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibriden a una temperatura de aproximadamente 65 °C en una solución que comprenda aproximadamente sal 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquiera otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavado a 65 °C en una solución que comprenda aproximadamente sal 0,1 M, o menos, preferentemente 0,2 x SSC o cualquiera otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realizó durante una noche, es decir, al menos durante 10 horas y preferentemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán la hibridación especifica de secuencias que tengan una identidad de secuencia de aproximadamente 90 % o más.
En el presente documento, condiciones moderadas se definen como condiciones que permiten que una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 50 nucleótidos, preferentemente de aproximadamente 200 o más nucleótidos, se hibride a una temperatura de aproximadamente 45 °C en una solución que comprenda aproximadamente sal 1 M, preferentemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable, y lavado a temperatura ambiente en una solución que comprenda aproximadamente sal 1 , preferentemente 6 x SSC o cualquier otra solución que tenga una fuerza iónica comparable. Preferentemente, la hibridación se realiza durante una noche, es decir, al menos durante 10 horas, y preferentemente el lavado se realiza durante al menos una hora con al menos dos cambios de la solución de lavado. Estas condiciones normalmente permitirán que la hibridación especifica de secuencias tenga una identidad de secuencia de hasta 50 %. El experto en la materia podrá modificar estas condiciones de hibridación para identificar específicamente secuencias cuya identidad varía entre 50 % y 90 %.
Las secuencias de nucleótidos que codifican una ent-copalil pirofosfato sintasa; ent-kaureno sintasa; ent-kaureno oxidasa; ácido kaurenóico 13-hidroxilasa; UGT; hidroximetilglutaril-CoA reductasa, farnesil-pirofosfato sintetasa; geranilgeranil difosfato sintasa; NADPH-citocromo p450 reductasa, pueden ser de origen procariota o eucariota.
Una secuencia de nucleótidos que codifique una ent-copalil pirofosfato sintasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 51, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 o 184.
Una secuencia de nucleótidos que codifique una ent-kaureno sintasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 o 184.
Una secuencia de nucleótidos que codifique una ent-kaureno oxidasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 o 186. Una KO preferida es el polipéptido codificado por el ácido nucleico mostrado en la SEC ID N° : 85.
Una secuencia de nucleótidos que codifique un ácido kaurenóico 13-hidroxilasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 o 185. Una secuencia KAH preferida es el polipéptido codificado por el ácido nucleico mostrado en la SEC ID N°: 33.
Un microorganismo recombinante adicional preferido de la invención puede expresar una combinación de los polipéptidos codificados por la SEC ID N° : 85 y SEC ID N° : 33 o una variante de cualquiera de éstas como se describe en este documento. Un microorganismo recombinante preferido de la invención puede expresar la combinación de secuencias mostradas en la Tabla 8 (en combinación con cualquier UGT2, pero en particular con la codificada por la SEC ID N°: 87) .
Una secuencia de nucleotidos que codifica una UGT puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73, 75, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 147, 148, 149, 87, 181, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 189, 190, 191 o 192.
Una secuencia de nucleotidos que codifique una hidroximetilglutaril-CoA reductasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en la SEC ID N° : 79.
Una secuencia de nucleotidos que codifique una farnesil-pirofosfato sintetasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en la SEC ID N° : 81.
Una secuencia de nucleotidos que codifique una geranilgeranil difosfato sintasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en la SEC ID N°: 83.
Una secuencia de nucleótidos que codifique una NADPH-citocromo p450 reductasa puede comprender, por ejemplo, una secuencia como se muestra en las SEC ID Nos: 53, 55, 57 o 77.
En el caso de las secuencias de UGT, pueden preferirse las combinaciones de al menos una de cada una de: (i) SEC ID Nos: 35, 37, 168, 169, 71, 147 o 189; (ii) SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; (iii) SEC ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 170, 171, 172, 173, 174, 73, 148 o 190; y (iv) SEC ID Nos: 49, 51, 175, 176, 75, 149 o 191. Típicamente, puede utilizarse al menos una UGT del grupo (i) . Si se utiliza al menos una UGT del grupo (iii), generalmente también se utiliza al menos una UGT del grupo (i) . Si se utiliza al menos una UGT del grupo (iv), generalmente también se utiliza una UGT del grupo (i) y al menos una UGT del grupo (iii) . Típicamente, se utiliza al menos una UGT del grupo (ü) - En la invención puede utilizarse una secuencia que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, preferentemente al menos aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 , aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % con una secuencia como se ha mencionado.
Para aumentar la probabilidad de que las enzimas introducidas se expresen en forma activa en una célula eucariota de la invención, la secuencia de nucleótidos codificante correspondiente puede adaptarse para optimizar su uso de codones con la de la célula hospedadora eucariota seleccionada. La adaptabilidad de las secuencias de nucleótidos que codifican las enzimas para el uso de codones de la célula hospedadora seleccionada pueden expresarse como Índice de adaptación de codones (IAC) . El índice de adaptación de codones se define en este documento como una medición de la adaptabilidad relativa del uso de codones de un gen frente al uso de codones de genes altamente expresados. La adaptabilidad relativa (w) de cada codón es la proporción del uso de cada codón con respecto a la del codón más abundante para el mismo aminoácido. El índice IAC se define como la media geométrica de estos valores DE adaptabilidad relativos. Se excluyen codones no sinónimos y codones de terminación (dependientes del código genético) . Los valores IAC varían de 0 a 1, indicando los valores más elevados una mayor proporción de los codones más abundantes (véase Sharp y Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; véase también: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8) : 2242-51) . Una secuencia de nucleótidos adaptada tiene preferentemente un IAC de al menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7.
En una realización preferida la célula eucariota según la presente invención está genéticamente modificada con (a) una secuencia (o secuencias) de nucleótidos que está (están) adaptada al uso de codones de la célula eucariota utilizando tecnología de optimización de pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007/0559 . La optimización de pares de codones es un método para producir un polipéptido en una célula hospedadora, donde las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido se han modificado con respecto a su uso de codones, en particular los pares de codones que se utilizan, para obtener expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o producción mejorada del polipéptido. Los pares de codones se definen como un conjunto de dos tripletes (codones) posteriores en una secuencia codificante.
La mejora adicional de la actividad de las enzimas in vivo en una célula hospedadora eucariota de la invención, puede obtenerse por métodos bien conocidos como PCR propensa a error o evolución dirigida. Un método preferido de evolución dirigida se describe en los documentos WO03010183 y WO03010311.
El microorganismo según la presente invención puede ser cualquier célula hospedadora adecuada de origen microbiano. Preferentemente, la célula hospedadora es una levadura o un hongo filamentoso. Más preferentemente, la célula hospedadora pertenece a uno de los géneros Saccharomyces , Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces , Yarrowia , Candida, Hansenula , Humicola , Torulaspora , Trichosporon , Brettanomyces , Pachysolen o Yamadazyma o Zygosaccharomyces .
Un microorganismo más preferido pertenece a las especies Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Pichia stipidis , Kluyveromyces marxianus , K. lactis, K. thermotolerans , Yarrowia lipolytica , Candida sonorensis , C. glabrata , Hansenula polymorpha , Torulaspora delbrueckii , Brettanomyces bruxellensis , Zygosaccharomyces bailii, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus o Saccharomyces cerevisiae . Preferentemente, la célula eucariota es una Saccharomyces cerevisiae .
Una célula de levadura recombinante según la invención puede modificarse de tal manera que el gen ERG9 esté regulado negativamente y o los genes ERG5/ERG6 estén delecionados . De esta manera, pueden modificarse genes correspondientes en otros microorganismos.
Dicho microorganismo puede transformarse como se muestra en este documento, por lo cual la secuencia (o secuencias) de nucleótidos con las que el microorganismo se transforma confiere a la célula la capacidad de producir un diterpeno o un glucósido del mismo.
Un microorganismo preferido según la invención es una levadura tal como una célula de Saccharomyces cerevisiae o de Yarrowia lipolytica . Un microorganismo recombinante de la invención, tal como una célula recombinante de Saccharomyces cerevisiae o de Yarrowia lipolytica , puede comprender una o más secuencias de nucleótidos de cada uno de los siguientes grupos : (i) SEC ID N°: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 152, 153, 154, 159, 160, 182 o 184. (ii) SEC ID N°: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 o 184. (iii) SEC ID N°: 21, 23, 25, 67 85, 145, 161, 162, 163, 180 o 186. (iv) SEC ID N°: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 o 185.
Dicho microorganismo típicamente también comprenderá una o más secuencias de nucleótidos como se muestra en las SEC ID Nos: 53, 55, 57 o 77.
Dicho microorganismo también puede comprender una o más secuencias de nucleótidos como se muestra en las SEC ID Nos: 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73, 75, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 147, 148, 149, 87, 181, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 189, 190, 191 o 192. En el caso de estas secuencias, pueden preferirse las combinaciones de al menos una de cada una de (i) SEC ID Nos: 35, 37, 168, 169, 71, 147 o 189; (ii) SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; (iii) SEC ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 170, 171, 172, 173, 174, 73, 148 o 190; y (iv) SEC ID N° : 49, 51, 175, 176, 75, 149 o 191. Típicamente, al menos una UGT del grupo (i) puede utilizarse. Si se utiliza al menos una UGT del grupo (iii) , generalmente también se utiliza al menos una UGT del grup (i) . Si se utiliza al menos una UGT del grupo (iv) , generalmente también se utiliza al menos una UGT del grupo (i) y al menos una UGT del grupo (iii) . Típicamente, se utiliza al menos una UGT del grupo (ii) .
Dicho microorganismo también puede comprender las siguientes secuencias de nucleótidos: SEC ID N° : 79; SEC ID N°: 81; y SEC ID N° : 83.
Para cada secuencia mostrada anteriormente (o cualquier secuencia mencionada en este documento) , puede utilizarse una variante que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, preferentemente al menos aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98 o aproximadamente 99 % con la secuencia indicada.
Para facilitar la transformación del microorganismo según la presente invención las secuencias de nucleótidos que codifican la ent-copalil pirofosfato sintasa, la ent-kaureno sintasa, la ent-kaureno oxidasa, la ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, las UGT, la hidroximetilglutaril-CoA reductasa, la farnesil-pirofosfato sintetasa, la geranilgeranil difosfato sintasa y la NADPH-citocromo p450 reductasa pueden ligarse en una o más construcciones de ácido nucleico.
Una construcción de ácido nucleico puede ser un plásmido que contenga los genes que codifiquen las enzimas del diterpeno, por ejemplo, la ruta del esteviol/glucósido de esteviol, como se ha descrito anteriormente, o una construcción de ácido nucleico puede comprender dos o tres plásmidos conteniendo cada uno de ellos dos o tres genes, respectivamente, que codifiquen las enzimas de la ruta del diterpeno distribuidos de cualquier modo apropiado.
Puede utilizarse cualquier plásmido adecuado, por ejemplo, un plásmido con pocas copias o un plásmido con muchas copias.
Puede ser posible que las enzimas seleccionadas del grupo que consiste en ent-copalil pirofosfato sintasa, ent-kaureno sintasa, ent-kaureno oxidasa y ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, las UGT, hidroximetilglutaril-CoA reductasa, farnesil-pirofosfato sintetasa, geranilgeranil difosfato sintasa y NADPH-citocromo p450 reductasa sean nativas para el microorganismo hospedador y que la transformación con una o más de las secuencias de nucleótidos que codifiquen estas enzimas pueda no ser necesaria para conferir a la célula hospedadora la capacidad de producir un diterpeno o diterpeno glucosidasa. Puede obtenerse una mejora adicional de la producción de diterpeno/diterpeno glucosidasa por el microorganismo hospedador por mejora clásica de cepas.
La construcción de ácido nucleico puede mantenerse episomalmente y por tanto comprender una secuencia para replicación autónoma, tal como una secuencia de replicación autosomal. Si la célula hospedadora es de origen fúngico, una construcción de ácido nucleico episomal adecuada puede basarse, por ejemplo, en los plásmidos de levaduras 2 µ o pKDl (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975), o en los plásmidos AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet . 29: 482-489).
Como alternativa, cada construcción de ácido nucleico puede integrarse en una o más copias en el genoma de la célula hospedadora. La integración en el genoma de la célula hospedadora puede producirse al azar por recombinación no homologa pero preferentemente la construcción de ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora por recombinación homologa como bien es sabido la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 y US 6.265.186).
Opcionalmente, en la construcción de ácido nucleico puede haber un marcador de selección. Como se utiliza en este documento, el término "marcador" se refiere a un gen que codifica un rasgo o un fenotipo que permite seleccionar o explorar un microorganismo que contenga el marcador.
El gen marcador puede ser un gen de resistencia a antibióticos por lo que para seleccionar células transformadas de entre células que no están transformadas, se utiliza el antibiótico apropiado. De manera alternativa o también, se utilizan marcadores de resistencia a no antibióticos, tales como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2) . Las células hospedadoras transformadas con las construcciones de ácido nucleico pueden carecer de genes marcadores. En el documento EP-A-0 635 574 se desvelan métodos para construir células hospedadoras microbianas carentes de genes marcadores y se basan en el uso de marcadores bidireccionales . Como alternativa, en las construcciones de ácido nucleico de la invención puede incorporarse un marcador de selección tal como Proteína Verde Fluorescente, lacZ, luciferasa, cloranfenicol acetiltransferasa, beta--glucuronidasa que permita seleccionar células transformadas. En el documento WO0540186 se describe un método preferido sin marcador para la introducción de polinucleótidos heterologos.
En una realización preferida, cada una de las secuencias de nucleótidos que codifican ent-copalil pirofosfato sintasa, ent-kaureno sintasa, ent-kaureno oxidasa y ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, UGT, hidroximetilglutaril-CoA reductasa, farnesil-pirofosfato sintetasa, geranilgeranil difosfato sintasa y NADPH-citocromo p450 reductasa, están unidas operativamente a un promotor que produce suficiente expresión de las secuencias de nucleótidos correspondientes en la célula eucariota según la presente invención que confiere a la célula la capacidad de producir un diterpeno o glucósido de diterpeno.
Como se utiliza en este documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una unión de elementos polinucleotidicos (o secuencias codificantes o secuencia de ácido nucleico) en una relación funcional. Una secuencia de ácido nucleico está "unida operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si éste influye en la transcripción de la secuencia codificante.
Como se utiliza en este documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que actúa para controlar la transcripción de uno o más genes, localizado cadena arriba con respecto a la dirección de la transcripción del sitio de inicio de la transcripción de dicho gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otras secuencias de ADN, incluyendo, pero sin limitación, sitios de unión a factores de transcripción, sitios de unión a proteínas represoras y activadoras y cualquier otras secuencias de nucleótidos conocidas por un experto en la materia para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones de desarrollo y ambientales. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación de desarrollo o ambiental .
El promotor que podría utilizarse para realizar la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifiquen una enzima, como se define anteriormente en este documento, puede no ser nativo para la secuencia de nucleótidos que codifique la enzima a expresar, es decir, un promotor que es heterólogo a la secuencia de nucleótidos (secuencia codificante) a la que está unida operativamente. Preferentemente, el promotor es homólogo, es decir, endógeno a la célula hospedadora.
Promotores adecuados en microorganismos de la invención pueden ser GAL7, GALIO o GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRPl, URA3 , LEU2 , ENO, TPI y AOXl . Otros promotores adecuados incluyen PDC, GPDl, PGK1, TEF1 y TDH. En los Ejemplos se muestran otros promotores adecuados.
Cualquier terminador, que sea funcional en la célula, puede utilizarse en la presente invención. A partir de genes naturales de la célula hospedadora se obtienen terminadores preferidos. En la técnica se conocen bien secuencias terminadoras adecuadas. Preferentemente, dichos terminadores se combinan con mutaciones que impiden que el ARNm interviniente sin sentido se- deteriore en la célula hospedadora de la invención (véase por ejemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161: 1465-1482).
Las secuencias de nucleótidos utilizadas en la invención pueden incluir secuencias que las dirijan a compartimentos deseados del microorganismo. Por ejemplo, en un microorganismo preferido de la invención, todas las secuencias de nucleótidos, excepto las secuencias codificantes de la ent-kaureno oxidasa, ácido kaurenóico 13-hidroxilasa y NADPH-citocromo p450 reductasa pueden dirigirse al citosol. Esta estrategia puede utilizarse en una célula de levadura .
Cuando el término "homólogo" se utiliza para indicar la relación entre una molécula (recombinante) de ácido nucleico o polipéptido y un organismo hospedador determinado o una célula hospedadora, se entiende que significa que en la naturaleza la molécula de ácido nucleico o polipéptido se produce por una célula hospedadora u organismo de la misma especie, preferentemente de la misma variedad o cepa.
Cuando el término "heterólogo" se utiliza con respecto a un ácido nucleico (ADN o ARN) o proteina se refiere a un ácido nucleico o proteina que no se produce de manera natural como parte del organismo, célula, genoma o secuencia de ADN o ARN en el que está presente, o que se encuentra en una célula o localización o localizaciones en el genoma o secuencia de ADN o ARN que es diferente del que se encuentra en la naturaleza. Los ácidos nucleicos o proteínas heterólogos no son endógenos a la célula en la que se introduce, sino que se han obtenido de otra célula o se han producido de un modo sintético o recombinante .
Típicamente, los microorganismos recombinantes de la invención comprenderán secuencias de nucleótidos heterólogas. Como alternativa, un microorganismo recombinante de la invención puede comprender secuencias totalmente homologas que se han modificado como se expone en este documento de tal manera que el microorganismo produce cantidades aumentadas de un diterpeno y/o glucósido de diterpeno en comparación con una versión no modificada del mismo microorganismo.
Como se describe en este documento, una o más enzimas de la ruta del diterpeno pueden sobreexpresarse para conseguir que la célula produzca suficiente cantidad de diterpeno.
Para la sobreexpresión de enzimas en las células hospedadoras de la invención hay diversos medios disponibles en la técnica. En particular, una enzima puede sobreexpresarse aumentando el número de copias del gen que codifica la enzima en la célula hospedadora, por ejemplo, integrando copias adicionales del gen en el genoma de la célula hospedadora.
Una célula hospedadora preferida según la presente invención puede ser una célula recombinante que pueda producir naturalmente GGPP.
Un microorganismo recombinante según la presente invención puede cultivarse en cualquier fuente de carbono adecuada conocida en la técnica y convertirlo en un diterpeno o en un glucósido diterpeno. El microorganismo recombinante puede convertir directamente biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas, pectinas, rhamnosa, galactosa, fucosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa y glicerol. Por lo tanto, un organismo hospedador preferido expresa enzimas tales como celulasas, (endocelulasas y exocelulasas) y hemicelulasas (por ejemplo, endo- y exo-xilanasas, arabinasas) necesarias para la conversión de celulosa en monómeros de glucosa y hemicelulosa en monómeros de xilosa y arabinosa, pectinasas que pueden convertir pectinas en ácido glucurónico y ácido galacturónico o amilasas para convertir almidón en monómeros de glucosa. Preferentemente, la célula hospedadora puede convertir una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en glucosa, xilosa, arabinosa, sacarosa, lactosa y glicerol. La célula hospedadora puede ser, por ejemplo, una célula hospedadora eucariota como se describe en los documentos WO03/062430, WO06/009434, EP1499708B1, WO2006096130 o WO04/099381.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno que comprende fermentar una célula eucariota transformada según la presente invención en un medio de fermentación adecuado, y opcionalmente recuperar el diterpeno y/o glucósido de diterpeno.
El medio de fermentación utilizado en el proceso de producción de un diterpeno y/o glucósido de diterpeno puede ser cualquier medio de fermentación adecuado que permita el cultivo de una célula hospedadora eucariota particular. Los elementos esenciales del medio de fermentación son conocidos por el experto en la materia y pueden adaptarse a la célula hospedadora seleccionada.
Preferentemente, el medio de fermentación comprende una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste en biomasa vegetal, celulosas, hemicelulosas , pectinas, rhamnosa, galactosa, fucosa, fructosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, ribulosa o almidón, derivados de almidón, sacarosa, lactosa, ácidos grasos, triglicéridos y glicerol. Preferentemente, el medio de fermentación también comprende una fuente de nitrógeno tal como urea, o una sal de amonio tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio o fosfato de amonio.
El proceso de fermentación según la presente invención puede realizarse en modo en lote, semicontínuo o continuo. También puede aplicarse un proceso de hidrólisis y fermentación distinto (SHF, Sepárate Hydrolisis and Fermentation) o un proceso simultáneo de sacarificación y fermentación (SSF, Simultaneous Saccharification and Fermentation) . Para una productividad óptima también puede ser posible una combinación de estos modos de procesos de fermentación. Un proceso SSF puede ser particularmente atractivo si se utiliza almidón, celulosa, hemicelulosa o pectina como fuente de carbono en el proceso de fermentación, donde puede ser necesario añadir enzimas hidroliticas , tales como celulasas, hemicelulasas o pectinasas para hidrolizar el sustrato .
El microorganismo recombinante utilizado en el proceso para la preparación de un diterpeno o glucósido de diterpeno puede ser cualquier microorganismo adecuado como se define en este documento anteriormente. Puede ser ventajoso utilizar un microorganismo eucariota recombinante según la invención en el proceso para la producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno, ya que la mayoría de las células eucariotas no requieren condiciones estériles para la propagación y son insensibles a infecciones por bacteriófagos. Además, las células hospedadoras eucariotas pueden cultivarse a pH bajo para evitar la contaminación bacteriana.
El microorganismo recombinante según la presente invención puede ser un microorganismo anaerobio facultativo. Un microorganismo anaerobio facultativo puede propagarse de un modo aerobio a una alta concentración celular. Esta fase anaerobia puede después realizarse a una alta densidad celular lo que reduce el volumen de fermentación sustancialmente necesario, y puede minimizar el riesgo de contaminación con microorganismos aerobios.
El proceso de fermentación para la producción de un diterpeno según la presente invención puede ser un proceso de fermentación aerobio o anaerobio.
Un proceso de fermentación anaerobio puede definirse en este documento como un proceso de fermentación realizado en ausencia de oxigeno o en el que sustancialmente no se consume oxigeno, preferentemente menos de 5, 2,5 o 1 mmol/l/h y donde las moléculas orgánicas sirven como donadoras de electores y como aceptoras de electrones. El proceso de fermentación según la presente invención también puede realizarse primero en condiciones aerobias y posteriormente en condiciones anaerobias .
El proceso de fermentación también puede realizarse en condiciones limitadas de oxigeno o microaerobias . Como alternativa, el proceso de fermentación puede realizarse primero en condiciones aerobias y posteriormente en condiciones limitadas de oxigeno. Un proceso de fermentación en condiciones limitadas de oxigeno es un proceso en el que el consumo del oxigeno está limitado por la transferencia de oxígeno del gas al líquido. El grado de limitación de oxígeno se determina por la cantidad y composición del flujo de gas entrante así como por las propiedades de transferencia reales de la mezcla/masa del equipo de fermentación utilizado.
La producción de un diterpeno en el proceso según la presente invención puede realizarse durante la fase de crecimiento de la célula hospedadora, durante la fase estacionaria (estado de equilibrio estacionario) o durante ambas fases. Puede ser posible realizar el proceso de fermentación a diferentes temperaturas.
El proceso para la producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno puede realizarse a una temperatura que sea óptima para la célula eucariota. La temperatura de crecimiento óptima puede ser diferente para cada célula eucariota transformada y es conocida por el experto en la materia. La temperatura óptima puede ser mayor que la óptima para organismos de tipo silvestre para cultivar eficazmente el organismo en condiciones no estériles bajo una sensibilidad de infección mínima y un coste de enfriamiento más bajo. Como alternativa, el proceso puede realizarse a una temperatura que no sea óptima para el cultivo del microorganismo recombinante . De hecho, se ha demostrado que un proceso para la preparación de un diterpeno o glucósido de diterpeno puede realizarse beneficiosamente a una temperatura de cultivo subóptima de un microorganismo recombinante.
Para cultivar el microorganismo recombinante en un proceso para la producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno la temperatura puede ser superior a 20 °C, 22 °C, 25 °C, 28 °C o superior a 30 °C, 35 °C o superior a 37 °C, 40 °C, 42 °C y preferentemente inferior a 45 °C. Sin embargo, durante la fase de producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno, la temperatura óptima podría ser menor que el promedio para optimizar la estabilidad de la biomasa. Durante esta fase la temperatura puede ser inferior a 45 °C, por ejemplo inferior a 42 °C, 40 °C, 37 °C, por ejemplo inferior a 35 °C, 30 °C, o inferior a 28 °C, 25 °C, 22 °C o inferior a 20 °C preferentemente superior a 15 °C.
La invención por tanto proporciona un proceso para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado cuyo proceso comprende fermentar un microorganismo recombinante que pueda producir un diterpeno o diterpeno glucosilado en un medio de fermentación adecuado a una temperatura de aproximadamente 29 °C o menor, y opcionalmente recuperar el diterpeno o diterpeno glucosilado. El microorganismo puede ser un microorganismo según la invención.
En dicho proceso la temperatura de fermentación puede ser de aproximadamente 29 °C o menor, aproximadamente 28 °C o menor, aproximadamente 27 °C o menor, aproximadamente 26 °C o menor o a una temperatura más baja.
El proceso para la producción de un diterpeno o glucósido de diterpeno según la presente invención puede realizarse a cualquier valor de pH adecuado. Si el microorganismo recombinante es una levadura, el pH en el medio de fermentación tiene preferentemente un valor inferior a 6, preferentemente inferior a 5,5, preferentemente inferior a 5, preferentemente inferior a 4,5, preferentemente inferior a 4, preferentemente inferior a 3,5 o inferior a pH 3,0, o inferior a pH 2,5, preferentemente superior a pH 2. Una ventaja de realizar la fermentación a estos valores de pH bajos es que puede impedirse el cultivo de bacterias contaminantes en el medio de fermentación.
Dicho proceso puede realizar a escala industrial.
El producto de dicho proceso puede ser uno o más de esteviolmonósido, esteviolbiósido, esteviósido o rebaudiosido A, rebaudiosido B, rebaudiosido C, rebaudiosido D, rebaudiosido E, rebaudiosido F, rubusósido, dulcósido A. Preferentemente se produce rebaudiosido A o rebaudiosido D.
La recuperación del diterpeno o glucósido de diterpeno del medio de fermentación puede realizarse por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, por destilación, extracción al vacio, extracción con disolventes, o evaporación .
En el proceso para la producción del diterpeno o glucósido de diterpeno según la invención, puede ser posible conseguir una concentración de caldo de fermentación superior a 5 mg/1, preferentemente superior a 10 mg/1, preferentemente superior a 20 mg/1, preferentemente un caldo de fermentación superior a 30 mg/1, preferentemente superior a 40 mg/1, más preferentemente superior a 50 mg/1, preferentemente superior a 60 mg/1, preferentemente superior a 70 mg/1, preferentemente superior a 80 mg/1, preferentemente superior a 100 mg/1, preferentemente superior a 1 g/l, preferentemente superior a 5 g/l, preferentemente superior a 10 g/l, pero normalmente inferior a 70 g/l.
La presente invención también se refiere a un caldo de fermentación que comprende un diterpeno y/o glucósido de diterpeno obtenible por el proceso según la presente invención. El diterpeno o diterpeno glucosilado puede ser un glucósido de esteviol, en particular rebaudiósido A o rebaudiósido D.
En el caso en el que un diterpeno o glucósido de diterpeno se exprese en el microorganismo, dichas células pueden necesitar tratarse para liberar el diterpeno/glucósido de diterpeno.
La invención también se refiere a un método para convertir un primer diterpeno glucosilado en un segundo diterpeno glucosilado, cuyo método comprende: poner en contacto dicho primer diterpeno glucosilado con un microoganismo como se describe en este documento, con un extracto acelular derivado de dicho microorganismo o con una preparación enzimática derivada de cualquiera de éstos, convirtiendo de esta manera el primer diterpeno glucosilado en el segundo diterpeno glucosilado.
El segundo diterpeno glucosilado puede ser rebaudiósido A o rebaudiósido D. En particular, el método puede realizarse en un formato de tal manera que el primer diterpeno glucosilado sea rebaudiósido A y el segundo diterpeno glucosilado sea rebaudiósido D.
El diterpeno o glucósido de diterpeno, por ejemplo, rebaudiósido A o rebaudiósido D, producido por el proceso de fermentación según la presente invención puede utilizarse en cualquier aplicación conocida para dichos compuestos. En particular, pueden utilizarse, por ejemplo, como un edulcorante, por ejemplo, en un alimento o una bebida. Por ejemplo, los glucósidos de esteviol pueden formularse en refrescos, como un edulcorante de sobremesa, chicle, producto lácteo tal como yogur (por ejemplo, yogur puro) , pastel, cereales o alimentos basados en cereales, nutracéuticos , productos farmacéuticos, geles comestibles, productos de confitería, cosméticos, pastas dentífricas u otra composición para la cavidad oral, etc. Además, un diterpeno o glucósido de diterpeno puede utilizarse como edulcorante no solo en bebidas, productos alimenticios y otros productos dedicados al consumo humano, sino también en piensos y forraje para animales con características mejoradas.
Por consiguiente, la invención proporciona, entre otras cosas, un producto alimenticio, pienso o bebida que comprende un diterpeno o diterpeno glucosilado preparado según un proceso de la invención.
Durante la preparación de productos alimenticios, bebidas, productos farmacéuticos, cosméticos, productos de sobremesa, chicles, pueden utilizarse métodos convencionales tales como mezclado, amasado, disolución, encurtido, impregnación, filtración, espolvoreo, atomización, infusión y otros métodos.
El diterpeno o glucósido de diterpeno obtenido en esta invención puede utilizarse en forma seca o líquida. Puede añadirse antes o después del tratamiento con calor de los productos alimenticios. La cantidad de edulcorante depende de la finalidad de uso. Éste puede añadirse solo o en combinación con otros compuestos.
Los compuestos producidos según el método de la invención pueden combinarse con uno o más edulcorantes no calóricos o calóricos adicionales. Dicha combinación puede utilizarse para mejorar el sabor o el perfil o la estabilidad temporal. Una amplia serie de edulcorantes tanto calóricos como no calóricos puede ser adecuada para combinar con glucósidos de esteviol. Por ejemplo, edulcorantes no calóricos, tales como mogrósido, monatina, aspartamo, sales de acesulfamo, ciclamato, sucralosa, sales de sacarina o eritritol. Los edulcorantes calóricos adecuados para combinar con glucósidos de esteviol incluyen alcoholes de azúcar e hidratos de carbono tales como sacarosa, fructosa y HFCS. También pueden utilizarse aminoácidos de sabor dulce tales como glicina, alanina o serina.
El diterpeno o glucósido de diterpeno puede utilizarse en combinación con un supresor edulcorante, tal como un supresor edulcorante natural. Puede combinarse con un potenciador del sabor umami, tal como un aminoácido o una sal del mismo.
Un diterpeno o glucósido de diterpeno puede combinarse con un poliol o alcohol de azúcar, un hidrato de carbono, una sustancia fisiológicamente activa o ingrediente funcional (por ejemplo, un carotenoide, fibra alimenticia, ácido graso, saponina, antioxidante, nutracéutico, flavonoide, isotiocianato, fenol, esterol o estanol vegetal ( fitoesteroles y fitoestanoles ) , polioles, un prebiótico, un probiótico, un fitoestrógeno, proteina de soja, sulfuros/tioles, aminoácidos, una proteina, una vitamina, un mineral y/o una sustancia clasificada en base a un beneficio para la salud, tal como cardiovascular, reducción de colesterol o un antiinflamatorio.
Una composición con un diterpeno o glucósido de diterpeno puede incluir un agente saporífero, un componente aromático, un nucleótido, un ácido orgánico, una sal de ácido orgánico, un ácido inorgánico, un compuesto amargo, una proteína o hidrolizado de proteína, un tensioactivo, un flavonoide, un compuesto astringente, una vitamina, una fibra alimenticia, un antioxidante, un ácido graso y/o una sal.
Un diterpeno o glucósido de diterpeno de la invención puede aplicarse como un edulcorante de alta intensidad para producir bebidas y productos alimenticios con cero calorías, con calorías reducidas o para diabéticos con características gustativas mejoradas. También puede utilizarse en bebidas, productos alimenticios, compuestos farmacéuticos y otros productos en los que no puede utilizarse azúcar.
Además, un diterpeno o glucósido de diterpeno de la invención puede utilizarse como un edulcorante no solo para bebidas, productos alimenticios u otros productos dedicados para el consumo humano, sino también en pienso y forraje para animales con características mejoradas.
Como ejemplos de productos en los que puede utilizarse un diterpeno o glucósido de diterpeno de la composición de la invención como un compuesto edulcorante pueden ser bebidas alcohólicas tales como vodka, vino, cerveza, licor, sake, etc.; zumos naturales, bebidas refrescantes, refrescos con gas, bebidas dietéticas, bebidas con cero calorías, bebidas y productos alimenticios con calorías reducidas, bebidas de yogur, zumos instantáneos, café instantáneo, tipos de bebidas instantáneas en polvo, productos enlatados, almíbar, pasa de semilla de soja fermentada, salsa de soja, vinagre, postres, mahonesa, salsa de tomate, curry, sopa, caldo instantáneo, salsa de soja en polvo, vinagre en polvo, tipos de galletas, galletas de arroz, galletas saladas, pan, chocolates, caramelo, confite, chicle, gelatina, budín, frutos y hortalizas en conserva, nata fresca, compota, mermelada, pasta azucarada para flores, leche en polvo, helado, sorbete, hortalizas y frutos envasados en frascos, judías enlatadas y hervidas, carne y alimentos hervidos en salsa edulcorada, productos alimenticios vegetales agrícolas, marisco, jamón, embutido, jamón de pescado, salchicha de pescado, pasta de pescado, productos de pescado fritos, productos de mar deshidratados, productos alimenticios congelados, algas en conserva, carne en conserva, tabaco, productos medicinales y muchos otros. En principal pueden tener aplicaciones ilimitadas .
La composición edulcorada comprende una bebida, como ejemplos no limitantes de los cuales se incluyen bebidas no gaseosas y gaseosas tales como colas, cerveza de jengibre, cerveza de raíz, sidra, refrescos con sabor a fruta (por ejemplo, refrescos con sabor a cítricos, tales como, lima-limón o naranja) , refrescos en polvo y similar; zumos de fruta que se originan en frutos o vegetales, zumos de fruta incluyendo zumos exprimidos o similar, zumos de fruta que contienen partículas de fruta, bebidas con fruta, bebidas de zumo de fruta, bebidas que contienen zumos de fruta, bebidas con sabor a fruta, zumos vegetales, zumos que contienen vegetales y zumos mixtos que contienen frutas y vegetales; bebidas deportivas, bebidas energéticas, agua saborizada y bebidas similares (por ejemplo, agua con saborizantes naturales o sintéticos) ; bebidas de tipo té o favoritas tales como café, cacao, té negro, té verde, té oolong y similar; bebidas que contienen componentes lácteos tales como bebidas lácteas, componentes lácteos que contienen café, café con leche, té con leche, bebidas lácteas con frutas, yogurt bebible, bebidas con bacterias ácido lácticas o similar; y productos lácteos.
Generalmente, la cantidad de edulcorante presente en una composición edulcorada varía bastante dependiendo del tipo de composición edulcorada particular y del dulzor deseado. Los expertos habituales en la materia pueden discernir fácilmente la cantidad de edulcorante apropiada a dispensar en la composición edulcorada.
El diterpeno o glucósido de diterpeno de la invención obtenido en esta invención puede utilizarse en forma liquida o deshidratada. Puede añadirse antes o después del tratamiento con calor de los productos alimenticios. La cantidad de edulcorante depende de la finalidad del uso. Puede añadirse solo o en combinación con otros compuestos.
Durante la preparación de los productos alimenticios, bebidas, productos farmacéuticos, cosméticos, productos de sobremesa, chicles, pueden utilizarse métodos convencionales tales como mezclado, amasado, disolución, encurtido, impregnación, filtración, espolvoreo, atomización, infusión y otros métodos.
Por tanto, las composiciones de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier método conocido por los expertos habituales en la materia que proporcionen mezclas homogéneas o casi homogéneas de los ingredientes. Estos métodos incluyen mezclado, secado por pulverización, aglomeración, granulación en húmedo, compactación, co-cristalización y similar.
Un diterpeno o glucósido de diterpeno de la presente invención puede proporcionarse a los consumidores en forma sólida, en cualquier forma adecuada para administrar en el comestible a edulcorar, incluyendo sobrecitos, paquetes, bolsas o cajas a granel, terrones, comprimidos', vaporizadores o tiras que pueden disolverse. La composición puede administrarse como una dosis unitaria o a granel.
Para sistemas y composiciones edulcorantes líquidos se diseñarán variedades convenientes de formas liquidas, semilíquidas , pastas y cremas, envasadas apropiadamente utilizando material de envasado apropiado de cualquier forma que sea conveniente para llevar, dispensar, conservar o transportar cualquier combinación que contenga cualquiera de los productos edulcorantes anteriores o una combinación de los productos producidos anteriormente.
La composición puede incluir diversos agentes formadores de volumen, ingredientes funcionales, colorantes, saporíferos .
En este documento, una referencia a un documento de patente u otro asunto que sea proporcionado como técnica anterior no debe considerarse como una admisión de que ese documento o asunto se conociese o que la información que contenga forme parte del conocimiento general común en la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.
La descripción de cada referencia indicada en este documento se incorpora en el mismo por referencia en su totalidad.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos: EJEMPLOS General Las técnicas genéticas convencionales, tales como sobreexpresión de enzimas en las células hospedadoras, asi como para modificación genética adicional de células hospedadoras, son métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, o F. Ausubel et al, eds . , "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987). A partir de los documentos EP-A-0 635 574, O 98/46772, O 99/60102 y WO 00/37671 se conocen métodos para la transformación y modificación genética de células hospedadoras fúngicas.
En la Tabla 1 se muestra una descripción de las secuencias. Las secuencias descritas en este documento pueden definirse con referencia al listado de secuencias o con referencia a los números de acceso de las bases de datos también mostrados en la Tabla 1.
Ejemplo 1; Clonación y expresión de la ruta de la biosíntesis del Rebaudiosido A en Sccharomyces cerevisiae 1.1. Construcciones de expresión Las SEC ID Nos: 79, 81 y 83 se obtuvieron por el método de pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007 /05594 para S. cerevisiae y se sintetizaron en ADN2.0. Las secuencias ID nos 79, 81 y 83 se clonaron detrás de promotores constitutivos, después de colocar un terminador en la secuencia codificante. La construcción de expresión pRS414rebA-01 que contenia los 3 casetes de expresión se creó ligando fragmentos de restricción, que consistían en construcciones génicas sintéticas, en el vector de expresión pRS414 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1): 19-27), basándose en el sitio de clonación múltiple presente en el este vector. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de E. coli DH10B (Invitrogen) dando lugar a la construcción de expresión de levadura pGBS414rebA-01.
Las secuencias de las SEC ID Nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69 y 77 se obtuvieron por el método de pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007 /05594 para S. cerevisiae y se sintetizaron en ADN 2.0. Las secuencias ID nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33 , 53 , 55 , 57 , 59 , 61 , 63 , 65 , 67 , 69 y 77 se clonaron detrás de promotores constitutivos, después de colocar un terminador en la secuencia codificante. La biblioteca de construcción de expresión pRS415rebA-01 que contenia diversas combinaciones de casetes de expresión que contenían las secuencias ID nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 53 , 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69 y 77 se creó ligando fragmentos de restricción, que consistían en construcciones génicas sintéticas, en el vector de expresión pRS415 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989 , 122(1): 19-27), basándose en el sitio de clonación múltiple presente en este vector. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de E. coli DH10B (Invitrogen) dando lugar a la biblioteca de construcción de expresión de levadura pGBS415rebA-01.
Las secuencias de las SEC ID Nos 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73 o 75 se obtuvieron por el método de pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007/05594 para S. cerevisiae y se sintetizaron en ADN 2.0. Las secuencias ID nos 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73 o 75 se clonaron detrás de promotores constitutivos, después de colocar un terminador en la secuencia codificante. La biblioteca de construcción de expresión pRS416rebA-01 que contenía diversas combinaciones de casetes de expresión que contenían la secuencias sec ID Nos 35, 36, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73 o 75 se creó ligando fragmentos de restricción, que consistían en construcciones génicas sintéticas, en el vector de expresión de pRS416 de S. cerevisiae (Sirkoski R.S. y Hieter P, Genetics, 1989, 122(1): 19-27) , basándose en el sitio de clonación múltiple presente en este vector. La mezcla de ligamiento se utilizó para la transformación de E. coli DH10B (Invitrogen) dando lugar a la biblioteca de construcción de expresión de levadura pGBS416rebA-01. 1.2 Transformación El plásmido de expresión pGBS414rebA-01 y las bibliotecas de plásmido de expresión pGBS 15rebA-01 y pGBS416rebA-01 se transformaron en la cepa CEN.PK113-6B (MATA ura 3 52 leu 2 112 trpl-289) de S. cerevisiae. Las mezclas de transformación se sembraron en placas en Base Nitrógeno para Levaduras (YNB) sin AA (Difco) + glucosa al 2 % . 1.3 Cultivo de transformantes Los transformantes se inoculan en medio Verduyn que contenía glucosa, galactosa y otras fuentes de C como etanol o glicerol, complementado con aminoácidos apropiados si fuera necesario (Verduyn et al., 1992, Yeast. Jul; 8(7): 501-17) y se cultivaron en condiciones aerobias, anaerobias y limitadas de oxígeno en matraces agitadores. El medio para el cultivo anaerobio se complementó con ergosterol 0,01 g/1 y Tween 80 0,42 g/1 disuelto en etanol (Andreasen y Stier, 1953, J. cell. Physiol, 41, 23-36; Andreasen y Stier, 1954, J. Cell. Physiol, 43: 271-281) . Todos los cultivos de levadura se cultivaron a 30 °C en una incubadora con agitación a 250-280 rpm. 1.4 Detección de rebaudiósido A A diferentes tiempos de incubación, se extrajeron alícuotas de los cultivos, se centrifugan y el medio y las células se analizan por LC/MS para detectar la formación de rebA, como se describe más adelante. Después de cultivo durante una noche las células se centrifugaron y la concentración de Rebaudiósido A (C44H70O23, Mmonoisotrópico = 966,43079) se midió por LC/MS como se describe más adelante. Para esta finalidad un sistema UHPLC se acopló a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo y el rebaudiósido A se detectó en modo MS/MS por la pérdida de una unidad de hexosa de la molécula protonada.
Se utilizó una columna de amida BEH UPLC de Waters acquity (1,7 um, 2,1*150 mm) con elución isocrática. La fase móvil consistió en acetonitrilo/NH4Ac 10 mM en agua MilliQ (pH 6,8), (8:2 v/v) , a un caudal de 300 ul/min. El volumen de inyección era de 5 µ? y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 grados Celsius.
Ejemplo 2; Sobreexpresión de ERG20, BTSl y tHMG en S. cerevisiae Para la sobreexpresión de ERGIO, BTSl, tHMG, se diseñaron casetes de expresión para integrar en un locus utilizando la tecnología descrita en la solicitud de patente en trámite junto con la presente n° US61/616254. Para amplificar los flancos de integración 5' y 3' para la integración en el locus, se utilizaron cebadores y ADN genómico adecuados de una cepa de levadura CEN.PK (van Dijken et al. Enzyme and Microbial Technology 26 (2000) 706-714) . Los diferentes genes se ordenaron como casetes (que contenía secuencia homologa, promotor, gen, terminador, secuencia homologa) en DNA2.0. Los genes en estos casetes se flanquearon por promotores y terminadores . Véase la Tabla 2. El ADN plasmídico del ADN2.0 que contenía los casetes ERG20, tHMGl y BTSl se disolvió a una concentración de 100 ng/µ?. En una mezcla de PCR de 50 µ? se utilizó molde 20 ng junto con 20 pmol de cebadores. El material se disolvió a una concentración de 0,5 µg/µl.
Tabla 2: Composición de las construcciones de sobreexpresión utilizó la construcción pUG7-EcoRV (Figura 1) y cebadores adecuados. El fragmento KanMX se purificó del gel utilizando el kit de Recuperación de ADN Zymoclean Gel (ZymoResearch) . La cepa de levadura Cen.PK113-3C se transformó con los fragmentos indicados en la Tabla 3.
Tabla 3: Fragmentos de ADN utilizados para la transformación de ERG20 , tHMGl y BTS1 Fragmento 5'YPRcTau3 Cásete ERG20 Cásete tHMGl Cásete KanMX Cásete BTS1 3'YPRcTau3 Después de la transformación y recuperación durante 2,5 horas en YEPhD (extracto de levadura fitona peptona glucosa; BBL Fitona Peptona de BD) a 30 °C las células se sembraron en placas en agar YEPhD con G418 200 µ?/p?? (Sigma) . Las placas se incubaron a 30 °C durante 4 días. La integración correcta se estableció con PCR de diagnóstico y secuenciación . La sobreexpresión se confirmó con LC/MS en las proteínas. El esquema del conjunto de ERG20, tHMGl y BTS1 se ilustra en la Figura 2. Esta cepa se denominó STV002.
La expresión de la recombinasa CRE en esta cepa condujo a la recombinación externa del marcador KanMX. La recombinación externa correcta y la presencia de ERG20, tHMG y BTS1 se estableció con PCR de diagnóstico.
Ejemplo 3 ; Disminución de la expresión de Erg9 Para reducir la expresión de Erg9, se diseñó y se utilizó una construcción con disminución de expresión de Erg9 que contenia un extremo 3' modificado, que continua en el promotor de TRPl conduciendo la expresión de TRPl.
La construcción que contenia el fragmento Erg9-KD se transformó en células TOP10 de E. coli. Los transformantes se cultivaron en 2PY (2 veces extracto de Levadura Fitona peptona) , medio sAMP. El ADN plasmidico se aisló con el kit Miniprep Spin QIAprep (Qiagen) y se digirió con Sall-HF (New England Biolabs) . Para concentrar, el ADN se precipitó con etanol. El fragmento se transformó a S. cerevisiae y se sembraron colonias en placas de agar con medio mineral (Verduyn et al, 1992. Yeast 8: 501-517) sin triptófano. La integración correcta de la construcción Erg9-KD se confirmó con PCR de diagnóstico y secuenciación . El esquema de la transformación realizada de la construcción Erg9-KD se ilustra en la Figura 3. La cepa se denominó STV003.
Ejemplo 4: Sobreexpresión de UGT2 Ia Para la sobreexpresión de UGT2_la, se utilizó tecnología como se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente n° US61/616254 y EP12159094.7. El UGT2a se ordenó como un cásete (que contenia secuencia homologa, promotor, gen, terminador, secuencia homologa) en el DNA2.0. Para detalles, véase la Tabla 4. Para obtener los fragmentos que contenían el marcador y la recombinasa Cre, se utilizó tecnología como se describe en la solicitud de patente en trámite junto con la presente n° EP1215909 .7. El marcador NAT, que confiere resistencia a nourseotricina se utilizó para selección.
Tabla 4: Composición de la construcción de sobreexpresión Se utilizaron cebadores adecuados para la amplificación. Para amplificar los flancos de integración 5' y 3' para el locus de integración, se utilizaron cebadores y ADN genómico adecuados de una cepa de levadura CEN.PK.
La cepa de levadura STV003 de S. cerevisiae se transformó con los fragmentos indicados en la Tabla 5, y la mezcla de transformación se sembró en placas de agar YEPhD que contenían nourseotricina 50 µg/ml (Lexy NTC de Jean Bioscience) .
Tabla 5: Fragmentos de ADN utilizados para la transformación de UGT2a Fragmento 5'CrQ9.01 Cásete UGT2a NAT-CR RE 3? 9.01 La expresión de la recombinasa CRE se activó por la presencia de galactosa. Para inducir la expresión de la recombinasa CRE, los transformantes volvieron a sembrarse en estrias en medio Galactosa YEPh. Esto dio como resultado la recombinación extrema del marcador (marcadores) localizada entre sitios lox. La integración correcta de la UGT2a y la recombinación externa del marcador NAT se confirmó con PCR de diagnóstico. La cepa resultante se denominó STV004. El esquema de la transformación realizada de la construcción UGT2a se ilustra en la Figura 4.
Ejemplo 5: Sobreexpresion de la ruta de producción a Esteviol: CPS, KS, KO, KAH y CPR Ruta de Esteviol Todos los genes de la ruta que conducen a la producción de Esteviol se diseñaron para la integración en tándem en un locus utilizando tecnología descrita en la solicitud de patente en trámite junto con la presente n° US61/616254. Para amplificar los flancos de integración 5' y 3' para el locus de integración, se utilizaron cebadores y ADN genómico adecuados de una cepa de levadura CEN.PK. Los diferentes genes se ordenaron como casetes (que contenían secuencia homologa, promotor, gen, terminador, secuencia homologa) en ADN2.0 (véase la Tabla 6). El ADN de ADN2.0 se disolvió a 100 ng/µ?. Esta solución madre se diluyó adicionalmente a 5 ng/µ?, de los cuales se utilizó 1 µ? en una mezcla de PCR 50 µ? . La reacción contenía 25 pmol de cada cebador. Después de la amplificación, el ADN se purificó con el kit de limpieza PCR NucleoSpin 96 (Macherey-Nagel) o de manera alternativa se concentró utilizando precipitación con etanol.
Tabla 6 Todos los fragmentos para la ruta de Esteviol, el marcador y los flancos (véase revisión en la Tabla 7) se transformaron en la cepa de levadura STV004 de S. cerevisiae. Después recuperar durante una noche en YEPhD a 20 °C las mezclas de transformación se sembraron en placas de agar YEPhD que contenían G418 200 µg/ l. Éstas se incubaron durante 3 días a 25 °C y una noche a TA.
Tabla 7. Fragmentos de ADN utilizados para la transformación de CPS, KS, KO, KanMX, KAH y CPR.
Fragmento 5'INTl Cásete CPS Cásete KS Cásete KO Cásete KanMX · Cásete KAH Cásete CPR 3'INTl La integración correcta se confirmó con PCR de diagnóstico y análisis de secuencias (3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) . Las reacciones de secuencia se realizaron con el kit de Secuenciación por Ciclos BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies). Cada reacción (10 µ?) contenía molde 50 ng y cebador 3,2 pmol. Los productos se purificaron por precipitación con etanol/EDTA, se disolvieron en formamida HiDi 10 µ? y se aplicaron sobre el aparato. La cepa se denominó STV018. El esquema de cómo se integra en el genoma la ruta de GGPP a esteviol se ilustra en la Figura 5.
Ejemplo 6: Sobreexpresión de la ruta de producción a RebA: CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGT1, UGT3 y UGT4 Todos los genes de la ruta que conducen a la producción de RebA se diseñaron para integrarse en un locus utilizando la tecnología descrita en la solicitud de patente pendiente en trámite junto con la presente n° US61/616254. Para amplificar los flancos de integración 5' y 3' para el locus de integración, se utilizaron cebadores y ADN genómico adecuados a partir de una cepa de levadura CEN.PK. Los diferentes genes se ordenaron como casetes (que contenían secuencia homologa, promotor, gen, terminador, secuencia homologa) en ADN2.0 (véase la Tabla 8 para revisión). El ADN de ADN2.0 se disolvió a 100 ng/µ?. Esta solución madre se diluyó adicionalmente a 5 ng/µ?, de los cuales se utilizaron 1 µ? en una mezcla de PCR 50 µ? . La reacción contenía 25 pmol de cada cebador. Después de la amplificación, el ADN se purificó con el kit de limpieza PCR NucleoSpin 96 (Macherey-Nagel) o de manera alternativa se concentró utilizando precipitación con etanol.
Tabla 8. Secuencias utilizadas para la ruta de producción a RebA Todos los fragmentos de la ruta a RebA, el marcador y los flancos (véase revisión en la Tabla 9) se transformaron a la cepa de levadura STV004 de S. cerevisiae . Después de recuperación durante una noche en YEPhD a 20 °C las mezclas de transformación se sembraron en placas de agar YEPhD que contenían G418 200 µg/ml. Éstas se incubaron durante 3 días a 25 °C y una noche a TA.
Tabla 9. Fragmentos de ADN utilizados para la transformación de CPS, KS, KO, KanMX, KAH, CPR, UGT1, UGT3 y UGT4.
Fragmento 5'INTl Cásete CPS Cásete KS Cásete KO Cásete KanMX Cásete KAH Cásete CPR Cásete UGT1 Cásete UGT2 Cásete UGT3 3'INTl La integración correcta se confirmó con PCR de diagnóstico y análisis de secuencias (3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) . Las reacciones de secuencia se realizaron con el kit de Secuenciación por Ciclos BigDye Terminator v3.1 (Life Technologies). Cada reacción (10 µ?) contenia molde 50 ng y cebador 3,2 pmol. Los productos se purificaron por precipitación con etanol/EDTA, se disolvieron en HiDi formamida 10 µ? y se aplicaron sobre el aparato. La cepa se denominó STV006. El esquema de cómo la ruta de GGPP a RebA se integra en el genoma se ilustra en la Figura 6.
Ejemplo 7: Producción de Esteviol en la cepa STV018 Una cepa de levadura de S. cerevisiae que contenía las modificaciones descritas en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 5, la cepa STV018, se cultivó en YEP (Peptona Extracto de Levadura) con glucosa. Los matraces agitadores se incubaron a 30 grados C durante 7 días. Para extraer el producto de las células, se incubó caldo completo a 95 °C durante 15 minutos, se añadió acetonitrilo (equivalente a la mitad de volumen) , las muestras se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se diluyeron con acetonitrilo al 33 % cuando fue apropiado. El Esteviol de las muestras se analizó utilizando LC/MS. Como patrón se utilizó Esteviol (Sigma H8664) . En la Figura 7 se ilustran los resultados.
Ejemplo 8: Producción de RebA en la cepa STV006 Una cepa de levadura de S. cerevisiae que contenía las modificaciones descritas en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 6, la cepa STV006, se cultivó en YEP (Peptona Extracto de Levadura) con glucosa. Los matraces agitadores se incubaron a 30 grados C y se incubaron durante 7 días. Para extraer el producto de las células, se incubó caldo completo a 95 °C durante 15 minutos, se añadió acetonitrilo (equivalente a la mitad de volumen), las muestras se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se diluyeron con acetonitrilo al 33 % cuando fue apropiado. El RebA de las muestras se analizó utilizando LC/MS. Como patrón se utilizó RebA (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd) . En la Figura 8 se ilustran los resultados.
La Tabla 10 muestra las cepas utilizadas en los Ejemplos 2 a 8.
Ejemplo 9: Efecto de variantes enzimáticas KO y CPR Se evaluó el efecto de diferentes combinaciones de la enzima KO y de la enzima CPR sobre la producción de RebA. Estas cepas se prepararon como se describe en el Ejemplo 6, utilizando los mismos casetes CPS, KS, AH, UGT1, UGT3 y UGT4, pero con diferentes variantes de los genes KO y/o de los genes CPR. Los genes KO están bajo el control del mismo promotor Se EN02.pro y terminador Se TPIl.ter como se describe en el Ejemplo 6. Los genes CPR están bajo el control del mismo promotor KI prom 6. pro y terminador Se PDCl.ter como se describe en el Ejemplo 6.
Tabla 11. Cepas con diferentes combinaciones de las enzimas KO y CPR Las cepas se inocularon en matraces agitadores y se incubaron a 30 grados C durante 7 días. Para extraer el producto de las células, se incubó caldo completo a 95 °C durante 15 minutos, se añadió acetonitrilo (equivalente a la mitad de volumen) , las muestras se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se diluyeron con acetonitrilo al 33 % cuando fue apropiado. El RebA de las muestras se analizó utilizando LC/MS. Como patrón se utilizó RebA (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd) . En la Figura 9 se ilustran los resultados.
Ejemplo 10 : Sobreexpresión de rutas de producción parcial: CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGTl y UGT2 Utilizando una estrategia similar a la detallada en el Ejemplo 6, se construyó una cepa que expresaba CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGTl y UGT2. Los mismos genes se expresaron como se describe para la cepa STV006 en el Ejemplo 6, excepto que esta cepa, denominada STV019 no contenia una UGT3 y UGT4.
E emplo 11 : Sobreexpresión de rutas de producción parcial: CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGTl, UGT2 y UGT4 Utilizando una estrategia similar a la detallada en el Ejemplo 6, se construyó una cepa que expresaba CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGTl, UGT2 y UGT4. Los genes se expresaron como se describen para la cepa STV006 en el Ejemplo 6, excepto que esta cepa, denominada STV020 no contenia una UGT4.
Ejemplo 12 : Formación de glucósido de Estaviol en las cepas STV018, STV018 y STV020 Las cepas de levadura de S. cerevisiae que contenían las modificaciones descritas en los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 y 11, las cepas STV018, STV019 y STV020, se cultivaron en YEP (Peptona Extracto de Levadura) con glucosa. Los matraces agitadores se incubaron a 30 grados C y se incubaron durante 7 días. Para extraer el producto de las células, se trató caldo completo con calor y acetonitrilo, se centrifugó y el sobrenadante se analizó para determinar el Esteviósido y el RebA utilizando LC/MS. Como patrones se utilizaron RebA (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd) y esteviósido (RV0141-95, DAE Pyung Co. Ltd) .
Sorprendentemente, se descubrió la producción de esteviósido en la cepa STV019, y de RebA en la cepa STV020. En la Figura 10 se ilustran los resultados.
Estos resultados ilustran la actividad para la formación de esteviósido, sin la expresión de una UGT3.
Ejemplo 13; Expresión Variable de KO SR Se construyeron cepas que expresaban CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGT1, UGT2, UGT3 y UGT4 por transformación como se describe en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 y 6. Como ent-Kaureno oxidasa, se utilizó cualquiera de KO_SR (SEC ID N° : 67) o KO_Gibfu (SEC ID N° : 85) . Para dirigir la expresión de la ent-Kaureno oxidasa, se utilizaron promotores de diferente longitud (véase la Tabla 12) . La producción de RebA se determinó como se describe en el Ejemplo 8. Con las dos ent-Kaureno oxidasas diferentes, se observaron efectos opuestos para la longitud del promotor.
Tabla 12: Secuencias KO y promotores utilizados en diversas cepas Ejemplo 14: Producción de esteviol en Yarrowla lipolytica recombinante Los plásmidos pMB6754, pMB6761 y pMB6762 (véase la Tabla 13 y las Figuras 11, 12 y 13) que codifican los genes para la síntesis de esteviol se construyeron de la siguiente manera. Las fases de lectura abierta para tCPS (SEC ID N°: 182), tKS (SEC ID N°: 183), CPSKS (SEC ID N° : 184), KOGib (SEC ID N°: 186), KAH4 (SEC ID N° : 185), CPR1 (SEC ID N° : 187) y CPR3 (SEC ID N°: 188) se optimizaron por pares de codones utilizando la tecnología de optimización de pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007/05594 , para la expresión en Yarrowia lipolytica. Las secuencias optimizadas, flanqueadas por 60 pb del promotor y terminador deseado, se sintetizaron por GenScript (SEC ID N°: 182-188), y se amplificaron por PCR utilizando cebadores apropiados. Los fragmentos de ADN que codifican las secuencias promotoras-terminadoras , promotor TPI, o marcadores de Yarrowia lipolytica se amplificaron por PCR a partir de construcciones existentes (SEC ID 193-197 y 199) . El ADN vectorial (SEC ID N° : 198), que consiste en el plásmido URA3 basado en centrómero de S. cerevisiae YCp50 (Rose et al., Gene 1987; 60(2-3) : 237-43) con ENOp de Yarrowia que reemplaza el gen tet utilizando técnicas convencionales, se preparó a partir de E. coli y se digirió con Xbal y SnaBI . Todos los fragmentos se purificaron por electroforesis en gel utilizando un kit QiaQuick (Qiagen) . La cepa 10556-23C de S. cerevisiae (fondo 303; G.R. Fink) se transformó (Gietz y Schiestl, Nat. Protoc. 2007; 2(1) : 31-4) con 250 ng de cada fragmento de ADN y se seleccionó para prototrofia en medio mínimo de aspartato glucosa. Los plásmidos se rescataron de los transformantes prototróficos (Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 14, pág. 3790 (1992)) y se utilizaron para transformar DH5a de E. coli contra resistencia a ampicilina (100 mg/1) en placas de agar LB.
La cepa ML2597 de Yarrowia con expresión aumentada de geranilgeranildifosfato sintasa se obtuvo por transformación de MF350 con pMB4591 {tefl-GGS URA2) (documento US7851199) . Los plásmidos pMB6754, pMB6761 y pMB6762 se digirieron con Sfil y se utilizaron para transformar L2579 a prototrofia de leucina sobre medio mínimo de aspartato glucosa que contenía adenina (0,2 mM) . Los transformantes volvieron a sembrarse en estrías en medio selectivo y posteriormente se inocularon a YPD 0,8 mi en placas de microtitulación (PMT) de 24 pocilios. Las placas se sellaron con protector BugStopper (Whatman) y las cepas se cultivaron para la producción de esteviol a 30 °C con agitación a 800 rpm durante seis días en una incubadora ultitron (Infors). 500 µ? de caldo de cultivo se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se añadieron 250 µ? de acetonitrilo y 600 µ? de perlas de sílice (0,5 mm) . Las células se rompieron por golpeteo de las perlas durante 10 min y los sedimentos celulares se sedimentaron a 13.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga . El sobrenadante se diluyó 200 veces con acetonitrilo : agua 1:2 (v:v) y se analizó por LC- S (Tabla 14) . Como patrón se utilizó una mezcla de esteviósidos que contenían esteviol 100 µg/ml. 13: Plásmidos de la ruta de esteviol y RebA Tabla 14. Producción de Esteviol Ejemplo 15: Producción de RebA en Yarrowia. lipolytica. recombinante El plásmido pMB6775, (véase la Tabla 13 y la Figura 14) que codifica genes para la síntesis de RebA se construyó de la siguiente manera. Las fases de lectura abierta de una UGT1, UGT3, UGT4 y UGT2 se optimizaron con pares de codones utilizando tecnología de optimización con pares de codones como se desvela en el documento PCT/EP2007/05594, para la expresión de Yarrowia lipolytica . Las secuencias optimizadas, flanqueadas por 60 pb del promotor y terminador deseado, se sintetizaron por GenScript (SEC ID N°: 189-192), y se amplificaron por PCR utilizando cebadores apropiados. Los fragmentos de ADN que codifican las secuencias promotoras-terminadoras o los marcadores de Yarrowia lipolytica se amplificaron por PCR a partir de construcciones existentes (SEC ID Nos: 194-196, 199 y 200) . El vector (SEC ID N°: 198), que consiste en el plásmido URA3 basado en centrómero de S. cerevisiae YCp50 (Rose et al., citado anteriormente) con ENOp de Yarrowia que reemplaza el gen tet utilizando técnicas convencionales, se preparó a partir de E. coli y se digirió con Xfoal y SnaBI . Todos los fragmentos se purificaron por electroforesis en gel utilizando un kit QiaQuick (Qiagen) . La cepa 10556-23C de S. cerevisiae (fondo W303; G.R. Fink) se transformó (Gietz y Schiestl, citado anteriormente) con 250 ng de cada fragmento de ADN y se seleccionó para prototrofia en medio mínimo de aspartato glucosa. Los plásmidos se rescataron de los transformantes prototróficos (Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 14, pág. 3790 (1992) ) y se utilizaron para transformar DH5a de E. coli contra resistencia a ampicilina (100 mg/1) en placas de agar LB.
El plásmido MB6775 se digirió con Sfil y se utilizó para transformar cepas ML12925, ML12929, y L12931 de Yarrowia productoras de Esteviol contra resistencia a higromicina (100 mg/1) en placas de agar YPD. Los transformantes volvieron a sembrarse en estrias en medio selectivo y posteriormente se inocularon a YPD 0,8 mi en placas de microtitulación (PMT) de 24 pocilios. Las placas se sellaron con un protector BugStopper (Whatman) y las cepas se cultivaron para la producción de esteviol a 30 °C con agitación a 800 rpm durante seis días en una incubadora ultitron (Infors).
Las muestras, que consistían en 100 µ? de caldo de cultivo, se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se añadieron 700 µ? de acetonitrilo al 33 % y perlas de sílice 600 µ? (0,5 mm) . Las células se rompieron por golpeteo de las perlas durante 10 min, y los sedimentos celulares se sedimentaron a 13.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga . El sobrenadante se diluyó 2,5 veces con acetonitrilo : agua 1:2 (v:v) y se analizó por LC-MS (Tabla 15) . Adicionalmente, se sedimentaron 500 µ? de caldo de cultivo y el sobrenadante se diluyó 20 veces antes del análisis LC-MS (Tabla Z) . Como patrón se utilizó RebA.
Tabla 15. Producción de RebA Ejemplo 16; Biosíntesis de Rebaudiósido D (RebD) en levaduras La variación en el nivel de expresión de los genes de una ruta metabólica puede dar como resultado la variación en cuanto a la formación de productos y subproductos. El cambio de los niveles de expresión de genes cuyos productos génicos compiten por el mismo sustrato puede alterar la cantidad y naturaleza de los productos producidos. Una estrategia para cambiar el nivel de expresión de un gen, es cambiar la fuerza del promotor que conduce la expresión de ese gen. Diferentes condiciones también pueden alterar la expresión de genes. Para alterar la expresión de las UGT descritas en el Ejemplo 6 se utilizaron diferentes promotores.
Todos los genes de la ruta que conduce a la producción de RebD se diseñaron para integrarse en un locus en el fondo de la cepa STV004. Para amplificar los flancos de integración 5' y 3' para el locus de integración (sitio 3) , se utilizaron cebadores y ADN genómico adecuados de una cepa de levadura CEN.PK. Los diferentes genes se ordenaron como casetes (que contenían secuencia homologa, promotor, gen, secuencia terminadora y secuencia homologa) en el ADN2.0 (véase Tabla 16 para revisión). El ADN de ADN2.0 se disolvió a 100 ng/µ? . Esta solución madre se diluyó adicionalmente a 5 ng/µ?, de los cuales se utilizó 1 µ? en una mezcla PCR de 50 µ? . La reacción contenia 25 pmol de cada cebador. Después de la amplificación, se purificó ADN con el kit de limpieza PCR NucleoSpin 96 ( acherey-Nagel) o como alternativa se concentró utilizando precipitación con etanol.
Tabla 16. Composición de la sobreexpresion de las construcciones para CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGT1, UGT3 y UGT4 Todos los fragmentos para la ruta a RebD, el marcador y los flancos (véase revisión en la Tabla 17) se transformaron a una cepa de levadura STV004 de S. cerevisiae . Después de recuperación de una noche en YEPhD a 20 °C las mezclas de transformación se sembraron en placas en agar YEPhD que contenían G418 200 µg/ml. Éstas se incubaron durante 3 días a 30 °C.
Tabla 17. Fragmentos de ADN utilizados para la transformación de CPS, KS, KO, KanMX, KAH, CPR, UGT1, UGT3 y UGT4.
Fragmento 5' sitio 3 Cásete CPS Cásete KS Cásete KO Cásete KanMX Cásete KAH Cásete CPR Cásete UGT1 Cásete UGT3 Cásete UGT4 3 'sitio 3 La integración correcta se confirmó con PCR diagnóstico. La cepa resultante se denominó STV015 (MATa URA3 HIS3 LEU2 trpl-289 MAL2-8C SUC2 sitio 1::ERG20, tHMGl, BTS1 ERG9 : : ERG9-KD TRP1 sitio 2::UGT2 sitio 3::CPS, KS, KO, KanMX, KAH, CPR, UGT1, UGT3, UGT4) . El esquema de la transformación realizada de la ruta de producción se ilustra en la Figura Ejemplo 17: Producción de RebD en la cepa STV015 La cepa de levadura de S. cerevisiae que contenia las modificaciones descritas en los Ejemplos 1, 2, 3, 4, 6 y 16, cepa STV015, se cultivó en YEP (Peptona Extracto de Levadura) con glucosa. Los matraces agitadores se incubaron a 30 grados C durante 7 días. Para extraer el producto de las células, se incubó caldo completo a 95 °C durante 15 minutos, se añadió acetonitrilo (equivalente a la mitad de volumen) , las muestras se mezclaron y se centrifugaron. Las muestras se diluyeron con acetonitrilo al 33 % cuando fuese apropiado. El RebA y el RebD de las muestras se analizó utilizando LC/MS. Como patrones se utilizaron RebA (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd) y RebD (ASB-00018229-010 , ChromaDex) . En la Figura 16 se ilustran los resultados.
E emplo 18 : Conversión enzimática de diterpenos en diterpenos glucosilados Cepa La cepa STV006 de Saccharomyces cerevisiae (véase el Ejemplo 6 anterior) se cultivó en medio adecuado que permitía la transcripción y la traducción activa de los genes introducidos. Las células obtenidas se sedimentaron y se conservaron a -20 °C hasta el análisis.
Preparación de Extracto Acelular A 8 g de sedimento celular de añadieron 40 mi de tampón Tris 100 mM pH 7,18 y se homogeneizó. Posteriormente se añadieron 8 g (50-200 um) de perlas de vidrio. Las muestras se enfriaron en hielo durante 15 minutos. Las células se rompieron por 4 ciclos de agitación vorticial de 2 min cada uno a velocidad completa seguido de 5 min de enfriamiento en hielo. Después de la lisis el extracto se centrifugó a 3000 g durante 60 min a 4 grados C. El sobrenadante obtenido se utilizó directamente para ensayos de actividad.
Preparación de Células Permeabilizadas Se homogeneizaron 8 g de sedimento reciente con 40 mi de DMSO al 40 % en tampón Tris (100 mM pH 7,8) y se congeló a -20 grados C. Antes del análisis las células se descongelaron y 5 mi se transfirieron a un tubo nuevo y se lavaron tres veces con tampón Tris 100 mM pH 7,18 que contenia glucosa al 0,1 %. Las células se centrifugaron cada vez mediante una centrifugación 3000 g. Finalmente, las células se resuspendieron en 5 mi de Tris 100 mM pH 7,18.
Ensayo enzimático de UDP-glucosiltransferasas Se añadieron 2,5 ul de la muestra enzimática (CFE, células permeabilizadas, enzima aislada o inmovilizada) a la mezcla de reacción que contenia: - Glucosa 0,05 (P/V; 5,55 mM) - UDP-Glc, 5 mM - DMSO, 2,5 (V/V) Como variables se añadieron diversos compuestos: - Fosfatasa alcalina - Lactalbúmina 10 ug/ml - Iones metálicos: Mn2+, Mg2+, Co2+, Cu2+, Zn2+ - Sustratos intermedios de Esteviol (todos disueltos en DSMQ) El volumen de reacción total fue de 100 ul y el ensayo se realizó en placas de microtitulación (PMT) calentadas a 30 grados C en una incubadora eppendorf para PMT. Las incubaciones se realizaron agitando al mismo tiempo a 800 rpm durante hasta 12 h. Las PMT se sellaron para impedir la contaminación y evaporación.
Análisis Las mezclas de reacción se centrifugaron a 4 grados C durante 20 minutos para detener la reacción enzimática y recoger las muestras. A 100 ul de muestra se añadieron 50 ul de acetonitrilo para detener completamente la reacción y extraer todas las moléculas formadas. Para ello, las PMT se sellaron y se agitaron enérgicamente. Posteriormente, las muestras se centrifugaron durante 60 minutos a 4 grados C y 100 ul se transfirieron a una nueva PMT para análisis LC-MS.
Incubaciones con Esteviol Se prepararon extractos acelulares como se ha descrito y se incubaron con cualquiera de 0, 30, 300, 3000 uM de esteviol. Las reacciones se realizaron durante 12 horas y se analizaron por LC-MS.
Tabla 18: Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando esteviol como sustrato con Mn2+ como ión metálico Tabla 19: Efecto de los iones metales sobre la glucosilación del esteviol. Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando esteviol como sustrato a 300 uM Incubaciones con Esteviósido Se prepararon extractos acelulares como se describe y se incubaron con cualquiera de 0 , 30 , 300 , 3000 uM de Esteviósido (RV0141-95, DAE Pyung Co. Ltd) . Las reacciones se realizaron durante 12 horas y se analizaron por LC-MS .
Tabla 20. Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando esteviósido como sustrato con Mn2+ como ión metálico.
Tabla 21: Efecto de iones metálicos sobre la glucosilación de esteviósido. Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando esteviósido como sustrato a 300 uM Incubaciones con Rebaudiósido A Se prepararon extractos acelulares como se describe y se incubaron con cualquiera de 0, 30, 300, 3000 uM de Rebaudiósido (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd Pureza RMN = 83,4 %). Las reacciones se realizaron durante 12 horas y se analizaron por LC-MS.
Tabla 22: Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando Rebaudiósido A como sustrato con n2+ como ión metálico Tabla 23: Efecto de iones metálicos sobre la glucosilación de Rebaudiósido. Glucósidos de esteviol ug/ml) utilizando Rebaudiósido como sustrato a 300 uM Incubaciones con Rebaudiósido B Se' prepararon células permeabilizadas como se describe y se incubaron con cualquiera de 0, 30, 300, 3000 uM de Rebaudiósido (RV0141-94, DAE Pyung Co. Ltd Pureza N R = 83,4 %) . Las reacciones se realizaron durante 12 horas y se analizaron por LC-MS.
Tabla 24: Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando Rebaudiósido B como sustrato con Mn2+ como ión metálico Tabla 25: Efecto de iones metálicos sobre la glucosilación de Rebaudiósido. Glucósidos de esteviol (en ug/ml) utilizando Rebaudiósido A como sustrato a 300 uM Ejemplo 19: Producción de diterpenos o diterpenos glucosilados por Sacchaxowycea cerevísíae 19.1 Construcción del hospedador recombinante para la producción de diterpenos o diterpenos glucosilados La construcción del hospedador recombinante para la construcción de diterpenos o diterpenos glucosilados, STV006, se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6. 19.2 Detección de rebaudiósido A A diferentes tiempos de fermentación, se retiraron alícuotas de los cultivos. El caldo de fermentación se trató con calor y acetonitrilo para extraer el RebA de las células.
La concentración del Rebaudiósido A (C44H70O23, Mmonoisotópico = 966,43079) se midió en el LC/MS como se describe más adelante. Para esta finalidad se acopló un sistema UHPLC a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo y el rebaudiósido A se detectó en modo MS/MS por la pérdida de una unidad de hexosa de la molécula protonada. Se utilizó una columna de amida BEH UPLC de Waters acquity (1,7 um, 2,1*150 mm) con elución isocrática. La fase móvil consistió en acetonitrilo/NH4Ac 10 mM en agua MilliQ (pH 6,8), (8:2 v/v) , a un caudal de 300 ul/min. El volumen de inyección era de 5 µ? y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 grados Celsius 19.3 Fermentación de diterpeno o diterpeno glucosilado La cepa de levadura STV006 construida como se ha descrito anteriormente, se cultivó en matraces agitadores (500 mi con medio 50 mi) durante 2 días a 30 °C y 280 rpm. El medio se basaba en Verduyn et al. (Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, 1992 Jul;8(7): 501-517), con modificaciones en las fuentes de carbono y nitrógeno, como se describe en la Tabla 26.
Tabla 26. Composición del medio de precultivo "Solución de oli oelementos bSolución de Vitaminas Posteriormente, 6 mi del contenido del matraz agitador se transfirieron a un fermentador (volumen de partida 0,3 1) , que contenia el medio como se expone en la Tabla 27.
Tabla 27. Composición del medio de fermentación El pH se controló a 5,0 añadiendo amoniaco (12,5 % en peso) . La temperatura se controló a 27 °C, 30 °C o 33 °C. El p02 se controló al 40 % ajustando la velocidad del agitador. La concentración de glucosa se mantuvo limitada por el suministro controlado en el fermentador.
Tabla 28. Composición del medio de alimentación de fermentación Tabla 29. Producción de RebA (mg/1) en el caldo de fermentación durante fermentación semicontinua a 27 °C, 30 °C y 33°C Los resultados expuestos en la Tabla 4 muestran que la fermentación de Saccharomyces cerevisiae recombinante a 27 °C da como resultado una producción más alta de RebA en comparación con la fermentación a la temperatura normal de 30 °C.
Tabla 1: Descripción del listado de secuencias Los id en color grisáceo están truncados on por tanto un fragmento del id UniProt mencionado.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES
1.- Un microorganismo recombinante que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican: un polipéptido que tiene actividad ent-copalil pirofosfato sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent-Kaureno sintasa; un polipéptido que tiene actividad ent- Kaureno oxidasa; y un polipéptido que tiene actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, por lo cual la expresión de la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviol.
2.- Un microorganismo recombinante según la reivindicación 1, caracterizado por que el microorganismo comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que tiene actividad UDP-glucosiltranferasa, por lo cual la expresión de la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos un esteviolmonósido, esteviolbiósido, esteviósido o rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, rubusósido, dulcósido A.
3. - Un microorganismo recombinante según la reivindicación 2, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la adición de una C-13-glucosa al esteviol, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviolmonósido .
4. - Un microorganismo recombinante según la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 de esteviol o esteviolmonósido, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviolbiósido .
5. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la adición de una C-19 glucosa al esteviolbiósido, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos esteviósido .
6. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 de esteviósido, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido A.
7. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido D.
8. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la glucosilación de esteviósido, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido E.
9. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado por que el microorganismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que puede catalizar la glucosilacion de rebaudiósido E, por lo cual la expresión de la secuencia de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir al menos rebaudiósido D.
10. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el microorganismo puede expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad NADPH-citocromo p450 reductasa.
11. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que puede expresar una o más de : a. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-copalil pirofosfato sintasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprenda: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent- copalil pirofosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 %, con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 18, 20, 60 o 62; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 %, con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 o 184; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, b. una secuencia de nucleótidos que codifique un ipéptido que tenga actividad ent-Kaureno sintasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprenda : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent- Kaureno sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 64 o 66; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 o 184; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ü); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, c. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent-Kaureno oxidasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprenda : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ent- Kaureno oxidasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 22, 24, 26, 68 u 86; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 o 186; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético; o d. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad ácido kaurenóico 13-hidroxilasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 28, 30, 32, 34, 70, 90, 92, 94, 96 o 98; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 o 185; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se híbrida con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético.
12.- Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, que pueda expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 de esteviol, caracterizado por que dicho nucleótido comprende : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 de esteviol, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 36, 38 o 72; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 35, 37, 71, 147, 168, 169, 189; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
13.- Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, que pueda expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 del esteviolmonósido, caracterizado por que dicho nucleótido comprende : i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-13 de esteviolmonósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
14.- Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, que puede expresar una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-19 de esteviolbiósido, caracterizado por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: v. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la adición de una glucosa en la posición C-19 de esteviolbiósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 40, 42, 44, 46, 48 o 74; vi. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 39, 41, 43, 45, 47, 73, 148, 170, 171, 172, 173, 174 o 190; vii . una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o viii. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
15.- Un microorganismo recombinante según una cualquiera e las reivindicaciones 2 a 14, que exprese una secuencia de ucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar a glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 e esteviósido, caracterizado por que dicha secuencia de ucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar la glucosilación del C-3' de la glucosa en la posición C-13 de esteviósido, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 50, 52 o 76; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 49, 51, 75, 149, 175, 176 o 191; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
16.- Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, que expresa una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar uno o más de: la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A a rebaudiósido D; la glucosilación de esteviósido a rebaudiósido E; o la glucosilación de rebaudiósido E a rebaudiósido D, caracterizado por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que pueda catalizar uno o más de: la glucosilación de esteviósido o rebaudiósido A a rebaudiósido D; la glucosilación de esteviósido a rebaudiósido E; o la glucosilación de rebaudiósido E a rebaudiósido D, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nos: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 o 192; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
17. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el microorganismo pertenece a uno de los géneros Saccharomyces , Aspergíllus, Pichia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula , Humicola , Tríchosporon , Brettanomyces , Pachysolen, Yarrowia , Yamadazyma o Escherichia .
18. - Un microorganismo recombinante según la reivindicación 17, caracterizado por que el microorganismo es una célula de Saccharomyces cerevisiae, una célula de Yarrowia lipolytica o una célula de Escherichia coli.
19. - Un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la capacidad del microorganismo para producir geranilgeranil difosfato (GGPP) está regulada positivamente.
20. - Un microorganismo recombinante según la reivindicación 19, que comprende una o más secuencias de nucleótidos que codifiquen hidroximetilglutaril-CoA reductasa, farnesil-pirofosfato sintetasa y geranilgeranil difosfato sintasa, por lo cual la expresión de la secuencia (o secuencias) de nucleótidos confiere al microorganismo la capacidad de producir niveles elevados de GGPP.
21. - Un microorganismo recombinante según la reivindicación 19 o 20, que puede expresar una o más de: a. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad hidroxilmetilglutaril- CoA reductasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad hidroxilmetilglutaril-CoA reductasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia- de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 80; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N° : 79; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético, b. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad farnesil pirofosfato sintasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad farnesil-pirofosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N° : 82; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 81; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii) ; o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético; o c. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad geranilgeranil difosfato sintasa, caracterizada por que dicha secuencia de nucleótidos comprende: i. una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido que tenga actividad geranilgeranil difosfato sintasa, comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 20 % con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 84; ii. una secuencia de nucleótidos que tenga una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 15 % con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N°: 83; iii. una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria se hibride con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i) o (ii); o iv. una secuencia de nucleótidos que difiera de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) , (ii) o (iii) debido a la degeneración del código genético .
22. - Un proceso para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado que comprende fermentar un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un medio de fermentación adecuado, y opcionalmente recuperar el diterpeno o diterpeno glucosilado.
23. - Un proceso para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado cuyo proceso comprende fermentar un microorganismo recombinante que puede producir un diterpeno o diterpeno glucosilado en un medio de fermentación adecuado a una temperatura de aproximadamente 29 °C o inferior, y opcionalmente recuperar el diterpeno o diterpeno glucosilado.
24. - Un proceso según la reivindicación 23 para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado, caracterizado por que la fermentación se realiza a una temperatura de aproximadamente 28 °C o inferior.
25. - Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado, caracterizado por que la fermentación se realiza a una temperatura de aproximadamente 27 °C o inferior.
26. - Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado, caracterizado por que la fermentación se realiza a una temperatura de aproximadamente 26 °C o inferior.
27. - Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado, caracterizado por que el microorganismo recombinante es un microorganismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
28. - Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27 para la preparación de un diterpeno o diterpeno glucosilado, caracterizado por que el proceso se realiza a escala industrial.
29. - Un caldo de fermentación que comprende un diterpeno o diterpeno glucosilado obtenible mediante el proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28.
30. - Un diterpeno o diterpeno glucosilado obtenido por un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28 u obtenible a partir de urt caldo de fermentación según la reivindicación 29.
31. - Un diterpeno o diterpeno glucosilado según la reivindicación 30 que es rebaudiósido A o rebaudiósido D.
32. - Un producto alimenticio, alimento o bebida que comprende un diterpeno o diterpeno glucosilado según la reivindicación 30 o 31.
33. - Un método para convertir un primer diterpeno glucosilado en un segundo diterpeno glucosilado, cuyo método comprende : poner en contacto dicho primer diterpeno glucosilado con un microorganismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, con un extracto acelular derivado de dicho microorganismo o con una preparación enzimática derivada de cualquiera de éstos, por lo cual el primer diterpeno glucosilado se convierte en el segundo diterpeno glucosilado.
34. - Un método según la reivindicación 33, caracterizado por que el segundo diterpeno glucosilado es rebaudiósido A o rebaudiósido D.
35. - Un método según la reivindicación 34, caracterizado por que el primer diterpeno glucosilado es rebaudiósido A y el segundo diterpeno glucosilado es rebaudiósido D.
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