CN104745543A - 桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用 - Google Patents

桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用 Download PDF

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Abstract

桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用，所述基因、蛋白的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA、SA胁迫。所述植物为桑树(Morus multicaulis)。本发明技术方案可以标识植物是否处于干旱、高盐ABA、SA等生长环境。

Description

桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及到一种桑树贝壳杉烯氧化酶基因克隆和其在胁迫条件下的表达应用。
背景技术
在植物的生长过程中植物激素的作用是十分重要的，赤霉素(GA)是众多重要的植物激素之一。赤霉素影响着高等植物生活史的各个阶段，如种子萌发，茎的伸长，花器官的诱导和发育以及种子和果实的形成。GA与植物的伸长生长密不可分，当GA的生物台成途径或感受途径发生阻塞之后，植物就会发生矮化，其矮化的程度取决于受阻步骤在途径中的先后位置。如受阻部位发生在合成途径较早的KO(贝壳杉烯氧化酶)或KS(贝壳杉烯合成酶)位点上，得到的植株将是极其矮化的类型，并可能不育(不开花或者不能形成果实)：若受阻部位发生在合成途径较晚的步骤上时.则会得到半矮化的植株.植株的矮化与果树的产量和品质息息相关.
牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)是合成赤霉素(GA)的前体。GGPP在古巴焦磷酸合成酶(GPS)和贝壳杉烯合成酶(KS)催化下环化为赤霉素的前身贝壳杉烯。贝壳杉烯的C-19的甲基在KO催化下不断被氧化，分别形成贝壳杉烯醇、贝壳杉烯醛和贝壳杉烯酸。贝壳杉烯酸再次分支，形成3种产物，一种是GA12-醛，它是GA的最初产物。GGPP在古巴焦磷酸合成酶(GPS)和贝壳杉烯合成酶(KS)催化下环化为赤霉素的前身贝壳杉烯。贝壳杉烯的C-19的甲基在KO催化下不断被氧化，分别形成贝壳杉烯醇、贝壳杉烯醛和贝壳杉烯酸。贝壳杉烯酸再次分支，形成3种产物，一种是GA12-醛，它是GA的最初产物。
因此KO是赤霉素生物合成途径中的关键酶，位于早期未分支的合成步骤上，催化3步氧化反应，即由贝壳杉烯氧化成贝壳杉烯醇，继而形成贝壳杉烯醛，再被氧化成贝壳杉烯酸，这是一系列的单加氧过程，此酶属于膜结合的依赖细胞色素P450和NADPH的单加氧酶。KO是新类型的P450酶。所有高等植物含有贝壳杉烯氧化酶(KO)，同时也是细胞色素P450(CYP)701家族成员(本专利实验结果在线软件分析验证得知)
P450是一类以还原态与CO结台后在波长450nm处有吸收蜂的含血红素的单链蛋白质。因为P450酶系在生物体中具有重要的功能，对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用，而受到广泛的重视。
近年来进一步的研究表明，贝壳杉烯氧化酶基因在赤霉素的合成中起到重要的作用，参与高等植物的氧化代谢与合成，但目前关于KO基因是否参与植物的环境胁迫反应还不清楚。
我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价值、药用价值、经济价值等。我们用已克隆得到的鲁桑品种(Morus multicaulis)育71-1MKO基因全长序列。通过生物信息学分析其序列特征。同时，利用荧光定量PCR的方法检测了MKO在干旱、盐、ABA、SA胁迫条件下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研究，使我们从分子水平了解到桑树KO基因在不同胁迫条件下的表达情况
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用，可以用于桑树中的贝壳杉烯氧化酶基因在环境胁迫下的表达调控。
技术方案：桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO，序列如SEQ ID NO.2所示。
编码桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
上述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。
上述编码桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。
所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA或SA胁迫。
所述植物为桑树(Morus multicaulis)。
有益效果：贝壳杉烯氧化酶是赤霉素生物合成途径中的关键酶，位于早期未分支的合成步骤上，催化3步氧化反应，即由贝壳杉烯氧化成贝壳杉烯醇，继而形成贝壳杉烯醛，再被氧化成贝壳杉烯酸，这是一系列的单加氧过程，此酶属于膜结合的依赖细胞色素P450和NADPH的单加氧酶。KO是新类型的P450酶。所有高等植物含有贝壳杉烯氧化酶(KO)，同时也是细胞色素P450(CYP)701家族成员。在植物的种子萌发，茎的伸长，花器官的诱导和发育以及种子和果实的形成发挥重要的作用。同时同为P450酶系，在生物体中具有重要的功能，对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用。本发明所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO，完善桑树基因组同时提供了桑树贝壳杉烯氧化酶在非生物胁迫条件的表达分析和应用。
附图说明
图1为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的ORF扩增结果图；M.2000bp DNA分子标记1.RT-PCR产物；
图2为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的3’-RACE扩增结果图；5′RACE扩增结果：M.2000bp DNA分子标记；1PCR扩增产物；
图3为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因推导的氨基酸序列保守区预测软件截图；
图4为定量RT-PCR检测MmKO基因在盐胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对照，2.盐处理6小时，3.盐处理12小时，4.盐处理1天，5.盐处理2天，6.盐处理4天，7.盐处理16天；每组数据左侧为盐实验处理组，右侧为对照组；
图5为定量RT-PCR检测MmKO基因在干旱胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对照，2.干旱处理2d，3.干旱处理4d，4.干旱处理8d，5.干旱处理10d，6.干旱处理16d；每组数据左侧为干旱实验处理组，右侧为对照组；
图6为定量RT-PCR检测MmKO基因在ABA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对照，2.ABA处理1小时，3.ABA处理2小时，4.ABA处理4小时，5.ABA处理6小时，6.ABA处理8小时，7.ABA处理10小时，8.ABA处理1天，9.ABA处理2天，10.ABA处理3天；每组数据左侧为ABA实验处理组，右侧为对照组；
图7为定量RT-PCR检测MmKO基因在SA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对照，2.SA处理1小时，3.SA处理2小时，4.SA处理4小时，5.SA处理6小时，6.SA处理8小时，7.SA处理10小时，8.SA处理1天，9.SA处理2天，10.SA处理3天；每组数据左侧为SA实验处理组，右侧为对照组。
具体实施方式
实施例1桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的克隆
供试桑树品种为保存于中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃的育71-1。利用已获得的包含桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因cDNA片段的ESTs序列，设计引物，并加以验证，引物序列如下：
MmKO-F：5′-ATTATTTGTTGTCCGAAGC-3′；
MmKO-R：5′-ACAGTCCTGCCGTTTTG-3′；
根据已克隆并验证的基因中间片段结果，设计3′RACE扩增所需目的基因的上游特异性引物，引物序列如下：
GSP1：5′-TGTGGATTATTTGTTGTCCGAAGC-3′
根据已克隆3′RACE产物验证序列结果，设计5RACE扩增所需目的基因的下游特异性引物，引物序列如下：
GSP2：5′-GTTCGTACATTGCCCATTCTGTCGTG-3′
根据已获得的基因全长序列设计进行荧光定量分析的引物，引物序列如下：
qMmKO-F：5′-ACTACTTTGGTCACGACAGAATGGGC-3′
qMmKO-R：5′-GCATCCTCCTAATTGGGTGTCTTCGT-3′
根据NCBI上查找的在桑树中稳定表达的β-actin基因(GeneBank登录号：DQ785808)序列设计内参基因的上下游引物，上游引物序列β-actin-F为5′-AGCAACTGGGATGACATGGAGA-3′，下游引物序列β-actin-R为5′-CGACCACTGGCGTAAAGGGA-3′。
桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因中间cDNA片段的克隆
以合成的cDNA第1链为模板，利用上述设计的RPS3a-F和RPS3a-R为引物进行RT-PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃40s，72℃1min，循环35次；72℃延伸10min；保存4℃。取3μL的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的大小，检测目的片段大小与预测大小是否相符(图1)。符合后取45μLRT-PCR产物用TAE缓冲液制作的1％琼脂糖凝胶进行电泳，采用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification Kit试剂盒进行目的片段的胶回收和纯化。目的片段用DNA连接酶与pMDTM18-T载体连接。连接产物转化到宿主菌E.coli TOP10菌株感受态细胞，涂布于在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体平板上。挑取单菌落白斑培养后送样测序，测序结果blast分析并与EST原始序列比对验证。
桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因全长的扩增
根据已获得的桑树MmKO基因的中间cDNA片段序列，经同源比对发现其没有完整的5′端也没有完整的3′端。根据所获得的序列设计引物进行3′-RACE扩增。
目的基因的完整3′端克隆以试剂盒通用引物3′外侧引物为正向引物，PCR反应体系如下：5μL10×Buffer，0.5μL dNTP，1μL cDNA模板，引物各1μL，0.5μL rTaq酶，最后用无菌双蒸水补充体系到50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃40s，58℃40s，72℃1min，循环40次；72℃延伸10min；保存4℃。
检测目的片段大小(图2)，胶回收扩增产物，将目的片段用DNA连接酶与pMDTM18-T载体连接。连接产物转化到宿主菌E.coli TOP10菌株感受态细胞，涂布于在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体平板上。挑取单菌落白斑培养后送样，由生工生物工程(上海)有限公司完成测序，测序结果进行blast分析，拼接获得基因全长序列。
桑树MmKO基因序列全长SEQ ID NO.1：
TAGAACACTTTTAGTACTATATGTATGTCTAAATTGATCACACCATGTAAATCGCGGCCACGGCACATATCCTCGAAGGTTTTCAAGGAACGCCCTTTGCCACCACTGCGGCTATTGGTGGTCTTTCTTTGTTGTTGTTTTTATCGCTCAGAAAATGCATCTTTGCAAAAAGGAGTGGATTCTCCAAACTCCCTCCTGTCCCAGTTGTTCCGGGGCTGCCGGTGATAGGGAATTTGCTACAACTGAAGGAGAAGAAACCTTACAAGACGTTCACCAAATGGGCCAAGACTTATGGGCCCATATACTCCATCAGAACTGGTGCTTCTACTCTTGTTGTTCTAAATACTGCCGAAGTTGCCAAGGAGGCGATGGTGACAAGGTTTTCATCAATATCAACAAGAAAGCTGTCAAACGCACTAACAATGCTTACTTTTGATAAATGTATGGTTGCGACAAGTGATTACAATGATTTCCATAAGATGGTCAAACGTTACATTCTCACAAATGTTCTTGGACCCAATGCTCAGAAAAAACACCGTTGCCACAGAGACGCTATGGCAGAAAATATTTCAAAGCGATTTCATGCTTATGTTAAGGACTTCCCTGGTGAAGCCGTGAATTTCAGGACAATTTTCCAGTCTGAACTATTTGGACTAGCGTTGAAACAAGCCATAGGAAAGGACATAGAATCAATATATGTGGAGGAGTTGGGAGGGAAGTTGTCAAGAGAAGAGATGCTTAAGGTTCTAGTGACTGATTTAATGGAGGGTGCTATTGAGGTCGACTGGAGAGACTTCTTCCCATATCTGAAATGGGTTCCTAACAACACCATCGAAAACAAGATTCGGAGAATGATTTTCCGAAAGCAAGCAGTCATGAATGCCATTATTAAGGAGCAAAAAAAGCGAATTGCTTCAGGAGAGGAGTTAAATTGCTATGTGGATTATTTGTTGTCCGAAGCAAAAACTCTTTCTGAGGAGCAAATAAGTATGTTGCTTTGGGAGACAATCATAGAATCGTCAGATACTACTTTGGTCACGACAGAATGGGCAATGTACGAACTTGCTAAAGATCCAAAACGGCAGGACTGTCTCTATCAAGAAATCAAAAAGGTTTTTGGATCCGACAAGGTGACCGAGGATCGCTCGTCTGAGATCCCATACTTGCTAGCTGTTTTTCATGAAACTATAAGGAAACACAGCCCAGCTCCAGTTGTTCCTTTGCGCTATGCACACGAAGACACCCAATTAGGAGGATGCTACATTCCTTCTGGAACAGAGATTGCAATAAACATATATGGATGTAACATGGACGAGAGGCAATGGGAAAGTCCTGAAGAGTGGATACCGGAGAGGTTTCTTGATGAGAAGTATGATCCAATGGATTTGCACAAGACTATGGCATTTGGAGCGGGGAAGAGGGTGTGTGCAGGCTCGCTTCAAGCGATGCTAATCTCGTGCACAATGATCGGGAGGTTGGTGCAGGAATTTGAGTGGCGGCTGAAAGGTGGAGAGGAGGAGAATGTTGACACCGTTGGACTCACCACTCACAAACTCCACCCATTGCATGCAATCTTGAAGCCAAGAGAAGTACTGTCATAAGACTAGTTGAGAGAGAGGACTAGTTGGCTCTTGTGAAAGATGCTGGGAGGAGTTGGAAACACATTTTTAGATGACACACTGAAGAAATAGTCTCTCTCTTTTTTCCTTTTCTTTTTTCTCTTTGGTTGTTGTTGTTGTGGAAGAAGGAATGCGACTGTAAAAAATGGGGATAGTTATAATAAATAAAGCAAAACTTTTCCATCTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
为起始密码子；为终止密码子
桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的生物信息学分析
利用在线工具PSORT，根据已报道的文献对目的基因进行核定位序列的预测及相关保守基因序列的分析(图3)；运用NCBI的Blast工具对其进行同源搜索和比对，并下载部分同源氨基酸序列；利用Clustal X软件将基因编码的氨基酸序列与桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因相关蛋白的氨基酸序列进行同源比对；利用DNAStar软件和在线分析(http：//www.expasy.org)对桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因进行较全面的分析，比如：该基因所编码的氨基酸及ORF预测，基因编码蛋白质的等电点及分子质量的预测等；然后，用MEGA4.1软件构建进化树，并研究相关蛋白的关系。
桑树MmKO蛋白序列全长SEQ ID NO.2：
MAATAHILEGFQGTPFATTAAIGGLSLLLFLSLRKCIFAKRSGFSKLPPVPVVPGLPVIGNLLQLKEKKPYKTFTKWAKTYGPIYSIRTGASTLVVLNTAEVAKEAMVTRFSSISTKKLSNALTMLTFDKCMVATSDYNDFHKMVKRYILTNVLGPNAQKKHRCHRDAMAENISKRFHAYVKDFPGEAVNFRTIFQSELFGLALKQAIGKDIESIYVEELGGKLSREEMLKVLVTDLMEGAIEVDWRDFFPYLKWVPNNTIENKIRRMIFRKQAVMNAIIKEQKKRIASGEELNCYVDYLLSEAKTLSEEQISMLLWETIIESSDTTLVTTEWAMYELAKDPKRQDCLYQEIKKVFGSDKVTEDRSSEIPYLLAVFHETIRKHSPAPVVPLRYAHEDTQLGGCYIPSGTEIAINIYGCNMDERQWESPEEWIPERFLDEKYDPMDLHKTMAFGAGKRVCAGSLQAMLISCTMIGRLVQEFEWRLKGGEEENVDTVGLTTHKLHPLHAILKPREVLS*
桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因在各种胁迫条件下目的基因的表达模式
在供试桑苗的新梢生长至约20cm长时，对桑苗分别进行干旱、高盐、ABA、SA胁迫处理。在整个胁迫诱导处理过程中，所有试验用苗的温度，光照强度，光周期以及湿度等非生物条件均保持不变。当桑苗在各种胁迫处理下表现出明显受害症状时，分别取对照和各种胁迫条件下的桑树幼叶，用铝箔纸包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃的冰箱中保存。在整个胁迫诱导过程中，所有嫁接苗的光照强度，光周期及湿度均保持不变。采用荧光定量PCR的方法，以桑树稳定表达的肌动蛋白基因(β-actin)作为内参，测定桑树在胁迫条件下目的基因的表达水平。所有胁迫实验均重复3次。
高盐胁迫：供试桑苗用浓度为0.3mol/L的NaCl溶液进行盐胁迫诱导处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于6h、12h、1d、2d、4d和16d时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。
干旱胁迫：供试桑苗放置于同一个光照培养箱的一个干燥的空间，一直不浇水，分别于2d、4d、8d、10d和16d取桑树幼叶(第1-3叶位)为实验材料。
ABA胁迫：供试桑苗用浓度为0.1mol/L的ABAl溶液进行ABA胁迫诱导处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1h、2h、4h、6h、8h、10h、1d、2d和3d时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。
SA胁迫：供试桑苗用浓度为0.1mol/L的SA溶液进行SA胁迫诱导处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1h、2h、4h、6h、8h、10h、1d、2d和3d时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。不同非生物胁迫下MmKO相对表达量变化显示：盐胁迫条件下，MmKO基因表达量总体的趋势是先下降，然后上升，上升到一定阶段的相对最大值，并保持在一个较高的稳定值(图4)。干旱胁迫条件下，MmKO基因表达量总体的趋势是先缓慢上升再缓慢下降然后上升，上升到相对最大值，最后下降(图5)。ABA胁迫条件下，MmKO基因表达量总体的趋势是先下降后上升再下降然后上升，上升到这阶段的相对最大值，并保持在一个较高的稳定值(图6)。SA胁迫条件下，MmKO基因表达量总体的趋势是先缓慢下降，然后上升，上升到这几阶段的最大值，并保持在这几阶段一个较高的稳定值，然后缓慢下降(图7)。MmKO基因在各种胁迫条件下都有明显的波动状态，这表明MmKO在发挥其功能，在非生物胁迫条件下，诱发MmKO基因的表达，使植物应对外界胁迫。通过荧光定量PCR分析，利用MmKO基因在干旱胁迫、盐胁迫和ABA、SA胁迫条件下总体表达的升降情况、在不同的胁迫时间内相对基因表达量指标，以及KO基因在植物中的保守性，可以以此标识植物是否处于盐胁迫、低温、ABA或SA等生长环境。

Claims (6)

1.桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO，其特征在于序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。
4.权利要求2所述编码桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。
5.根据权利要求4中所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用，其特征在于所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA或SA胁迫。
6.根据权利要求4中所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用，其特征在于所述植物为桑树(Morus multicaulis)。
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