CN1260251C - 一种调控赤霉素生成的转录因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控赤霉素GA合成的转录因子及其编码基因，以及该基因在促进植物的生长，增强植物对不良环境抵抗能力方面的应用。本发明所提供的转录调控因子命名为GPBF，是序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。调控GA合成的转录调控因子GPBF的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。本发明提供的基因对提高植物生长能力和增强植物对不良环境的抵抗能力具有重要的意义。

Description

一种调控赤霉素生成的转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种调控赤霉素(GA)合成的转录因子及其编码基因与应用，尤其是来源于玉米的转录调控因子及其编码基因与应用。

背景技术

赤霉素(GA)是具有内根-赤霉素烷环系统的四环二萜羧酸，内根-赤霉素烷环系统的结构经过不同的改变，就形成许多种GA。现在已知的GA有100余种，绝大部分存在于植物中，在被子植物、裸子植物、蕨类植物、藻类、真菌和细菌中都有发现。高等植物的各个部位都有GA，一般未成熟种子含有较多的GA，而在营养组织中含量较少。只有少数种类的GA具有生物活性，能在高等植物的整个生命周期起作用。

GA具有许多生理功能，影响种子的萌发、茎叶的伸长，控制着花、果、种子的发育等；植物也通过调节自身内源性GA的合成和含量而介导对外部环境的应答，在基因表达调控过程中起重要调节作用。例如，拟南芥ga-1基因的突变，使拟南芥体内的GA含量降低，导致矮生和花瓣雄蕊的发育异常，外施GA则可发育正常，

番茄GA突变体gib-1会导致雄性不育。研究表明GA在花粉母细胞的减数分裂过程中具有重要作用，可诱导许多特异基因的表达。因此，GA的生物合成调控对植物的生长发育和对环境的适应有着极其重要的作用(Hedden and Kamiya，1977)。

少数具有高生物活性的赤霉素(GA)的共同特点是具有19个C的碳环骨架，并在C3位具有羟基(GA1，GA3，GA4，GA7)或不饱和的C3(GA5)。GA的生物合成可分为三步：1)在内根-贝壳杉烯合成酶的作用下从牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)合成内根-贝壳杉烯；2)细胞色素P450催化内根-贝壳杉烯转变GA12醛；3)在双加氧酶的作用下GA12醛代谢成为具有不同生物活性的GA。

在植物的生长发育过程中，具有生物活性的GA在植物体内不同组织中的分布和含量受到精确的调节。一方面参与GA生物合成的相关基因受到严格的调控，如拟南芥GA1的启动子活性只表现在特定类型的组织细胞中(茎尖、根尖、花药和未成熟种子中)；但参与GA生物合成的其他相关基因在同一组织中的表达情况还需进一步研究(Yamaguchi and kamiya，2000)；另一方面，高含量的活性GA可以抑制GA的生物合成，促进GA的失活和降解，如拟南芥中的GA2β-羟化酶能够灭活活性GA，高水平的活性GA可诱导其表达；相反，高水平的活性GA抑制GA20氧化酶的表达(Thomas，1999)。总之，植物体内活性GA的水平是由合成和分解代谢协同调节的，GA的正负反馈调节使不同组织不同发育阶段的GA水平维持在一个特定的水平，控制植物的生长发育过程。

拟南芥ga3-1突变体是赤霉素应答的矮突变体，该突变体缺乏内根-贝壳杉烯氧化酶活性，进一步分析发现是由于该基因(GA3)的突变而导致GA的合成受阻(Chris A.Helliwell，1998，PNAS，45：9091-9024)。在其启动子区存在着一系列的顺式调控元件，对其表达起着重要的调控作用，如-580--550序列可与相应的调控因子相互作用，调控该基因的表达(Jutarou Fukazawa，2000，Plant Cell，12：901-915)。

发明内容

本发明目的在于提供一种调控赤霉素合成的转录因子及其编码基因。

本发明所提供的转录调控因子命名为GPBF因子(GA3 Promoter BindingProtein)，是具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

SEQ ID №：2由430个氨基酸残基组成。

调控GA合成的转录调控因子GPBF的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。

本发明的转录调控因子GPBF的编码基因(SEQ ID №：1)来源于玉米，由1560个碱基组成，推测的读码框为1293个碱基，是序列1自5’端第181到第1471位碱基。把克隆的GPBF因子的蛋白序列输入到GenBank中进行BLAST分析，结果表明GPBF因子属于bZIP类转录因子，与已报道的bZIP类转录因子相比，GPBF与它们之间的同源性都比较低，与来源于水稻的RF2a同源性相对最高，其DNA同源性为57.1％，蛋白同源性为51.9％。

本发明所克隆的GPBF基因产物不但在酵母体内具有GRE(GPBF Binding Element)结合功能，在体外也同样具有GRE结合功能，GPBF能够特异作用于含有核心元件序列CCA(N3-9)TTG的GRE顺式元件。

本发明所克隆的GPBF基因产物在酵母中具有转录激活功能，GPBF是具有GRE结合功能的转录因子。

本发明所克隆的GPBF基因在不同的逆境条件，如高盐、干旱、过氧化氢等条件下均可诱导其表达。

本发明所克隆的GPBF基因在种子萌发早期不表达，在芽萌发至0.5-1厘米时开始表达，之后在整个营养生长期间均有表达，且呈现动态变化。在授粉后的种子发育过程中，随着种子的发育其表达量开始升高，而后降低，在晚期则停止表达。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码调控GA生成的转录因子的基因导入植物细胞，可以促进植物的生长发育过程，并且也可以获得对各种逆境胁迫耐受力得到增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。本发明把GPBF基因构建到植物转化载体pBI121上，得到pBI121-GPBF质粒，将其转化到农杆菌LBA4404中，用农杆菌转化烟草和拟南芥并获得了转基因植株。把转基因植株与未转基因的野生型植株在相同条件下进行比较，结果表明，转GPBF基因植株的生长快，生长状态好，营养体生长明显优于对照植株，对不良环境的抵抗能力也有所提高。

由于GA在植物生长发育和增强抵抗力方面的重要影响，本发明所提供的GPBF基因在改良植物对不良环境抵抗能力和促进植物生长发育方面，特别是在培育生长快，抗逆性好，尤其是抗盐、抗旱的植物中具有重要的理论及现实意义。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详述，列举的实施例说明但不限制本发明。

附图说明

图1为不同处理的yG2酵母的表达情况

图2为非变性聚丙烯酰胺电泳

图3为不同处理的yG2酵母的表达情况

图4为PCR扩增后的电泳图谱

图5为RT-PCR电泳图谱

图6为RT-PCR电泳图谱

图7为GPBF转基因表达载体的构建图谱

图8为GPBF转基因拟南芥及对照在生长试验中的植株

图9为GPBF转基因拟南芥及对照在抗性试验中的植株

具体实施方式

实施例1：GPBF的克隆

1.材料的准备：

玉米材料：玉米选用齐319授粉后17天(17dpp)的幼胚。

菌种：大肠杆菌E.coli DH5α、JM109及酵母菌株yWAM2(Leu-，His-，Trp-)。

载体：pBSK+及pRS315、pPC86。

工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司，New EnglandBiolab公司和Gibco公司。

化学试剂：酵母培养用试剂均购自Sigma公司和Oxford公司；其它化学药品均为国产分析纯。

试剂盒：质粒DNA提取用Promega公司的WizardTM Minipreps DNA纯化系统和WizardTM Maxipreps DNA纯化系统；回收DNA用鼎国公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒；RNA提取用Promega公司的RNAgents Total RNA分离试剂盒和PolyATtractmRNA分离系统；文库构建用GibcoBRL公司生产的用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScriptTM质粒体系(Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningkit)。

引物合成：由北京赛百盛生物工程公司和上海博亚生物技术有限公司合成。测序：由上海博亚生物技术有限公司完成。

2.RNA的提取和mRNA的分离：

RNA的提取和mRNA的分离分别按Promega公司的RNAgents Total RNA分离试剂盒和PolyATtract mRNA分离系统进行。取玉米17dpp幼胚1g，提取总RNA 2.834mg，共分离出mRNA 43.7μg。

3.玉米幼胚17dpp cDNA文库的构建及扩增：

按GibcoBRL公司的用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScriptTM质粒体系进行，取出5μg 17dpp的mRNA用于cDNA文库构建，反转录引物用：

Not I adapt er：5’-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)₁₅-3’，

双链合成后加Sal I adapter：5’-TCGACCCACGCGTCCG-3’；

                               3’-GGGTGCGCAGGCp-5’；

再用Not I酶切，构建到经Sal I和Not I酶切纯化后的pPC86载体上(Trp+)。转化E.coli.DHl0B，得到库容量为5.2×10⁶ cfu的cDNA文库。

4.cDNA文库的扩增：

配2 x LB培养基4L(Bacto-Trypton 20g/L，Bacto-Yeast Extract 10g/L，NaCl10g/L，SeaPrep琼脂糖3g/L，pH 7.0)，121℃30min灭菌后，37℃温育2小时；加入氨苄青霉素至终浓度200mg/L；加入文库至10⁶cfu/L；混匀后，分装20-30mL到50mL的培养管中；置于冰上1小时；30℃培养40小时；8000rpm，10分钟，离心收集菌体；弃上清，加入200mL 2 x LB(含甘油12.5％)悬浮细胞，分装成10mL一份于-70℃保存备用。

5.2mer GRE诱饵载体及2mer mutant GRE(mGRE)挽救载体的构建

合成GRE(+)：5’-ctagagctcaat cca act tgg aaa atg gtc aat cca act tgg aaaatg g和GRE(-)：5’-gatcc cat ttt cca agt tgg att gac cat ttt cca agt tggattgagct，各取20μL(1μg/μL)的GRE(+)和GRE(-)，混匀，加4μL 3M的NaOAc和100μL的无水乙醇，-20℃，30分钟后离心沉淀DNA，70％乙醇洗一次，干燥，加6.5μL无菌水，1μL 10x的T4多聚核苷酸激酶缓冲液(polynucleotide kinasebuffer)，退火：条件是88℃，2’；65℃，10’；37℃，10’；25℃；5’，加1.5μL 20mM的ATP和1μL T4多聚核苷酸激活酶(polynucleotide kinase)，37℃反应2小时，加酚氯仿和氯仿各抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA。pRS315His(Leu+)载体用BamH I、Xba I双切后纯化，把GRE克隆到pRS315His，得到诱饵载体pRSG2(Leu+)。同样的方法，合成mGRE(+)：5’-ctagagctcaat ttg act cag aaa atg gtc aat ttg act cag aaaatg g和mGRE(-)：5’-gatcc cat ttt ctg agt caa att gac cat ttt ctg agt caaattgagct，构建到pRS315His上，获得pRSmG2质粒。

6.玉米幼胚17dpp cDNA文库的筛选：

制备yWAM2感受态细胞，把pRSG2转化到酵母菌株yWAM2(Leu-，His-，Trp-)中，转化方法参照酵母双杂交体系TRAFO体系(Two Hybrid System TRAFO Protocol)进行。获得含有pRSG2的酵母菌株yG2(His-，Trp-)。用含有诱饵载体的yG2酵母对文库进行筛选，转化方法同上，将转化细胞涂到His-合成培养基上，28℃培养3-5天。待酵母长出后，提酵母质粒，提取方法参照Method I：Quick Plasmid DNAPreparations from Yeast(Christine Guthrie 1991)。将酵母质粒转化E.Coli DH5α，在从中提取质粒，酶切分析，测序可知所获得的阳性克隆的DNA序列，再对序列进行分析。

7.GPBF全长cDNA序列的获得：

采用5’RACE的方法得到了GPBF基因的全长cDNA序列，按GibcoBRL公司提供的快速扩增cDNA的5’RACE方法，2.0版本(5’RACE System for Rapid Amplificationof cDNA Ends，Version2.0 kit)进行操作。用于反转录的引物：GPBF rv2：5’5’cca acg gat aaa aca act gtt-3’；扩增条件是：PCR：94℃，3分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟；72℃，5分钟；35个循环。把扩增出DNA片段从琼脂糖胶中回收并连接到pGEM-T easy vector，转化E.coli.JM109，酶切鉴定后测序，获得GPBF基因的全长cDNA序列(序列表中序列1)，根据cDNA序列推测出其蛋白序列(序列表中序列2)。

实施例2.GPBF与GRE体内和体外的结合功能分析；

1.GPBF与GRE在酵母体内结合功能分析：把筛库得到的GPBF质粒分别转化yG2和ymG2酵母，28℃在His-合成培养基上培养3-5天，只有用GPBF质粒转化的yG2酵母能够生长，而GPBF转化的ymG2酵母不能够生长，说明GPBF在酵母体内能够特异结合GRE元件，激活了报告基因HIS3的表达，故能够在His-合成培养基上生长(图1中的B)，相反由于GPBF不能与mGRE结合，不能激活报告基因组氨酸脱氢酶(His+)的表达，在His-合成培养基上也不能生长(图1中的A)，因此，GPBF在酵母体内具有GRE结合功能。

2.GPBF的GRE体外结合特异性分析(EMSA实验)：

GPBF蛋白的纯化：把GPBF的全长基因克隆到pGEX4T-1原核表达载体上，将克隆到pGEX4T-1载体上的GPBF转化到BL21菌株中，用37℃，0.3mM IPTG诱导表达2-3小时，SDS-PAGE电泳，有特异的GPBF表达条带。GPBF蛋白纯化的操作方法按照Pharmacia公司的MicroSpin^TM GSTPurification ModuLe protocol进行，纯化的蛋白用于EMSA实验。

同位素标记GRE和mGRE：采用Promega公司的DNA 5’末端标记系统(End-Labeling System)，反应体系是：GRE(或mGRE)1μL，T4PNK 10×缓冲剂5μL，γ-32P-ATP 3μL，T4PNK(10U/μL)2μL，H2O 39μL；37℃ 20分钟；加2μL 0.5M EDTA，68℃10分钟灭活；37℃10分钟；4℃保存备用。

GPBF蛋白与DNA结合反应体系：5×混合缓冲液(binding buffer)(125mMHEPES-KOH ph7.6；50％甘油；250mM KCl)4μL；GPBF和GST蛋白各约4μg(9μL)；1M DTT 1μL；上述标记的GRE(或mGRE)探针1μL；H2O 4μL；冰上结合30分钟，加3μL上样缓冲液(含0.025％溴酚蓝的无菌水)，进行聚丙烯酰胺电泳分析。

非变性聚丙烯酰胺电泳：配制聚丙烯酰胺胶(5.4％)：30％丙烯酰胺9ml；10×电泳缓冲液5ml(甘氨酸142.7g/L，EDTA 3.92g/L，Tris 30.28g/L)；50％甘油2.5ml；去离子水33ml；10％APS 400μL；TEMED 25μL。待胶凝后，用1×电泳缓冲液电泳，预电泳10分钟(300V)；上样，电泳1小时(300V)；用滤纸粘下胶，保鲜膜封好后，压X光片1小时；洗片，显影2分钟，定影5分钟。结果表明有明显的被GPBF蛋白阻滞GRE的电泳条带(图2)，相反，mGRE则不被阻滞，说明GPBF基因产物在体外同样具有GRE结合功能。

实施例3.酵母细胞中转录激活试验

把GPBF和YepGAP(Trp+)用Sal I和Not I双切、回收连接，转化E.coli DH5α；得到含有GPBP基因全长cDNA的酵母表达载体Yep-GAPGPBF质粒，将其转化到yG2和ymG2酵母中，在His-合成培养基上28℃培养3-5天，结果表明用YepGAP-GPBF质粒转化的yG2能够生长(图3中的B)，而ymG2不能生长(图3中的A)，因此GPBF在酵母细胞内不但具有GRE结合功能，而且具有转录激活功能。

实施例4.GPBF在非生物逆境条件下的表达分析

1.玉米材料的处理：取玉米种子，吸胀24小时，种植于花盆中，28℃，12hr后光照培养约20天，待长出三叶一芯，进行不同条件的处理。

1).冷害处理：将玉米苗置于2℃培养箱，12小时，光照培养48小时，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

2).盐渍处理：分别将玉米苗置于0.6％，0.8％，1％的NaCl溶液中，12小时，光照培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

3).干旱处理：分别将玉米苗置于含水量为8％(混和920g干土和80mL水)，10％，13％的土壤中12小时，光照培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

4).ABA处理：分别将玉米苗置于10-4M、10-5M、10-6M的ABA溶液中(取5mgABA用0.1N KOH溶解后，定容至95mL水中即为10-4M)，12小时，光照培养24小时，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

5).H₂O₂处理：分别将玉米苗置于10mM H₂O₂(1.13mL 30％H₂O₂/L)，60mM H₂O₂(6.78mL30％ H₂O₂/L)，150mM H₂O₂(14.95mL 30％ H₂O₂/L)的水溶液中，12小时，光照培养24小时，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

6).水处理：将玉米苗直接置于水中12小时，光照培养24小时，-80℃冻存。

7).对照的处理：直接取未经任何处理的苗-80℃冻存作为对照。

2.RNA的提取及DNA的去除：

1).取约200mg处理的玉米材料，液氮研磨，提取RNA的方法按照Promega公司的RNAgents Total RNA分离系统进行。

2).将RNA溶于85μL水中，加入10X缓冲剂10μL和5μL RQl RNA Free DNase(1U/μL)，37℃，15min，以去除DNA的污染。

3).加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，70％的乙醇洗一次，溶于50μL的水中。

4).定量RNA的浓度为1μg/μL。

3.RT-PCR：

取Oligo dT181μL(0.5μg/μL)，RNA 5μL(1μg/μL)，dNTP 1μL(10mM)，水27μL；65℃，5分钟；0℃，2分钟；加入5×缓冲剂10μL，DTT(100mM)5μL，RNase抑制剂10U(40U/μL)；42℃，2~5min；加入SuperScipt II 1μL(200u/μL)；42℃，50分钟；70℃，15分钟灭活，备用。

模板cDNA的相对定量及内标引物的设计：根据GenBank上登录的玉米肌动蛋白基因(Maize Actinl gene：Accession NO.J01238)设计如下引物；

mAct1F：5’-CAC CTT CTA CAA CGA GCT CCG-3’

mAct1R：5’-TAA TCA AGG GCA ACG TAG GCA-3’

用该引物进行扩增，如果是cDNA可扩增出405bp的条带，如果是基因组DNA可扩增出512bp的条带(有107bp的内含子)。

PCR反应体系：模板1μL，2X PCR buffer 10μL，10mM dNTP 1μL，10μM mAct1F 1μL，10μM mAct1 R 1μL，Taq 1U，灭菌水6μL。

PCR条件：94℃，2分钟；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒；30个循环；72℃，5分钟。

根据PCR产物的电泳结果对模板DNA进行稀释，调整模板DNA的用量，直到用mAct1 F和mAct1 R引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。

4.GPBF基因的PCR扩增。

GPBF，设计PCR扩增的引物如下(扩增660bp)：

F1：5’-ACT TTC CTA CCC GGA GCA CC

R1：5’-TCA GTG TGT CGT TCA AAG CAT C

PCR体系：模板1μL，2X PCR buffer 10μL，10m MdNTP 1μL，10uM mAct1 F 1μL，10uM mAct1 R 1μL，Taq 1U，灭菌水6μL。

PCR条件：94℃，2分钟；94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，50秒；30个循环；72℃，5分钟。图中，A：CKl；B：1％NaCl；C：0.8％NaCl；D：0.6％NaCl；E：150mMH₂O₂；F：60mM H₂O₂；G：10mM H₂O₂；H：H₂O；I：13％H₂O；J：10％H₂O；K：8％H₂O；L：10-6M ABA；M：10-5M ABA；N：10-4M ABA；0：4℃；P：CK₂。电泳结果表明GPBF基因在盐渍(图4，C)、干旱(图4，K)、过氧化氢(图4，F)等逆境条件的诱导下会表达。

5.GPBF在种子发育和种子萌发过程中的表达分析

分别取授粉后A：15天、B：17天、C：21天、D：23天、E：25天的玉米穗，分离幼胚，立即冻存于-80℃备用。

RNA的分离提取及RT-PCR方法同上，结果表明GPBF在授粉后15天的胚中就有表达，21天时达到高峰，然后逐渐下降(图5)。

6.GPBF在种子萌发过程中的表达分析

分别取玉米萌发后A：0.2cm、B：0.5cm、C：2cm、D：5cm、E：1片叶、F：1.5片叶、G：2片叶、H：1.5片叶、I：3片叶等不同时期的幼苗，立即冻存于-80℃备用。

RNA的分离提取及RT-PCR方法同上，结果表明，在种子萌发初期，检测不到GPBF的表达，在芽萌发到约2厘米时可检测到GPBF的表达，且在玉米生长过程中呈现动态变化(图6)。

实施例5.GPBF基因的拟南芥转化

载体构建及农杆菌转化：把GPBF用Sma I、Ecl136II酶切，回收目的片段；载体pBI121用Sma I和Ecl136II酶切，纯化回收相应大小的片段，连接(图7)，转化JM109，提质粒，酶切鉴定，挑出所需克隆，测序，获得pBI121-GPBF克隆，并将其转化到农杆菌LBA4404中。

拟南芥转化：

1).拟南芥的培养。拟南芥种子在4℃进行2-3天的春化处理，每盆播种7~10粒种子(营养土和蛭石按2∶1)；放于温室中培养(22℃，光照16h)；待拟南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少数开始结荚时，可用于转化。

2).农杆菌的培养。挑农杆菌单菌落接种在3mlYEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)，28℃，250rpm培养30小时；按1∶400转接入200ml新鲜的YEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，250rpm培养约14小时，测OD60约为1.5；7500rpm，4℃，10分钟离心收集菌体；重悬菌体于二倍体积(400mL)的渗透液(1/2MS盐+5％蔗糖，pH5.7，121℃，15分钟灭菌；用之前加6-BA至终浓度为0.044uM，VB6终浓度为1mg/L，VB1终浓度为10mg/L，SILWET 0.02％。

3).转化。把拟南芥的花蕾浸入渗透液中，抽真空(25 IN Hg，保持5分钟)；转化完毕后，花盆外套上塑料袋，水平放置，使其在低光强度下生长24-48小时后，即可正常培养。

4).收集种子，进行筛选。称25-30mg种子放入1.5mL离心管，加1mL 75％的乙醇(含0.05％ Tween 20)，于摇床上摇10分钟(300rpm)，离心，去上清；加1ml 95％的乙醇洗一次，离心，去上清；重复一次；在超净台中加0.3ml的100％乙醇，移到无菌滤纸上，吹干；把吹干的种子撒到1/2MS平板(Kan50mg/L)上；4℃，放2天后，22℃，16小时光照培养；将阳性植株(T0代)移栽到盆中培养，并收集种子进行T1代筛选。

转基因拟南芥基因组DNA的提取：

1).在液氮中研磨0.1-0.2g植物叶片，转移至1.5ml离心管中。

2).加入0.7ml CTAB(Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巯基乙醇0.1％)，60℃，30分钟。每隔10分钟，颠倒一次。

3).加0.7ml酚∶氯仿(1∶1)，颠倒几次，10000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm离心5分钟。转移上清至一新的离心管。

4).加等体积的异丙醇，颠倒混匀，10000rpm离心10分钟，除去上清，70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。

转基因拟南芥PCR检测：

正向引物：35S promoter：5’-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA

反向引物：GPBF rv1：5’-TCA GTG TGT CGT TCA AAG CAT C

反应体系(20μL)：转基因植株DNA 1μL(20ng-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；dNTP(2.5mM)2μL；引物各加10μM；加无菌水至20μL。

反应条件：94℃，5分钟；94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，45秒；35个循环；72℃延伸5分钟。筛选出PCR阳性植株。

GPBF转基因植株的生理分析实验：

1).生长率实验：把转基因植株种子与未转基因种子在同样的条件下种植于1/2MS浸泡过的蛭石中，22℃，连续光照培养，观察其生长，结果表明GPBF能够明显提高植株的生长速度和生长率(图8)。

2).对不良环境的抗性实验；把转基因植株与未转基因植株种植于营养成分不同的土壤中，22℃，连续光照培养，结果表明转GPBF基因植株在不良环境中的生长状况优于未转基因植株(图9)。

                                     序列表

<160>2

<210>1

<211>1560

<212>DNA

<213>玉蜀黍属玉米(Zea mays L.)

<400>1

cccgggctct tctcatttcc tctcggttct gctcggtggc aacccagcgc gtagatctta      60

ttcttggacg agaattctcc tcaagttctc ggatttctgt ttttgtgccg cttagcaatt     120

caaccccgaa attcttttgc ggcgcagtct tcacccgaat cttgggtcgt agccaagaag     180

atgaacaagg ataaggctcc gatgccggga gacggcgacc ccagcgacgg cttgccgccg     240

cagtccacgc gccgtgccgg ggcgccgccc tcgtcgtcga ccccgccgcg ggagtacgac     300

atcagccgca tgccggactt tcctacccgg agcaccggcc accggcgtgc gcactccgag     360

atcctgggcc tccccgacga cctcgacctc agcgcccctg gaggcggcga cggaccgtcg     420

ctgtcggacg agaacgacga ggagctcttc tctatgttcc ttgatgtgga caagctgaac     480

tcatcgtgcg gggcgtcgtc ggaggccgag gctgagtcct cgtccgttgc ggatggcgtc     540

ggtgaggggg ctgagttggg ccacgcgccc aggccaaggc atcagcacag ccagtccatg     600

gatgagtcca tgtcgatcaa ggcggaacag ctggtggggg agcaggggat ggaggggatg     660

tcgtctgcag aggccaagaa agcagtctct gcggcgaaac tggctgagct tgctcttgtt     720

gacccaaaga gggctaaaag gatttgggct aatagacaat ctgctgcaag atcaaaggaa     780

aggaagatgc gatatattgc tgaactcgag cgcaaggtgc aaaccctcca aacagaagcc     840

acaacattgt cagctcagct aacattgctg cagagagaca ccactgggct aacaaccgag     900

aacagtgagc tgaagattcg cctgcagacc atggaacggc aagtccactt acaagatgct     960

ttgaacgaca cactgaaagc tgaaggtcca ccggctgaag gtggcaaaca agggccaggg    1020

gccggcccaa tgggtggtgg aggcataatg aatgaaactt tttggcgcca tgccacgcgc    1080

gtttggagga ggcaaccagc agatgttcca cagcagccag agccaagcga tgcaatccat    1140

gctggcgacg caccagctgc agcagctcca gctccactcc cagcctcagc agcagcagct    1200

gcaggcgcag catctccagc aggcggcgag agacctcaaa atgaaagggc atctgggcgc    1260

ccaaggccag tggggcggtg ggaagtctgg gagcagcggc agctgagcct actggcactg    1320

gagttttggt gtatgtggtg ttactggtta gctaggagtg gagaacccct tgttctcggg    1380

gggggggggg gggggggctg ccgtccatgt gtacttaccg ttagctcggg ctatctatct    1440

acaagctcag ttcagcttca gttttactgt taactcggtg gctcagctct cctgcagcgt    1500

actgtctcca gaaactcgga tggtaacagt tgttttatcc gttggaaaaa aaaaaaaaaa    1560

<210>2

<211>430

<212>PRT

<213>玉蜀黍属玉米(Zea mays L.)

<400>2

Met Asn Lys Asp Lys Ala Pro Met Pro Gly Asp Gly Asp Pro Ser Asp

1               5                   10                  15

Gly Leu Pro Pro Gln Ser Thr Arg Arg Ala Gly Ala Pro Pro Ser Ser

            20                  25                  30

Ser Thr Pro Pro Arg Glu Tyr Asp Ile Ser Arg Met Pro Asp Phe Pro

        35                  40                  45

Thr Arg Ser Thr Gly His Arg Arg Ala His Ser Glu Ile Leu Gly Leu

    50                  55                  60

Pro Asp Asp Leu Asp Leu Ser Ala Pro Gly Gly Gly Asp Gly Pro Ser

65                  70                  75                  80

Leu Ser Asp Glu Asn Asp Glu Glu Leu Phe Ser Met Phe Leu Asp Val

                85                  90                  95

Asp Lys Leu Asn Ser Ser Cys Gly Ala Ser Ser Glu Ala Glu Ala Glu

            100                  105                  110

Ser Ser Ser Val Ala Asp Gly Val Gly Glu Gly Ala Glu Leu Gly His

        115                  120                  125

Ala Pro Arg Pro Arg His Gln His Ser Gln Ser Met Asp Glu Ser Met

    130                  135                  140

Ser Ile Lys Ala Glu Gln Leu Val Gly Glu Gln Gly Met Glu Gly Met

145                 150                 155                 160

Ser Ser Ala Glu Ala Lys Lys Ala Val Ser Ala Ala Lys Leu Ala Glu

                165                 170                 175

Leu Ala Leu Val Asp Pro Lys Arg Ala Lys Arg Ile Trp Ala Asn Arg

            180                 185                 190

Gln Ser Ala Ala Arg Ser Lys Glu Arg Lys Met Arg Tyr Ile Ala Glu

        195                 200                 205

Leu Glu Arg Lys Val Gln Thr Leu Gln Thr Glu Ala Thr Thr Leu Ser

    210                 215                 220

Ala Gln Leu Thr Leu Leu Gln Arg Asp Thr Thr Gly Leu Thr Thr Glu

225                 230                 235                 240

Asn Ser Glu Leu Lys Ile Arg Leu Gln Thr Met Glu Arg Gln Val His

                245                 250                 255

Leu Gln Asp Ala Leu Asn Asp Thr Leu Lys Ala Glu Gly Pro Pro Ala

            260                 265                 270

Glu Gly Gly Lys Gln Gly Pro Gly Ala Gly Pro Met Gly Gly Gly Gly

        275                 280                 285

Ile Met Asn Glu Thr Phe Trp Arg His Ala Thr Arg Val Trp Arg Arg

    290                 295                 300

Gln Pro Ala Asp Val Pro Gln Gln Pro Glu Pro Ser Asp Ala Ile His

305                 3l0                 315                 320

Ala Gly Asp Ala Pro Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Leu Pro Ala Ser

                325                 330                 335

Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ser Pro Ala Gly Gly Glu Arg Pro

            340                 345                 350

Gln Asn Glu Arg Ala Ser Gly Arg Pro Arg Pro Val Gly Arg Trp Glu

        355                 360                 365

Val Trp Glu Gln Arg Gln Leu Ser Leu Leu Ala Leu Glu Phe Trp Cys

    370                 375                 380

Met Trp Cys Tyr Trp Leu Ala Arg Ser Gly Glu Pro Leu Val Leu Gly

385                 390                 395                 400

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Arg Pro Cys Val Leu Thr Val Ser Ser

                405                 410                 415

Gly Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Val Gln Leu Gln Phe Tyr Cys

            420                 425                 430

Claims (8)

1、一种调控赤霉素合成的转录因子GPBF，是序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列。

2、调控GA合成的转录因子GPBF的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述的转录因子的编码基因是序列表中SEQ ID №：1。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：该基因的读码框为序列1中自5’端第181到第1471碱基。

5、含有权利要求2所述编码基因的表达载体。

6、含有权利要求5所述表达载体的细胞系。

7、权利要求2所述的编码基因在改良植物对不良环境抵抗能力方面的应用。

8、权利要求2所述的编码基因在促进植物生长发育方面的应用。

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