CN1798843A - 植物中细胞分裂素活性的调节 - Google Patents

植物中细胞分裂素活性的调节 Download PDF

Info

Publication number
CN1798843A
CN1798843A CNA2004800155350A CN200480015535A CN1798843A CN 1798843 A CN1798843 A CN 1798843A CN A2004800155350 A CNA2004800155350 A CN A2004800155350A CN 200480015535 A CN200480015535 A CN 200480015535A CN 1798843 A CN1798843 A CN 1798843A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
promotor
phytokinin
polynucleotide
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800155350A
Other languages
English (en)
Inventor
J·E·哈本
C·津塞尔迈尔
D·T·托梅斯
S·E·阿比特
T·G·赫伦特亚里斯
X·牛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pioneer Hi Bred International Inc
Original Assignee
Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred International Inc filed Critical Pioneer Hi Bred International Inc
Publication of CN1798843A publication Critical patent/CN1798843A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

本发明大体上涉及植物分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于在时间和/或空间上调节基因表达的方法和试剂，所述基因在代谢上影响细胞分裂素在植物特别是在植物的种子和相关的雌性生殖组织中的有效水平。本发明进一步涉及具有增强的细胞分裂素表达水平的转基因植物，其中所述转基因植物表现出有用的特性例如改善了的种子大小、减少的顶端核败育、在不利的环境条件期间增加的种子结实或稳定的产量。本发明也提供了用于调节异源核苷酸序列在植物中表达的组合物和方法。组合物包含新的称作eep1和eep2的种子优选的启动子的核苷酸序列。提供了使用此处公开的启动子序列表达异源核苷酸序列的方法。所述方法包括转化植物细胞以使之包含可操作地连接至本发明的一个启动子的异源核苷酸序列和从转化的植物细胞中再生稳定转化的植物。

Description

植物中细胞分裂素活性的调节
发明领域
本发明大体上涉及植物分子生物学领域。更特定地，本发明涉及用于在时间或空间上调节基因表达的方法和试剂，所述基因在代谢上影响细胞分裂素在植物中，包括种子和产生这些种子产生的母本组织(包括雌性花序、子房、雌小花、糊粉、花梗和花梗形成区域)中的有效水平。
发明背景：
细胞分裂素是参与植物中大量生理学过程的植物激素。植物对环境协迫的应答部分是通过修饰活性和无活性细胞分裂素的相对平衡来调节的。例如，在非生物协迫期间(包括，但不限于，干旱、密度、冷、盐度和/或土壤压实状况)，增加的细胞分裂素氧化酶活性使平衡朝有利于无活性细胞分裂素的方向移动，从而导致降低的植物生产力(Jones和Setter， In CSSA Special Publication No.29，pp.25-42.American Society of Agronomy，Madison，WI.(1999))。相反地，有利于活性细胞分裂素的细胞分裂素平衡的靶向操作可导致增加的生产力，甚至在非生物协迫下，通过例如增加细胞分裂、诱导气孔张开、抑制器官衰老和/或抑制顶端优势来增加生产力(Morris，R.O.1997. In Cellular and Molecular Biology of Plant SeedDevelopment，pp.117-148.Kluwer Academic Publishers.(1997))。在遭受不利环境状况的玉米中，已显示细胞分裂素降低，从而造成种子大小减小、顶端核败育增加和种子结实减少(Cheikh和Jones，Plant Physiol.106：45-51(1994)；Dietrich等人，PlantPhysiol Biochem 33：327-336(1995))。因此，这些研究显示在协迫条件下一个提高种子结实和种子大小的方法是将活性细胞分裂素库保持在临界阀值水平以上。
第一个天然存在的细胞分裂素在1963年被从玉米(Zea mays)未成熟的核中纯化(Letham，D.S.，Life Sci.8：569-573(1963))出来并且被鉴定为6-(4-羟基-3-甲基-反式-2-烯基氨基)嘌呤，今天更通常称为玉米素。总体上所有天然存在的细胞分裂素似乎是具有分支的5碳N6取代基的嘌呤衍生物。(参见：McGaw，B.A.，In：PlantHormones and their Role in Plant Growth and Development，ed.P.J.Davies，Martinus Nijhoff Publ.，Boston，1987，Chap B3，Pgs.76-93，引用其内容作为背景说明参考)。尽管已经鉴定了大约25个不同的天然存在的细胞分裂素，被认为特别具有活性的为N6(Δ2-异戊烯基)腺苷(iP)、玉米素(Z)、diHZ、苄基腺嘌呤(BAP)和其9-核糖基(并且在Z和iHZ的情况下，其O-葡糖基)衍生物。然而，这种活性在7-和9-葡糖基和9-丙氨酰基缀合物中被大大降低。这些后面的化合物可能是失活或控制机制的反映。
植物中细胞分裂素的代谢是复杂的。已知细胞分裂素生物合成和降解是多步骤的生物化学途径。至少两个主要的细胞分裂素生物合成途径得到公认。第一个途径涉及作为中间物的转运RNA(tRNA)。第二个途径涉及从头(直接)生物合成。在第一种情况下，已知tRNAs含有各种过度修饰的碱基(其中有某些细胞分裂素)。已知这些修饰作为转录后修饰发生在tRNA聚合物水平。分支的5碳N6取代基来源于甲羟戊酸焦磷酸，所述甲羟戊酸焦磷酸进行脱羧、脱水和异构化以产生Δ2-异戊烯基焦磷酸(iPP)。后者与tRNA上的相关腺苷残基缩合。然后可能进行进一步修饰。最终所述tRNAs被水解成其组成碱基，由此形成可获得的游离的细胞分裂素库。
可选择地，已发现了催化从头形成细胞分裂素的酶，即无tRNA中间物。应用于本发明实践中的ipt基因就是一个这样的基因。假定游离细胞分裂素的形成是从[9R5’P]iP开始的。这种化合物可被快速地和立体特异性地羟基化从而产生可继续发生许多进一步代谢事件的玉米素衍生物。这类事件包括但不限于(1)缀合，整合核糖核苷、核糖核苷酸、葡糖苷和氨基酸；(2)水解；(3)还原；和(4)氧化。尽管这些途径中的各个酶是作为细胞分裂素水平的效应物的候选者，但只有与限速步骤相关的酶在本发明实践中具有特别效用。
一个这样的酶是异戊烯基转移酶(ipt)。在van Larebeke等人的( Nature 252：169-170(1974)；也参见Barry等人， Proc.Nat′l. Acad.Sci.(USA)81：4776-4780(1984)和Strabala等人，Mol.Gen.Gen.216(2-3)：388-394(1989))中描述了编码ipt的分离的基因。也已报道在拟南芥中分离ipt基因(Takei等人，J Biol Chem.276(28)：26405-26410(2001)；Kakimoto等人，Plant Cell Physiol.42(7)：677-685(2001)和WO 2002/072818；Sun等人，Plant Physiol131：167-176(2003))。本发明包括合适地调节来自任何来源(包括其它物种，例如玉米)的ipt基因表达。
基于细胞分裂素在跨跃多个植物物种的数百次实验中的可证实的效应，提高玉米中活性细胞分裂素的转基因方法可在正常和/或非生物协迫条件下提高其生产力。然而，简单地增加活性细胞分裂素的库并不会自动地导致增强的植物生长。事实上，已经显示提高细胞分裂素水平会对植物表型产生有害效应。
例如通过使用来自 根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的可操作地连接至35S或NOS启动子上的ipt基因，Smigocki等人( Proc.Nat′l. Acad.Sci.(USA)85：5131-5135(1988))显示在茎器官发生和玉米素水平上的普遍的效应。需要指出的是启动子的活性控制着观察到的形态发生应答的程度，并且不受调节的细胞分裂素的产生可造成不想要的多效性效果。关于上面鉴定的构建体，不想要的效应包括在烟草中完全抑制根的形成和阻碍未存活的黄瓜幼苗生长。(Smigocki等人( 同上)；Klee等人，Annual Rev.Plant Physiol.38：467-486(1987))。
接着进行以更受控制的方式表达ipt基因的尝试。Medford等人( The Plant Cell 1：403-413(1989))报道将 土壤杆菌ipt基因置于热诱导型启动子的控制下并且在转基因生根的烟草植物中表达所述基因。在热处理后细胞分裂素的水平显著提高，并且在转基因植物中观察到的效应包括高度、木质部含量和叶片大小显著减小。在烟草和拟南芥中，相对于野生型植物，转基因植物表现较慢的根生长、混乱的根发育和增加的腋芽生长。此外，实验构建体也不令人满意，因为即使在缺乏热诱导的情况下植物也表现出与过量细胞分裂素水平相关的表型，包括高度、叶片面积和茎宽的减小。进一步发现，在野生型和转基因植物中都观察到某些改变并且可能归因于热诱导自身。
Schmulling，T.等人( FEBS Letters 249(2)：401-406(1989))用在 果蝇(Drosophila)hsp70启动子控制下的 土壤杆菌ipt基因转化烟草，所述启动子在正常温度下提供极低水平的表达而在热激之后迅速地增加表达。绝大部分受热激的转基因植物愈伤组织变得更绿，具有更高的细胞分裂素浓度，并且比对照愈伤组织的生长速度更快。从热激转基因愈伤组织再生的植物被描述为“相当正常”并且这些植物中的细胞分裂素水平与在野生型植物中测得的相同。来自未诱导的转基因愈伤组织的再生植物与对照在植物表型或细胞分裂素含量上都没有差别。第二个实验产生通过其天然启动子驱动的ipt基因的愈伤组织转基因植物。在从这些愈伤组织再生的茎中，高细胞分裂素水平抑制根的形成。稼接至野生型烟草茎上的这些茎表现出微小的叶片和被抑制的、高度分枝的生长习性。因此，转化导致了负面的表型改变或没有效应。
在1991年2月7日的PCT专利申请公开号WO91/01323和美国专利号5,177,307和4,943,674中，用连接至果实特异性启动子(2AII、Z130和Z70)的ipt基因转化的番茄植物表现了改变的成熟特性。在未成熟阶段果实被形容成粗糙的，而在成熟过程中则被形容为杂色的、有斑斑点点的和有深色染斑的。也参见美国专利6,329,570，其中公开了用ipt和种子组织优选的启动子转化棉花以改变棉桃座果和纤维质量。
在PCT专利申请公开号WO93/07272中，ipt基因被融合入来自金鱼草(Antirrhinum majus)查耳酮合酶(chs)启动子中并在马铃薯中表达。转化体的表型改变包括增加的块茎产量、植物的高度和叶片大小、增粗的茎和延缓的叶衰老。Wang等人(Australian J of PlantPhys 24(5)：661-672和673-683，1997)报道了在用chs启动子驱动的ipt转化的烟草的叶板和上部的茎中细胞分裂素水平增加，以及腋芽释放、根的发育被抑制、叶衰老延缓、叶绿素水平提高、开花起始期推迟、花的发育延迟、叶枝从主根中长出、叶形状改变、叶中脉扩大、叶脉扩大、茎干增粗、结节数目增加和呼吸速率增大。查尔酮合酶基因的表达是很复杂的并且受到许多因素的调节，包括光、真菌诱导物(elicitor)、损伤和微生物病原体。此外，chs表达可以是组织特异性的(产生于着色的花和根中)和发育特性的(在早期萌发过程中产生)。(Ito等人，Mol.Gen.Gen.255：28-37(1997)；Shimizu等人，Plant Molecular Biology 39(4)785-95(1999))。
另外的ipt基因/启动子构建体已有报道。
Smigocki等人在WO 94/24848和美国专利5,496,732和5,792,934中公开了能够赋予增强的昆虫抗性、包含融合至ipt基因的损伤诱导型启动子的基因构建体。所述研究集中于昆虫抗性并且没有报道植物形态学上的变化。
Houck等人在美国专利4,943,674和5,177,307中公开了几个启动子(2AII，Z130和Z70)，所述启动子与编码细胞分裂素代谢途径中的酶的基因偶联，特别是用于在蕃茄果实中表达这类酶的ipt。
Amasino等人在PCT专利申请公开WO96/29858中公开了两个衰老特异性启动子，包括被可操作地连接至ipt基因从而在烟草中抑制叶片衰老的SAG-12。转化体发育正常，具有增加的生物量和花和种子产量，也许归因于通过延缓衰老造成的延长的发育周期。也参见：美国专利5,689,042和6,359,197；Gan，S.等人，(Science270：1986-1988(1995))。Jordi等人在 Plant，Cell and  Environment23(3)：279-289(2000)中研究了SAG12：ipt构建体在烟草中的生理学效应。尽管更老的叶子受益于保持叶绿素、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶和蛋白，但营养物质从更老的叶子向更年轻叶子的重新流动却减少了，从而导致上部叶片光合作用受到限制并限制了这些植物潜在的生物量的增加，特别是在协迫条件下。
Roeckel，P.等人( Transgenic Res.6(2)：133-141(1997))用在来自土壤杆菌的受发育调节的、种子特异性的2S清蛋白启动子控制的ipt基因转化了低芥酸芥子(canola)和烟草。尽管ipt mRNA只在种子中被发现，并且只在种子中估量了细胞分裂素水平，但构建体的效应并不限于种子：烟草具有减少的根；低芥酸芥子植株令人异外地(p.139)增高并且具有更多的分枝和更多具有种子的结构。然而，在两个物种中，既没有影响产量，也没有影响叶的类型、叶的数目、第一次开花前的天数或结实前的天数。
用连接至铜诱导型的、根部特异性启动子的ipt进行的烟草转化(在31例中有28例)提供了用于估计增加的细胞分裂素产量的效应的受控制系统。依赖诱导的形态学改变包括顶端优势的释放、整株植物叶片数目的增加和叶片衰老的延缓。(McKenzie等人， Plant Physiol.116：969-977(1998))。然而，几个转基因系表现出不受控制的细胞分裂素的表达并且表现出截然不同的、不想要的表型，缺乏根发育和和茎伸长。
Ivic等人( Plant Cell Reports 20：770-773(2001))报道ipt在转基因甜菜中的表达导致根发育受到严重抑制，同时在叶和茎的形态学上伴有不想的变化。转化的幼苗生根较慢或根本不生根，并且在移栽至土壤中时成活率极低。
Sa等人(Transgenic Research 11(3)：269-278，2002)报道用在TA29启动子(特异性地在花药中表达)控制下的来自土壤杆菌的ipt转化烟草导致花药和花粉的发育紊乱。大约80％的T0转基因植物表现显著的花粉萌发率降低，并且最高达20％的T0转基因植物是雄性不育的。此外，在所述转基因植物中发现了异常花柱和雄蕊。
在PCT公开号WO 00/52169中特别提到这些由转基因IPT的指导的表达造成的负面效应：“即使在ipt或rolC在组织特异性启动子的控制下表达的情况下，这些方法也在植物中产生了不想要的副作用，可能因为细胞分裂素在植物的细胞和组织之间容易地被转运，所以在其它组织中会观察到这些副作用。”(加上强调)
因此，为了在没有这些有害效应，例如减少的根发育或异常的茎形态学的情况下提高植物活力和产量，仍然存在对用于在植物(包括植物种子和在其中发生种子发育的亲本组织)中控制和指导细胞分裂素代谢基因的时间和空间上受控制的表达，或用于调节植物感觉(sensing)和/或响应细胞分裂素的核酸构建体和方法的需要。本发明提供了几种这样的用于在植物中调节细胞分裂素活性(包括植物种子、发育中的植物种子和相关的亲本生殖组织中细胞分裂素的有效水平)的核酸构建体和方法。此外，存在对在有利的或不利的生长条件下可提供所述植物活力和产量提高的构建体和方法的需要。本发明提供了允许本领技术人员通过利用尤其是转基因方法学如此地影响细胞分裂素的活性水平(包括种子中关于细胞分裂素代谢途径的代谢通量)的工具和试剂。该影响可以是合成代谢的也可以是分解代谢的，其意思是所述影响可增加细胞分裂素的生物合成和/或减少降解。本发明也预期两种方法的组合。进一步的组合可包括分离的编码多肽的多核苷酸表达的靶向调节，所述多肽参与细胞分裂素的识别和对提供如此处定义的增强的细胞分裂素活性的细胞应答。
发明概述
本发明的某些实施方案提供了植物，特别是转基因玉米，其相对其它等基因植物具有增加的细胞分裂素活性而无相应的有害效应。所述相对于其它等基因植物的增加可发生在有利的环境条件下、不利的环境条件下或两种条件下都可。增加的细胞分裂素活性可包括种子、发育中的种子和与种子发育相关的亲本组织中细胞分裂素的水平。可选择地或此外，增加的细胞分裂素活性可能是由于所述植物对细胞分裂素的感觉和应答提高而产生的。增加的细胞分裂素活性可起着代谢缓冲剂的作用以改善短暂协迫的影响，特别是在种子发育的延滞期，因而提高玉米对协迫的耐受性和产量稳定性。增加的细胞分裂素活性也表现为提高了的植物活力和/或增加的种子产量。这类实施方案包含了稳定地整合入其基因组中的核酸构建体，所述构建体能够在时间或空间上调节细胞分裂素水平。
本发明的某些实施方案提供了具有可遗传表型的转基因植物系，所述表型用于设计用来生产具有改善的表现的商业产品的育种程序，所述表现包括在有利的或不利的环境条件下植物的活力、改善的种子大小、降低的顶端核败育和/或增加的种子结实。这些商业产品是本发明的进一步实施方案。
本发明的一些实施方案提供了包含稳定地整合入其基因组内的核酸构建体的可育转基因植物，所述构建体能够在所述植物中影响细胞分裂素活性的调节。
本发明的某些实施方案提供了分离的重组DNA分子，所述重组DNA分子包含启动子和任选地包含一个或多个来自高度表达的基因的增强子元件，所述启动子指导受时间或空间调节的可操作地连接的细胞分裂素调节基因的表达。
在一些实施方案中，本发明提供了用于在植物中提高协迫耐受力和产量稳定性的方法，其包括稳定地将能够影响细胞分裂素活性调节的核酸构建体导入植物细胞，并且从所述细胞再生出具有提高的协迫耐受力和产量稳定性的所述植物。所述构建体可导致在植物种子发育的延滞期期间细胞分裂素调节基因的优选表达。
实施方案也提供了用于产生可育的能够在发育中的种子中调节细胞分裂素调节基因表达的转基因植物的方法，其包括将核酸构建体在足以进行将所述构建体稳定地整合入所述细胞的基因组中的条件下导入植物宿主细胞中，并再生和回收所述可育的转基因植物，所述核酸构建体在发育中的种子和与种子发育相关的亲本组织中能够进行细胞分裂素调节基因的优选的时间和/或空间表达。
本发明进一步的实施方案提供了用于生产可育的具有增强活力的转基因植物的方法，其包括将核酸构建体在足以进行将所述构建体稳定地整合入所述细胞的基因组中的条件下导入植物宿主细胞中，并再生和回收所述可育的转基因植物，所述核酸构建体能够影响细胞分裂素活性的调节。
根据本发明的这些方面，提供了编码细胞分裂素代谢酶的分离的核酸分子，其包括mRNAs、cDNAs、基因组DNAs和其生物学有用的变体、类似物或衍生物，包括其变体、类似物或衍生物的片段。本发明的其它实施方案提供了编码细胞分裂素代谢酶的序列的核酸分子的天然存在的等位基因变体。同样被提供的还有包含细胞分裂素代谢酶和其生物学或诊断上有用的片段、以及前述的变体、衍生物和类似物和其片段的多肽。例如，被特别提供的是细胞分裂素代谢多肽，特别是ipt(例如，SEQ ID NOS：1和2)和细胞分裂素氧化酶(例如，SEQID NOS：26-37)，所述多肽或酶可用于调节种子和相关的雌性生殖组织特别是雌性生殖组织的分生组织区域中的细胞分裂素水平。
本发明的某些实施方案提供了用于生产目的多肽的方法，包括在适合于种子和相关雌性生殖组织中细胞分裂素代谢酶在时间和/或空间上表达的条件下培养具有可表达地整合于其中的多核苷酸的宿主细胞，然后任选地回收表达的多肽。
在某些实施方案中被提供的还有与在育种程序中用作分子标记的细胞分裂素代谢酶的多核苷酸序列杂交的探针。
本发明的其它实施方案提供了利用前述的多肽和多核苷酸进行生物学和农业目的研究的产品、组合物、过程和方法。
本发明的其它实施方案提供了针对这类多肽，用于调节所述多肽的活性和/或表达的抑制剂。特别地，提供了抗这类多肽的抗体。
在本发明这个方面的某些实施方案中，提供了抗细胞分裂素分解代谢酶的抗体。所述抗体可以是对整个细胞分裂素分解代谢酶类(无论物种来源)有选择性的抗体以及物种特异性的抗体。
其它实施方案提供了细胞分裂素酶的拮抗剂和激动剂。其中优选的拮抗剂是那些与细胞分裂素分解代谢酶(例如，细胞分裂素氧化酶)结合以抑制结合分子的结合或破坏细胞分裂素分解代谢酶与结合分子之间形成的复合物的稳定性，从而进一步阻止由细胞分裂素分解代谢酶产生的生物学活性的拮抗剂。其中优选的激动剂是与细胞分裂素生物合成酶结合或相互作用以刺激特定细胞分裂素生物合成酶的一种或更多种效应的分子或增强所述酶的表达的分子和也优选地导致细胞分裂素积累调节的分子。
有效的构建体导致在分生组织，特别是雌性生殖组织中调节细胞分裂素，从而提供可观察到的在活力上的提高。本发明包含此处描述的特定的构建体和其它可提供细胞分裂素调节基因表达以在无显著有害效应的情况下产生提高了的植物活性的这类构建体。在任何情况下和不受限于任何特定的理论的情况下，在所述植物雌性生殖组织中导致在没有显著有害效应的情况下植物活力增强的细胞分裂素活性的调节被要求保护。
植物宿主中分离的DNA序列的表达依赖于可操作地连接的在所述植物宿主中发挥功能的调节元件的存在。所述调节序列的选择将决定分离的DNA的序列在何时在生物中何处进行表达。当想要在整个发育过程中在所有或几乎所有植物细胞中连续表达时，使用组成型启动子。相反地，当想要对刺激作应答的基因表达时，诱导型启动子是所选择的调节元件。当想要在特定的组织或器官中有时在特定的发育阶段表达时，使用组织优选的启动子和/或终止子。即这些调节元件可在特定的组织或器官中在特定的阶段驱动表达。在转化载体的表达盒中可包含位于核心序列的上游和/或下游的另外的调节序列以在转基因植物中产生各种水平的分离的核酸序列的表达。
种子发育包括胚发生和成熟事件以及发生在种子内部以确保后代存活的生理学适应过程。发育中的植物种子积累和贮存随后在萌发期间所使用的糖类、脂类和蛋白。通常，种子蛋白的表达模式受到高度调节。这种调节包括在种子发育期间在时间和空间上的调节。在胚形成和种子发育期间，各种蛋白积累和分解并且提供了用于考察基因调节的不同方面和用于提供用于植物遗传操作的调节序列的优秀系统。
随着植物生物工程领域的发展和可以获得更多的基因，存在着对使用多基因转化的更大需求。这些多个外源基因通常需要由分开的调节序列进行控制。一些基因应当被组成型调节，而其它基因应当在转基因生物的某些发育阶段或位置表达。因此，需要各种具有不同效果的调节序列。
另一个需要各种调节序列的理由是不想要的生物化学相互作用可能是由于使用相同的调节序列控制超过一个基因造成的。例如，具有多拷贝调节元件的转化可导致两个或更多表达系统之间的同源重组、由于两个非常邻近的以相反方向排列的相同启动子或增强子拷贝的原因造成发夹环的形成、相同表达系统之间在结合共同启动子特异性调节因子上的竞争和由于第二个启动子或增强子的反式效应造成的外源基因不恰当表达水平。
基于这些考虑，本领域的目标已确立为检测和表征用于DNA构建体的转基因控制的新的调节序列。
为提高植物种子的性状中需要分离和表征种子优选的启动子和终止子，所述启动子和终止子可用作以种子优选的方式表达分离的目的核苷酸序列的调节元件。特别地，早期核发育是干旱诱导的穗尖败育的关键阶段。已证明保持植物细胞分裂素的活性库对于在短暂的干旱协迫下维持核生长和发育是至关重要的。此外，通常有利于对协迫的应答的基因，例如参与ABA应答的基因，还有维持细胞长大和分裂的基因在协迫下对生殖发育起着关键作用。由于早期阶段的胚乳包围发育中的胚并为其提供营养，所以其已成为转基表达的重要靶组织。EEP1和EEP2启动子满足了在所述早期胚乳组织中指导转基因表达的需要。
通过下列描述，本发明的其它目标、特性、优势和方面对本领域技术人员来说将变得更加明显。然而，应当理解，下列描述和特定的实施例(尽管表示为本发明优选的实施方案)仅以说明的方式提供。通过阅读下列描述和本公开内容的其它部分，对于本领域技术人员来说，在公开的发明的精神和范围内的各种变化和修饰将变得显而易见。
附图简述
图1A-胚：本图显示胚优选的ipt超表达增加胚的细胞分裂素水平，特别是ZR和Z9G(范围为2-8倍差异)。相反地，Z水平未改变，而IPAR在任一发育阶段都未检测到。缩写：Z＝玉米素，ZR(或[9R]Z)＝玉米素核糖核苷，Z9G(或[[9G]Z]＝玉米素-9-葡糖苷，IPA或[9R]iP＝异戊烯基腺苷，IPAR(或[9R-5’P]iP)＝异戊烯基腺苷-5’-单磷酸，和DAP＝授粉后天数。
图1B-胚乳：本图表示胚优选的ipt超表达改变了胚乳中细胞分裂素水平，但低于胚中的水平(范围仅为10至30％差异)。所使用的缩写如图1A中。
图2表示在非协迫条件下D2F1半合子植物的穗生长速率数据。
图3表示在非协迫条件下D3F1半合子植物的谷物产量、核数目、核干物质和穗长度数据。
图4表示在非协迫条件下D4F3纯合子植物的植株高度数据。
图5表示在非协迫条件下D4F3纯合子植物的产量数据。
图6提供了非协迫条件下D4F3纯合子植物的产量构成数据。
图7提供了干旱协迫的D4F3植物的植株高度数据。
图8提供了干旱协迫的D4F3植物的叶片绿色数据
图9提供了干旱协迫的D4F3植物的产量数据
图10表示事件TC15850的增加的植物生物量。
序列表描述
  1   Agro ipt(pnt)
  2   Agro ipt(ppt)
  3   zag2.1
  4   CaMV35s增强子
  5   ZmMADS＝ZAP
  6   启动子ckx1-2
  7   eep1
  8   end2
  9   lec1
  10   F3.7启动子
  11   eep1的GSP1引物
  12   eep1的GSP2引物
  13   eep1的引物
  14   eep1的引物
  15   Clontech AP1引物
  16   Clontech AP2引物
  17   tb1启动子
  18   eep2启动子
  19   trx1或thxH启动子(硫氧还蛋白H)
  20   Zm40启动子
  21   eep2的GSP1引物
  22   eep2的GSP2引物
  23   mLIP15
  24   ESR启动子
  25   PCNA2启动子
  26   ZmCkx2 pnt
  27   ZmCkx2 ppt
  28   ZmCkx3 pnt
  29   ZmCkx3 ppt
  30   ZmCkx4 pnt
  31   ZmCkx4 ppt
  32   ZmCkx5 pnt
  33   ZmCkx5 ppt
  34   ZmCkx2启动子
  35   ZmCkx3启动子
  36   ZmCkx4启动子
  37   ZmCkx5启动子
  38   用于ipt基因分离的引物
  39   用于ipt基因分离的引物
术语表
提供下列说明性解释以帮助理解此处特别是在实施例中频繁使用的某些术语。所述解释是为了方便而提供的但不限定本发明。
细胞分裂素活性，如此处所用的，包括植物中活性细胞分裂素的水平和植物对细胞分裂素的感觉和应答的水平。因此，细胞分裂素生物合成酶和细胞分裂素降解酶是能够调节细胞分裂素活性的酶的例子。“细胞分裂素调节基因”包含编码这些酶的多核苷酸和编码参与细胞分裂素感觉和植物应答的蛋白(包括与细胞分裂素应答有关的转录因子)的多核苷酸。确切地说，“活性细胞分裂素库”是指在任何时间在细胞或植物的部分或整个植物中活性细胞分裂素的积累。稳定活性细胞分裂素库可涉及细胞分裂素降解或缀合的下调或细胞分裂素生物合成的上调。
细胞分裂素代谢酶结合分子，如此处所用的，是指特异性地与本发明的细胞分裂素代谢酶多肽或多核苷酸结合或相互作用的分子或离子，包括，例如酶的底物、细胞膜成分和经典受体。本发明的多肽与这类分子(包括结合或相互作用的分子)的结合可以是专门地针对本发明的多肽的，或其可高度特异地针对本发明的多肽，或其可高度特异地针对包含本发明多肽的蛋白组，或其可高度特异地针对几组蛋白(其中至少有一组包含本发明的多肽)。结合分子也包括抗体和来源于抗体的特异性地与本发明多肽结合的试剂。
细胞分裂素应答组分，如此处所使用的，通常是指与细胞分裂素结合或相互作用，从而导致细胞内或细胞间信号传导或引起一种或多种对细胞分裂素存在或不存在或水平波动的应答的细胞组分。
发育中的植物种子，如此处所使用的，通常是指授粉后能够产生植物种子的亲本植物组织。这种亲本植物组织包括这样的组织，例如雌小花、子房、糊粉、花梗和花梗形成区域。
有害效应，如通常所理解的和如此处所使用的，是指那些明显的损害或破坏效应。显著的有害效应，在本申请上下文中，是指对植物的生产力或活力产生净负面效应的形态学变化。
基因沉默是指对基因表达的转录后干涉。例如，反义、共抑制和RNA干涉(RNAi)这类技术已显示对基因沉默是有效的。(综述，参见Arndt和Rank，Genome 40(6)：785-797，1997；Turner和Schuch，Journal of Chemical Technology and Biotechnology 75(10)：869-882，2000；Klink和Wolniak，Journal of Plant GrowthRegulation 19(4)：371-384，2000)。
遗传因子，如此处所使用的，通常是指包含编码多肽的区域、或调节复制、转录或翻译或对多肽在宿主细胞中的表达相当重要的其它过程的多核苷酸区域的多核苷酸、或包含编码多肽的区域和与其可操作地连接的调节表达的区域两者的多核苷酸。遗传因子可包含于作为附加型元件进行复制的载体中；即，作为物理上独立于宿主细胞基因组的分子。其可包含于质粒中。遗传因子也可包含于宿主细胞的基因组中；除了其它以外，不是以其天然状态而是经过操作的，例如分离、克隆和以纯化的DNA或含于载体中的形式导入宿主细胞中。
种质，如此处所使用的，是指一套可用于开发新的植物变种的育种程序的遗传实体。
高细胞分裂素转基因，如此所使用的，是指作为重组遗传操作的结果，产生在细胞分裂素上具有可遗传的增加和/或在生长素上可遗传的减少的种子的实体。
宿主细胞，如此处所使用的，是已被转化或转染的或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细胞。“外源多核苷酸序列”定义为非天然存在于所述细胞的、或天然存在于所述细胞中但以不同遗传基因座、以不同的拷贝数目或在不同调节元件指导下存在的序列。
同一性和相似性，如此处所使用的和本领域已知的，是指两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的相互关系，如通过比较所述序列所确定的。在本领域中，同一性也表示如通过这些序列的两条链之间的匹配确定的两个多肽或两个多核苷酸序列之间的序列相关程度。同一性和相似性都可容易地计算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，编著，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，编著，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，编著，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编著，M Stockton Press，New York，1991)。一般用于确定两个序列之间同一性或相似性的方法包括，但不限于在Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM  J.Applied Math.，48：1073(1988)中公开的方法。优选的用于确定同一性的方法被设计用来在两个受试序列之间产生最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编成计算机程序。确定两个序列之间同一性和相似性的一般计算机程序方法包括GCG程序包(Accelrys，Inc.，San Diego，CA.；Devereux，J.等人 Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA和TFASTA(Atschul，S.F.等人， J.Mol.Biol.215：403(1990))。
分离的，如此处所使用的，是指“借助于人手”从其天然状态进行改变；即如果其天然存在，那么其已被改变或被从其原始环境中取出，或两种情况都发生。例如，以其天然状态天然地存在于活生物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但从其天然状态共存的材料中分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如此处所使用的术语。例如，对于多核苷酸，术语分离的意思是将其从其天然存在的染色体和细胞中分离出来。作为分离的一部分或分离后，这样的多核苷酸可被连接至其它多核苷酸，例如DNAs中，以例如用于进行诱变，以形成融合蛋白，及用于在宿主中繁殖或表达。可将单独地或连接至其它多核苷酸例如载体中的分离的多核苷酸导入宿主细胞、培养物或整个生物中。这样的DNAs在导入宿主细胞、培养组织或整个生物后，因为不是以其天然存在的形式或环境存在的，所以仍然是分离的，如此处所用的术语。类似地，多核苷酸和多肽可存在于组合物中，例如用于导入细胞的培养基制剂或溶液中，或用于化学或酶促反应的组合物或溶液中，所述培养基或溶液不是天然存在的组合物，因此，这种多核苷酸或多肽在如此处所使用的术语的含意范围内是保持分离的。
连接，如此处所使用的，是指在两个或更多个多核苷酸(最常见的是双链DNAs)之间形成磷酸二酯键的过程。用于连接的技术在本领域是熟知的，且用于连接的实验方法描述于标准的实验室手册和文献中，例如Sambrook等人的，MOLECULAR CLONING，A LABORATORYMANUAL，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1989)和Maniatis等人，pg.146，如下面所引用的。
低水平组成型表达是指基因基本上在植物的所有组织中和在大多数或所有发育阶段以低于被CaMV35S启动子驱动的基因的水平表达。多核苷酸的低水平组成型表达可能是由于可操作地连接至正常驱动这种表达的启动子例如F3.7(SEQ ID NO：10)或与可操作地连接至基因的启动子形成组合造成的，所述组合进一步邻近增强子元件例如CaMV35s增强子。(参见，例如Mol.Gen.Gen.261：635-643(1999))优选地在分生组织中驱动表达的启动子例如zag2.1(SEQ ID NO：3)也可以提供低水平的组成型表达。
寡核苷酸，如此处所使用的，是指短的多核苷酸。所述术语通常是指单链脱氧核糖核苷酸，但除此之外，其也可以指单链或双链核糖核苷酸，RNA:DNA杂合体和双链DNAs。寡核苷酸，例如单链DNA探针寡核苷酸，通常通过化学方法合成，例如在自动寡核苷酸合成仪上所实施的。然而，寡核苷酸可通过其它各种方法制备，包括体外重组DNA介导的技术和细胞和生物内的DNAs表达。起初，化学合成获得的DNAs通常没有5’磷酸。这种寡核苷酸的5’端不是用于通过连接反应形成磷酸二酯键的底物，所述连接反应使用通常用于形成重组DNA分子的连接酶。在想要连接这种寡核苷酸的地方，可通过标准技术例如使用激酶和ATP的技术加上磷酸。化学合成的寡核苷酸的3’端通常具有游离的羟基，并且在连接酶例如T4 DNA连接酶存在的情况下容易地与另一个多核苷酸例如另一个寡核苷酸的5’磷酸形成磷酸二酯键。众所周知，在需要时，通过在连接前除去另一个多核苷酸的5’磷酸可选择性的阻止该反应。
可操作地连接，如此处所使用的，是指在启动子和第二个序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动和介导对应于第二个序列的DNA的转录。通常，可操作地连接表示被连接的核酸序列是邻接的，并且，当需要连接两个蛋白编码区域时，是邻接的并且相同阅读框架内。
植物，如此处所使用的，包括指完整的植物、植物的部分或器官(例如，叶、茎、根等)、植物细胞、种子和其后代。植物细胞，如此处所使用的，进一步包括，但不限于，获自或发现于：种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、茎、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。也可理解植物细胞包括被修饰的细胞例如获自前述组织的原生质体。可用于本发明方法的植物种类通常广至可适合于转化技术的高等植物种类，包括单子叶和双子叶植物，包括例如例如玉米、大豆和低芥酸芥子。
质粒，如此处所使用的，在此处通常按照本领域技术人员熟知的标准命名规则以小写字母p开头和/或接着以大写字母和/或数字进行命名。此处公开的起始质粒是商业可获得、公开地可获得的，或可以是通过熟知的公开方法的常规应用从可获得的质粒构建而来。许多可依照本发明使用的质粒和其它克隆和表达载体是众所周知的和对本领技术人员来说是容易获得的。此外，本领域技术人员可容易地构建许多适合于本发明使用的其它质粒。根据本发明的公开内容，本发明中这些质粒和其它载体的特性、构建和用途对本领域技术人员来说是显而易见的。
多核苷酸，如此处所使用的，通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或被修饰的RNA或DNA。因而，此外，例如，此处所使用的多核苷酸是指单链和双链DNA、作为单链和双链区域或单链、双链和三链区域的混合物的DNA、单链和双链RNA和作为单链、和双链区域的混合物的RNA、包含可以是单链或更一般地是双链或三链或单链和双链区域混合物的DNA和RNA的杂交分子。此外，此处所用的多核苷酸是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域。这种区域中的链可来自相同分子或来自不同分子。所述区域可包括完整的一个或多个分子，但更一般只包括一些分子的区域。三螺旋区域的分子之一通常是寡核苷酸。如此处所用的，术语多核苷酸包括上述的含有一个或多个经修饰碱基的DNAs或RNAs。因此，因为稳定性或其它原因具有经修饰主链的DNAs或RNAs也是此处术语想要表达的“多核苷酸”。此外，包含非常规碱基例如肌苷或经修饰的碱基例如三苯甲基化碱基的DNAs或RNAs(仅举两个例子)是如此处所用术语所表达的多核苷酸。应当认识到已经对具有许多本领域技术人员已知目的的DNA和RNA进行了大量各种的修饰。此处所用的术语多核苷酸包括这种化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞特别是包括简单和复杂细胞的特征性DNA和RNA的化学形式。
多肽，如此处所用的，包括下面描述的所有多肽。多肽的基本结构是众所周知的，并且已在本领域的大量教科书和出版物中进行了描述。在本上下文中，此处所用术语是指任何包含两个或更多个通过肽键在线性链上相互连接的氨基酸的肽和蛋白。如此处所用的，所述术语是指在本领域也被称为例如肽、寡肽和寡聚物的短链，和指通常在本领域被称作蛋白的更长的链，所述蛋白具有许多种类。应当认识到多肽通常包含除了一般被称作20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸外的氨基酸，并且许多氨基酸(包括末端氨基酸)在给定的多肽中可被修饰，不仅通过天然的过程例如加工和其它翻译后修饰被修饰，还可通过本领域熟知的技术被化学修饰。甚至天然存在于多肽中的普通修饰都太多以至于此处不能完全列出，但在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中对其进行了很好的描述，并且它们对本领域的技术人员来说是熟知的。其中可存在于本发明多肽中的已知的修饰(举少数说明性的例子)是乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂类或脂类衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚定、羟化、碘化、甲基化、十四酰基化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白中添加氨基酸例如精氨酰化和遍在蛋白化。这些修饰对本领域技术人员来说是熟知的，并且在大量科学文献中已进行了极为详细的描述。几种特别普通的修饰，例如糖基化、脂类附着、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化描述于最基本的教科书中，例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)。可获得许多有关该主题的详细的综述，例如由Wold，F.的POSTTRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)中的Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects，1-12页；Seifter等人的Meth.Enzymol.182：626-646(1990)和Rattan等人的Protein Synthesis：Posttranslational Modifications andAging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-62(1992)提供的综述。应当认识到，如上面指出的和众所周知的，多肽并不总是完全线性的。例如，由于遍在蛋白化的结果，多肽可以是分支的，而且通常由于翻译后事件(包括天然加工事件和非天然存在的通过人工操作产生的事件)的结果，它们可以是具有或不具有分支的环形。同样，可通过非翻译天然过程和通过完全合成的方法合成环形的、分支的和分支环形的多肽。修饰可发生在多肽的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。事实上，通过共价修饰封闭多肽的氨基或羧基基团或两者在天然存在的和合成的多肽中是很普便的，并且这类修饰同样也可存在于本发明的多肽中。例如，在蛋白水解加工之前，于大肠杆菌(E.coli)或其它细胞中产生的多肽的氨基末端残基几乎总是N-甲酰甲硫氨酸。在肽的翻译后修饰过程中，NH2-末端的甲硫氨酸残基可被除去。因此，本发明预期本发明的蛋白的含有甲硫氨酸和缺少甲硫氨酸氨基末端的变体的用途。发生于多肽上修饰通常是其如何产生的函数。例如，对于通过在宿主中表达克隆基因制备的多肽来说，修饰的性质和程度很大程度上取决于宿主细胞翻译后的修饰能力和存在于多肽氨基酸序列中的修饰信号。例如，众所周知糖基化通常不发生于细菌宿主例如大肠杆菌中。因此，当想要糖基化的时候，多肽应当在进行糖基化的宿主(通常是真核细胞)中表达。相似的考虑可应用到其它修饰。要认识到相同类型的修饰可在给定的多肽的几个位点以相同或可变的程度存在。同样，给定的多肽可含有许多类型的修饰。总的说来，如此处所用的，术语多肽包括所有这些修饰，特别是存在于通过在宿主细胞中表达多核苷酸而合成的多肽上的修饰。
启动子，如此处所用的，包括来自转录起始位点的上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白以启动转录的DNA区域。“植物启动子”是指能够在植物细胞中启动转录的启动子。示例性植物启动子包括但不限于，获自植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌例如土壤杆菌和根瘤菌(Rhizobium)的启动子。在发育控制下的启动子的例子包括优选地在某些组织，例如叶、根或种子或在空间上位于例如胚乳、胚或分生组织区域的区域上启动转录的启动子。这类启动子被称为“组织优选的”。只在某种组织中启动转录的启动子称为“组织特异性的”。在时间上受调节的启动子在特定的时间上，例如授粉后0-25天驱动表达。“细胞类型优选的”启动子主要在一个或更多个器官中的某些细胞类型，例如根或叶中的维管细胞中驱动表达。“诱导型”启动子是在环境控制下和可被诱导或去阻遏的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括厌氧条件或光照的存在。组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类。“组成型”启动子是在绝大多数环境条件下和在所有或几乎所有的组织中、在所有或几乎所有的发育阶段都具活性的启动子。
重组表达盒，如此处所用的，是指具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定遗传元件的核酸构建体，所述核酸构建体是通过重组或合成产生的。所述重组表达盒可被整合入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般地，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分包括被转录的核酸和启动子，和可任选地包括额外的元件，例如增强子。
相关的雌性生殖组织，如此处所用的，包括授粉前或授粉后的亲本植物组织，例如雌小花、子房、糊粉、花梗和花梗形成区域。授粉前种子组织也可被称为“谷物原始体”或“种子原始体”。
转化，如此处所用的，是当外源DNA已被导入细胞膜内时，使细胞被所述外源DNA转化的方法。外源DNA可以或可以不被整合(共价连接)入组成细胞基因组的染色体DNA中。例如，在原核生物和酵母中，所述外源DNA可以保持在附加型元件例如质粒上。至于高等真核细胞，稳定转化的或转染的细胞是已将外源DNA整合入其中的染色体上以使外源DNA通过染色体复制从而由子细胞遗传的细胞。通过真核细胞建立由含有外源DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆的能力来验证该稳定性。
多核苷酸或多肽的变体，如此处所使用的术语，是分别不同于参照多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽。在这个意义上，变体在下面和本公开内容的其它地方得以更加详细的描述。对于多核苷酸，差异通常是有限的，从而参照和变体的核苷酸序列在总体上是十分相似的，且在许多区域是相同的。如下面所指出的，变体核苷酸序列的变化可能是沉默的；也就是说，它们可以不改变由所述核苷酸编码的氨基酸。当改变被限制于这种类型的沉默变化时，变体将编码具有与参照相同的氨基酸序列的多肽。在其它情况下，如下面所指出的，变体的核苷酸序列的改变可改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下面所讨论的，这种核苷酸变化可在由参照序列编码的多肽中导致一个或多个氨基酸替代、添加、缺失、融合和截短。对于变体多肽，差异通常是有限的，从而参照和变体的序列总体上十分相似，并且在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨基酸序列上可由一个或多个替代、添加、缺失、融合和截短造成不同，所述变化可以以任意组合存在。
植物活力，如此处所用的，是指相对健康、生产力和植物和/或某些植物部分的生长速度，并且可反映在各种发育贡献上，所述贡献包括但不限于叶绿素浓度、光合速率、总生物量、根生物量、谷物质量和/或谷物产量。特别是在玉米中，活力也可反映在穗生长速率、穗大小和/或穗丝的延伸程度。可在相似的环境条件下确定不同基因型的活力或在不同环境条件下确定相同或不同基因型的活力。
产量稳定性，如本领域已知的和此处所用的，是指在所有环境(包括协迫环境)下的给定基因型的一致产量表现。
发明详述
本发明部分涉及用于调节植物中细胞分裂素活性(包括细胞分裂素基因在种子和相关雌性生殖组织中的时间和/或空间上的表达)的核酸构建体和相关的多核苷酸和多肽、这些多核苷酸和多肽的变体、用于制备这些多核苷酸和这些多肽和其变体和衍生物的方法、所述多肽的激动剂和拮抗剂、包含这些多核苷酸和多肽和其变体和衍生物的产品、和这些多核苷酸、多肽、变体、衍生物、激动剂和拮抗剂的用途以及包含这些多核苷酸、多肽、变体、衍生物、激动剂和拮抗剂的产品的用途。特别是在这些和其它方面，本发明涉及细胞分裂素代谢途径的多核苷酸和多肽(包括ipt酶和细胞分裂素氧化酶和编码它们的基因)和其单独地或相互组合地和/或与许多其它分离的影响细胞分裂素活性的多核苷酸和多肽组合的用途。描述了被靶向的提高植物活力和种子产量的表达调节。
如上所述，本发明提供了以增强的细胞分裂素活性为特征的转基因植物的发育所必须的试剂。如此处所用的，短语“细胞分裂素活性”是相对活性，并且是指不含影响细胞分裂素的转基因的对照植物与具有这种发挥功能的转基因的植物相比较的细胞分裂素活性。也可以只使用转基因植物测量相对水平，但是要在受试转基因表达存在和不存在的情况下进行测量。因此，任何结构基因可用于本发明的实践中，所述结构基因的调节的表达具有在植物中(特别是在种子中)增加细胞分裂素活性的效应。指导起着增加细胞分裂素生物合成作用的基因(例如，ipt或tzs)或编码细胞分裂素降解酶的基因(其表达被抑制)可用于本发明的实践中。然而，本发明也预期其它基因的用途。除了影响细胞分裂素绝对水平的基因外，也可使用影响细胞分裂素与生长素的比率的基因。降低生长素的基因例如iaa-1和gene-5也可用于本发明的实践中。此外或可选择地，被靶向的分离多核苷酸的表达调节可提供增强的如此处定义的细胞分裂素活性，所述多核苷酸编码参与细胞分裂素识别和细胞应答的多肽。也预期这些方法的组合(包括一个或多个细胞分裂素调节基因表达中的变化)。
如上所述，除其它以外，如下面更加详细描述的，本发明还涉及新的细胞分裂素代谢多肽和编码其的多核苷酸的构建体。特别地用于本发明实践的多肽包括但不限于ipt和细胞分裂素氧化酶。编码上述酶的核酸及其片段可用于产生酶生产性转基因。例如，可将单个基因或基因片段(或几个基因的组合)整合入合适的表达盒(使用例如用于胚优选表达的球蛋白-1[glb1]启动子或种子中胚乳优选表达的27kdγ玉米醇溶蛋白启动子)，并与合适的选择标记(例如BAR和PAT基因)一起转化入玉米中。某些实施方案包含可操作地连接至编码细胞分裂素生物合成酶的多核苷酸的在雌性生殖分生组织中驱动表达的启动子。用于这种实施方案的启动子的例子包括zag2.1、Zap(也称作ZmMADS)、tb1和PCNA2，如SEQ ID NOS：3、5、17和25中所示。
在某些情况下，沉默或下调某些基因，例如细胞分裂素氧化酶是优选的。描述同源性依赖性基因沉默应用的相关文献包括：Jorgensen， Trends Biotechnol.8(12)：340-344(1990)；Flavell，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)91：3490-3496(1994)；Finnegan等人， Bio/Technology 12：883-888(1994)；Neuhuber等人， Mol.Gen.Genet.244：230-241(1994)；Flavell等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等人，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等人，(2002)PlantCell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等人，(2003)Phytochemistry 63：753-763；和美国专利号5,034,323、5,283,184和5,942,657。可选择地，产生基因沉默的另一个方法是可使用反义技术(Rothstein等人，在Plant Mol.Cell.Biol.6：221-246(1989)中；Liu等人(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743和美国专利号5,759,829和5,942,657)。用于下调细胞分裂素氧化酶表达的方法和构建体描述于2004年4月2日提交的共同未决的美国临时专利申请：Cytokinin Oxidase-LikeSequences and Methods of Use，60/_________。
某些实施方案可同时包含增加的细胞分裂素生物合成和减少的细胞分裂素降解以导致提高的细胞分裂素活性。
多核苷酸
根据本发明的一个方面，提供了分离的多核苷酸SEQ ID NOS：26、28、30和32，所述分离的多核苷酸编码细胞分裂素代谢酶玉米细胞分裂素氧化酶，具有推导的此处显示为SEQ ID NOS：27、29、31和33的氨基酸序列，如2004年4月2日提交的共同未决的临时申请：Cytokinin Oxidase-Like Sequences and Methods of Use，60/_________中所公开的；和SEQ ID NO：38的玉米细胞分裂素氧化酶，编码SEQ ID NO：39，如于美国专利6,229,066和WO99/06571中所公开的。本发明也预期编码ipt(异戊烯基转移酶)的分离的多核苷酸(如在Molecular and General Genetics 216：388-394(1989)中提供的和在此处如SEQ ID NO：1提供的，其推导氨基酸序列是SEQID NO：2)的用途，以及分离自其它生物例如拟南芥或玉米的细胞分裂素生物合成基因(例如，ipt)的用途。
根据本发明的一个方面，提供了编码异戊烯基转移酶的分离的根癌土壤杆菌多核苷酸SEQ ID NO：1和其推导的氨基酸序列SEQ ID NO：2(Strabala等人，Mol.Gen.Genet.216，388-394(1989)；GenBankAccession X14410)；玉米Zag2.1启动子，SEQ ID NO：3(GenBankX80206)；CaMV 35s增强子，SEQ ID NO：4；玉米Zap启动子，SEQID NO：5(也称为ZmMADS；美国专利申请10/387,937；WO 03/078590)；玉米ckx1-2启动子，SEQ ID NO：6(美国专利公开2002-0152500 A1；WO 02/0078438)；玉米eep1启动子，SEQ ID NO：7(美国临时专利申请60/460,718)；玉米end2启动子，SEQ ID NO：8(美国专利6,528,704和美国专利申请10/310,191)；玉米lec1启动子，SEQ IDNO：9(美国专利申请09/718,754)；玉米F3.7启动子，SEQ ID NO：10(Baszczynski等人，Maydica 42：189-201(1997)；玉米tb1启动子，SEQ ID NO：17(Hubbarda等人，Genetics 162：1927-1935，December 2002)；玉米eep2启动子，SEQ ID NO：18、玉米硫氧还蛋白H启动子，SEQ ID NO：19，美国临时专利申请60/514,123)；玉米Zm40启动子，SEQ ID NO：20(美国专利6,403,862和WO 01/2178)；玉米mLIP15启动子，SEQ ID NO：23(美国专利6,479,734)；玉米ESR启动子，SEQ ID NO：24(2004年2月25日提交的美国申请10/786,679)；玉米PCNA2启动子，SEQ ID NO：25(2003年3月13日提交的美国10/388,359)；玉米细胞分裂素氧化酶和启动子，SEQID NOS：26-37(2004年4月2日提交的共同未决的临时申请，Cytokinin Oxidase-Like Sequences and Methods of Use，60/______)。
基于与拟南芥中指导花发育的AGAMOUS基因的同源性分离出玉米的ZAG2基因。(Schmidt等人，Plant Cell 5(7)：729-737，1993)ZAG2通常主要在发育中的雌小花中表达。ZAG2编码序列和大约2.1kb的5’序列于1995年9月以记录号X80206保藏于GenBank中。ZAG25’区域的部分在此处为SEQ ID No：3并被称为ZAG2.1启动子。
使用此处提供的信息，例如下面提供的多核苷酸序列，通过使用标准的克隆和筛选方法可获得编码细胞分裂素代谢酶多肽的本发明的多核苷酸。为通过使用下面给出的DNA序列获得编码蛋白的多核苷酸，可合成与已知的多核苷酸序列互补的寡核苷酸引物。然后可将这些引物用于从模板中扩增所述多核苷酸的PCR，所述模板来源于分离自想要的源材料的mRNA或基因组DNA。然后可将所得的扩增产物克隆入商业购得的克隆载体中，例如来自InVitrogen的TA系列载体。然后通过用根据原始序列设计的测序引物对单个克隆进行测序，可能在两个方向上延伸所述序列以确定全部基因序列。通过使用制备自质粒克隆的变性双链DNA进行这种测序。合适的技术描述于Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.的MOLECULAR CLONING，ALaboratory Manual(第二版，1989 Cold Spring Harbor Laboratory.见Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70中。
ipt基因的分离
本发明的异戊烯基转移酶(ipt)可从包括但不限于玉米、土壤杆菌属、萨氏假单胞菌(Psuedomonas savastano)、红球菌属(Rhodococcus)和欧文氏菌属(Erwinia)中获得。Strabala，T.J.等人的Isolation and characterization of an ipt gene from theTi plasmid Bo542，Mol.Gen.Genet.216，388-94(1989)提供了ipt基因的完整序列。可使用对基因合成领域内的技术人员熟知的DNA合成方法通过合成制备该基因的拷贝。可选择地，可直接从携带ipt基因的生物中分离所述基因拷贝，例如通过如WO 00/63401中所描述的PCR克隆，此处引用作为参考。
本发明的多核苷酸可以以RNA(例如mRNA)的形式或以DNA(包括例如cDNA和基因组DNA)的形式存在，所述多核苷酸可通过克隆获得或通过化学合成技术或通过其组合获得。所述DNA可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称作有义链，或其可以是非编码链，也称作反义链。
编码多肽的编码序列可与下面显示的多核苷酸的编码序列相同。其也可以是具有不同序列的编码下面显示的多肽的多核苷酸，所述不同序列是由于遗传密码的冗余(简并性)造成的。如下面更全面的讨论，这些可选择的编码序列是用于密码最优化的重要序列来源。
编码下面所列多肽的本发明多核苷酸可包括，但不限于，成熟多肽自身的编码序列；成熟多肽的编码序列和额外编码序列，例如编码前导序列或分泌序列(例如前(pre-)或原(pro-)或前原(prepro-)蛋白序列)的序列；成熟多肽的编码序列(具有或不具有前述额外编码序列)连同额外的非编码序列，所述额外的非编码序列包括例如，但不限于非编码的5’和3’序列，例如在转录(例如包括终止信号)、核糖体结合、mRNA稳定性元件中起作用的被转录的非翻译序列，和编码额外氨基酸，例如提供额外功能的氨基酸的额外编码序列。
所述DNA也可包含起着指导编码本发明的异源细胞分裂素调节酶的DNA转录的功能的启动子区域。异源定义为不是天然地与所述启动子序列一起存在的序列。尽管所述核苷酸序列对于启动子序列是异源的，但其可以是与所述植物宿主同源(天然的)或异源(外源的)。
此外，所述多肽与标记序列融合，所述标记序列是例如有助于纯化所述融合多肽的肽。在本发明这个方面的某些实施方案中，所述标记序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(Qiagen，Inc.)和PET系列载体(Novagen)提供的标记，其中，许多标记是商业可获得的。例如，如在Gentz等人的 Proc.Nat′l.Acad.Sci.，(USA)86：821-824(1989)中所描述的，六组氨酸为纯化融合蛋白提供了方便。例如，Wilson等人已在Cell 37：767(1984)中描述过，HA标记也可用于生成融合蛋白并对应于来源于流感血凝素蛋白的表位。
根据前述，如此处所用的术语“编码多肽的多核苷酸”包含含有编码本发明多肽，特别是具有下面所列氨基酸序列的细胞分裂素调节酶的序列的多核苷酸。所述术语包括含有编码多肽的单一连续区域或不连续区域(例如，被整合的噬菌体或插入序列或编辑打断)和额外区域(所述区域也可含有编码和/或非编码序列)的多核苷酸。
本发明进一步涉及编码具有下列推导的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物的本发明多核苷酸的变体。多核苷酸的变体可天然地存在的变体，例如天然存在的等位基因变体，或其可以是已知的非天然存在的变体。这种多核苷酸的非天然存在的变体可通过突变发生技术，包括应用于多核苷酸、细胞或器官的技术制备。
其中，变体在这点上是由于替代、缺失或添加产生的不同于前述多核苷酸的变体。所述替代可包括一或多个多核苷酸。所述变体可在编码或非编码区或两个区都发生改变。在编码区上的改变可产生保守或非保守氨基酸替代、缺失或添加。
其中，本发明实施方案在这点上是编码具有如下所列氨基酸序列的多肽的多核苷酸、其变体、类似物、衍生物和片段。
在这点上，进一步的是编码具有下列氨基酸序列(所述序列中有几个、少数几个、1至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或无氨基酸残基经受任何组合的替代、缺失或添加)的细胞分裂素生物合成酶的变体、类似物、衍生物和片段以及所述片段的变体、类似物和衍生物的多核苷酸。其中，这些多核苷酸是包含不改变细胞分裂素生物合成酶的性质和活性的沉默替代、添加和缺失；保守替代的多核苷酸和编码具有下列氨基酸序列、无替代的多肽的多核苷酸。
本发明的进一步实施方案包含多核苷酸(所述多核苷酸与编码具有下面提供的氨基酸序列的多核苷酸具有大于79％、至少80％或至少85％同一性)和与这些多核苷酸互补的多核苷酸。此外，某些实施方案是如下多核苷酸，所述多核苷酸编码在生物学功能或活性上与由下面提供的多核苷酸编码的成熟多肽相比保持基本相同或甚至表现增加的多肽。
本发明进一步涉及与此处上述序列杂交的多核苷酸。在这点上，本发明特别涉及在严格条件下与此处上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如此处所用的，术语“严格条件”是指只有当序列之间存在至少80％同一性时才会发生杂交。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”是指探针与其靶序列杂交达到高于与其它序列杂交的可检测程度(例如，至少高于本底2倍)时所处的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境下有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，严格条件可调整至允许一些序列错配，以使检测到更低程度的相似性(异源探测)。通常，探针在长度上小于大约1000个核苷酸，在长度上经常小于500个核苷酸。
一般地，严格条件是盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常在pH7.0至8.3时Na离子浓度(或其它盐)为大约0.01至1.0M，且对于短的探针(例如，10至50个核苷酸)温度至少是约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度至少是约60℃。严格性条件也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液于37℃下进行杂交和在50至55℃下在1X至2XSSC(20XSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格条件包括在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下进行杂交，和在0.5X至1XSSC中于55至60℃下进行洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交，和在0.1XSSC中于60至65℃下洗涤。
特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是最后洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，可近似地从Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284(1984)中的等式：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L计算获得Tm；其中M是单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰氨是杂交溶液中甲酰胺的百分比，和L是碱基对中杂合体的长度。Tm是50％的互补靶序列与充分配对的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每发生1％的错配Tm就下降大约1℃；因此，Tm、杂交和/或洗涤条件可调整至适合与具有想要的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有≥90％同一性的序列，Tm可下降10℃。通常在确定的离子强度和pH下选择比热解链温度(Tm)低大约5℃的严格条件用于特异性序列和其互补序列。然而，高度严格条件可在比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的温度上进行杂交和/或洗涤；中等严格条件可在比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的温度上进行杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的温度上进行杂交和/或洗涤。通过使用所述等式、杂交和洗涤组合物以及想要的Tm，本领域技术人员会理解可内在地描述杂交和/或洗涤溶液的严格度上的变化。如果想要的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，那么优选地增加SSC浓度以使可以使用更高的温度。杂交和/或洗涤条件可使用至少10、30、60、90、120或240分钟。在Tijssen的LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1部分，第2章″Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probeassays″，Elsevier，New York(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编著，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)中可查找到核酸杂交的详细说明。
例如，如此处关于本发明多核苷酸测定的另外的讨论，如上面讨论的本发明多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因组DNA的探针，以分离编码细胞分裂素生物合成酶的全长cDNAs和基因组克隆，以及分离具有与所述基因高度序列相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆。这种探针通常包括大约15至50个碱基。
本发明的多核苷酸和多肽可用作用于发现具有受调节的细胞分裂素活性的转基因植物的研究试剂和材料。本发明的多核苷酸(其是来源于下面序列的寡核苷酸)可在此处描述的方法中用作PCR引物，以确定此处被鉴定的此处鉴定的基因是否完整地或部分地在细胞分裂素累积组织中转录。
所述多核苷酸可编码成熟蛋白加额外的氨基或羧基末端氨基酸、或插入成熟多肽内部的氨基酸的多肽(例如，当成熟形式具有超过一个多肽链时)。除其它以外，这种序列可在将蛋白从前体加工至成熟形式中发挥作用，可允许蛋白运输，可延长或缩短蛋白的半衰期或可用帮助操作蛋白以进行测定或生产。如通常在体内的情况一样，通过细胞内的酶可将所述额外氨基酸从成熟蛋白中加工除去。
具有被融合至一个或多个序列原(prosequence)的多肽的成熟形式的前体蛋白可以是所述多肽的无活性形式。当序列原被去除后，该无活性前体通常被激活。在活化前，前体序列的一部分或全部可被除去。通常，这种前体被称为蛋白原(proprotein)。
总之，本发明的多核苷酸可编码成熟蛋白、成熟蛋白加前导序列(其可称为蛋白原)、具有一个或多个非蛋白原前导序列的序列原的成熟蛋白前体、或是具有前导序列和一个或多个序列原(通常可在产生活性和成熟形式的所述多肽的加工步骤中被除去)的蛋白原的前体，即前蛋白原。
多肽
本发明进一步涉及具有下面推导的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成的多肽。在某些实施方案中，其是重组多肽。
本发明也涉及这些多肽的片段、类似物和衍生物。当涉及所述多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指保持有这些多肽的至少90％的、至少95％的或基本相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过切割蛋白原的部分以产生活性成熟多肽而被激活的蛋白原。其中，本发明的实施方案在这点上是具有下面提供的细胞分裂素调节酶氨基酸序列的多肽、其变体、类似物、衍生物和片段以及所述片段的变体、类似物和衍生物。
下列多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中用保守或非保守的氨基酸残基(优选地保守的氨基酸残基)替代一个或多个氨基酸残基的多肽，并且该被替代的氨基酸残基可以是或可以不是被遗传密码编码的氨基酸残基，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含有取代基的多肽，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物，例如增加所述多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合的多肽，或(iv)其中额外氨基酸(例如前导或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或蛋白原序列)被融合至成熟多肽的多肽。这些片段、衍生物和类似物据信是通过本领域技术人员根据此处教导获得的。
其中，优选的变体是通过保守氨基酸替代从参考物变化而来的变体。这些替代是通过另一个具有相似特征的氨基酸替代多肽中给定的氨基酸的替代。通常被看作是保守替代的是在脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中一个对另一个的替代、羟基残基Ser和Thr的交换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的替代、碱性残基Lys和Arg的交换和芳族残基Phe、Tyr间的替代。
在这点上，进一步特别优选的是具有下面氨基酸序列的变体、类似物、衍生物和片段以及所述片段的变体、类似物和衍生物，在所述氨基酸序列中，有几个、少数几个、1至10个、1至5个、1至3个、2个、1个或没有氨基酸残基经过任何组合的替代、缺失或添加。在这些当中特别优选的是不改变细胞分裂素生物合成酶的特性和活性的沉默替代、添加和缺失。在这点上同样特别优选的是保守替代。最优选的是具有下面没有替代的氨基酸序列的多肽。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并且可被纯化至同质。
载体、宿主细胞、表达
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体、包含本发明载体的宿主细胞和通过重组技术产生本发明多肽。
载体
根据本发明的这个方面，所述载体可以是例如质粒载体、单链或双链噬菌体载体、单链或双链RNA或DNA病毒载体。通过熟知的用于将DNA和RNA导入细胞的技术可将这些载体作为多核苷酸(特别是DNA)导入细胞内。在噬菌体和病毒载体的情况下，通过熟知的用于转染和转导的技术也可将所述载体导入和优选地以包裹的或衣壳化的病毒导入细胞中。病毒载体可以是具有复制能力的或复制缺陷型的。在后者的情况下，病毒的繁殖通常只能在互补的宿主细胞中发生。
在某些方面，其中优选的载体是用于表达本发明的多核苷酸和多肽的载体。通常，这些载体包含用于在宿主中有效地表达、可操作地连接至要表达的多核苷酸上的顺式作用控制区域。合适的反式作用因子由宿主提供、由互补载体提供或由载体自身在导入宿主后提供。
在这点上，在某些优选的实施方案中，载体提供优选表达。这种优选表达可以是诱导型表达或受时间的限制或被局限于主要在某些类型的细胞中或可以是上述的任何组合的表达。在诱导型的载体中特别优选的是由可以容易操作的环境因素例如温度和营养添加物诱导表达的载体。各种适合本发明这个方面的载体(包括用于原核和真核宿主的组成型和诱导型表达载体)为本领域技术人员所熟知并被常规使用。其中，这类载体包括染色体、附加型和来源于病毒的载体，例如来源于细菌质粒、来自噬菌体、来自转座子、来自酵母附加型、来自插入元件、来自酵母染色体元件、来自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒、例如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒的载体以及来自其组合的载体，例如来自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒和用于土壤杆菌介导的转化的二元载体。所有载体都可用于根据本发明这个方面的表达中。
通过例子提供下列可商业购得的载体。优选的用于细菌的载体之中有可从Qiagen获得的pQE70、QE60和pQE-9、可从Stratagene获得的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A，以及可从Pharmacia获得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。优选的真核载体之中有从Stratagene获得的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG以及从Pharmacia获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。有用的植物二元载体包括从Clontech获得的BIN19和其衍生物。这些载体仅仅是以说明许多商业可获得的和熟知的载体的方式列出，所述载体是本领域技术人员可获得的根据本发明的这个方面进行使用的载体。应当认识到到任何其它的适合用于例如在宿主中导入、维持、繁殖或表达本发明多核苷酸或多肽的质粒或载体可用于本发明的这个方面，下面更加详细地公开了其中几个。
通常，表达构建体含有用于转录起始和终止的位点和在所转录的区域中用于翻译的核糖体结合位点。由所述构建体表达的成熟转录物的编码部分包括位于起始的启动翻译的AUG和恰当地位于被转录多肽末端的终止密码子。
此外，所述构建体可包含调节和产生表达的控制区域。通常，根据许多普通实践方法，除了其它以外，这些区域通过控制转录起作用，例如转录因子、阻遏物结合位点和终止信号。为了将翻译的蛋白分泌至内质网腔申、分泌至周质空间或至细胞外环境中，可将合适的分泌信号整合入表达的多肽中。这些信号对于所述多肽可以是内源的或其可以是异源信号。
通过将增强子序列插入载体中可增加通过高等真核细胞进行的编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是起着在给定的宿主细胞类型中增加启动子转录活性作用的DNA顺式作用元件，通常大约为10至300bp。增强子的例子包括位于bp100至270的复制起点晚期侧(latesite)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多形瘤增强子和腺病毒增强子。另外的用于本发明以增强导入的DNA片段转录的增强子特别地包括病毒增强子，例如位于35S启动子内的增强子，如Odell等人在 Plant Mol.Biol.10：263-72(1988)中所显示的，和来自opine基因的增强子，如Fromm等人在Plant Cell 1：977(1989)中所描述的。增强子可影响包含于载体中的序列的组织特异性和/或时间特异性表达。例如，构建体可包含与驱动ipt(SEQ ID NO：1)的zag2.1启动子(SEQ ID NO：3)以“头对头”方向排列的CaMV 35s增强子(SEQ ID NO：4)。
通过在合适的位点终止转录，终止区域也有助于有效地表达。用于实践本发明的有用终止子包括，但不限于，pinII(参见An等人，Plant Cell 1(1)：115-122(1989))、glb1(参见Genbank Accession#L22345)、gz(参见gzw64a终止子，Genbank Accession #S78780)和来自土壤杆菌的nos终止子。
其中已知的适合用于一般化表达的真核启动子是CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTRs启动子例如劳斯肉瘤病毒(“RSV”)的启动子、金属硫蛋白启动子例如小鼠金属硫蛋白-I启动子和各种植物启动子例如球蛋白-1(globulin-1)。在可能的时候，可使用细胞分裂素调节酶基因的固有启动子。原核启动子的代表包括噬菌体λPL启动子、大肠杆菌的lac、trp和tac启动子，仅举少数几个众所周知的启动子。
对于植物，种子优选的启动子的例子包括种子贮藏蛋白的启动子(Thompson等人；BioEssays；.10：108(1989))，例如对于双子叶植物，为豆β-菜豆蛋白启动子、napin启动子、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)启动子和大豆凝集素启动子，所述启动子以高度受调节的方式在种子中表达这些蛋白。对于单子叶植物，用于本发明实践的启动子包括但不限于玉米15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27Kdγ-玉米醇溶蛋白启动子(例如gzw64A启动子，参见Genbank Accession #S78780)、Waxy启动子、shrunken-1启动子、球蛋白-1启动子(参见Genbank Accession #L22344)、ltp2启动子(Kalla等人，Plant Journal 6：849-860(1994)；美国专利5,525,716)、cim1启动子(参见美国专利6,225,529)玉米end1和end2启动子(参见2002年12月4日提交的美国专利6,528,704和申请10/310,191)、nuc1启动子(美国专利6,407,315)、Zm40启动子(美国专利6,403,862)、eep1(SEQ ID NO：7)和eep2(SEQ ID NO：18)、lec1(美国专利申请09/718,754)、硫氧还蛋白H启动子(美国临时专利申请60/514,123)、mlip 15启动子(美国专利6,479,734)、PCNA2启动子、SEQ ID NO：25和shrunken-2启动子。(Shaw等人，Plant Phys 98：1214-1216，1992；Zhong Chen等人，PNAS USA 100：3525-3530，2003)。然而，其它用于本发明实践的启动子对本领域技术员来说是已知的，例如nucellain启动子(参见C.Linnestad等人，Nucellain，A Barley Homolog of the DicotVacuolar-Processing Proteasem is Localized in Nucellar CellWalls，Plant Physiol.118：1169-80(1998)、kn1启动子(参见S.Hake和N.Ori，The Role of knottedl in Metistem Functions，B8：INTERACTIONS AND INTERSECTIONS IN PLANT PATHWAYS，COEURD′ALENE，IDAHO，KEYSTONE SYMPOSIA，February 8-14，1999，at 27.)和F3.7启动子(Baszczynski等人，Maydica 42：189-201(1997)；SEQ ID NO：10)。在空间上起作用的启动子，例如glb1(胚优选的启动子)、或γ玉米醇溶蛋白(胚乳优选的启动子)、或在胚周围区域具有活性的启动子(参见2004年2月25日提交的美国专利申请10/786,679)、或BETL1(参见G.Hueros等人，Plant Physiology121：1143-1152(1999)和Plant Cell 7：747-57(June 1995))，是特别有用的，包括优选地在雌性生殖组织中有活性的启动子和在分生组织，特别是在分生雌性生殖组织中有活性的启动子。
本发明也预期在时间上起作用的启动子的用途。在授粉后(DAP)0-25天起作用的启动子是优选的，在4-21、4-12或8-12DAP起作用的启动子也一样是优选的。在这点上，启动子例如cim1和ltp2是优选的。也可使用授粉后-14至0天起作用的启动子，例如SAG12(参见WO 96/29858，Richa rd M.Amasino，published 3 Oct.1996)和ZAG1或ZAG2(参见R.J.Schmidt，等人；Identification andMolecular Characterization of ZAG1，the Maize Homolog of theArabidopsis Floral Homeotic Gene AGAMOUS，Plant-Cell 5(7)：729-37(July 1993)。也参见SEQ ID NO：3)。
有用的启动子包括玉米zag2.1(SEQ ID NO：3)、Zap(SEQ IDNO：5，也称作ZmMADS；美国专利申请10/387,937；WO 03/078590)；玉米tb1启动子(SEQ ID NO：17；也参见Hubbarda等人，Genetics162：1927-1935，2002)。
用于在植物中一般性表达的合适启动子的例子是核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的启动子、来自根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒的启动子，例如胭脂碱合酶和章鱼碱合酶启动子，以及病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。
应当理解大量未提到的启动子适用于本发明的这个方面，所述启动子是众所周知的并且本领域技术人员通过此处讨论和实施例中说明的方式可容易地使用所述启动子。例如，本发明预期使用(当合适时)天然的细胞分裂素生物合成酶启动子，以在重组环境中驱动酶的表达。
用于繁殖和表达的载体通常包括选择标记。这些标记也可适用于扩增或者所述载体可包含用于该目的的另外的标记。在这点上，所述表达载体优选地包含一个或多个选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征。优选的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因、和用于培养大肠杆菌和其它原核生物的四环素或氨苄青霉素抗性基因。卡那霉素和除草剂抗性基因(PAT和BAR)通常用于植物体系。
使用在物理上紧邻导入的DNA片段的选择标记基因以使转化的细胞能够通过阳性遗传选择或筛选得以回收。选择标记基因也使得能够对转基因植物群体保持选择压，以确保转基因植物保持导入的DNA片段和其控制启动子和增强子。
许多一般使用的用于植物转化的阳性选择标记基因已从细菌中分离出来，并且编码在代谢上解除选择化学试剂的毒性的酶，所述化学试剂可以是抗生素或除草剂。其它阳性选择标记基因编码对抑制剂不敏感的改变了的靶。
用于植物转化的选择标记基因的例子是与选择试剂双丙氨酰膦一起使用的BAR或PAT基因。Spencer等人，J .Theor.Appl′d Genetics 79：625-631(1990)。另一个有用的选择标记基因是分离自Tn5的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，当所述基因被置于植物调节信号的控制之下时赋予对卡那霉素的抗性。Fraley等人， Proc. Nat′l Acad.Sci.(USA)80：4803(1983)。提供对抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因是有用的选择标记的进一步例子。VandenElzen等人， Plant Mol.Biol.5：299(1985)。另外的源于细菌的赋予对抗生素抗性的阳性选择标记基因包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3-腺嘌呤转移酶和博来霉素抗性决定簇。Hayford等人， Plant Physiol.86：1216(1988)；Jones等人， Mol.Gen.Genet.210：86(1987)；Svab等人， Plant Mol. Biol.14：197(1990)；Hille等人， Plant Mol.Biol.7：171(1986)。
其它用于植物转化的阳性选择标记基因不是细菌来源的。这些基因包括小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合成酶。Eichholtz等人， Somatic Cell Mol.Genet.13：67(1987)；Shah等人， Science 233：478(1986)；Charest等人， Plant Cell Rep.8：643(1990)。
另一类用于用DNA序列进行植物转化的标记基因要求筛选假定被转化了的植物细胞，而不是就对毒性物质例如抗生素的抗性直接对转化的细胞进行遗传选择。因为这些基因可被融合至基因或基因的调节序列以用于研究基因的表达，所以其特别适用于定量或观察在特定组织中DNA序列表达的空间模式并且通常被称作报告基因。一般使用的用于筛选假定被转化的细胞的基因包括β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson， Plant Mol. Biol.Rep.5：387(1987)；Teeri等人， EMBO J.8：343(1989)；Koncz等人， Proc.Nat′l Acad.Sci.(USA)84：131(1987)；DeBlock等人， EMBO J.3：1681(1984)。另一个鉴定相对稀少的转化事件的方法已使用了编码玉米花色素苷色素形成途径的显性组成型调节剂的基因(Ludwig等人， Science 247：449(1990))。
可通过任何各种已知的和常规技术将合适的DNA序列插入载体中。通常，通过用一个或多限制性内切核酸酶切割DNA序列和表达载体，然后用T4DNA连接酶将限制片段连接起来，从而将用于表达的DNA序列连接入表达载体中。所述序列可以以正向或反向的方向插入。在这一点上可使用的用于限制和连接的方法对本领域技术人员来说是熟知和常规的。在这点上，在Sambrook等人的MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，第2版；Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中对使用可选择的对本领域技术人员来说也是熟知和常规的技术构建表达载体的合适方进行了十分详细的阐述。
通过使用标准技术通常将编码本发明多肽的异源结构序列的本发明多核苷酸插入载体中，以使其可操作地连接至用于表达的启动子上。确定所述多核苷酸的位置以使转录起始位点适当地位于核糖体结合位点的5’。所述核糖体结合位点将位于启动要表达的多肽的翻译的AUG的5’。一般地，不存在其它的从起始密码子(通常是AUG)开始并位于核糖体结合位点和起始密码子之间的可读框。同样，一般地，在所述多肽的末端存在翻译终止密码子，且在用于真核宿主的构建体中存在多聚腺苷酸化信号。恰当地置于被转录区域的3’末端的转录终止信号也可包含在所述多核苷酸构建体中。
使用各种熟知的技术可将含有如此处别的地方所描述的合适的DNA序列和合适的启动子以及其它合适的控制序列的载体导入适合于在其中表达想要的多肽的宿主中。本发明也涉及含有上述构建体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是高等真核细胞例如植物细胞，或低等真核细胞例如酵母细胞，或者所述宿主细胞可以是原核细胞例如细菌细胞。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、阳离子脂类介导的转染、电穿孔、转导、摩擦加载(scrape loading)、冲击(ballistic)导入、感染或其它方法可实现将构建体导入宿主细胞中。这些方法描述于许多标准实验室手册中，例如Davis等人的BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，(1986)和Sambrook等人的MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)中。
合适的宿主的代表例子包括细菌细胞，例如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌(streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。植物细胞可来源于广泛的植物类型，特别是单子叶植物，例如包括高粱(Sorghum bicolor)和玉米的禾本科的物种，和双子叶植物，例如大豆(Glycine max)和低芥酸芥子(欧洲油菜(Brassica napus)，芜青(Brassica rapa ssp.))。优选地，植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、低芥酸芥子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿和高粱；然而，本发明的分离核酸和蛋白可用于来自下列属的物种：凤梨属(Ananas)、金鱼草属(Antirrhinum)、拟南芥属(Arabidopsis)、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、Browaalia、山茶属(Camellia)、辣椒属(Capsicum)、Ciahorium、柑桔属(Citrus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Cofea)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、毛地黄属(Digitalis)、无花果属(Ficus)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、蕃薯属(Ipomoea)、胡桃属(Juglans)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、番茄属(Lycopersicon)、Majorana、杧果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、芭蕉属(Musa)、Nemesis、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、驴食草属(Onobrychis)、稻属(Oryza)、Panieum、天竺葵属(Pelargonium)、狼尾草属(Pennisetum)、鳄梨属(Persea)、碧冬茄属(Petunia)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、番石榴属(Psidium)、毛茛属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、蔷薇属(Rosa)、Salpiglossis、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、茄属(Solanum)、白芥属(Sinapis)、高粱属(Sorghum)、可可树属(Theobroma)、小麦属(Triticum)、车轴草属(Trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。
本发明的启动子区域可分离自任何植物，包括，但不限于玉米(玉米；Zea mays)、低芥酸芥子(欧洲油菜(Brassica napus)、芜青(Brassica rapa ssp.))、紫苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryzasativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(普通小麦(Triticumaestivum))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(咖啡属(Cofea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔树(柑桔属(Citrus spp.))、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属(Musaspp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、杧果(Mangifera indica)、油橄榄(Oleaeuropaea)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选的植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、低芥酸芥子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿和高粱。
用于许多种类的表达构建体的宿主是众所周知的，并且通过本公开内容本领域技术人员能够容易地选择用于表达根据本发明这个方面的多肽的宿主。
可将经工程改造的宿主细胞培养在可以被修饰作为适合于(尤其是)激活启动子、选择转化体或扩增基因的常规营养培养基上。对本领域技术人员而言显而易见的是，前面用于经选择用于表达的宿主细胞的培养条件，例如温度、pH等，通常适合于本发明多肽的表达。
在合适启动子的控制之下可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。通过使用来自本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可用于生产这些蛋白。
在转化合适的宿主株系和使所述宿主株系生长至合适的细胞密度后，当选择的启动子是诱导型的时，其可通过合适的方法(例如，温度转换或暴露于化学诱导物中)进行诱导并将细胞再培养一段时间。
然后通常通过离心收集细胞，用物理或化学方法破坏细胞，并将所得的粗提取物保留用于进一步纯化。可通过任何方便的方法破坏用于表达蛋白的微生物细胞，包括冷冻-融化循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂；这些方法对本领技术人员是熟知的。
植物转化方法
按照本领域已知的技术可将本发明分离的核酸导入植物中。一般地，制备如上所述的和适合于转化植物细胞的重组表达盒。用于转化广泛的高等植物物种的技术是众所周知的并且描述于技术、科学和专利文献中。参见，例如Weising等人的 Ann.Rev.Genet.22：421-477(1988)。例如，使用例如电穿孔、PEG穿孔、粒子轰击、硅纤维递送，或植物原生质体的显微注射或胚发生的愈伤组织直接将DNA构建体导入植物细胞的基因组DNA中。可选择地，可将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区域组合并导入常规的根癌土壤杆菌宿主载体中。当细胞被细菌感染后，根癌土壤杆菌宿主的侵入性功能将指导构建体和邻近的标记插入所述植物细胞DNA中。参见，美国专利号5,591,616。
在Paszkowski等人的 Embo J.3：2717-2722(1984)中描述了使用聚乙二醇沉淀导入DNA构建体。电穿孔技术描述于Fromm等人的Proc.Natl.Acad.Sci(USA)82：5824(1985)。轰击转化技术描述于Klein等人的 Nature 327：70-73(1987)和Tomes，D.等人的IN：Plant Cell，Tissue and Organ Culture：FundamentalMethods，Eds，O.L.Gamborg和G.C.Phillips，第8章，pgs.197-213(1995).(也参见Tomes等人的美国专利5,886,244；6,258,999；6,570,067；5,879,918)。
根癌土壤杆菌介导的转化技术很好地描述于科学文献中。参见，例如Horsch等人的 Science 233：496-498(1984)，和Fraley等人的 Proc.Natl.Acad.Sci(USA)80：4803(1983)。尽管土壤杆菌主要用于双子叶植物，但某些单子叶植物也可通过土壤杆菌转化。例如用土壤杆菌转化玉米描述于美国专利号5,550,318中。
其它的转染或转化方法包括(1)发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)介导的转化(参见，例如，Lichtenstein和Fuller In：Genetic Engineering，第6卷，PWJ Rigby，Ed.，London，AcademicPress，1987；和Lichtenstein，C.P.，和Draper，J，In：DNACloning，Vol.II，D.M.Glover，Ed.，Oxford，IRI Press，1985)，1988年4月7日公开的申请PCT/US87/02512(WO 88/02405)描述了发根土壤杆菌A4株系和其Ri质粒连同根癌土壤杆菌载体pARC8或pARC16的用途(2)脂质体介导的DNA吸收(参见，例如，Freeman等人的Plant Cell Physiol.25：1353，1984)，(3)涡旋方法(参见，例如，Kindle， Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)87：1228，(1990)。
如Zhou等人的 Methods in Enzymology，101：433(1983)；D.Hess，Intern.Rev.Cytol.，107：367(1987)；Luo等人的 PlantMol. Biol.Reporter，6：165(1988)所描述的，通过指导DNA转入花粉也可将DNA导入植物中。如Pena等人的 Nature 325：274(1987)中所描述的，通过将DNA注射入植物的生殖器官中可获得多肽编码基因的表达。如Neuhaus等人的 Theor.Appl.Genet.，75：30(1987)；和Benbrook等人在 Proceedings Bio Expo.1986，Butterworth，Stoneham，Mass.，pp.27-54(1986)中所描述的，也可将DNA直接注射入未成熟胚的细胞中并再水化干燥的胚。各种用作载体的植物病毒在本领域是已知的，并且包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒群、雀麦草花叶病毒和烟草花叶病毒。
转化的植物的再生
可培养通过任何上述转化技术产生的转化的植物细胞以再生出具有所述转化的表型的完整植株。这种再生技术通常依赖于在组织培养基中进行某些植物激素处理，通常依赖于已与本发明的多核苷酸一起被导入的杀生物剂和/或除草剂标记。关于玉米的转化和再生参见，例如，美国专利5,736,369。
根据标准的植物组织培养技术可从例如单个细胞、愈伤组织或叶盘中再生出用植物表达载体转化的植物细胞。在本领域众所周知的是，来自几乎任何植物的各种细胞、组织和器官均可成功地培养以再生出完整的植株。来自培养的原生质体的植物的再生描述于Evans等人的Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant CellCulture，Macmillilan Publishing Company，New York，pp.124-176(1983)；和Binding，Regeneration of Plants，PlantProtoplasts，CRC Press，Boca Raton，pp.21-73(1985)中。
如Horsch等人的 Science，227：1229-1231(1985)中所描述的，可实现从叶外植体中再生出含有通过土壤杆菌导入的外源基因的植物。在该方法中，如Fraley等人在 Proc.Nat′l.Acad.Sci. (U.S.A).，80：4803(1983)中所描述的，使转化体在选择试剂存在的情况下并在诱导转化的植物物种再生出枝条的培养基中进行生长。该方法通常在2至4周内产生枝条，然后将这些转化体枝条转移至合适的生根诱导培养基中，所述培养基含有选择试剂和防止细菌生长的抗生素。本发明的转基因植物可以是可育的或不育的。
也可从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这些再生技术通常描述于Klee等人的 Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486(1987)中。来自单个植物原生质体或各种外植体的植物再生在本领域中是众所周知的。参见，例如，Methods for Plant MolecularBiology，A.Weissbach和H.Weissbach，eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1988)。该再生和培养方法包括选择转化体细胞和枝条、使转化的枝条生根并使小植株生长在土壤中的步骤。关于玉米细胞培养和再生，通常参见，The Maize Handbook，Freeling和Walbot，Eds.，Springer，N.Y.(1994)；Corn and CornImprovement，第3版，Sprague和Dudley Eds.，American Societyof Agronomy，Madison，Wisconsin(1988)。
本领域技术人员认识到在重组表达盒被稳定地整合入转基因植物中并被确定为可操作的后，可通过有性杂交将其导入至其它植物中。可使用许多标准杂交技术中的任何一种，这视被杂交的物种而定。
在营养繁殖的作物中，通过采取插条或通过组织培养技术可繁殖成熟的转基因植物以产生多个相同的植物。进行需要的转基因选择和获得新的变种并进行营养繁殖以备商业使用。在经种子繁植的作物中，成熟的转基因植物可通过自交产生纯合的自交植物。所述自交植物产生包含新导入的异源核酸的种子。可使这些种子生长以产生可产生选择表型的植物。成熟转基因植物也可与其它合适的植物杂交，所述合适的植物通常是另一种自交植物或杂种植物，包括，例如，等基因非转化自交植物。
获自再生植物的部分，例如花、种子、叶、枝条、果实等都包含于本发明中，前提是所述部分包含含有本发明的分离核酸的细胞。再生植物的后代和变体以及突变体也包含于本发明范围内，前提是这些植物包含导入的核酸序列。
通过例如标准的免疫印迹和DNA检测技术可筛选表达选择标记的转基因植物中本发明的核酸传递。通常也估计转基因系的异源核酸的表达水平。起初可确定RNA水平的表达，以鉴定和定量表达阳性的植物。可使用标准的RNA分析技术，并且所述技术括使用设计用来只扩增异源RNA模板的寡核苷酸引物进行的PCR扩增测定和使用异源核酸特异性探针进行的溶液杂交测定。然后通过使用本发明的特异性反应抗体进行蛋白免疫印迹分析来对所述RNA阳性植物的蛋白表达进行分析。此外，通过分别使用异源核酸特异性多核苷酸探针和抗体可进行根据标准方案的原位杂交和免疫细胞化学，以在转基因组织内定位表达位点。一般地，通常会筛选大量转基因系的整合核酸以鉴定和选择具有最合适表达特征的植物。
一些实施方案包含转基因植物，所述转基因植物是加入的异源核酸纯合子；即，含有两个加入的核酸序列的转基因植物，其中所述加入的核酸序列是位于染色体对的各染色体上相同基因座的一个基因。通过有性交配(自交)含有单个加入的异源核酸的杂合(aka半合子)转基因植物可获得纯合的转基因植物，将一些产生的种子萌发并分析所产生的植物，以观察相对于对照植物(即，天然的，非转基因的)改变了的本发明的多核苷酸的表达。也预期了与亲本植物进行回交和与非转基因植物、或与具有相同或另外的一个或多个性状的转基因的植物进行异型杂交。
也预期所述转化的植物将可用于传统的育种程序中，包括公开于US 5,706,603和US 5,704,160中的顶交(TOPCROSS)授粉系统，其各公开内容在此引用作为参考。
多核苷酸测定
如例如PCT公开US89/00709中所描述的，本发明也涉及将细胞分裂素生物合成酶多核苷酸用于标记以帮助育种程序。在进行分析之前所述DNA可直接用于检测或可使用PCR进行酶促扩增(Saiki等人， Nature 324：163-166(1986))。也可以以相同方式使用RNA或eDNA。作为例子，与编码细胞分裂素生物合成酶的核酸互补的PCR引物可用于鉴定和分析细胞分裂素生物合成酶的存在和表达。通过使用PCR，存在于特定组织或植物变种中的基因可通过分析所述组织或变种的基因型来进行表征。例如，通过扩增产物与参照序列的表型相比较的大小变化可检测缺失和插入。通过将扩增的DNA与放射性标记的细胞分裂素生物合成酶RNA或可选择地，与放射性标记的细胞分裂素生物合成酶反义DNA序列进行杂交来鉴定点突变。通过RNA酶A消化或通过解链温度上的差异可将优选地配对的序列从错配双链体中区分开来。
通过直接的DNA测序也可揭示参照基因和具有突变的基因之间的序列差异。此外，可将克隆的DNA片段用作探针以检测特异性DNA片段。通过PCR或另一种扩增方法的合理使用可大大增强这些方法的灵敏度。例如，将测序引物与双链PCR产物或由修饰的PCR产生的单链模板分子一起使用。通过使用放射性标记的核苷酸的常规方法或通过带荧光标记的自动测序方法进行序列确定。
通过在变性剂存在或不存在的情况下，在凝胶中检测DNA片段的电泳迁移率的改变可获得基于DNA序列差异的各种植物变种的基因分型。通过高分辨率凝胶电泳可显示小序列缺失和插入。在变性的甲酰胺梯度凝胶上可区分不同序列的DNA片段，在所述凝胶中不同DNA片段的迁移率根据其特异性解链或部分解链温度而被阻滞在凝胶中的不同位置。(参见，例如，Myers等人的 Science，230：1242(1985))。
通过核酸酶保护测定，例如RNA酶和S1保护或化学断裂也可显示特定位置上的序列变化(例如Cotton等人， Proc.Nat’l.Acad. Sci.，(USA)，85：4397-4401(1985))。
因此，通过例如杂交、RNA酶保护、化学断裂、直接的DNA测序列或使用限制性内切酶(例如，限制性片段长度多态性(“RLFP”))和基因组DNA的DNA印迹的方法可实现对特异性DNA序列的检测。
除了更常规的凝胶-电泳和DNA测序列外，通过原位分析也可检测突变。
例如通过DNA测序测定可确定突变。通过本领域已知的方法处理样品以捕获RNA。通过加入寡核苷酸引物从所述RNA样品中合成cDNA的第一条链，所述引物由与所述mRNA上的区域杂交的序列组成。加入逆转录酶和脱氧核苷酸以使合成cDNA的第一条链。基于本发明的细胞分裂素调节酶的DNA序列合成引物序列。所述引物序列通常由至少15个连续碱基组成，且可包含至少30个或甚至50个连续碱基。
通过各种技术也可在DNA水平上检测在本发明的基因中携带突变或多态性的细胞。所述DNA可直接用于检测或在分析之前可通过使用PCR进行酶促扩增(Saiki等人， Nature，324：163-166(1986))。也可使用RT-PCR检测突变。特别优选的是使用与自动检测系统例如GeneScan相结合的RT-PCR。RNA或cDNA也可用于相同的目的，PCR或RT-PCR。作为例子，可使用与编码细胞分裂素生物合成酶的核酸互补的PCR引物鉴定和分析突变。代表性引物的例子显示于下面。例如，通过扩增产物与正常表型相比的大小变化可检测缺失和插入。可通过将扩增的DNA与放射性标记的RNA或可选择地，与放射性标记的反义DNA序列杂交来确定点突变。尽管通过RNA酶A消化或通过解链温度上的差异可将优选配对的序列从错配的双链体中区分开，但优选地通过序列分析来鉴定点突变。用于在ipt基因中检测突变或多态性的引物：
引物序列
5’GCGTCCAATGCTGTCCTCAACTA3’
5’GCTCTCCTCGTCTGCTAACTCGT3’
上述引物可用于扩增分离自来源于单个植物的样品的细胞分裂素生物合成酶cDNA或基因组克隆。本发明也提供了具有从5’和/或3’末端删除1、2、3或4个核苷酸的上述引物。所述引物可用于扩增分离自个体的基因，从而使所述基因可接着进行各种技术检测以阐明DNA序列。通过该方法，可鉴定DNA序列上的突变。
多肽测定
本发明也涉及诊断测定，例如用于检测细胞和组织中细胞分裂素生物合成酶水平(包括确定正常和异常水平)的定量和诊断测定。因此，例如，根据本发明用于检测细胞分裂素生物合成酶与正常对照组织样品相比的表达的诊断测定可用于检测不能接受水平的表达。可用于在来自植物来源的样品中确定本发明的多肽水平的测定技术对本领域技术人员来说是熟知的。这类测定方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、蛋白印迹分析和ELISA测定。其中，ELISAs通常是优选的。ELISA测定最初包括制备对所述多肽特异性的抗体，优选地是单克隆抗体。此外，通常制备与单克隆抗体结合的报告抗体。所述报告抗体被附着上可检测的试剂，例如放射性、荧光或酶试剂，在本例子中是辣根过氧化物酶。
为进行ELISA，从宿主中取出样品并在固体支持物例如聚苯乙烯皿中进行温育，所述固体支持物可与样品中的蛋白结合。接着通过与非特异性蛋白例如牛血清清蛋白温育将皿上任何游离的蛋白结合位点覆盖。接着，在皿中用单克隆抗体进行温育，在温育期间所述单克隆抗体附着至附着在聚苯乙烯皿上的任何细胞分裂素生物合成酶上。用缓冲液洗涤除去未结合的单克隆抗体。将连接至辣根过氧化物酶的报告抗体放入皿中，导致所述报告抗体与任何结合至细胞分裂素生物合成酶上的单克隆抗体结合。然后将未附着的报告抗体洗涤除去。接着将用于显示过氧化物酶活性的试剂包括比色底物加入皿中。通过一抗和二抗连接至细胞分裂素生物合成酶上的被固定的过氧化物酶产生了有色的反应产物。在给定时间段内的显色量指示存在于样品中的细胞分裂素生物合成酶的量。定量结果通常通过参照标准曲线获得。
可使用竞争测定，其中将对细胞分裂素生物合成酶特异性的抗体附着至固体支持物上，并使标记的来源于宿主的酶在固体支持物上流过。被检测到的附着在固体支持物上的标记的量可与样品中细胞分裂素生物合成酶的量相关。
抗体
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达它们的细胞可用作免疫原以产生针对其的抗体。这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明也包括嵌合的、单链的和人源化的抗体，以及Fab片段、或Fab表达文库的产物。可使用各种本领域已知的方法生产这些抗体和片段。
产生的抗对应于本发明序列的多肽的抗体可通过将所述多肽直接注射入动物，或通过给动物(优选地非人的动物)施用所述多肽获得。然后将这样获得的抗体与所述多肽自身结合。通过这种方式，甚至只编码多肽的片段的序列都可用于产生结合所述完整天然多肽的抗体。然后可将这些抗体用于分离来自表达该多肽的组织的多肽。
为制备单克隆抗体，可使用任何提供通过连续的细胞系培养物产生的抗体的技术。产生人单克隆抗体的例子包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.， Nature 256：495-497(1975))、三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，ImmunologyToday 4：72(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，pg.77-96于MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY中，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系是本发明的另一方面。
(美国专利号4,946,778)中所描述的用于生产单链抗体的技术可适合于生产针对本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。同样，转基因小鼠或其它生物例如其它动物可用于表达针对本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。
上述抗体可用于分离或鉴定表达所述多肽的克隆，或通过将所述抗体附着在用于通过亲和层析分离和/或纯化的固体支持物上来纯化本发明的所述多肽。
多肽衍生物包括抗原上或免疫学上等同的形成本发明特定方面的衍生物。
此处所使用的术语“抗原等同衍生物”包括被某些抗体特异性识别的肽或其等同物，当产生针对本发明的蛋白或多肽的抗体时，所述抗体干扰了抗体与其关联抗原之间的直接物理相互作用。
如此处所使用的术语“免疫学等同衍生物”包括肽或其等同物，当所述肽或其等同物以合适的制剂用于在脊椎动物中产生抗体时，产生了干扰抗体和其关联抗原之间直接物理相互作用的抗体。
将所述多肽例如抗原或免疫学等同衍生物或其融合蛋白用作抗原以免疫小鼠或其它动物，例如大鼠、豚鼠、山羊、兔、绵羊、牛或鸡。融合蛋白可为所述多肽提供稳定性。所述抗原可与免疫原性载体蛋白例如牛血清清蛋白(BSA)或匙孔血蓝蛋白(KLH)通过缀合连接。可选择地，包含多拷贝蛋白或多肽的多抗原肽，或其抗原或免疫学等同的多肽可具有足够抗原性以提高免疫原性，从而免去载体的使用。
可选择地，噬菌体展示技术可用于选择具有与多肽结合活性的抗体基因，所述抗体基因来自PCR扩增的来自经筛选具有抗Fbp的人淋巴细胞的v-基因库谱或来自原始(naive)文库(McCafferty，J.等人(1990)， Nature 348：552-554；Marks，J.等人，(1992)Biotechnology 10：779-783)。通过链改组(chain shuffling)也可提高这些抗体的亲和力(Clackson，T.等人，(1991) Nature 352：624-628)。
应当对所述抗体再次筛选以寻找对所述多肽和/或融合蛋白具有高度亲和力的抗体。
如上所述，可制备最终抗体的片段。
所述抗体可以是Mr大约为150,000的完整抗体或是其衍生物，例如如描述于Sierra，A和Pluckthun，A.， Science 240：1038-1040(1988)中的Fab片段或Fv片段。如果存在两个抗原结合结构域，那么各结构域可以抗不同表位-称作“双特异性”抗体。
如上所述，本发明的抗体可通过常规方法制备，例如通过已建立的单克隆抗体技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature，256：495-497(1975))或使用重组方法，例如组合文库，例如如在Huse，W.D.等人的 Science 246：1275-1281(1989)中描述的。
优选地通过在合适的表达系统，例如上述用于表达本发明多肽的系统中表达编码所述抗体的DNA聚合物来制备抗体。用于表达系统的载体的选择将部分由宿主决定，所述宿主可以是原核细胞，例如大肠肝菌(优选地株系B)或链霉菌属物种，或真核细胞例如小鼠C127、小鼠骨髓瘤、人HeLa、中国苍鼠卵巢、丝状或单细胞真菌或昆虫细胞。所述宿主也可以是转基因动物或转基因植物，例如如Hiatt，A.等人的 Nature 340：76-78(1989)中所描述的。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和重组病毒(例如来源于杆状病毒和痘苗病毒)。
也可通过酶处理，例如使用木瓜蛋白酶从Fc部分切割出Fab部分，从而从亲本单克隆抗体制备Fab片段。
细胞分裂素生物合成酶结合分子和测定
本发明也提供了用于鉴定分子例如结合分子的方法，所述结合分子结合细胞分裂素生物合成酶。通过大量本领域技术人员已知的方法，例如配体淘选法和FACS分选法可鉴定编码与酶结合的蛋白例如结合蛋白的基因。这些方法描述于许多实验室手册，例如Coligan等人的Current Protocols in Immunology 1(2)：Chapter 5(1991)。
例如，表达克隆可用于该目的。为此，从表达分裂素生物合成酶的细胞中制备聚腺苷酰化RNA，从该RNA建立cDNA文库，将所述文库分成集合体(pool)，并单个地将集合体转染入不表达所述酶的细胞中。然后将被转染的细胞暴露于标记的酶中。可通过各种熟知的技术标记所述酶，所述技术包括放射性碘化或引入用于位点特异性蛋白激酶的识别位点的标准方法。暴露后，细胞被固定并且酶的结合被确定。这些方法可在玻璃载玻片上方便地进行。
集合体是已鉴定的产生细胞分裂素生物合成酶结合细胞的cDNA。从这些阳性的集合体中制备亚集合体，将其转染入宿主细胞中并如上所述进行筛选。通过使用重复的亚集合体化和再筛选方法，可分离一个或多个编码假定的结合分子的单个克隆。
可选择地，标记的配体可通过光亲和连接至细胞提取物上，例如从表达其结合的分子例如结合分子的细胞中制备的膜或膜提取物。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(“PAGE”)可分辨交联的材料并暴光于X射线胶片。可将含有配体结合的标记的复合物切下来，分解成肽片段并接受蛋白微量测序。获自微量测序的氨基酸序列可用于设计单一的或简并的寡核苷酸探针以筛选cDNA文库来鉴定编码假定的结合分子的基因。
本发明的多肽也可用于估计细胞或无细胞制剂中的细胞分裂素生物合成酶结合分子(例如结合分子)的细胞分裂素生物合成酶结合能力。
本发明的多肽也可用于估计例如细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中的小分子底物和配体的结合。这些底物和配体可以是天然的底物和配体或可以是结构或功能模拟物。
抗细胞分裂素生物合成酶抗体代表本发明预期的有用的结合分子种类。
拮抗剂和激动剂-测定法和分子
本发明也提供了筛选化合物以鉴定增强或阻断细胞分裂素生物合成酶对细胞的作用，例如与底物分子相互作用的化合物的方法。拮抗剂是降低所述酶的天然生物学功能的化合物。在这点上被靶向的特定的酶是细胞分裂素氧化酶。
可能的拮抗剂包括与细胞分裂素氧化酶结合并因此抑制或消除其活性的有机小分子、肽、多肽和抗体。可能的拮抗剂也可以是结合至结合分子例如细胞分裂素氧化酶结合分子的相同位点上的有机小分子、肽、多肽，例如紧密相关的蛋白或抗体，其不诱导细胞分裂素代谢酶诱导的活性，从而通过排斥酶的结合而阻止酶的作用。
可能的拮抗剂包括结合至并占据多肽的结合位点因而阻止与细胞结合分子例如结合分子结合的小分子，这样就阻止了正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于有机小分子、肽或样分子。
其它可能的拮抗剂包括影响编码细胞分裂素生物合成酶的基因表达的分子(例如反式激活抑制剂)。其它可能的拮抗剂包括反义分子。通过反义DNA或RNA或通过双螺旋或三螺旋的形成，反义技术可用于控制基因表达。例如，在Okano，J.Neurochem.56：560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)中对反义技术进行了讨论。例如在Lee等人的 Nucleic Acids Research 6：3073(1979)；Cooney等人的 Science 241：456(1988)；和Dervan等人的 Science 251：1360(1991)中对三螺旋的形成进行了讨论。所述方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。例如，编码本发明成熟多肽的多核苷酸的5’编码部分可用于设计长度在大约10至40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸设计用来与参与转录的基因区域互补，因而阻止了细胞分裂素生物合成酶的转录和产生。所述反义RNA寡核苷酸在体内与所述mRNA杂交，并阻断了将mRNA分子翻译成细胞分裂素生物合成酶。也可将上面描述的寡核苷酸递送入细胞以使反义RNA或DNA可在体内表达，从而抑制细胞分裂素生物合成酶的产生。
本发明的DNAs也可用于共抑制或沉默细胞分裂素代谢酶基因；例如，如PCT专利申请公开WO 98/36083中描述的。
拮抗剂可用于例如在植物细胞内增加细胞分裂素的水平和/或降低可获得的生长素。
可选择地，本发明提供了用于筛选激动剂的方法，所述激动剂是起着增强酶的天然生物学功能的分子。在这点上靶包括酶，例如ipt、β-葡糖苷酶和iaa-1。
可能的激动剂包括与生物合成酶结合并因此刺激或增加其活性的有机小分子、肽、多肽和抗体。可能的激动剂也可以是结合在结合分子例如ipt结合分子的位点上并且提高细胞分裂素代谢酶诱导的活性，并因此而增强酶的作用的有机小分子、肽、多肽，例如紧密相关的蛋白或抗体。
可能的激动剂包括小分子，所述小分子结合并占据酶的变构位点因而促进与细胞结合分子例如底物的结合，这使得正常的生物学活性得以增强。小分子的例子包括但不限于有机小分子、肽或肽样分子。
其它可能的激动剂包括影响编码细胞分裂素合成酶的基因表达的分子(例如反式激活蛋白)。
构建体和性状的“堆积(stacking)”
在某些实施方案中本发明的核酸序列可与其它目的多酸苷酸序列组合(“堆积”)使用以给植物生成想要的表型。可与任何基因或基因的组合堆积本发明的多核苷酸，并且产生的组合可包含任何一个或多个目的多核苷酸的多个拷贝。所述想要的组合可影响一个或多个性状；即，可生成某些组合以用于调节影响细胞分裂素活性的基因的表达。例如，上调细胞分裂素合成可与下调细胞分裂素氧化酶表达组合。其它组合可设计用来产生具有各种想要的性状的植物，包括但不限于用于动物饲料的所需性状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如，经修饰的贮藏蛋白(2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429))，其公开内容在此引用作为参考。也可以将本发明的多核苷酸与需要的性状堆积，所述性状包括对昆虫、疾病或除草剂的抗性(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；串珠镰孢菌素(fumonisin)解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变体；谷氨酰胺合酶的抑制剂，例如膦丝菌素或草铵膦(basta)(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；和想要的用于加工或处理产品所需的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶(β-ketothiolase)、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bactedol.170：5837-5847)有助于聚羟基链烷酸(polyhydroxyalkanoates)(PHAs)的表达)，其公开内容在此引用作为参考。也可以将本发明的多核苷酸与影响农学性状的多核苷酸组合，所述性状是例如雄性不育(例如，参见美国专利号5,583,210)、茎杆强度、开花时间或转化技术学性状，例如细胞周期调节或基因靶向(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)，其公开内容在此引用作为参考。
可通过任何方法来生成这些堆积组合，所述方法包括但不限于通过任何常规的或顶交方法学进行的杂交植物育种、或基因转化。如果所述性状是通过遗传转化植物堆积的，那么目的多核苷酸序列可在任何时间和以任何顺序进行组合。例如，包含一个或多个想要性状的转基因植物可用作通过后来的转化引入进一步性状的靶。使用由任意转化盒的组合提供的目的多核苷酸以共转化方法可同时引入所述性状。例如，如果要导入两个序列，则可将两个序列包含于分开的转化盒中(反式)或包含于相同的转化盒中(顺式)。目的序列的表达可通过相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，导入可抑制目的多核苷酸表达的转化盒可能是需要的。其可以由任何其它的抑制盒或超表达盒相伴以在植物中产生需要的性状组合。
在育种方法中的用途
本发明的转化植物可用于植物育种程序中。植物育种的目的是将各种所需的性状组合在单个变种或杂种中。对于大田作物，这些性状可包括，例如对疾病和昆虫的抗性、对热和干旱的耐受力、减少作物成熟时间、增加产量和更好的农学品质。由于用机械收割许多作物，因此统一的植物特征例如萌发和植物群丛(stand)建立、生长速度、成熟以及植物和穗的高度是需要的。传统植物育种在开发新的和改善的商业作物中是非常重要的工具。如此处所描述的，本发明包括用于通过将第一亲本玉米植株与第二亲本玉米植株杂交产生玉米植株的方法，其中一个或两个亲本玉米植株是展现增强的活力的转化植物。
本领域已知的和用于玉米植物育种程序的植物育种技术包括但不限于轮回选择、集团选择、混合选择、回交、谱系育种、开放传粉育种、限制性片段长度多肽性增强的选择、遗传标记增强的选择、单位体加倍和转化。这些技术经常被组合使用。
在玉米植物育种程序中玉米杂种的开发通常需要开发出纯合自交系，将这些系杂交并估计杂交结果。有许多可获得的估计杂交结果的分析方法。最早和最传统的分析方法是观察表型性状。可选择地，可考察植物的基因型。
通过使用植物育种领域内众所周知的传统育种技术可将通过使用转化技术经工程导入特定玉米植物中的遗传性状转入另外的系中。例如，一般使用回交方法将转基因从转化的玉米植株转移至原种自交系中，于是所得的后代将包含转基因。同样，如果将自交系用于转化，那么可将所述转基因植物与不同的自交植物杂交以产生转基因杂种玉米植物。如此处所用的，“杂交”可以指样品X被Y杂交，或回交过程，这视上下文而定。
在玉米植物育种程序中开发培育玉米杂种包括三个步骤：(1)从各种种质库中选择植物用于最初育种杂交；(2)将从育种杂交中选择的植物自交数代以产生系列自交系，所述系列自交系尽管相互不同，但为纯种并且高度一致；和(3)将选择的自交系与不同的自交系杂交以产生杂种。在玉米的育种过程中，系的活力降低。当两个不同的自交系杂交产生杂种时活力得以恢复。自交系的纯合性和同质性的重要结果是通过确定的成对自交系杂交生成的杂种总是相同的。一旦产生超级杂种的自交系已被鉴定，则只要保持着自交系亲本的同质性就可源源不断地繁殖杂交种子。
本发明的转基因植物可用于生产单杂交杂种、三杂交或双杂交杂种。当两个自交系杂交产生F1后代时就产生了单杂交杂种。双杂交杂种是通过四个自交系成对(AXB和CXD)杂交，然后将两个F1杂种再杂交(AXB)X(CXD)产生的。三杂交杂种产自三个自交系，其中先将两个自交系杂交(AXB)，然后将所得的F1杂种与第三个自交系杂交(AXB)XC。许多由F1杂种展现的杂种活力和一致性在第二代(F2)丢失。因此，由杂种产生的种子是用于消费的而不是用于种植的。
根据本发明，提供了允许在种子中启动转录的核苷酸序列。本发明的序列包含与种子形成和种子组织相关的转录起始区域。因此，本发明的组合物包含用于调节序列的新的核苷酸序列。
提供了用于通过使用此处公开的转录起始序列在植物中表达分离的核苷酸序列的方法。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.在MOLECULAR CLONING，A Laboratory Manual(第2版1989 ColdSpring Harbor Laboratory)中描述了合适的技术。所述方法包括用包含可操作地连接至本发明的启动子的分离核苷酸序列的转化载体转化植物细胞和从转化的植物细胞再生出稳定转化的植物。通过这种方法，将启动子用于以种子优选的方式控制内源和外源产物的表达。
提供种子表型修饰的目的序列在种子优选的启动子区域的转录起始的调节下。这种修饰包括调节内源产物的产生(关于量、相对分布等)、或外源表达产物的产生以在种子中提供新的功能或产物。
“种子优选的”是指偏向于在种子中，包括至少在胚、核、果皮、胚乳、珠心、糊粉、花梗等中的表达。
“调节元件”是指负责相关编码序列的组织优选的和时间上优选的表达的序列，包括启动子、终止子、增强子、内含子等。
“启动子”是指通常包含能够指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点启动RNA合成的TATA框的DNA调节区域。启动子可额外地包含其它通常位于TATA框的上游或5’的识别序列，被称作上游启动子元件，其影响转录起始速率。应当认识到在鉴定了此处公开的启动子区域的核苷酸序列后，进一步分离和鉴定位于此处鉴定的特定启动子区域上游的5’非翻译区的调节元件在本领域的技术水平之内。因而此处公开的启动子区域通常被进一步定义为包含上游调节元件，例如负责编码序列的组织优选的和时间优选的表达的元件、增强子等。通过相同的方式，使表达能够在想要的组织例如种子中进行的启动子元件可被鉴定、分离，并且与其它核心启动子一起使用，从而确定种子优选的表达。
可修饰本发明分离的启动子序列以提供分离的核苷酸序列表达水平的范围。可使用小于完整启动子区域的区域并且保持驱动种子优选的表达的能力。然而，要认识到由于所述启动子序列的部分缺失，mRNA的表达水平可能会降低。因此，启动子可被修饰成弱或强启动子。通常“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”是指大约1/10,000转录物至大约1/100,000转录物至大约1/500,000转录物的水平。相反地，强启动子以高水平驱动编码序列的表达，或以大约1/10转录物至大约1/100转录物至大约1/1,000转录物的水平。通常，至少大约20个分离的启动子序列的核苷酸可用于驱动核苷酸序列的表达。
要认识到为了增加转录水平，可将增强子与本发明的启动子区域组合使用。增强子是增加启动子区域表达的核苷酸序列。增强子在本领域是已知的并且包括SV40增强子区域、35S增强子元件等。
本发明的启动子可分离自侧翼连接有其各自编码序列的转录起始位点的5’非翻译区。同样，终止子可分离自侧翼连接有其各自编码序列的终止密码子的3’非翻译区。
术语“分离的”是指材料，例如核酸或蛋白，所述材料是：(1)基本上或本质上不含在所述材料天然存在的环境中发现的通常伴随或与其相互作用的成分或(2)如果所述材料存在于其天然环境中，则所述材料已经通过有意的人为干涉被改变成组合物和/或被置于细胞内不同于所述材料原始位点的位点上。用于启动子区域分离的方法在本领域是众所周知的。启动子区域eep1的序列是SEQ ID NO：7所示序列。启动子区域eep2的序列是SEQ ID NO：18所示序列。
SEQ ID NO：7所示的eep1启动子长度为960个核苷酸。在翻译起始位点的上游308bp处发现推定的CAAT基元和在翻译起始位点的上游139bp处发现推定的TATA基元。所述启动子分离自在4和6DAP胚囊以及5和7DAP完整核的玉米组织文库中发现的EST序列。通过在种子发育的早期阶段在种子组织中提供表达，eep1启动子可解决表达问题。
SEQ ID NO：18所示的eep2启动子长度为1027个核苷酸。所述启动子分离自在4DAP(授粉后天数)胚囊的玉米组织文库中发现的EST序列，并且对早期核和胚乳表达是高度特异的，如由EST在文库中的分布和Lynx MPSS特征所确定的。
本发明的启动子区域可分离自任何植物，包括但不限于，玉米(玉米；Zea mays)、低芥酸芥子(欧洲油菜(Brassica napus)、芜青(Brassica rapa ssp.))、紫苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryzasativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghumvulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(普通小麦(Triticumaestivum))、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属(Cofea spp.))、椰子(Cocosnucifera)、凤梨(Ananas comosus)、柑桔树(柑桔属(Citrus spp.))、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属(Musa spp.))、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、杧果(Mangifera indica)、油橄榄(Oleaeuropaea)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选的植物包括玉米、大豆、向日葵、红花、低芥酸芥子、小麦、大麦、黑麦、苜蓿和高粱。
来自其它植物的启动子序列可根据熟知的基于其序列与此处所列启动子序列同源的技术进行分离。在这些技术中，将已知启动子序列的全部或部分用作探针，所述探针可与其它存在于来自选择的生物的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中的序列选择性杂交。可使用在本领域易于获得的用于核酸序列杂交的方法以获得对应于本发明启动子的序列。
完整的启动子序列或其部分可用作能特异性地与对应的启动子序列杂交的探针。为在各种条件下实现特异性杂交，这些探针包含唯一的并且长度优选地为至少大约10个核苷酸和最优选地长度至少为大约为20个核苷酸的序列。通过众所周知的聚合酶链反应(PCR)方法可将这些探针用于扩增来自选择的生物的相应的启动子序列。该技术可用于分离来自需要的生物的额外启动子序列或用作确定所述启动子序列存在于生物中的诊断测定。例子包括铺平板的DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或菌落；参见例如Innis等人的(1990)PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications，eds.，AcademicPress)。
通常，对应于本发明启动子序列和与此处公开的启动子序列杂交的序列与此处公开的序列具有至少50％同源性、55％同源性、60％同源性、65％同源性、70％同源性、75％同源性、80％同源性、85％同源性、90％同源性、95％同源性和甚至98％同源性或更高。
下列术语用于描述两个或更多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参照序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性百分比”，和(d)“相当大同一性”。
(a)如此处所用的，“参照序列”定义为用作序列比较基础的序列。参照序列可以是特定序列的亚群或整体；例如全长启动子序列的片段或完整的启动子序列。
(b)如此处所用的，“比较窗口”涉及多核苷酸序列的邻接和特定片段，其中所述多核苷酸序列可与参照序列比较，并且其中与参照序列(不包含添加或缺失)相比，在比较窗口内的多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即，缺口)，以用于两个序列的最佳比对。通常，比较窗口在长度上至少是20个邻接的核苷酸，并且在长度上任选地可以是30、40、50、100或更多个邻接的核苷酸。本领域技术人员理解为了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而造成的与参照序列高度的相似性，通常引入缺口罚分并且从匹配数目中减去缺口罚分。
(c)如此处所用的，“序列同一性百分比”是指通过比较两个在比较窗口上最佳比对的序列确定的值，其中为了两个序列的最佳比对，与参照序列(不包含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分比是通过下述方法来计算的：确定在两个序列上存在相同核酸碱基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口内的总的位置数目并将结果乘以100，从而产生序列同一性百分比。
(d)术语多核苷酸序列的“相当大同一性”是指通过使用一个用标准参数描述的比对程序与参照序列进行比较，多核苷酸包含具有至少70％序列同一性、优选地至少80％、更优选地至少90％和最优选地至少95％序列同一性的序列。
用于比较的比对序列的方法在本领域是熟知的。基因比较可通过在缺省参数下对与包含于BLAST“GENEMBL”数据库中的序列的同一性进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，等人，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410；也参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索来确定。在缺省参数下使用BLASTN算法可将序列与所有包含于GENEMBL数据库的公开可获得的DNA序列的同一性进行分析。与本发明序列的同一性表示具有至少65％序列同一性、更优选地至少70％序列同一性、更优选地至少75％序列同一性、更优选地至少80％序列同一性、更优选地至少85％序列同一性、更优选地至少90％序列同一性和最优选地至少95％序列同一性的多核苷酸，其中所述百分比序列同一性是基于完整启动子序列的。
为了定义本发明的目的，使用了GAP(Global AlignmentProgram)。GAP使用了Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)的算法以发现能够使匹配数目最大化和使缺口数目最小化的两个完全序列的比对。GAP考虑所有可能的比对和缺口位置，并且生成了具有最大匹配碱基数目和最少缺口数目的比对。其使得能够在匹配的碱基单位中提供缺口生成罚分和缺口延伸罚分。GAP必须对其插入的每个缺口的匹配数目使用缺口生成罚分。如果选择大于零的缺口延伸罚分，那么GAP还要对每个插入的缺口使用缺口长度乘以缺口延伸罚分。在Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)第10版中，用于蛋白序列的缺省缺口生成罚分值和缺口延伸罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列的缺省缺口生成罚分是50，而缺省缺口延伸罚分是3。所述缺口生成和缺口延伸罚分可表示为选自0至200的整数。因此，例如，缺口生成和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP提供了最佳比对的家族中的一员。可能有许多这种家族的成员，但没有其它成员具有更好的质量。GAP展示了用于比对的四个优良指数：质量、比例、同一性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的指标。比例是质量除以在更短片段上的碱基数目。百分比同一性是实际匹配的符号的百分比。百分比相似性是相似的符号的百分比。忽略跨过缺口的符号。当用于符号配对的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，给相似性评分。用于Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)第10版中的评分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
具有与本发明的序列高百分比同一性的序列片段也指此处公开的特定启动子序列片段，所述起动子序列片段提高了可操作连接的分离的核苷酸序列的种子优选的表达。这些片段包含此处公开的特定启动子核苷酸序列的至少大约20个邻接的核苷酸、优选地至少大约50个邻接的核苷酸、更优选地至少大约75个邻接的核苷酸、更优选地至少大约100个邻接的核苷酸。这些片段的核苷酸通常包含特定启动子序列的TATA识别序列。通过使用限制性内切酶切割此处公开的天然存在的启动子序列、通过合成来自天然存在的DNA序列的核苷酸序列或通过使用PCR技术可获得这些片段。特别参见，Mullis等人的(1987)Methods Enzymol.155：335-350，和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press，New York)。同样，这些片段的变体，例如由定点诱变造成的变体包含于本发明的组合物中。
含有SEQ ID NO：10所示序列的至少大约20个邻接的序列的核苷酸序列被包含在内。可通过杂交、PCR等分离这些序列。这些序列包含能够驱动种子优选表达的片段、用作鉴定相似序列的探针的片段以及负责时间或组织特异性的元件。
本发明的组合物也包含所述启动子序列的生物学活性变体。调节“变体”是经修饰的启动子形式，其中一个或多个碱基已被修饰、除去或添加。例如，除去部分DNA序列的常规方法是使用与DNA扩增结合的外切核酸酶，以产生双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于该目的的商业试剂盒以商品名为Exo-SizeTM出售(New England Biolabs，Beverly，Mass.)。简而言之，该方法需要用外切核酸酶III与DNA一起温育以在DNA模板上的5’突出端、平端或切口处按3’至5’方向逐个切除核苷酸。但，外切核酸酶III不能切除在3’，4碱基突出端的核苷酸。使用该酶的克隆的时控的消化产生单向嵌套缺失。
调节序列变体的一个例子是通过在更大的启动子上产生一个或多个缺失形成的启动子。如Zhu等人在The Plant Cell 7：1681-89(1995)中所描述的，启动子中最远至靠近转录起始位点的TATA框的5’部分可以缺失而不失去启动子活性。这些变体应当保持启动子活性，特别是驱动在种子或种子组织中表达的能力。生物学活性变体包括，例如，具有一个或多个核苷酸替代、缺失或插入的本发明的天然调节序列。通过RNA印迹分析、使用转录融合时的报告基因活性测量等可测量活性。参见，例如，Sambrook等人的(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，此处引用作为参考。
当可操作地与分离的核苷酸序列连接时，本发明公开的种子优选的启动子的核苷酸序列以及其变体和片段可用于任何植物的遗传操作，所述分离的核苷酸序列在控制之下表达以获得想要的表型应答。“可操作地连接”是指分离的核苷酸序列的转录或翻译在所述调节制序列的影响之下。通过这种方式，可将用于本发明启动子的核苷酸序列与用于在目的植物中(更特别地在所述植物的种子中)表达的分离的核苷酸序列一起提供在表达盒中。这种表达盒具有多个用于插入在启动子转录控制下的核苷酸序列的限制位点。
在本发明的启动子指导下表达的目的基因可用于改变种子的表型。通过增加种子中内源或外源产物的表达可实现这种改变。可选择地，通过提供降低一个或多个内源产物，特别是种子中的酶或辅因子的表达可达到结果。这些修饰导致转化种子的表型改变。要认识到启动子可与其天然编码序列一起使用以增加或降低表达，从而导致转化种子中表型的改变。
用于本发明目的的目的基因的一般类别包括例如涉及信息例如锌指的基因类别；涉及通讯例如激酶的基因类别；和涉及管家例如热激蛋白的基因类别。更特定的转基因类别包括编码农学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性和谷物特征的重要性状的基因。其它的转基因类别包括用于诱导外源产物，例如来自植物和其它真核以及原核生物的酶、辅因子和激素表达的基因。要认识到任何目的基因，包括天然编码序列都可以可操作地连接至本发明的调节元件并在种子中表达。
影响谷物性状的修饰包括增加油酸的含量或改变饱和与不饱和脂肪酸的水平。同样，增加赖氨酸和含硫氨基酸的水平以及改变种子中淀粉的类型和含量可以是需要的。在1997年4月10日提交的WO9416078；1997年3月26日提交的WO 9638562；1997年3月26日提交的WO 9638563和1997年12月30日授权的美国专利号5,703,409中描述了Hordothionin蛋白修饰；其公开内容在此引用作为参考。另一个例子是由描述于1996年3月20日提交的WO 9735023中的大豆2S清蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白，以及来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106，各公开内容都在此引用作为参考。
可通过定点诱变制备下列基因的衍生物以增加被编码多肽中预选的氨基酸水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因来源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，1996年11月1日提交的WO 9820133，其公开内容在此引用作为参考。其它蛋白包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如来自向日葵种子(Lilley等人(1989)Proceedings of theWorld Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foodsand Animal Feedstuffs；Applewhite，H.(ed.)；American OilChemists Soc.，Champaign，IL：497-502，在此引用作为参考)、玉米(Pedersen等人，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人，(1988)Gene 71：359，二者都在此引用作为参考)和水稻(Musumura等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，此处引用作为参考)的蛋白。其它重要的基因编码葡聚糖、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
通过改变基因的表达可改善种子中的农学性状，所述基因是在环境协迫期间影响种子生长和发育应答的基因，Cheikh-N等人(1994)Plant Physiol.106(1)：45-51)和控制糖类代谢以减少玉米中核败育的基因，Zinselmeier等人(1995)Plant Physiol.107(2)：385-391。这些基因包括，例如，编码细胞分裂素生物合成酶的基因，例如异戊烯基转移酶；编码细胞分裂素分解代谢酶例如细胞分裂素氧化酶的基因；编码参与调节细胞周期的多肽例如细胞周期蛋白D或cdc25的基因；编码细胞分裂素受体或传感蛋白例如CRE1、CKI1和CKI2、组氨酸磷酸递质(phospho-transmitter)或细胞分裂素应答调节物的基因。
昆虫抗性基因可编码对造成产量大大降低的害虫例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。这些基因包括，例如：苏云金芽孢杆菌内毒素基因，(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；Geiser等人(1986)Gene 48：109)；凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825)等。
编码疾病抗性性状的基因包括：解毒基因，例如抗fumonosin的基因(1995年6月7日提交的WO 9606175)；无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因，Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089；等。
商业性状也可以编码在基因上，所述基因可以改变或增加例如用于纸张、纺织品和乙醇生产的淀粉或提供具有其它商业用途的蛋白表达。转化植物的另外的重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如于1997年2月11日授权的美国专利号5,602,321中所描述的。基因例如B-酮硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见Schubert等人的(1988)J.Bacteriol 170(12)：5837-5847)有助于聚羟基链烷酸(PHAs)的表达。
外源产物包括植物的酶和产物以及来自其它包括原核生物和其它真核生物的来源的产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可增加种子蛋白(特别是经修饰的具有改善的氨基酸分配以提高种子营养价值的种子蛋白)的水平。通过表达这类具有增加的氨基酸含量的蛋白来实现该目的。
可操作地连接至此处公开的调节元件的核苷酸序列可以是被靶向的基因的反义序列。“反义DNA核苷酸序列”是指以与所述核苷酸序列的5’至3’正常方向相反的方向排列的序列。当反义DNA序列被递送入植物细胞后，其表达会阻止被靶向的基因的DNA核苷酸序列的正常表达。所述反义核苷酸序列编码与内源信使RNA(mRNA)互补并能与其杂交的RNA转录物，所述信使RNA由被靶向的基因的DNA核苷酸序列的转录产生。在这种情况下，由所述被靶向的基因编码的天然蛋白的生产受到了限制从而达到了需要的表型应答。因此此处公开的调节序列可以可操作地连接至反义DNA序列以减少或抑制植物种子中天然蛋白的表达。
所述表达盒也包括在植物中发挥功能的位于分离的目的核苷酸序列3’末端的转录和翻译终止区域。所述终止区域对于本发明的启动子核苷酸序列可以是天然的，对于目的DNA序列可以是天然的，或可以来源于其它来源。
其它便利的终止区域可从根癌土壤杆菌的Ti-质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区域。也参见：Guerineau等人的(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人的(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人的(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人的(1990)Gene91：151-158；Ballas等人的1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；Joshi等人的(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
所述表达盒可另外含有5’前导序列。这种前导序列可以增强翻译。翻译前导序列在本领域是已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如：EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)，Elroy-Stein等人(1989)Proc.Nat Acad.Sci.USA 86：6126-6130；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)，Allison等人(1986)；MDMV前导序列(玉米矮缩花叶病毒)，Virology 154：9-20；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak等人(1991)Nature353：90-94；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)，Jobling等人(1987)Nature 325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie等人(1989)Molecular Biology ofRNA，pages 237-256；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)Lommel等人(1991)Virology 81：382-385。也参见Della-Cioppa等人的(1987)Plant Physiology 84：965-968。所述盒也可包含增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。
在想要使分离的核苷酸序列的表达产物导向特定的细胞器，特别是质体、造粉体，或导向内质网、或分泌至细胞表面或细胞外的情况下，所述表达盒可进一步包含用于转运肽的编码序列。这种转运肽在本领域是众所周知的，并且包括，但不限于：用于酰基载体蛋白的转运肽、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亚基、植物EPSP合酶等。
在制备表达盒过程中，可操作各种DNA片段，以便以正确的方向和适当地以正确的阅读框架提供DNA序列。为此，可使用连接物或接头连接DNA片段或可通过其它操作以提供方便的限制位点，除去多余的DNA，除去限制位点等。为此，可涉及体外诱变、引物修复、限制酶切消化、退火和再替代例如转换和颠换。
如此处所指出的，本发明提供了能够在调节元件控制下表达目的基因的载体。通常，所述载体应当在植物细胞中发挥功能。有时，具有在大肠杆菌中发挥功能(例如，用于生产抗体的蛋白的生产、DNA序列分析、插入片段的构建、获得核酸的量)的载体可以是优选的。在Sambrook等人的(同上)中讨论了用于在大肠杆菌中进行克隆和表达的载体和方法。
包含可操作地连接至表达盒中的分离的核酸上的本发明启动子的转化载体也可包含至少一个额外的将要共转化入生物的基因的核苷酸序列。可选择地，可在另一个转化载体上提供所述额外序列。
在植物中发挥功能的载体可以是来源于土壤杆菌的二元质粒。这种载体能够转化植物细胞。这些载体包整合入宿主(植物)染色体中所必需的左边界和右边界序列。至少，在这些边界序列之间是在本发明调节元件控制下表达的基因。在一个实施方案中，也包含了选择标记和报告基因。为容易地获得足够量的载体，可使用能在大肠杆菌中进行复制的细菌复制起点。
报告基因可包含于转化载体中。本领域已知的合适的报告基因的例子可在例如：Jefferson等人的(1991)Plant Molecular BiologyManual，ed.Gelvin等人(Kluwer Academic Publishers)，pp.1-33；DeWet等人的(1987)Mol.Cell.Biol.7：725-737；Goff等人的(1990)EMBO J.9：2517-2522；Kain等人的(1995)BioTechniques 19：650-655；和Chiu等人的(1996)CurrentBiology 6：325-330中找到。
用于选择转化细胞或组织的选择标记基因可包含于转化载体中。这些基因可包括赋予抗生素抗性或抗除草剂抗性的基因。合适的选择标记基因的例子包括但不限于：编码抗氯霉素(HerreraEstrella等人(1983)EMBO J.2：987-992)、甲氨蝶呤(HerreraEstrella等人(1983)Nature 303：209-213；Meijer等人(1991)PlantMol.Biol.16：807-820)、潮霉素(Waldron等人(1985)Plant Mol.Biol.5：103-108；Zhijian等人(1995)Plant Science 108：219-227)、链霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.210：86-91)、壮观霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)Transgenic Res.5：131-137)、博来霉素(Hille等人(1990)Plant Mol.Biol.7：171-176)、磺胺(Guerineau等人(1990)Plant Mol.Biol.15：127-136；溴苯腈(Stalker等人(1988)Science 242：419-423)、草甘膦(Shaw等人.(1986)Science 233：478-481)、膦丝菌素(DeBlock等人(1987)EMBO J.6：2513-2518)抗性的基因。
其它在转基因事件的回收中起作用的但在最终的产品中可能不需要的基因可包括但不限于：GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)(Jefferson(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387)、GFP(绿色荧光蛋白)(Chalfie等人(1994)Science 263：802)、萤光素酶(Teeri等人(1989)EMBOJ.8：343)和编码花色素苷生产的玉米基因(Ludwig等人(1990)Science 247：449)。
包含本发明特定调节序列的、可操作地连接至表达盒中的目的分离的核苷酸序列的转化载体可用于转化任何植物。通过这种方式，可获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。转化方案可根据被靶向用于进行转化的植物或植物细胞的种类，即单子叶植物或双子叶植物而变化。转化植物细胞的合适方法包括，显微注射，Crossway等人(1986)Biotechniques 4：320-334；电穿孔，Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606；土壤杆菌介导的转化，参见例如，Townsend等人美国专利号5,563,055；直接基因转移，Paszkowski等人(1984)EMBO J.3：2717-2722；和轰击微粒加速，参见例如，Sanford等人，美国专利号4,945,050；Tomes等人(1995)in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；和McCabe等人(1988)Biotechnology 6：923-926。也参见Weissinger等人(1988)Annual Rev.Genet.22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology 6：923-926(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology 8：736-740(稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)Biotechnology6：559-563(玉米)；Klein等人(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooydaas-Van Slogteren等人(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet等人(1985)in TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.G.P.Chapman等人(Longman，New York)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9：415-418；和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(颈须(whisker)-介导的转化)；D.Halluin等人(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports 12：250-255和Christou等人(1995)Annals of Botany 75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(通过根癌土壤杆菌转化的玉米)，所有文献都在此处引用作为参考。
按照常规的方法可使已被转化的细胞生长成植物。参见，例如McCormick等人的(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后可使这些植物生长并用相同的转化株系或不同株系授粉，然后可鉴定所得的具有需要的表型特征的种子优选表达的植物。可以生长两代或更多代以确保稳定地保持和遗传需要的表型特征的种子优选表达。
实施例
通过下列实施例对本发明作进一步描述。通过参考特定的实施方案，所述实施例仅用于提供说明本发明。这些范例，尽管说明本发明的某些特定方面，但不描述公开的本发明范围的限制或约束。很明显可在所附的权利要求的范围内实践某些改变和修饰。
在前述的术语表中对此处所用的某些术语进行了解释。
除非另有详细说明，使用本领域技术人员熟知且常规的标准技术实施所有实施例。下列实施例中的常规分子生物学技术可按标准实验室手册，例如Sambrook等人的MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1989)中所描述的进行。
除非另外说明，所有下列实施例所示的份或量都以重量计算。
除非另外规定，使用Sambrook等人的MOLECULAR CLONING：ALABORATORYMANUAL，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)和其它大量文献，例如Goeddel等人的Nucleic Acids Res.8：4057(1980)中标准的琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(“PAGE”)技术进行下列实施例中的片段大小分离。
除非另有描述，使用标准的缓冲液、温育温度和时间、大约等摩尔量的待连接的DNA片段和每0.5微克DNA大约10单位的T4 DNA连接酶完成连接。
实施例1：用于细胞分裂素生物合成酶的时间和空间种子优选表 达的载体系统的构建
PHP11466和PHP11467及其其合体(cointegrate)(分别为 PHP11551和PHP11552)的构建。将PHP11466和PHP11467用于基因枪转化方法中，即使其具有tDNA的右边界和左边界。将称为PHP11551和PHP11552的形式用于土壤杆菌介导的转化方法中。
获取作为732bp BamHI/HpaI片段的ipt编码序列并将其插入GLB1表达盒(BamHI/HpaI，4.9kb)中以产生PHP11310。PHP3303中的玉米GLB1启动子(Genbank Accession#L22344 L22295)和终止子(Genbank Accession # L22345 L22295)包含GLB1表达盒。将pGLB1：ipt：GLB13’盒以两个片段(HindIII/BamHI 1401 bp和BamHI/EcoRI 1618 bp)导入用EcoRI+HindIII(6.33kb)消化的T-DNA载体中，从而产生PHP11363。最后，将选择标记基因(pUBI：UBIINTRON1：玉米最优化的PAT：35S 3’)以2.84kb HindIII片段插入HindIII消化的PHP11363(9.35kb)中。在PHP11466中，所述两个基因以相互相对的方向排列。在PHP11467中，所述两个基因以相同的方向排列。三亲杂交后，PHP11466/PHP10523的共合体被称作PHP11551。同样，PHP11467/PHP10523的共合体被称作PHP11552。
PHP11404和PHP11550的构建
对PHP11404使用生物弹射击法(biolistics)介导的转化方法。所述质粒具有全部土壤杆菌形式的特征。实际上土壤杆菌介导的转化方法使用的质粒是PHP11550。
使用质粒PHP9063(pUBI：UBIINTRON1：ipt：pinII 3’)，使用定点诱变(特别地，5 Prime→3 Prime，Inc.的MORPHTM试剂盒)在ipt的起始密码子生成NcoI限制位点。所得的质粒称为PHP11362。然后将ipt编码序列以724 bp NcoI/HpaI片段转入PHP8001(BamHI-切割，用克列诺(Klenow)处理将突出端填成平端，然后用NcoI切割，4.9kb)以产生PHP11401。PHP8001包含来自玉米的27KD玉米醇溶蛋白基因的GZ-W64A启动子和终止子(Genbank Accession #S78780)。用PacI+KpnI消化PHP11401并将1.35kb片段插入PHP11287(PacI/KpnI消化的，10.87kb)以产生PHP11404。PHP11287是已经携带上述pUBI：UBIINTRON1：玉米最优化PAT：35S3’选择标记的T-DNA载体。在三亲杂交后，PHP11404/PHP10523的共合体被称作PHP11550。
PHP12975的构建
在1999年8月19日提交的美国专利申请09/377,648中描述了CIM1启动子。使用定点诱变在CIM1翻译起始处生成NcoI位点(PHP12699)。启动子被切成1.69kb SacI/NcoI片段并被连接至ipt编码序列和来自PHP11362的pinII终止子，从而形成PHP12800。然后将CIM1：ipt：pinII转录单位作为2.8kb BstEII片段插入BstEII消化的PHP12515(9.5kb)中，所述PHP12515是已在边界序列之间携带UBI：UBIINTRON1：MO-PAT：35S选择标记的二元载体。所得质粒称为PHP12866。通过三亲杂交导入根癌土壤杆菌LBA4404(PHP10523)中以产生共合体质粒PHP12975。
PHP12425的构建
将质粒PHP11404(上述)用作起始质粒，以用来自大麦(H.vulgare)的LTP2启动子替代GZ-W64A启动子。用NotI和KpnI(9.46kb片段)以及分别用NcoI和KpnI(1.24kb片段)消化PHP1 1404DNA。将这两个片段与来自PHP8219含有LTP2启动子的1.52kbNotI/NcoI片段混合并连接。所得的质粒产物称为PHP12333.将该质粒三亲杂交导入根癌土壤杆菌LBA4404(PHP10523)以产生共合体质粒PHP12425.。
三亲杂交和选择标记35s：bar：pinII：
使用标准的分子生物学技术构建所有载体。用于转化的T-DNA区域由侧翼连接有报告基因和选择标记的T-DNA边界序列组成。所述报告基因靠近T-DNA的右边界插入并且由侧翼连接有5’HindIII和3’BamHI限制位点的玉米遍在蛋白启动子Ubi-1(Christensen等人，1992)的2.0kb PstI片段组成。将遍在蛋白启动子连接至β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报告基因(Jefferson等人，1986)的5’BamHI位点，所述报告基因包含来自马铃薯ST-LS1的第2个内含子(Vancanneyt等人，1990)。将马铃薯蛋白酶II(pinII)终止子(碱基2至310，来自An等人的Plant Cell 1(1)：115-122(1989))以平端连接至GUS编码序列的下游。在终止子的3’末端是NotI限制位点。
所述选择标记由侧翼连接有5’NotI位点和3’PstI位点的增强的花椰菜花叶病毒35S启动子(碱基-421至-90和-421至+2，来自Gardner，R.C.，等人的Nucl.Acids Res.9：2871-88(1981).))组成。将含有79bp烟草花叶病毒前导序列的PstI/SalI片段(Gallie，D.R.，等人，Nucl.Acids Res.15：3257-73(1987).))插入启动子的下游，然后再插入含有玉米乙醇脱氢酶ADH1-S的第一个内含子的SalI/BamHI片段(Dennis等人，1984)。将BAR编码序列(Thompson，C.J.，等人，Embo J.6：2519-23(1987).))克隆入BamHI位点，且pinII终止子连接在下游。pinII信号侧翼接有3’SacI位点。
通过两个质粒之间的重组将PHP8904的T-DNA整合入超级二元质粒pSB1中(Ishida等人1996)。用携带pSB1的土壤杆菌株系LBA4404与含有PHP8904的大肠杆菌株系HB101杂交以在土壤杆菌中产生称作LBA4404(PHP10525)的共合体(通过Ditta G.，等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7347-51(1980)中描述的方法)。通过土壤杆菌对壮观霉素的抗性来选择LBA4404(PHP10525)，并通过SalI限制酶切消化质粒来证实其为重组体。
实施例2：玉米的转化
生物弹射击法：
通过粒子轰击将包含于载体中的本发明的多核苷酸转化入胚发生的玉米愈伤组织中，通常如Tomes，D.等人在IN：Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，Eds.O.L.Gamborg和G.C.Phillips，第8章，pgs.197-213(1995)中所描述的和如在下面简单概述的。通过使用结合有DNA质粒的钨微粒轰击胚发生应答的未成熟胚以产生转基因玉米植物。所述质粒由可选择的和非选择结构基因组成。
微粒的制备
向2ml浓硝酸中加入15mg 0.5至1.8μ、优选地1至1.8μ和最优选地1μ的钨微粒(General Electric)。在0℃下对该悬浮液超声处理20分钟(Branson Sonifier Model 450，40％输出量，恒定工作循环)。通过在10000rpm(Biofuge)下离心1分钟沉淀钨微粒，并去除上清液。向沉淀加入2毫升无菌蒸馏水，并进行短暂超声处理以重新悬浮微粒。将所述悬浮液沉淀，向沉淀加入1毫升无水乙醇，短暂超声处理重新悬浮微粒。用无菌蒸馏水再对微粒进行2次漂洗、沉淀和重新悬浮，最终将所述微粒重新悬浮于2毫升无菌蒸馏水中。将微粒分成250-ml等分试样并冰冻贮存。
微粒-质粒DNA缔合体的制备
在水浴超声波仪(Branson Sonifier Model 450，20％输出量，恒定工作循环)中对钨微粒贮存物进行短暂超声处理，并将50ml转移至微量离心管中。所有载体都是顺式的：即选择标记和目的基因在相同质粒上。然后将这些载体单独地或组合地进行转化。
以最终10μl总体积中含0.1至10μg最终DNA的量向所述微粒中加入质粒DNA并进行短暂超声处理。优选地，使用10μg(1μg/μL于TE缓冲液中)总DNA以混合DNA和用于轰击的微粒。特别地，其中每次轰击可使用1.0μg的PHP11404、11466和/或11467(1μg/μL)、其中任何细胞分裂素生物合成酶多核苷酸都可替代ipt。加入50微升(50μL)无菌的2.5M CaCl2水溶液，并将混合物短暂超声处理和涡旋。加入20微升(20μL)无菌的0.1M亚精胺水溶液并将混合物短暂超声处理和涡旋。在间歇性短暂超声处理的情况下将所述混合物在室温下温育20分钟。对微粒悬浮液离心并移走上清液。向沉淀加入250微升(250μL)无水乙醇，然后进行短暂超声处理。将悬浮液沉淀，除去上清液，并加入60ml无水乙醇。在将微粒-DNA凝聚体(agglomeration)加入巨载体前对悬浮液进行短暂超声处理。
组织的制备
玉米变种High Type II的未成熟胚是粒子轰击介导的转化的靶。该基因型是两个纯种遗传系(亲本A和B)的F1，所述亲本A和B来源于两个已知的玉米自交系A188和B73的杂交。根据Armstrong等人的 Maize Genetics Coop.News 65：92(1991)，两个亲本是就高体细胞胚发生能力选择的。
将来自F1植物的穗进行自交或同胞杂交，当盾片第一次变得不透明时从正在发育的颖果中将胚在无菌条件下解剖出来。该阶段在授粉后大约9-13天发生，最普便是在授粉后大约10天，这视生长条件而定。所述胚为大约0.75至1.5毫米长。用20-50％Clorox对穗表面灭菌30分钟，然后用无菌蒸馏水漂洗3次。
将未成熟胚以盾片朝上的方向培养在胚发生诱导培养基上，所述培养基由N6基本盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺素、30gm/l蔗糖、2.88gm/l L-脯氨酸、1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸、2gm/lGelrite和8.5mg/l AgNO3组成。Chu等人， Sci.Sin.18：659(1975)；Eriksson， Physiol.Plant 18：976(1965)。将培养基在121℃高压灭菌15分钟并分配至100×25mm培养皿中。将AgNO3过滤灭菌并在高压灭菌后加入培养基中。将组织在28℃下完全黑暗培养。大约3至7天后，最普便大约4天后，胚的盾片膨胀至大约为其原来大小的2倍，而盾片的胚根鞘表面的隆起表示开始形成胚发生组织。最高达100％的胚显示这种应答，但最普便地，胚发生应答频率为大约80％。
当观察到胚发生应答后，将胚转移至由经修饰含有120gm/l蔗糖的诱导培养基组成的培养基中。以胚根鞘杆(胚发生应答组织)从培养基朝向的方向对胚进行定向。以每个培养皿10个胚将胚置于培养皿中间直径大约2cm的区域内。就在用结合有含有选择和非选择标记基因的质粒DNA的粒子轰击之前，将胚在28℃下在该培养基中完全黑暗维持3-16小时，优选地4小时。
为实现对胚的粒子轰击，使用DuPont PDS-1000微粒加速设备将微粒-DNA凝聚体加速。将微粒-DNA凝聚体进行短暂超声处理并将10ml沉积在巨载体上，并让乙醇蒸发。通过聚合物隔膜(安全隔膜)的破裂将巨载体加速至不锈钢停止屏(stopping screen)上。通过加压的氦气实现破裂。微粒-DNA加速的速度根据安全隔膜的破裂压力决定。使用200至1800磅/英寸2(psi)的安全隔膜压力，优选地650至1100磅/英寸2，和大约900磅/英寸2是最优选的。使用多个盘以产生一定范围的破裂压力。
将含有装载有胚的平板的架子放置在位于巨载体平台底部下面5.1cm处(架子#3)。为进行对培养的未成熟胚的粒子轰击，将安全隔膜和载有干燥微粒-DNA凝聚体的巨载体安装在设备中。将递送至设备的He压调整至高于安全隔膜破裂压力200磅/英寸2。将载有靶胚的培养皿放入真空室中并置于加速微粒的发射路径中。在室中产生真空，优选地大约28英寸Hg。在完成设备操作后，释放真空并取出培养皿。
在轰击过程中，被轰击的胚保持在渗透压受调节的培养基中，并随后持续1-4天。将胚转移至由N6基本盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺素、30gm/l蔗糖、1mg/l 2，4-二氯苯氧基乙酸、2gm/lGelrite和0.85mg/l AgNO3和3mg/l双丙氨酰膦(Herbiace，Meiji)组成的选择培养基中。加入过滤灭菌的双丙氨酰膦。以10至14天的间隔将胚继代培养至新配的选择培养基上。大约7周后，从大约7％的经轰击的胚中繁殖出假定转化了选择和非选择标记基因的胚发生组织。拯救假定的转基因组织，将来源于单个胚的组织当作一个事件并且独立地在选择培养基上进行繁殖。通过目测选择最小的有组织的胚发生组织连续片段完成二轮克隆繁殖。
处理来自各事件的组织样品以回收DNA。用限制性内切核酸酶限制性切割所述DNA，并用设计用来扩增与细胞分裂素生物合成酶和质粒的非细胞分裂素生物合成酶部分交叠的DNA序列的引物序列进行探测。将具有可扩增序列的胚发生组织进一步用于植物再生。
为了再生转基因植物，将胚发生组织继代培养于100×25mm培养皿中包含MS盐和维生素(Murashige & Skoog， Physiol.Plant 15：473(1962))、100mg/l肌醇、60gm/l蔗糖、3gm/l Gelrite、0.5mg/l玉米素、1mg/l吲哚-3-乙酸、26.4ng/l顺-反-脱落酸和3mg/l双丙氨酰膦的培养基中，并在28℃下黑暗培养直至可以看到良好发育形成的、成熟的体细胞胚为止。这需要大约14天。良好形成的体细胞胚是不透明的和呈奶油色的，并且由可确定的盾片和胚芽鞘组成。将胚单个地继代培养在100×25mm培养皿中含有MS盐和维生素、100mg/l肌醇、40gm/l蔗糖和1.5gm/l Gelrite的培养基中，并在16小时光照：8小时黑暗的光周期和40 meinsteinsm-2秒-1(来自冷白荧光管)下进行温育。在大约7天后，体细胞胚已经萌发并且产生很明确的茎和根。将单棵植物继代培养在125×25mm玻璃管中的萌发培养基中以使植物进一步发育。将植物保持在在16小时光照：8小时黑暗的光周期和40 meinsteinsm-2秒-1((来自冷白荧光管)下。在大约7天后，植物已很好地长成并将其移栽至园艺土壤中，将土压实，并盆栽到商业温室土壤混合物中，并在温室中生长到性成熟。将原种自交系用作雄性对再生的转基因植物进行授粉。
土壤杆菌介导的：
当使用土壤杆菌介导的转化时，和在PCT专利公号WO98/32326中一样使用Zhao的方法，其内容在此引用作为参考。简而言之，从玉米中分离未成熟胚并将胚与土壤杆菌悬浮液接触(步骤1：感染步骤)。在该步骤中优选地将未成熟胚浸入土壤杆菌悬浮液中开始进行温育。将胚与土壤杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。优选在感染步骤后将未成熟胚培养在固体培养基上。在这个共培养时段后预期进行任选的“静止”步骤。在该静止步骤中，在不加用于植物转化体的选择试剂的情况下，将胚在至少一种已知抑制土壤杆菌生长的抗生素存在的情况下进行温育(步骤3：静止步骤)。优选地将未成熟胚培养在含有抗生素但不含选择试剂的固体培养基上，以除去土壤杆菌和进行所述被感染的细胞的静止相。然后，将接种的胚培养在含有选择试剂的培养基中，并且回收生长中的转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地，将未成熟胚培养在含有导致转化细胞选择性生长的选择试剂的固体培养基上。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)和优选地将生长在选择培养基上的愈伤组织培养在固体培养基上以再生植物。
实施例3：高细胞分裂素转基因玉米系的鉴定
使用直接测量和体内关联的组合就提高了的细胞分裂素水平筛选所得的转化体。
胎萌实验(glb1：ipt构建体)
因为认识到种子休眠是受ABA：细胞分裂素的比率控制的，所以种子中提高了的细胞分裂素水平可诱导胎萌表型。
使用GS3胚和土壤杆菌(本发明的多核苷酸11551和11552)或生物弹射击法(本发明的多核苷酸11466和11467)介导的转化启动了G1b1∷ipt转化体。2-3个月后再生出小植物并在再过2-3个月后将这些小植物(T0’s)转移至温室中。在开花期，用HG11与T0’s杂交并且在大约30天后在发育中的T1种子中检测到胎萌。通过在不进行种子干燥的情况下进行重新栽种(replant)来拯救表现胎萌表型的发育中的T1种子。通过PCR和叶片着色(paint)来分析可存活的植物以确定ipt基因和选择标记(PAT基因)是否存在。T1植物开花并且将穗自交以产生T2种子。那些携带ipt基因(PCR和叶片着色呈阳性)的植物对所述基因产生了3∶1分离的种子，但是PCR和叶片着色呈阴性的植物不产生分离。
细胞分裂素确定
授粉后(DAP)19和23天，从每个事件(11551和11552)的四个重复的每一个中收获10粒种子。然后将种子分离成胚和胚乳并冷冻在液氮中。在各取样日期，将来自4个重复的胚组织合在一起并确定细胞分裂素水平。以相似的方法处理胚乳组织。结果显示于图1中。
glb1∷ipt种子繁殖：
为了繁殖胎萌种子，在25DAP收获各事件内剩下植物中的一半。将穗放在干燥器盒子中并用环境空气(22至25℃)吹3天以慢慢干燥种子。然后将装有转基因穗的干燥器盒子转移至生长培养室中并且用35℃空气吹过种子3至5天，将其干燥至约12％的湿度。然后将单个穗脱壳并将种子贮在10℃和50％RH下。
表型确定
为确定表现胎萌的种子的比例，在大约45DAP从剩下的一半植物中收获穗并就胎萌程度给种子评分。胎萌的四个级别确定为：
级别1：无明显胚芽鞘隆起。
级别2：可见胚芽鞘隆起，但未延长。
级别3：可见胚芽鞘隆起并且延长超过盾片，但没有突破果皮。
级别4：可见胚芽鞘隆起并且延长超过盾片和突破果皮。
结果显示于下列表1中
                              表1
  事       S         P   叶   T   胎件       I         C   片   2   萌D         R   着   表  结#         结  色   征  果果  结果   45DAP的胎萌表征   总种子#
  级    级    级    级别    别    别    别1     2     3     4
  11551    751412    +    +        +751415    +    +        +751416    +    +        +751417    +    +        +751420    +    +        +751422    +    +        +   4     4     7     40     159   34    299    28    16    59167   55    39    182     193   47    00     141   93    11   19205204279242245
  总计   272   590   238   94   1194
  11551    751425    +    +        +751426    +    +        +751429    +    +        +751432    +    +        +   50    57    85    40     75    64    1266    40    19    441    16    14    4   19615112975
  总计   157   188   182   24   551
  11551    751433    -    -751434    -    -        -751435    -    -        -751436    -    -        - 438   0     0     0405   0     0     0375   0     0     0 438405375
  总计   406   0     0     0   405
  11551    751437    +    +        +751438    -    +        +751439    +    +        +751443    +    +        +   14    50    78    1952    37    128   10128   92    101   970    84    89    4   161227330247
  总计   264   263   396   42   965
  11551    751441    -    -        -751442    +    -751444    -    -        -   375   0     0     0343   0     0     0   375343
  总计   359   0     0     0   359
  11551    751445                  +751448    -    +        +751450    +    +        +751451    +    +        +   158   76    38    94     126   79    3101   83    44    14101   33    48    1   281212242183
  总计   364   318   209   27   918
  11552    752902         +        +752908    +    +        +752910    +    +        +752911    +    +        +752912    +    +        +752913    +    +        +752914    +    +        +752919         +        +   16    53    62    435    74    24    491    132   14    02     146   39    30     40    27    249    36    36    875    47    12    2125    72    80    16   13513715519269129156193
  总计   211   602   294   58   1165
  11551    752924    +    +        +752930    +    +        +752938    +    +        +752937    +    +        +752939    +    +        +752940    +    +   109   57    98    166     27    22    1053    60    47    353    36    70    1058    48    66    60     1     0     0   28065163169180
  总计   279   229   305   45   857
表型估计结果表明，相对于无基因的植物，ipt基因的存在导致更大的胎萌发生(2级至4级)。
增加的种子干单位质量(gz：iDt构建体)：
因为核质量是胚乳细胞和造粉体的数目的函数，并且细胞分裂素涉及增加胚乳细胞数目和涉及从原质体分化造粉体，所以表现增加的细胞分裂素水平的种子应当在种子干单位质量上产生相应的增加。
用GS3胚和土壤杆菌介导的转化(本发明的多核苷酸11550)启动Gz∷ipt转化体。在1997年，2-3个月中再生出小植物，再过2-3个月后将这些小植物(T0’s)转移至温室中。在开花期，用HG11与T0’s杂交并且在成熟期收获穗、脱壳，并将种子用于再度的种子繁殖(与HG11回交和自花授粉)。然后种植T2种子(BC2代和自交)。通过使用PCR和叶片着色分析T2植物以分别确定ipt基因和选择标记(PAT基因)是否存在。将这些植物的亚群进行自花授粉用以确定细胞分裂素，或进行开放传粉以用于表型确定(产量和产量构成)。
细胞分裂素确定
可采集样品并如下进行分析。在10、16和22 DAP，从每个事件的2个重复(每个重复由2个小例样组成)中采集50至100粒种子并除去花梗。对于10 DAP样品，可将剩下的种子组织直接放入液氮(定义为“种子”的组织主要由果皮、糊粉层、胚乳和珠心组成)。相反地，在16和22 DAP，首先可将胚从剩余的种子组织(定义为“种子减去胚”的组织，并且主要由果皮、糊粉层和胚乳组成)中解剖出来，然后将两种组织直接放入液氮中。
表型确定
为确定gz∷ipt构建体对种子质量的影响，在生理成熟期(可见黑色的层)手工收获单株植物，将种子脱壳并用烘箱干燥至恒定质量(104℃，最少3天)。在初生穗和次生穗上确定产量(g植物)和产量构成(每株植物的穗，每个穗上的种子和每粒种子的重量)。
增加的种子结实频率和增加的种子数目
(ltp2：ipt构建体)：
因为产量是每个穗的种子结实频率和种子数目的组合，所以在种子结实和形成早期表现增加的细胞分裂素水平的种子应当具有在种子结实和数目上具有相应增加的穗。
用GS3胚和土壤杆菌介导的转化(12425)启动ltp2：ipt转化体。在1998年，经2-3个月后再生出小植物，并且再过2-3个月后将这些小植物(T0’s)转移至温室。在开花期，用HGl1与T0’s杂交并在成熟期收获穗、脱壳和将种子用于再度种子繁殖(与HG11回交和自花授粉)。将每个T0事件的种子数目和种子结实事件数目与其它具有启动子：基因组合而非ltp2：ipt的转基因事件的数目进行对比。结果显示于表2中。
表2.1998年在Johnston，IA，ltp2：ipt基因T0事件的种子结实平均数与在相同温室条件下生长的其它T0植物的基因的对比。
  发明的多肽   基因描述   T0数   ％T0w/种子  种子平均数#
  12425   ltp2：ipt   35   82.9  198
  12384   木质素   92   22.8  145
  12417   糖   40   55.0  156
  12427   成熟   35   45.7  69
  12428   木质素   29   75.9  174
  12723   木质素   35   62.9  184
  12724   木质素   35   45.7  161
通过比较每个T0植物的种子结实百分比和种子平均数#，与在相同时间和相同的温室条件下生长的6个其它转基因组合T0植物相比，ltp2：ipt具有最高结种子的T0植物百分比和最高的种子数值平均数#。这些结果表明种子发育早期的糊粉层中细胞分裂素的表达可通过增加结种子的植物的百分比和每个穗的种子结实数目来增加产量。
将随后的代生长在不同田地位置以确定与具有相同遗传背景的非转基因对照相比其种子结实和种子数目特征以及种子产量。也可在相似遗传背景的转基因和非转基因核上测量细胞分裂素水平。
细胞分裂素确定：
可如下采集和分析样品。可在2、6和22DAP从每个事件的两个重复(每个重复包含2个小例样)中采集50至100粒种子并除去花梗。对于2、6和22DAP样品，可将剩下的种子组织直接放入液氮(定义为“种子”的组织主要由果皮、糊粉、胚乳和珠心组成)。
实施例4-ipt的分离和ckx1-2的分离
简而言之，构建了优选地包含方便的限制性内切核酸酶位点的PCR引物。两个有用的引物显示如下：
SEQ ID NO：38(具有Bam HI位点的上游引物(Upper primer))
5’caucaucaucauggatccaccaatggatctacgtctaattttcggtccaac 3’
SEQ ID NO：39(具有Hpa1位点的下游引物(Lower primer))
5’cuacuacuacuagttaactcacattcgaaatggtggtccttc 3’
引物的限制位点用粗体标示。与模板结合的引物部分分别从核苷酸22和19延伸至3’末端。在起始密码子之前引入BamHI位点“ggatcc”(粗体标示)和Kozak共有序列和在终止密码子之后引入HpaI位点“gttaac”(也用粗体标示)。下列是显示引物是如何连附着至所述公开的序列上的示意图。
               BamHI
5’caucaucaucauggatccaccaatggatctacgtctaattttcggtccaac
                        aatggatctacgtctaattttcggtccaacttgcacaggaaaga
catcgactgcgatagctcttgcccagcagactggcctcccagtcctctcgctcgatcgcgtccaatg
ctgtcctcaactatcaaccggaagcgggcgaccaacagtggaagaactgaaaggaacgactcgtctg
taccttgatgatcgccctttggtaaagggtatcattacagccaagcaagctcatgaacggctcattg
cggaggtgcacaatcacgaggccaaaggcgggcttattcttgagggaggatctatctcgttgctcag
gtgcatggcgcaaagtcgttattggaacgcggattttcgttggcatattattcgcaacgagttagca
gacgaggagagcttcatgagcgtggccaagaccagagttaagcagatgttacgcccctctgcaggtc
tttctattatccaagagttggttcaactttggagggagcctcggctgaggcccatactggaagggat
cgatggatatcgatatgccctgctatttgctacccagaaccagatcacgcccgatatgctattgcag
ctcgacgcagatatggagaataaattgattcacggtatcgctcaggagtttctaatccatgcgcgtc
gacaggaacagaaattccctttggtgggcgcgacagctgtcgaagcgtttgaaggaccaccatttcg
aatgtga
                                       3’cctggtggtaaagcttacact
cattgaucaucaucauc
HpaI
获得了携带肿瘤诱导质粒pTi Bo542的根癌土壤杆菌(参见Guyon，P.，等人，Agropine in null-type crown gall tumors：Evidence for generality of the opine concept，Proceedings ofthe National Academy of Sciences(U.S.)77(5)：2693-97(1980)；Chilton，W.S.，等人Absolute stereochemistry ofleucinopine，a crown gall opine，Phytochemistry(Oxford)24(2)：221-24(1985)；Strabala，T.J.，等人，Isolation andcharacterization of an ipt gene from the Ti plasmid Bo542，Molecular & General Genetics 216：388-94(1989))，并将活细菌用作PCR模板。使用标准的PCR条件。这种条件的例子如下：在薄壁管中每100μl的反应体积，用0.5μL 10ng/μL靶质粒，0.05单位/μLTaq聚合酶，各0.5μM引物，0.8mM dNTP’s 1X缓冲液。混合试剂，置于冰上。向管中加入靶质粒，然后向各管加入100μL反应混合物。在热循环仪中在95℃下预温育3分钟。然后以在95℃进行35秒，55℃进行1分钟和72℃进行1分钟循环5次。然后以在95℃进行35秒，65℃进行1分钟和72℃进行1分钟循环30次。通过在72℃逗留10分钟结束反应并允许浸泡在6℃下。然后根据厂商说明使用由LifeTechnologies制备的试剂盒将PCR产物克隆入DH5α细胞。从推定的转化体中提取DNA，用BamHI和HpaI切割，并跑胶以证实转化。然后将该插入片段进行凝胶纯化并转化入便利的表达载体中，例如含有Ubi启动子和pinII终止子的7921载体DNA中。
在Molecular and General Genetics 216：388-394(1989)中提供了优选的DNA序列。其包含编码239个氨基酸、具有大约26.3kDa的推导分子量(按氨基酸残基数目X110计算的)的蛋白的可读框。
玉米细胞分裂素氧化酶基因，cytox1-2的分离
另一个优选的DNA序列由下面的SEQ.I.D.NO：1提供。其包含编码大约535个氨基酸残基(SEQ ID NO.：2)、具有大约58.9kDa的推导分子量(按氨基酸残基数目X110计算的)的蛋白的可读框。应用基因合成领域的技术人员所熟知的DNA合成方法可合成制备细胞分裂素氧化酶的拷贝。可选择地，通过PCR克隆可从携带细胞分裂素氧化酶的生物中直接分离基因拷贝。University of Missouri的Roy Morris克隆了玉米细胞分裂素氧化酶基因(ckx1)，并将序列保藏在Genbank中。(Morris等人，1999.Isolation of a geneencoding a glycosylated cytokinin oxidase from maize.Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2)：328-333。也参见Houba-Herin等人，1999.Cytokinin oxidase from Zea mays：purification，cDNAcloning and expressionin moss protoplasts.Plant J.(6)：615-626.)。构建了优选地含有便利的限制性内切核酸酶位点的PCR引物：两个使用的引物显示如下：
5’CATGCCATGGCGGTGGTTTATTACCTGCT 3’(在5′端具有NcoI位点)
5’CGGGATCCTCATCATCAGTTGAAGATGTCCT 3’(在3′端具有BamHI位点)
这些引物是针对ckx1的序列设计的，并且使用逆转录酶PCR(RT-PCR)以从发育中的玉米核的几种不同组织中分离细胞分裂素氧化酶基因。从下列组织中扩增DNA片段：10DAP、13DAP、18DAP和20DAP的胚乳；和10DAP、18DAP和20DAP的胚，其中DAP是授粉后天数。来自所有组织的片段在凝胶中迁移至1.6kb，这与公开的序列的长度相同。我们选择其中一个片段(来自18DAP胚)并对所述DNA测序。该片段在此处称作Cytox1-2，并且其全长序列由下面SEQ ID NO.：1提供。在氨基酸水平上，ckx1基因与cytox1-2之间具有98％的同源性，因此，本领域技术人员可认识到cytox1-2是来自玉米的细胞分裂素氧化酶基因。
实施例5.转基因在单子叶植物中的表达
构建包含可操作地连接至编码ipt的分离的核苷酸(SEQ ID NO：1)的Zag2.1启动子(SEQ ID NO：3)或Zap启动子(SEQ ID NO：5，也称作ZmMADS)或tb1启动子(SEQ ID NO：17)的质粒载体。然后通过下列方法将该构建体导入玉米细胞。
从来源于玉米株系杂交的发育中的颖果中解剖出未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离胚，此时其大约1.0至1.5mm长。然后将胚按轴侧朝下放置并与琼脂糖固化的N6培养基(Chu等人(1975)Sci.Sin.Peking 18：659-668)接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟的胚的盾片中增殖出易碎的胚发生愈伤组织，所述胚发生愈伤组织由未分化的具有位于胚柄结构上的生产的体细胞原胚状体和胚状体组成。将分离自初生外植体的胚发生愈伤组织培养在N6培养基上，并每2至3周继代培养在这些培养基上。
为了提供选择标记，可将质粒p35S/Ac(Hoechst Ag，Frankfurt，德国)或同等物用于转化实验。该质粒含有编码膦丝菌素乙酰转移酶(PTA)的Pat基因(参见欧洲专利公开0 242 236)。PAT酶赋予对除草剂谷氨酰胺合酶抑制剂例如膦丝菌素的抗性。p35S/Ac中的pat基因在来自花椰菜花叶病毒的35S启动子的控制之下(Odell等人(1985)Nature 313：810-812)，并且包含来自根癌土壤杆菌的Ti质粒T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区域。
可使用粒子轰击方法(Klein等人(1987)Nature 327：70-73)将基因转入愈伤组织培养细胞中。根据该方法，使用下列技术给金微粒(直径1μm)包被DNA。将10μg质粒DNAs加入50μL金微粒悬浮液(每mL 60mg)中。向微粒中加入氯化钙(50μL 2.5M的溶液)和无亚精胺的碱基(20μL 1.0M的溶液)。在加入这些溶液期间涡旋悬浮液。10分钟后，将管进行短暂离心(15,000rpm 5秒)并除去上清液。将微粒重悬于200μL无水乙醇中、再离心和除去上清液。再次进行乙醇漂洗和将微粒重悬于终体积为30μL的乙醇中。可将DNA包被的金微粒等分试样(5μL)放置于Kapton flying disc(Bio-Rad Labs)的中央。然后在1000磅/英寸2的氦气压力、0.5cm的缝隙距离和1.0cm的飞行距离下用Biolistic PDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)将微粒加速至玉米组织中。
为进行轰击，将胚发生组织放在覆在琼脂糖固化的N6培养基上的滤纸上。将组织按薄草坪那样排放并覆盖直径大约5cm的圆形区域。可将装有组织的培养皿放在距离停止屏大约8cm的PDS-1000/He小室中。然后将小室空气抽至28英寸Hg的真空。通过使用安全隔膜用氦冲击波加速巨载体，所述安全隔膜在冲击管中的He压达到1000磅/英寸2时发生爆裂。
在轰击后第7天可将组织转移至含有草铵膦(gluphosinate)(每升2mg)和缺少酪蛋白和脯氨酸的N6培养基中。所述组织继续在该培养基中慢速生长。再过2周可将组织转移至含有草铵膦的新配N6培养基中。6周后，在一些装有草铵膦补充的培养基的板上可鉴定直径大约1cm面积的活跃生长的愈伤组织。这些愈伤组织可以继续生长到在选择培养基上进行继代培养的时候。
通过首先将组织簇转移至补充了每升0.2mg的2，4-D的N6培养基中可从所述转基因愈伤组织中再生植物。2周后可将所述组织转移至再生培养基中(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)。
实施例6.转基因在双子叶植物中的表达
如下所述，用包含可操作地连接至编码ipt的异源核苷酸序列上的Zag2.1启动子的质粒轰击大豆的胚。为诱导体细胞胚，从大豆栽培种A2872的表面消毒的未成熟种子中分离长度为3-5mm的子叶，然后在26℃下在光照或黑暗下培养在合适的琼脂培养基上6至10周。然后切割产生次生胚的体细胞胚并放入合适的液体培养基中。在重复选择如早期球形阶段胚那样增殖的体细胞胚簇后，如下所述维持所述悬浮液。
可在旋转振荡器上，于150rpm和26℃下，16:8小时白天/夜晚(使用荧光灯)的时间安排下将大豆胚发生悬浮培养物保持在35ml液体培养基中。每2周通过将大约35mg组织接种到35ml液体培养基中对培养物进行继代培养。
然后可通过基因枪轰击(Klein等人(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利号4,945,050)的方法转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用DuPont Biolistic PDS1000/HE仪(氦改进型)进行这些转化。
可用于促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)，来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz等人(1983)Gene 25：179-188)和来自根癌土壤杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3’区域组成。包含Zag2.1启动子和编码ipt的异源多核苷酸的目的表达盒可作为限制片段被分离。然后将该片段插入携带标记基因的载体的单一限制位点。
向50μL 60mg/ml的1μm的金微粒悬浮液中加入(按顺序)：5μLDNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl2(2.5M)。然后搅拌所述微粒制剂3分钟，在微量离心机上旋转10秒并去除上清液。然后将DNA包被的微粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并重新悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/微粒悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将5微升DNA包被的金微粒加载到各巨载体盘上。
将大约300-400mg的2周龄的悬浮培养物放在空的60×15mm培养皿中并用移液器从组织中除去残留的液体。对于每个转化实验，通常轰击大约5-10个板的组织。将膜破裂压力设置在1100磅/英寸2，和将小室抽至28英寸汞的真空。将组织放置在距离阻滞筛(retainingscreen)3.5英寸的地方并轰击3次。轰击后，可将所述组织分成两半并放回至液体中，并如上所述进行培养。
轰击后5至7天，可用新配培养基更换液体培养基，轰击后11至12天用新配的含有50mg/ml潮霉素的培养基更换培养基。可每周更换该选择培养基。在轰击后7至8周，可观察到绿色转化的组织从未转化的坏死的胚发生簇中长出。取出分离的绿色组织并接种到单个的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。可将各新的系作为独立的转化事件进行处理。然后可将这些悬浮液进行继代培养，并当作未成熟胚族进行保持或通过单个体细胞胚的成熟和萌发再生成完整的植物。
实施例7.在非协迫条件下T1(D2F1半合子)植物的穗生长速 率的分析。
如实施例5中所描述的用zag2.1∷ipt构建体对玉米进行转化。用其中一个亲本基因型给再生植物授粉以产生D2F1种子(D2是指亲本的2倍剂量；也称作T1种子)。在17个原始的转化体中，选择9个用于基于有利的遗传复杂度(即，通过DNA印迹分析确定的单-至低拷贝数目)、植物转录单位的完整性(如通过DNA印迹分析所确定的)和足够的种子数量的进一步分析。
将D2F1种子种在Johnston，Iowa的重复、良好灌溉的试验田。在最初的穗丝出现时和7天后测量未授粉穗的干物质质量。以干物质量的差除以天数计算穗生长速率(EGR)。如图2中所示，相对于作为对照种植的转基因阴性姊妹株，9个受试事件中有4个显示穗生长速率增加。通过RT-PCR证实了ipt转录物存在于代表所有9个事件的发育中的穗。
然而，田地的空间限制使得不能直接进行对相同事件和相同基因型的转基因阳性和转基因阴性植物的比较。作为替代，本实施例中的对照植物长自分离的T1种子大批样品。将对照小块地变稀至标准密度；同样，除去转基因阳性的植物(通过用除草剂对叶子进行着色鉴定)。作为混合杂交事件和基因型以及转基因植物相对对照植物的田间条件变化的结果，转基因和对照植物之间在EGR上的差异是含糊的而且结果是非决定的。因此，下一年对所有9个事件都进行产量分析。
对于转基因事件预期存在穗生长速率的不同，并且可在遗传背景和田间生长条件保持恒定的情况下通过直接比较进行恰当地估计。
实施例8.在非协迫条件下T2(D3F1半合子)植物产量的分析
将代表9个选择事件的T2种子(来源于用回归亲本对T1植物授粉)种植在Johnston，Iowa的非重复、良好灌溉的试验田中。通过RNA印迹分析确定ipt转录物存在于发育中的穗中。将各事件的转基因阴性姊妹株作为对照种植，并且对各事件进行成对方式分析(差异分析)以及事件平均数分析。将所有受试植物去雄花穗并通过混合的非转基因雄性亲本授粉。
通过收集初生穗确定产量。将谷物按事件和按转基因的存在或不存在混合；然后将谷物用烘箱干燥并测量总的干物质质量。结果显示于图3中。9个事件中有7个的谷物产量大于对照的产量。也对核数目、穗长度和核质量进行测量；在穗长度上9个事件中有5个的转基因的结果超过非转基因姊妹株；对于核数目和每个核的干物质，9个事件中有5个的转基因的结果超过非转基因姊妹株。
实施例9.D4F3纯合植物在产量和植物高度上的分析
在2002年，在Johnston，Iowa的重复的良好灌溉的实验田中对9个选择事件的下一代后代进行估计。将转基因阴性姊妹株作为对照种植。对所有受试植物去雄花穗；将非转基因植物的混合物用作花粉源。
在V10和V12测量植物高度。(关于生长阶段，参见 How a Corn Plant Develops，Iowa State University of Scienee andTechnology Cooperative Extension Service Special Report No.48，Reprinted June 1993.)。如图4中所示，9个事件申有5个在植物高度上显示统计学上显著的增加。
通过收集所有产生谷物的穗来确定产量。适当地将谷粒混合，烘干和测量总的干物质质量。如图5中所示，在产量上9个事件中有3个显示统计学上显著的增加，包括其中也显示增加的植物高度的两个事件。如图6中所示，对穗数目、核数目和核质量也进行了测量。
实施例10.在干旱协迫下D4F3植物的产量、植株高度、叶片 绿色、生物量和转基因表达的分析。
2002年在Woodland，California的重复试验田中对9个事件的纯合后代进行了估计。在开花期期间停止补充灌溉，以靶向足以减产40％至50％的协迫。为达到该目的，在种植后从920GDUs(生长程度单位)开始停止灌溉并在1860GDUs重新灌溉。对所有受试植物去雄花穗并用混合的非转基因植物雄性亲本授粉。通过发育中的茎、叶和雄花穗的RNA印迹分析确定ipt转录物的存在。
在开花前大约一个星期用Minolta SPAD叶绿素测量仪测量叶片的绿色。同时测量植株高度。如图7所示，9个事件中有5个在植株高度上显示具有统计学上显著的增加。如图8所示，这5个事件中有4个和另外的一个事件显示增加的叶片绿色。
通过收集所有具有谷物的穗确定产量。适当地混合谷粒、烘干和测量总的干物质质量。也对核数目、穗数目和核质量进行测量。如图9所示，9个事件中有3个产生提高的产量结果；所有这三个事件也显示增加的植株高度和叶片绿色。这些事件中的一个在植物生物量上的增加显示于图10。此外，在所有受试事件中，相对于转基因阴性植物，转基因阳性植物在各种营养和生殖组织中都显示ipt转录物的稳定态水平增加。
实施例11.在非协迫条件下转基因对产量作用的分析
在一块按要求补充灌溉的地中对几个构建体就其对产量的影响在初步的筛选中进行检验。将所有构建体当作多个事件、原种亲本的2倍剂量进行估计，并通过每个事件两个重复来检验自身产量。只收获转基因阳性植物，然后所有事件就其产量有利方面进行相互之间的比较。所述结果显示于表2，其中按产量对不同构建体进行分级，产量最高的在顶部而产量最低的位于底部。第二栏记录粗产量，而第三栏记录所述条目与所有构建体的平均值之间的不同。
                             表2
  PHP   Bu/acr   构建体减其他构建体的   S.E.   P值
  平均值bu/acr
  PHP19698PHP19020PHP19874PHP15418   138.0137.4135.8132.0   13.0512.5410.879.00   5.815.545.061.85   0.02480.02360.0318＜.0001
  PHP16036   131.2   6.23   4.86   0.2006
  PHP19304   129.4   4.42   4.17   0.2895
  PHP19369   128.6   3.57   4.17   0.3925
  PHP19512   126.4   1.30   4.17   0.7543
  PHP19513   126.0   0.85   4.22   0.8399
  PHP19815   124.3   -0.89   4.35   0.8375
  PHP19380   124.1   -1.07   4.17   0.7977
  PHP16889   124.0   -1.18   7.79   0.8794
  PHP17897   123.3   -1.87   5.67   0.7416
  PHP16037   122.9   -2.34   4.97   0.6378
  PHP19699   122.7   -2.58   4.32   0.5497
  PHP18070   122.1   -3.11   4.97   0.5315
  PHP16176   121.7   -3.52   5.22   0.5011
  PHP16178   121.5   -3.74   6.08   0.5385
  PHP16172   120.8   -4.45   5.58   0.4258
  PHP19523   120.5   -4.82   4.20   0.2478
  PHP19814   120.3   -5.04   4.37   .0.2504
  PHP19368   118.4   -6.92   4.17   0.0968
  PHP19514   118.1   -7.31   4.20   0.0812
  PHP19822   117.4   -8.23   4.91   0.0936
  PHP18015PHP19370PHP19303   114.5104.0108.9   -10.92-11.56-16.90   4.994.204.17   0.02880.0058＜.0001
可以看出在表顶端的4个构建体具有比其它任何一个受试构建体显著更高的产量。类似地，三个构建体表现出显著低于本检验中的任何一个其它构建体的产量。剩下的在相互之间没有显著的差异因而可假定其转基因没有产生明显不同于仅是背景基因型的影响。在该检验中，有4个被Zag2.1或Zap驱动表达的IPT构建体并且在本检验中该组代表四个最高产量的构建体：PHP19698 Zap∷IPT、具有Ubi：BAR的PHP19020 Zag：IPT、具有35s BAR(头对头)的PHP19874Zag∷IPT和具有35s BAR(头对头)的PHP15418原始Zag∷IPT构建体。尽管剩余的这些构建体用每个构建体10个事件进行检验，但实际上PHP15418的重制(remake)包含超过90个事件。这些结果清楚地表明将IPT基因与集中在雌性分生组织周围表达的启动子/调节序列偶联的影响。
实施例12.zag2：ipt在大豆中表达的分析
通过使用本领域已知的方法用基因枪轰击的方法转化大豆胚发生悬浮培养物(Klein等人(1987)Nature(London)327：70-73；美国专利号4,945,050；Hazel，等人(1998)Plant Cell.Rep.17：765-772；Samoylov，等人(1998)In Vitro Cell Dev.Biol.-Plant34：8-13)。
在基因枪轰击方法中可能使用纯化的1)完整质粒DNA或，2)仅含有目的重组DNA表达盒的DNA片段。在本实施例中，所述重组DNA片段是在用于轰击之前从完整质粒中分离的。对于每8次对大豆组织的轰击，用3mg 0.6μm金微粒和每DNA片段的碱基对最高达100皮克(pg)的DNA片段制备30μl溶液。
使用2个重组DNA片段进行大豆转化实验。用于表达IPT基因的重组DNA片段存在于与来自提供对磺酰脲除草剂抗性的选择标记基因分开的重组DNA片段上。两种重组DNA片段都被共沉淀在金微粒上。
通过从大豆未成熟种子开始获得用于这些转化实验的原种组织。在起始培养基上培养6至8周后从外植体中将次生胚切出。所述起始培养基是琼脂固化修饰的补充了维生素、2，4-D和葡萄糖的MS(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant 15：473-497)培养基。将次生胚放在烧瓶内的液体培养维持培养基中并于26+/-2℃、～80μEm-2s-1光密度下在回转振荡器上维持7至9天。所述培养维持培养基是补充了维生素、2，4-D、蔗糖和天冬酰胺的经修饰的MS培养基。在轰击前，从烧瓶中取出组织块并转移至用于轰击的空的60×15mm培养皿中。通过印迹在Whatman #2滤纸上干燥组织。对每个受轰击组织的板使用对应于10-20个块(各块大小1-5mm)的大约100-200mg组织。轰击后，将来自各经轰击的板中的组织分开，将每板经轰击的组织放入两个烧瓶内的液体维持培养基中。在轰击后7天，用新配的补充了100ng/ml选择试剂的培养维持培养基(选择培养基)更换各烧瓶中的液体培养基。为选择转化的大豆细胞，所使用的选择试剂是化学名称为2-氯-N-((4-甲氧基-6甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基羰基)苯磺酰胺(俗名：DPX-W4189和绿黄隆(chlorsulfuron))的磺酰脲(SU)。绿黄隆是DuPont磺酰脲除草剂(GLEAN)的活性成分。在6-8周期间每周更换含有SU的选择培养基。在6-8周的选择时段后，可观察到从未转化的坏死的胚发生簇中长出绿色岛状的转化组织。分离这些推定的转基因事件并在含有100ng/ml SU的培养基上再保持2-6周(每1-2周更换培养基)以产生新的、克隆繁殖的转化胚发生悬浮培养物。胚在SU中总共度过大约8-12周。将悬浮培养物继代培养并维持在未成熟胚簇状态，且也可通过单个体细胞胚的成熟和萌发再生出完整的植物。
在温室中，将1400株来源于42个zag2：ipt∷ALS转基因事件的T1植物以高密度(在设计容纳480株的空间种上1400株植物)种植。使用18株生长在相同环境下的变种‘Jack’植物作对照。将植物培养至成熟并就异常的荚簇或增加的荚装载(pod load)进行目测选择。测量83株zag2：ipt∷ALS植物和18株Jack植物的每株荚数目、每株种子数和种子重量(转换成100粒种子重量)。使用SAS中的PROC GLM程序对数据进行ANOVA，和使用SAS的PROC MEANS功能完成平均数分离(means separation)。
进行虚假设检验以确定zag2：ipt∷ALS植物就异常的荚簇或明显增加的荚装载的目测选择是否与未转化对照(Jack)有显著差异。对来自34个事件的植物进行了选择，并且在全部所有选择的事件中荚数目数据在ipt植物和Jack之间有显著差异(p＝0.05)。在全部所有事件中，所述选择的zag2：ipt∷ALS植物平均有32.1个荚，相比之下显著高于(LSD＝5.2个荚)Jack的平均25.4个荚。
在0.05水平上鉴定了显著不同于Jack的5个事件，并且对至少2株来自各事件的植物进行了测量。当将这些事件的荚数据进行ANOVA时，zag2：ipt∷ALS植物与Jack植物存在统计学差异。来自5个选择的事件的植物具有平均42.3个荚，统计学上显著高于(LSD＝5.9个荚)对照。
种子数目计数自两个具有最高平均荚数目(AFS 3579.7.1和AFS3586.1.2)的事件的所有脱粒植物。Zag2：ipt∷ALS植物具有平均每株植物73.6颗种子，其显著高于(LSD＝11.7颗种子)每株Jack植物的平均种子数(44.7粒种子)(表5)。事件相互之间无统计学上差异。
称量各单株zag2：ipt∷ALS植物和单株Jack植物的种子以确定种子大小是否受到增加的荚装载影响。来自AFS 3579.7.1和AFS3586.1.2的单株植物的100粒种子重量是16.6克，其与来自对照Jack植物100粒种子的重量(16.2克)无统计学上差异(LSD＝1.1克)。
考察的数据表明zag2：ipt∷ALS构建体可明显地影响每株植物的荚数目和种子。此外，所测量的zag2：ipt∷ALS植物的种子大小与非转化的Jack对照无统计学上的差异。高水平的可变性存在于温室环境中；然而，这些初步的数据暗示zag2：ipt∷ALS构建体可增加每株植物的持荚数(pod retention)和种子而在种子大小上无统计学差异。
实施例13-eep1启动子序列的分离
用于启动子分离的方法描述于Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California出售的Universal Genome Walker试剂盒的使用者手册中。通过在液氮中碾磨10日龄的玉米幼苗叶片制备基因组DNA，并使用DNeasy Plant试剂盒(Qiagen，Valencia，Califnia)制备DNA。然后严格按照Genome Walker使用者手册(ClontechPT3042-l version PR68687)中所描述的使用所述DNA。简而言之，分别用限制酶DraI、EcoRV、PvuII、ScaI和StuI(所有都是平端切割酶)消化DNA。除了Clontech建议的平端酶外，其它三种平端酶EcoICRI、XmnI和SspI也用于分别的消化。用酚，然后用氯仿，之后用乙醇沉淀提取DNA。将Genome Walker连接物连接至限制酶切DNA的末端以生成“Genome Walker文库”。
关于分离特异性启动子区域，设计两个与从序列数据库中鉴定的玉米基因的5’末端互补的非交叠基因特异性引物(长度26-30bp)。所述引物设计用来扩增所述编码序列上游的区域，即所选择基因的5’非翻译区和启动子。在下面给出引物的序列。使用Clontech引物AP1(SEQ ID NO：15)和具有SEQ ID NO：11所示序列的基因特异性引物(gsp)1对各Genome Walker文库进行第一轮PCR。
使用Genome Walker试剂盒提供的试剂在购自Bio-Rad(Hercules，Califonia)的iCycler型热循环仪中进行PCR。使用下列循环参数：进行7个循环：94℃进行2秒，然后68℃进行3分钟，接着进行32个循环：94℃进行2秒和67℃进行3分钟。然后，将样品保持在67℃进行4分钟，之后置于4℃直至进一步分析。
如使用者手册中所描述的，接着将来自第一轮PCR的DNA稀释并用作使用Clontech引物AP2(SEQ ID NO：16)和具有SEQ ID NO：12所示序列的基因特异性引物(gsp)2进行的第二轮PCR的模板。
第二轮的循环参数是：5个循环：94℃进行4秒，然后70℃进行3分钟，接着进行20个循环：94℃进行4秒，然后68℃进行3分钟。最后，所述样品保持在67℃进行4分钟，然后保持在4℃。将大约10ml的各反应物在0.8％琼脂糖凝胶上跑胶，并将带(通常500bp或更大)切下，用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，Califonia)纯化并克隆入TA载体pGEMTeasy(Promega，Madison，Wisconsin)。对克隆进行测序以确认。
产自XmnI Genome Walker文库的带含有1.5kb的SEQ ID NO：12所示基因特异性引物上游的序列。使用引物SEQ ID NOS：13和14获得eep1启动子区域，所述引物根据该序列生成以扩增来自玉米株系A63的1kb基因组DNA。这些引物在5’端加入了HindIII位点，在翻译的起始位点加入了NcoI位点和恰好在NcoI位点的上游加入了EcoRV位点。加入这些位点以有助进一步的载体构建。使用PCRsupermix High fidelity(Cat# 10790020，Invitrogen，Carlsbad，Califonia)在Bio-Rad iCycler(Hercules，CA)热循环仪中进行PCR反应。使用下列循环参数：94℃进行2秒，接着进行30个循环：94℃进行20秒，55℃进行30秒，和68℃进行1分钟。最后，样品保持在67℃进行4分钟，然后保持在4℃直至进一步分析。然后将PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体(Promega Corp.Madison，WI)。对克隆进行测序以确认。
实施例14-eep2启动子序列的分离
用于启动子分离的方法描述于Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，California出售的Universal Genome Walker试剂盒的使用者手册中。通过在液氮中碾磨来自V6阶段的玉米B73植物的叶子制备基因组DNA，和使用PureGene DNA分离试剂盒(GentraSystems，Minneapolis，Minnesota)制备DNA。然后严格按照GenomeWalker使用者手册(Clontech PT3042-1 version PR68687)中所描述的使用所述DNA。简而言之，分别用产生平端的酶DraI消化DNA。用酚，然后用氯仿，之后用乙醇沉淀提取DNA。将Genome Walker连接物连接至限制酶切DNA的末端以生成“Genome Walker文库”。
关于分离特异性启动子区域，设计两个与从序列数据库中鉴定的玉米EST 5’末端互补的非交叠基因特异性引物(长度各自为27bp)。所述引物设计用来扩增所述编码序列上游的区域，即所选择的基因的5’非翻译区和启动子。在下面给出引物的序列。使用Clontech引物AP1(SEQ ID NO：15)和具有AAACACCTTCGGATATTGCTCCCTTTT(SEQ IDNO：21)序列的基因特异性引物1(GSP1)对Genome Walker文库进行第一轮PCR。
使用Genome Walker试剂盒提供的试剂在购自MJ Research Inc.(Waltham，Massachusetts)的PTC-200 DNA Engine热循环仪中进行PCR。使用下列循环参数：进行7个循环：94℃进行10秒，然后72℃进行3分钟，接着进行32次循环：94℃进行10秒和67℃进行3分钟。最后，将样品保持在67℃进行7分钟，之后置于8℃直至进一步分析。
如使用者手册中所描述的，接着将来自第一轮PCR的DNA稀释并用作使用Clontech引物AP2(SEQ ID NO：16)和具有TCTCGCATTTGCAGAAACGAACAACGT(SEQ ID NO：22)序列的基因特异性引物2(GSP2)进行的第二轮PCR的模板。
用于第二轮的循环参数是：5个循环：94℃进行10秒，然后72℃进行3分钟，接着进行20个循环：94℃进行10秒，然后67℃进行3分钟。最后，所述样品保持在67℃进行7分钟，然后保持在8℃。将大约10μl的各反应物在1.0％琼脂糖凝胶上跑胶，并将500bp或更大的PCR产物切下，用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Valencia，Califonia)纯化。产自Dra I Genome Walker文库的条带含有1.0kb的GSP2引物上游的序列，并将其克隆入TA载体pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，Califonia)中。对克隆进行测序以确认。通过使用对应于来自AP2引物的下游的1027bp区域和ATG起始密码子的上游的引物对所述质粒进行PCR，以获取eep2启动子区域。对克隆进行测序以确认。
关于eep2的EST分布如下：
○p0083.cldeu53r B73    ″核″″″″7DAP完全的核″
○p0124.cdbmq47r B73    ″核，胚″″″″6日胚囊，筛选1″
○p0062.cymab46r B73    ″核，胚乳″″″″多核体的(4DAP)胚囊，″
○p0106.cjlps68r B73    ″核″″″″5DAP完全的核，筛选1″
○p0124.cdbmq21r B73    ″核，胚″″″″6日胚囊，筛选1″
○p0100.cbaab57r B73    ″核，胚，胚乳″″″″多核体的(4
                              DAP)胚囊，筛选1(原始的lib
                              P0062)″
○p0100.cbaac19r B73    ″核，胚，胚乳″″″″多核体的(4
                              DAP)胚囊，筛选1(原始的lib
                              P0062)″
○p0062.cymal89r B73    ″核，胚乳″″″″多核体的(4DAP)
                                  胚囊，″
○p0062.cymal74f  B73   ″核，胚乳″″″″多核体的(4DAP)
                                  胚囊，″
下面是PPM中关于该基因的Lynx数据：
  名称  PPM Adj   标题
  Cen6lm  10261   B73胚乳，6DAP胚囊
  Cdk8lm  457   玉米完全的核、胚和胚乳，8DAP
  Cpd1-ctr  395   玉米花梗对照
  Cpd1-drg  375   玉米花梗-干旱胁迫的
  Cen8lm  312   玉米胚乳8DAP
  Cper5lm  8   B73，5DAP果皮
  Cebho4lm  5   玉米胚Askc0，15DAP
  Cen12lm  2   玉米胚乳12DAP
这些数据与将该基因的表达限制在发育中的种子中非常符合。
在说明书中提到的所有文献和专利申请表示本发明相关领域内的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在此处引用作为参考，其程度就如同每一单个出版物或专利申请被明确和单独地说明被引用作为参考一样
尽管通过用于增进理解的说明和实施例对前述发明已作比较详细的描述，但很明显在所附的权利要求的范围内可实践某些变化和修饰。
                        序列表
<110>Pioneer Hi-Bred International，Inc.
<120>植物中细胞分裂素活性的调节
<130>0803R-PCT
<150>US 60/460,718
<151>2003-04-04
<150>US 09/545,334
<151>2000-04-07
<150>US 60/129,844
<151>1999-04-16
<160>39
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1919
<212>DNA
<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<220>
<221>CDS
<222>(690)…(1411)
<223>ipt
<400>1
ggatcccgtt acaagtattg cacgttttgt aaattgcata ttaatgcaat ctggatgttt  60
aataacgaat gtaatggcgt agaaatatgt attttattgt atttatcttt cactatgttg  120
aagtttgcaa taatatgcta atgtaaaatt aaaaaattat gtactgccgc atttgttcaa  180
atggcgccgt tatttcaaaa atatctttga ttttgttacg aggacaacga ctgcaggaag  240
taaataaaag acgctgttgt taagaaattg ctatcatatg tgcccagcta tagggccatt  300
taagttcaat tgtgaaatag ccgcccttat tttgacgtct catcaaatca aatattaaaa  360
aatatctcac tctgtcgcca gcaatgatgt aataaccgca gaaaagtgag agtaaatcgc  420
ggaaaaacgt cgccgagtgg catgaatagc ggcctccgta ttgctgattt agtcagcttt  480
atttgactta agggtgccct cgttagtgac aaattgcttt caaggagaca gccatgcccc  540
acactttgtt gaaaaacaag ttgccttttg ggaagaacct aaagccactt gctcttcaag  600
gaggaatatc gaggaagaga atataacagc ctctggtaca gacttctctt gtgcaaaaat  660
caatttgtat tcaacatatc gcaagaccg atg gat cta cgt cta att ttc ggt    713
                                Met Asp Leu Arg Leu Ile Phe Gly
                                 1               5
cca act tgc aca gga aag aca tcg act gcg ata gct ctt gcc cag cag    761
Pro Thr Cys Thr Gly Lys Thr Ser Thr Ala Ile Ala Leu Ala Gln Gln
     10                  15                  20
act ggc ctc cca gtc ctc tcg ctc gat cgc gtc caa tgc tgt cct caa    809
Thr Gly Leu Pro Val Leu Ser Leu Asp Arg Val Gln Cys Cys Pro Gln
 25                  30                  35                  40
cta tca acc gga agc ggg cga cca aca gtg gaa gaa ctg aaa gga acg    857
Leu Ser Thr Gly Ser Gly Arg Pro Thr Val Glu Glu Leu Lys Gly Thr
                 45                  50                  55
act cgt ctg tac ctt gat gat cgc cct ttg gta aag ggt atc att aca    905
Thr Arg Leu Tyr Leu Asp Asp Arg Pro Leu Val Lys Gly Ile Ile Thr
             60                  65                  70
gcc aag caa gct cat gaa cgg ctc att gcg gag gtg cac aat cac gag    953
Ala Lys Gln Ala His Glu Arg Leu Ile Ala Glu Val His Asn His Glu
         75                  80                  85
gcc aaa ggc ggg ctt att ctt gag gga gga tct atc tcg ttg ctc agg    1001
Ala Lys Gly Gly Leu Ile Leu Glu Gly Gly Ser Ile Ser Leu Leu Arg
     90                  95                 100
tgc atg gcg caa agt cgt tat tgg aac gcg gat ttt cgt tgg cat att    1049
Cys Met Ala Gln Ser Arg Tyr Trp Asn Ala Asp Phe Arg Trp His Ile
105                 110                 115                 120
att cgc aac gag tta gca gac gag gag agc ttc atg agc gtg gcc aag    1097
Ile Arg Asn Glu Leu Ala Asp Glu Glu Ser Phe Met Ser Val Ala Lys
                125                 130                 135
acc aga gtt aag cag atg tta cgc ccc tct gca ggt ctt tct att atc    1145
Thr Arg Val Lys Gln Met Leu Arg Pro Ser Ala Gly Leu Ser Ile Ile
            140                 145                 150
caa gag ttg gtt caa ctt tgg agg gag cct cgg ctg agg ccc ata ctg    1193
Gln Glu Leu Val Gln Leu Trp Arg Glu Pro Arg Leu Arg Pro Ile Leu
        155                 160                 165
gaa ggg atc gat gga tat cga tat gcc ctg cta ttt gct acc cag aac    1241
Glu Gly Ile Asp Gly Tyr Arg Tyr Ala Leu Leu Phe Ala Thr Gln Asn
    170                 175                 180
cag atc acg ccc gat atg cta ttg cag ctc gac gca gat atg gag aat    1289
Gln Ile Thr Pro Asp Met Leu Leu Gln Leu Asp Ala Asp Met Glu Asn
185                 190                 195                 200
aaa ttg att cac ggt atc gct cag gag ttt cta atc cat gcg cgt cga    1337
Lys Leu Ile His Gly Ile Ala Gln Glu Phe Leu Ile His Ala Arg Arg
                205                 210                 215
cag gaa cag aaa ttc cct ttg gtg ggc gcg aca gct gtc gaa gcg ttt    1385
Gln Glu Gln Lys Phe Pro Leu Val Gly Ala Thr Ala Val Glu Ala Phe
            220                 225                 230
gaa gga cca cca ttt cga atg tga ta gattgcacca gttttgtttc           1431
Glu Gly Pro Pro Phe Arg Met  *
        235
agacttgtcg ctatttgaat aagatgttcg ttctttgttg tgttggtgtg ttgtgataga  1491
ggcaagtggt ttgaaacttg tttttactgg tttattttca gtctcttgga cgatgtttta  1551
caaatataat attgtgaaaa ttgtggtttt atattcgtag aacgaaataa atggtaagta  1611
tagccgttat caaaatttag caaaaattgt taaaggttct tttatgcggt gaggttgtcg  1671
acttttcatc attgtcgcgt aaggagttac ggatatccat aactgtaaaa acgccgcaga  1731
atttacgggt ggtgcattta gtttgccgtt caacatgatt ttggcaatag ttggtaacca  1791
agcactagcc aaccgttcga taatcactta atcgatggaa ccgttcagct ttccttcgtg  1851
aggctgctct tgatgatgag ctgccgtcta gtttttataa cgccgggtta cgcattatag  1911
acaagctt                                                           1919
<210>2
<211>239
<212>PRT
<213>根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)
<400>2
Met Asp Leu Arg Leu Ile Phe Gly Pro Thr Cys Thr Gly Lys Thr Ser
 1               5                  10                  15
Thr Ala Ile Ala Leu Ala Gln Gln Thr Gly Leu Pro Val Leu Ser Leu
            20                  25                  30
Asp Arg Val Gln Cys Cys Pro Gln Leu Ser Thr Gly Ser Gly Arg Pro
        35                  40                  45
Thr Val Glu Glu Leu Lys Gly Thr Thr Arg Leu Tyr Leu Asp Asp Arg
    50                  55                  60
Pro Leu Val Lys Gly Ile Ile Thr Ala Lys Gln Ala His Glu Arg Leu
65                  70                  75                  80
Ile Ala Glu Val His Asn His Glu Ala Lys Gly Gly Leu Ile Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ile Ser Leu Leu Arg Cys Met Ala Gln Ser Arg Tyr Trp
            100                 105                 110
Asn Ala Asp Phe Arg Trp His Ile Ile Arg Asn Glu Leu Ala Asp Glu
        115                 120                 125
Glu Ser Phe Met Ser Val Ala Lys Thr Arg Val Lys Gln Met Leu Arg
    130                 135                 140
Pro Ser Ala Gly Leu Ser Ile Ile Gln Glu Leu Val Gln Leu Trp Arg
145                 150                 155                 160
Glu Pro Arg Leu Arg Pro Ile Leu Glu Gly Ile Asp Gly Tyr Arg Tyr
                165                 170                 175
Ala Leu Leu Phe Ala Thr Gln Asn Gln Ile Thr Pro Asp Met Leu Leu
            180                 185                 190
Gln Leu Asp Ala Asp Met Glu Asn Lys Leu Ile His Gly Ile Ala Gln
        195                 200                 205
Glu Phe Leu Ile His Ala Arg Arg Gln Glu Gln Lys Phe Pro Leu Val
    210                 215                 220
Gly Ala Thr Ala Val Glu Ala Phe Glu Gly Pro Pro Phe Arg Met
225                 230                 235
<210>3
<211>2085
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(2085)
<223>zag2.1
<400>3
agcttcgtgt gttccttcga tcggtcacag tttgattcct gctcaccaca tatttttgcc 60
gcgtgggagg gaggccacga ctggtggcag aacagcgaga ggcagactac ccttacagcc 120
ttaataactc ttatatcttc tactataaca tcaaaataag acgtagtgtg gtggatatgt 180
tgtctctaat ttagcagcag gtcttgagtt tgattcacaa ttcttgcaga tttatttttt 240
gagccataac agggatgagg gcaaaatagg aaatgaacga catgttaccc ttaccgcctt 300
aataagtagt agagatatcc agtttatacg taattattat tatataaaat gcactgcaca 360
tatattacta ttaccagttt tcttggacat gcacagcaga aaacacgcac acgcagagag 420
gaaaaggaga ggccataaac caaaaggctt taagaatata tgtaaagata tgtctaaatg 480
gctatatctg gttaagcaag ataacagggc tctggtcatc agtagtagtg gccttttgcc 540
cttgcccctc atctctctca cacctctctt ttctcagcct tgcttccgat cgatggatcc 600
catcccactg ccatagtgcc atcctttctt tcccttgcgc gcattgccta gccggccggc 660
cggcctgcta ttaaaccact ttacccccct tctcgttcac gctcgacgca gctccctttt 720
ccttgcttgc ttattgcaag tctctgcaag aacctgctag agaggaacaa ggtagaatag 780
tatcgctttt tccatctaga ggttatctct ttttacatga aaaatttcag ccgtattttc 840
gttctccata tatcagtcct gcgataatat aaatacgcgc gtcttgtgtg atccggcata 900
tgtatagttc ctactaactg atcgagatcg ctctcgtttg tactttctcc ctttgaggaa 960
agagttcccc tttttctgtg cttcaaattc ttgtaaggaa aaccatgcct gcctgccagc 1020
ttcttctgct acttggatga tgattcttat ttgcttactt gatttccgtt tttttttctt 1080
gctttctata tgtatgtatc tgggctgtct tcccctgcgt ctcgttacta cgtactaagc 1140
tttggaaggt ttcaactctt tgtatacgat gaggtttctg cccctagtag cagatccgcg 1200
cacgactaga tgtttgagga aaagaaaagg gcaagacgct atatatatat gcagcacgca 1260
gtcgcacata tatccagttt tccaatctgc ctcttgcttt atgataattc aacttgcgct 1320
gattatattc ttggctacct agctagaaat gtctaattaa actttgtttg ctagctagat 1380
tttgttgctt cttttcgcat ctgatctttt tatctcttct gagtgctccg caaagccttc 1440
cagtgttgaa gaagctgctg gaagaagaga tgagctttct cttgaaggaa aaagagatga 1500
tcattgccgg tttgttgttg tttcgtgttt ttttagcttc ttgtccccca tttatattcg 1560
cgcctaatga acgagcccgt agatcttgtg ttcttgtggc tggttttgtt ggatctcgat 1620
ctcggttacg tttacatgag tcttgctgcc taacatacat ctgtgttctt tttctaggct 1680
gcgagaaact taactgatcg agtctgtctg gcaggcatcg atctatccag tcgtcagttc 1740
gtcacatccg ctttttcgta tatatcatct tcagattttg tccatctgtc aaatcatgga 1800
aaatctgtcg tctttgcttg tattctcttc tgttattcct gctgcctccg gcggaccaat 1860
tcttgaatcg acccgtgttc ctattccctt ttgttagaca gcccaaatcg cttgctcgat 1920
cgtagtgtac tgtactactg cggctagcta gatcttccaa gctagctata gttcgccggt 1980
ccctttgatc tgcttcacag aacatatata acacttgaac tcttttacgc ttatgagaaa 2040
acttgctgct tgctgctttc agctggtatc gtcgccagcg gatcc                 2085
<210>4
<211>344
<212>DNA
<213>花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)
<220>
<221>增强子
<222>(1)…(344)
<223>CaMV35s
<400>4
tctagaaatc cgtcaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag 60
atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa 120
acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg 180
aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct 240
ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 300
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tgct                  344
<210>5
<211>2198
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(2198)
<223>ZmMADS
<400>5
cctttttctt tttctccaca acatgaacct tactagaaca ctgccccact taaaagaatg 60
agggtagaac tcttgaatct tagggatttg aactccttgc agtacctcat aacaagggtg 120
ttacatgtcc ttcttctgct gttgctgctt gagcaggata tagagagatg accgacaccg 180
ggttgatctt gggacaacct tcttctcatc ttttcttcgt tgttttcttt tctattctca 240
ctaccttttt ctttctcttt gttcttccca ctggaggatt ctatcaaaaa gtattaccat 300
catacagagg aggaacccga agactatgaa ccatgtacaa cagtcttcaa cccaagaatc 360
accaagcatt gtgatcttag gggcgaggga gtggaaaatg gagttgcttg tgatttggca 420
gagggaattt tatcaggagt gttttgcttt gagtggaatg ggaactgagg gagttgttgg 480
gggggggggg tttataggcg agtgggagtg ctcgggtgcg gagtgtggtg atggaacagg 540
tgacatgagg tagcaggtcg atggaggggg gctgttgccg gcgatgatgg cggcggtggg 600
tgcgctgcaa aggagggcgt ggggcggtgg tagtgcgcat ggaggcgggc acgcgtgcgg 660
ggggcacaag tgagtggtgg ggtcgatgac cctgatgttt gtggtctctg gttccaagaa 720
tctttgtctc tctttatgat aataacttct tttgtcgtcc ttttctgttt actttgactc 780
aggggcagtg ctttgattct cacggtcggt ccttttgact gagtgactgg acatgtttct 840
tctgtagcat tgtacaacat gtactttgtg caagctacaa ggccacattt tttgaagcat 900
agattctttc ccccaaacaa tttatacaaa tatgcaaggc tacacttctt gtatttctat 960
aacattgtac attcatgaca gaggctcaaa agcttgtaaa ttttgtgcag gtttaattca 1020
tgtaaagttc ccttgtagag tcatgacaac atcgtactat aaaattattc tacaaaaacc 1080
acacatgacc cccatgttat ttggtgacaa tacagaaacc acacatctag tgatgatata 1140
acactgtaca gaagccacaa attataatat ataaaacact atacaaagta tccaaataaa 1200
gcctaatagg tatggagggt aacctgaatc tttcctaata ataatgaata atctacaata 1260
atgatttgtt tggacaaaga gaattaaacg gtattgagtg ggctaaaatt ccttgttatt 1320
caaaaccctc aatcacagtt tctccgaggg aaaaagaaac aggggaggac actcaggctg 1380
ttcacaatag ggatttcata tcgctctttc caacaatgcc acatcatcaa aagtgttatg 1440
aaactaaaaa tgaaataata cttctcaatg caaactttca ttttcataga ttaatatact 1500
aattaaatga tgcaactaaa taaccaatag atgttagtaa aatatggtaa gattaaacaa 1560
accactatca atggacattt cacatagttt ccaagacttt gaaaacgggt tgacatgatt 1620
tcatccacat caaactaatt ttatctctga aacccattca ttttaaatga tatggcataa 1680
cgtccaaaat gctgacgtga cataccatta aatgtgcatg aaactcccat aaaactttta 1740
ttgataatag cctcacagac atccggtcct acacccgtgt ggacccatca gccagacgcc 1800
ctgcagcaaa cgcgacgttt gacttgccat ctcgctccct tgtgcccgac cgaccctgga 1860
aggctggact ggaactggaa caagcaaaat ggaaaaaacc atatctcacc actgaaccgc 1920
acccttccgg cccacgccag gctcgaccaa tccctgcccc gcgcgccctg acgagcgcat 1980
cactcgaacg ccggcctcgc taggcccatc cttctggccc gcaataacga tccccgtcat 2040
gatccgacgg tctagctgcc tccacgccgc tccaaaaccc ccgcgtccaa tcaaaacacg 2100
acagcgggac gagcgaaacc accgtggttt cgccaaaccg ctttccttcc catctaaaac 2160
cgccccctcc cttcctcttc tcctagctct cttgcctg                         2198
<210>6
<211>1470
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1470)
<223>ckx1-2
<400>6
gagctcgccc ttgcatgctt gagtcatatc ttggaaaaaa aaactgtaac ttaaagtatg 60
atctatatat ggattatttg gatgggatgt cattttcgta tcaccaacca aaattacagt 120
ttggtcgtgc gtagaaattc tacctactag ctgaaacaac ggctgctatg tataactact 180
ggtactggaa agaatattag tcattgactc aaaattagaa tgcatgtgta agtcatgcgt 240
gctaatttgt tctatcagca ttcggcgaat tccgaagtcc gtacgtgttg ttcgtggagg 300
agaggaaaac atcagaaatg acaaaactag acggcgtgtg cttctacact gaattcatca 360
acatttgttt tacttttact agagaatggc atcagatgga aaaccgctga aaaaacaaga 420
aaacaattgg accccaaata tgtacagacg ctagctatag ccagccacac tgaagttgac 480
atgcggcaac tagctaacca ccttctctga aacactaaca tttgtacctt ggtcgtgtaa 540
gtgtagttag taacgtatgt tgacgcgact taccgaacaa aaatataatt gtcccaatca 600
agctagggac gattgtttgt ttccaaaatg ttgccatttg cttaatcaat cctatattga 660
ttcatggctg ttaaggtgag ataaagcgac aagaaatctc tctctatata tatatataag 720
atcccgaagg ctagcgacat ttttgatagc aaaatatgag aagttggcag gttctggtag 780
caaatcaaat aatatggcca gaataatcgt ggctagcttg attaaacctt cagcttggtg 840
tattttggaa gtcgaccaac cagctgggcc ggggctcgtc gtagtaccaa aattacagcc 900
tgcttccttc gtcgtcctgt acgtaatgca gtacagctgt ctgtctagta gagacgattt 960
tgagcaggca cacacattaa gtgataacat aaaagacggc ttcattttat ttcataacca 1020
aacgatatgg tcaacacaca cctatagcta ccaaatttgt acaactattt agtgcgaaaa 1080
ctatttcatt ctcaagaatt gatcgcttat atttattatt acaggttttt aaatgtataa 1140
atacgctata ttgcatggca aaagggggta ataattaggc aggactatat atataatagt 1200
tttttttcct ttaaattctt gggaggatgg taaagttggt aactaggcac cttgtgcgca 1260
tatttttctg tggtcaaaca gaataaaact agacgggatg cagaattttt ttttccttgg 1320
aaagcagctc atctctgtgt tcgagtacgt aattgaagaa gtatgtgatc gcactacacc 1380
tacacgtatg tgccgccgta tccgtcctat atatatacgg ggtgcaatca cctagttacc 1440
aaacactcac acataagggc ggatccatgg                                  1470
<210>7
<211>960
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(960)
<223>eep1
<400>7
tcaaaccggt catcgtttgt atcatccact gcttgacttg ggaagaagtt aagaacttgg 60
taagacagct gtgagggtgt gacccaacta acccataaat acattttctc caattagtaa 120
attagttttt ttttcttggc ttgattgatg aatcattcaa gttggcatga taagattttg 180
ttcagttatt cgtgtgtctt atgtatgaaa agtgattgaa aaaaattatg gatagttttg 240
acttgctatg gatttaatta cacctaatcg cctccaatcc atatggattg gagggaacca 300
aacaagctct aaggttgata tccgcttcta tatatgctgc atgagcagtt tactgcttta 360
tttttctaca gatgggtcag tgatgaggat tggtgaatgc atcaggtcat tcaaataaat 420
ttttttaacg acagggttat gtaggtgatg acacaccata tattccctaa ctgcctgtct 480
agtgtctact aattactaac gggaaaattg cgtatgctca ttgacgtctc agctgtgcag 540
aagaatctcg gaacatttaa ttcacatata ttgatactac gtgctagctg gtgccatctt 600
cctagctgga tactacttat tgcatcaatt aatttctttt tttgttttct ttcaattgct 660
tccaaggtca aactgaatgc aaaccattac ttgttacaac ggtcctctcc atcctacgct 720
acgcctgatg tgatgtaatg taatcgaagc aagagcctta ttattgtata tttctgttcc 780
taccagggct tgcatggaaa actgccagcc tctcattata ttataaatat acgtatactg 840
atacacatac atgcacacca aaagtactca ggactgtcat ctctcagttg caattgcaaa 900
aaaaatacag agagagagag agagagagag agagatccct accctgcaaa gatatcgacc 960
<210>8
<211>1224
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1224)
<223>end2
<400>8
tactataggg cacgcgtggt cgacggcccg ggctggtaaa aagtaattga acccaaaata 60
tcatggtatg tttggtgaag acagtgatca gtgatttttt tatatctata tatatatcaa 120
agatacttga ttttctagaa ggttcttttt gttgttttcc cttatgtttt tacgcatgat 180
gcaattcttt ttgagaggtt tccgatgcat tgatgttatt gtattatctc ctatatatag 240
gtcgacgtac attatgtatt gcaataacca gttaactgga tccagcttcg cttagttttt 300
agtttttggc agaaaaaatg atcaatgttt cacaaaccaa atatttttat aacttttgat 360
gaaagaagat caccacggtc atatctaggg gtggtaacaa attgcgatct aaatgtttct 420
tcataaaaaa taaggcttct taataaattt tagttcaaaa taaatacgaa taaagtctga 480
ttctaatctg attcgatcct taaattttat aatgcaaaat ttagagctca ttaccacctc 540
tagtcatatg tctagtctga ggtatatcca aaaagccctt tctctaaatt ccacacccaa 600
ctcagatgtt tgcaaataaa tactccgact ccaaaatgta ggtgaagtgc aactttctcc 660
attttatatc aacatttgtt attttttgtt taacatttca cactcaaaac taattaataa 720
aatacgtggt tgttgaacgt gcgcacatgt ctcccttaca ttatgttttt ttatttatgt 780
attattgttg ttttcctccg aacaacttgt caacatatca tcattggtct ttaatattta 840
tgaatatgga agcctagtta tttacacttg gctacacact agttgtagtt ttgccacttg 900
tctaacatgc aactctagta gttttgccac ttgcctggca cgcgactcta gtattgacac 960
ttgtatagca aataatgcca atacgacacc tggccttaca tgaaacatta tttttgacac 1020
ttgtatacca tgcaacatta ccattgacat ttgtccatac acattatatc aaatatattg 1080
agcgcatgtc acaaactcga tacaaagctg gatgaccctc cctcaccaca tctataaaaa 1140
cccgagcgct actgtaaatc actcacaaca caacacatat cttttagtaa cctttcaata 1200
ggcgtccccc aagaactagt aaac                                        1224
<210>9
<211>1433
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1433)
<223>lec1
<400>9
tcctaatctt caaataacca tctcaaaagt tttttaaaac atcttttgag gatatgtatc 60
ccatagccct agagcgctaa attgactact tttagtcgat taaaaggtat tagacatcct 120
tacaagtcct aagtatcaaa tcaccttcta tcggctatac acaactaacg gaagttatct 180
ctagtcacac taacttatgt cggtttccgc atggcagatc aaaattagct aacttttgtt 240
ggctaataag agcaattcca aaagaacgtg taaactaatc tcaaaacaga tattagttaa 300
gaatagtaat ttttcttact ccaacagttc cctcagtctt ccccaaaaaa ttaagcgttc 360
cgcatccaca gcctcctctc ggtcgtattt tggtgtgttt catccctccc caatccattt 420
ctcaacgtat cagatcatcc accgcctacg acgactgtac agtttgcgtc acatatcaca 480
tttaaaggaa ctgttggagt acccatcata attcactctt aaaaaatttt agcctgctct 540
caataatcaa ttgggggggt aaaattttta acatcctttc ggatctaatc caacttatgg 600
aagttagcta gctctggtcg cgctaacttc tgtcgatcgc ctattagcta atactccatc 660
tgtcccatta tataaggtat aaccaactct gattcaaaga ccaaaaatat acttaattgt 720
gtctatacca cttcatcgat gtacgtatgc atagaaagag cacatcttat attgtggaac 780
aagaacaaaa atatggttac gccttatatt ataagacgta gaaatcaatg gtttacaata 840
gccaagaata gatgttttta tttatttcct atatagatgt ttttatttat ttcctatatg 900
tttcacaata gccttatatt gtgccgaaaa tttaggcaca cgtgccacga acgtctgaaa 960
tgtactccgc gcgtattacc atgcactacg acgtacgtag gagtatgtac gttgaaccaa 1020
gcacacatat atctctgaca cagtacaatg atatactaca acaacaacag tactgcccaa 1080
ttcatccatt ttcacgttcc atcttccgcg tgtgacaact cgatcggcca cgcacgcaga 1140
cgacgacgga gcagtacttc acagaatcct ccgccactcg tcacaccaac aggcgcgcgc 1200
tggtgcgcat gcatcatgtg catgccatcg tccgtccctt ggcgtgcctc ggtagacggt 1260
agctagagta gtagcctgtg cttgctaccc ctggtcaaca catcgtagcc tcctatattt 1320
aacgtatcct cacacatcac aagaacgaca cacagaaacc agtagccact actccatcca 1380
ccacgagcga gcgagcgata accctagcta gcttcaggat ccagcgagag ccc        1433
<210>10
<211>820
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(820)
<223>F3.7启动子
<400>10
gagctcaagc cgcaacaaca aatttcggtg ctcccaagct tcataaaggc tatcttcggc 60
gtcgttggga tccatggtgg cacagaatcg agttgatgtt gtagctggcg gctagggttt 120
gaagtggaga agaggtccgg ctggtggcat cctatcgtct attgagggtt gggtccggtg 180
gcatcatact tgatgacaat tgaaagtaat tttaatcaac ttgtcatgag tagtgagtct 240
tttataaaaa ataagctgaa ataagcaccc tttgatgagc ttataggatt atcataatct 300
caaatgctaa attatataat tttattagat aagttgcttg tttgtttccc cactagctta 360
tttacattgg attatataat ctacataaat tataatctca aacaaaaagt ccttaatcag 420
agatcagcga ggtctcacga gtgagaaggc gagagcttgt ccaaacgagc attttcgggc 480
gtgtgaacac ccatttcagc aaagccgtcg ttgtccagtt cagcgaagcg cattctgcgg 540
ctttggcgtg acccattctg ctagctcagc actgagaata cgcgtccgct gcagcgttgg 600
cgtacaggcc ggactacatt agccaacgcg tatcggcagt ggcaaacctc ttcgcttcta 660
actccgctgg gccaccagct ttgaccgccg cctcccttcc cctccgctac tgctcctccc 720
caccccactc ccccgcagga gcggcggcgg cggcggcgag gtcgtacccc acatcggcga 780
gcggcggcgg caccgccgga ggcaaaggca agtctagaac                       820
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>11
gtcagtggtg taaaagcact tctggt                                      26
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>12
tgcgccagaa gaagcagcag gaagat                                      26
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>13
aagcttaggg tacctcaaac cggtca                                      26
<210>14
<211>34
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>14
ccatggtcga tatctttgca gggtagggat ctct                             34
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Clontech AP1引物
<400>15
gtaatacgac tcactatagg gc                                          22
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Clontech AP2引物
<400>16
actatagggc acgcgtggt                                              19
<210>17
<211>1679
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1679)
<223>tb1启动子
<400>17
gcggccgcct acctaataga tatgtatcac tctctcctca cttcggctat aaaagagagg 60
gatagagaaa catagaatgg gtttcgaaaa aaactctttg actctctaaa tagaaacaag 120
aggaaaggga agttagttgg tcattatctt tgttgatgcc tcaacatgta attttcttcg 180
ccattgtatt tctcaatcca ctatatacaa agaggttata gggtatatat tacacatctt 240
acggtccgaa cctatattta aattacccat gtattgatgc ctaggcggta tccagcaaca 300
gagtgtctct agcacgcatc tcttactcta tttatcaact ctcccccgaa tacatgtggt 360
tccttattgt cactggcgga tctacagggt gtcaccctgt agtccggtac cggcataaca 420
tattagcttt gtctatttca tgacttcaaa catgttgcaa caacctacag atgcgttcag 480
tctatctata tacaagagga agaatacaag tgacaaatct aatttgtgaa tataagaatt 540
attatgctgg tttacataga ataccaaatt atagcacaca tttatcattc cttattgaat 600
ttctaaatgt atttcactga attattcatg catttttaat ttggcatacc ttatagtaaa 660
attctataac cgctactgct tattgtcatt atgcgacttg gaagacattt tctacctact 720
gaaagcggtc tgttttttgt gttgtcgaga gtgtgatggg taaccatagt taataatgca 780
ctggatctat cactactcat acaggtccca tatgcctaat aatgttgtga agaccaactc 840
atctgaccac atctgtccct accatgcttg tacaccacac tacatacatc actcatcact 900
ggtccttcgt ttcggtaccc tcctcccaca atgttcaatg tatatactaa tagttctcaa 960
ataaattcct gtggatgtta caaaaaccca cggtctttgg tttcctgaag aagtatttca 1020
tggaggcgcg cacgtccatc gtactgcgtc ctgcagctat ggccgccccc atctggccaa 1080
taaatgtact aggtcacttg tagccaatag cgtttcaaca tgcacacagc ttttccccca 1140
atagtgcagg tccttgtatt ctcctccctc tccctcacct caaatctcat ccacacgaac 1200
aggcggcacg gcagtattcc tccacagccc tcctctctat aagatggcac agccctctca 1260
ggtaggggcg agtgtctcac tctcacatag taaaaaaaaa aaaaacgccc ccaaggttct 1320
taagcacaat tctctagcta tcttggtctc ctacacagcc tatgcacatg agcccatgcc 1380
tctcctctcc ttgcgcctgc atagagaggt ggtatgatca cctggaaagt ttttaactct 1440
ctctctctct ctctctctct ctctctctta caagcctaga ccttatgcat ggtcggacgg 1500
acacatctga tcataggaca tatgagtagg ccacactcct cctgcccctc tctcgtagag 1560
atcaacacac actgctctta gtgccaggac ctagagaggg gagcgtggag agggcatcag 1620
ggggccttgg agtcccatca gtaaagcaca tgtttccttt ctgtgattcc tcaagcccc  1679
<210>18
<211>1027
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1027)
<223>eep2启动子
<400>18
gtaaagttac aattatatat caaatgctag ctactagtcg ggagaaaacc aactaagggg 60
atgtttgttt gggattgtaa tctgtccaga atatataatc caacaaattt tgaactaaca 120
ctcggttcaa aatttattag attatataat ccatacatat tacaatccca aacaaacacc 180
cctaattcta aatggtgaga gtaaaaagcg ctgtctaata acttttatca gctaatttgt 240
ttatcttgag ctgttaatta aaccattagt gaagtttttt tggggggtgg tcgaatagag 300
ctaatctaac tattagctca taggatcaag gccattggtt taatttcacc ccactatgac 360
tatgtcccag taactaaata ctatatttgt caccataaac tttggaagaa attagttgct 420
actagaaaga agatccaaac ctggaaaaaa ttagtttcta ctagaaagca gatcatgtct 480
gctacccaga cattgattta tactccagca tcaaccaacc ccgtacttgt tactacaaaa 540
ttggaagaaa ttagttgcta ctagaaagta gataatttct gccaccagat attgatttat 600
aacctagtat caatctctac tagccttgct tccgtcattt gttgctagat ataaatggtt 660
ttctttcaca tatgtgagtg tatatatatg aaccttgcag caaccattat attcggtagt 720
caaacaaagc cctacagaca tcgatctctg atctgagaaa aaaaatcctt atatggcgag 780
aattacaatg gaagcaagca aggctgtcct gctcttgatg gtgatcctag gaagtttgat 840
gattcccgca tactgtaagt gcacatcggg caaccatgcg catttgaatc aagttacata 900
ttatacagtt tcttactagt agtaaatata aattgttcgc ataatgtcaa caaccttaac 960
ttactgtaaa aacagtaact gaatgccctt attgcatgca gctcggaacc ttgttcgttt 1020
tctgccc                                                           1027
<210>19
<211>723
<212>DMA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(723)
<223>trx1或thxH启动子(硫氧还蛋白H)
<400>19
gcccttacta tagggcacgc gtggtcgacg gcccgggctg gtactctctg gtactgagtt 60
agatttggtg aatgttaata catatatact tttaataaaa ttacttttta agacaaaatt 120
gatgcactgg cgttcattgg cggctgtgtt aacaaaaccg aagtggaagt agcccgttcc 180
actggaggtt ggcttaagtg cacatgcagt gaaaataacg ttccacttgc gattcattta 240
acacaactgt cagtataaat agtttttttt attggcggtt gatttaggtg aaccccaagc 300
gaaaatatat ttacacatgc ggttttttaa gccgtgctca cctatttatt ttcagtgtgc 360
ttaactgaaa ctgtcggtat aaatttttgc gtgccatcag tttagagcac ttatctactg 420
actttttttt tcaagtatcg tacggatttt gcaccacgtc gacgaccgtc gataacgagg 480
cacgccgatc tagagagctc gaagacctgg gaatggcaca ggggaccggc cggagcccgc 540
cggcgccatg caagctgcct cgatcgcggg cctcgaccta agtagcccgt ccctgtcgcg 600
cgccagtcgc tcgctgcgcc tataaaagcc gcccgcggct cgcgtaggct accagcgcaa 660
aactctgcca agggcttcgg atcccacacc gaggaaagga gaagagaggg tcggaatacc 720
atg                                                               723
<210>20
<211>1626
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(1626)
<223>zm40或Mze40-2启动子
<400>20
aagcttagct agatcatttg taagaatgca acttgttcat atagcatggc tacagcctac 60
atcatctgaa atagacctgt ttataggata cctaagctca attcacccta tatctaaaac 120
ctacgaggcc taaacacacc cgtcctcaag aaaacgacca aaccaaacca aaccatgcgt 180
ccgtgtcatg gttttgtaga cacgtttacg tatcaattat agtgttctga ttttttatat 240
tctcctaatt atttagagct aaatttattt ttatgatagc agagatctaa atatttttgt 300
tttgattttt tatatactaa aatcatctct acaatattag agattttaaa tgctcagaag 360
aattttactt gaattaaaac ctttactgat ttttaactaa aacggagacc aaaagaaatc 420
tatccaaggc tgcctctaag agccttcgtg tctcgttttc ttatttcaga cttcactcat 480
cttcttattt caggctccac tatataaggt ggtctctagt atctttccta tcacatatcc 540
tatttaaaac tttagtatat aaaacattat aattcataat ataaatcgat tattttacac 600
gatctcagcc taaaagcggt aatatgcacg ctctgagcat ggcccaagct ccacgttaac 660
cgttctgtca aaaaaaaaaa catctagtct agaatggaaa acacacgatt ttagaagtta 720
ggactagttt ggcaactcaa ttttccaaat gattctcatt cttttaagag gatttaattt 780
attttttggt aaaataggaa tcactagaaa ctctattttt tcaagagaaa gtaagctatt 840
tttttagaaa aataaaaaat cccttaaaaa atattgttcg taaattagcc ctaagatgga 900
ctaaaaatct ggttttatag aatagggagg gatcgagcaa ccgccaaatc tacgcgccaa 960
aaaggtacct tttccgtgaa taaacacgac tgcggcgatc acgatctgat cgaactcgta 1020
gaataaaatg gagcagcgga atagtgtggg aggcacaagc acaggaggag ctgaaaccga 1080
accgaagtgg cgaacacgat ccccactccg gccggcaccc gagtgtgcga gacgtgtggg 1140
gctgatctga cgagcctgga agaagaagaa gaaaaaaaag tcctcacgct cctgcttggc 1200
tccatcgaca gctcactagc tgctaccgga tgctcgcgtc tctgatgcct ctcgattcat 1260
catccatcgt tggtggcggc ggcggggcgg caaaggttct gattccgcag cagccaagtg 1320
ctcctcctgc agacgaaaat gacggcagag gttggcgttg atccaggaga ctcatcagtt 1380
tagtttaata atgaatctgt agcaggcgct tcagtctctc atcggatgag cgagcagctt 1440
agcagagcag gtggtggtcc ctggctcgcc cccgtccatt ctttcccgcc cgtcctgccg 1500
tccactccgc cgcctattta tacccctcct cgcccaccct gccatcctca ccatcgcaat 1560
tcacaagcaa agcaatcaga gccaagcacc caccgtcctc ctttctttcc ttcgactcat 1620
caaagc                                                            1626
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>21
aaacaccttc ggatattgct ccctttt                                     27
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>22
tctcgcattt gcagaaacga acaacgt                                     27
<210>23
<211>525
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(525)
<223>mLIP15
<400>23
ctttcagcta agtccctgct ccctctcttt ttcttacatt caggtcctcg cagctcctct 60
cttttttctt gtttctttct ttcgatctgc gagccgtcca ggtccagtac tctcctttcc 120
gtgaaggaac tcttgcagcc ggcccctctg gtttcctcga attcttgttc cccggtccct 180
cctcctgtcc ccgcgtagat ccgtccgtcc gaggagcaca ccgtccccac ccccatgttt 240
acccaccagt tcctctgacg gccgccgtgc tccgatgaag ctgagcgtgc tccgtatccg 300
ccgctcccac tccttctccg tcgccttcct ctactggttc tacgtcttct catgaacgca 360
tcgcccctct ccacctgctg atccttcgcc atctctccat ctctctttct ctctgagata 420
gtctttcgaa tccatctcta gggctcttgt ttctccccat cctcccccca ccccaccccc 480
caccaaacac aagtcccctt gttcaatccg acaagacaag catcc                 525
<210>24
<211>587
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(587)
<223>ESR启动子
<400>24
gaattcgccc ttggtagatg tctagatgac ctattctact tttcctaaga ttttctctgt 60
atgagtaacc tgtcataatt taacttgtga gatcttgccg atataaaaaa aaaacgccag 120
tcatttatgg tacgggatta ataggttcca agaaccagcc acaatccatt tattagtttc 180
atataaatgt cataaatttt tactaaaatt ttctctgtat agtaacatgt cataactgaa 240
cttgtgagaa aaacgccagt tatttatggt acgggattaa taggttccaa aaaccagccg 300
taacctattt atattagggt actttaagct ggtgccctca gttttgttgg tgtcttcgtt 360
tttaaactta gttgtatttt ttttcttagt tctgtccttc tagtgttata gagcataagg 420
acaaaattga gcaaaaaatg actaaggata aaaatgagga tatcagaaag ggcagcagct 480
taaaaaacct tttatattag ttcaaaagga caccagtcta taaaaagtat actccaagca 540
catttgaatt tggatttgca ttgtcagtca ggccagtcaa ggggacc               587
<210>25
<211>900
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)…(900)
<223>PCNA2启动子
<400>25
atcgtaatcg gttttcaccg tataccgaac cgaaaaaacc gaataccaaa ctttatcaat  60
tcccaaattt gactattcga ttatgtgaac taattgtgtg atacaattaa attgttattc 120
acttatttgt atgtgatgta tgatgtatat ctaaatattt gtacctatat aatttttact 180
ttttaaaatt atatgtaatc tatcatgtaa acttgttgta tgtattgtct tgattataag 240
tttggtattc ggtttttacc gaaaaatcga agtaaaaaac cgaaaccgaa cttctcggtt 300
tttcattttc tagaaaaccg aacggtttct aatgtttgaa aaaccgaagt tttttaaaac 360
cgaaaaaccg aaccgaagtt tagaaaaaaa ccgaatgccc agccctaaaa attagtaccc 420
cataagaact aaaaaaagat aaaatgacta aaaattaatc agttgaaacc aaacctattt 480
tcccccacac ctcacggtat tgtttcgcat tccaagtttg aaacacgact ggaaacaaaa 540
cccaaaacga ctggagggac cgagcttgtg ctgagcagca gagatggcgg gaaatgctgc 600
gtctcccgcc tcagtttcgg atgccccgcc ctttcccaaa ccggccaccg ccgccgcccg 660
tgtctcccca ccgacaggtg ggtccaatcc ttaaccacgg accagggccc ccacctgtca 720
ggtggacctt ccgaagcaag gatcggccag gcgggaaaac atttcgcggc aggtggcggt 780
tgcgccaaat ttctccctcc cttttccgtt cggcgtcccc aaacgcctcc ctattaatct 840
ccccgcgttc cccttccctc gcgccgccgc tctcccctcc caaagctcgc cccgctccca 900
<210>26
<211>1560
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(1560)
<400>26
atg aag ccg cca tca ctg gtg cac tgc ttc aag ctg ctg gtc ctg ctg    48
Met Lys Pro Pro Ser Leu Val His Cys Phe Lys Leu Leu Val Leu Leu
1                5                   10                  15
gcg ctc gcc agg ctg acc atg cac gtc ccc gac gag gac atg cta tcg    96
Ala Leu Ala Arg Leu Thr Met His Val Pro Asp Glu Asp Met Leu Ser
             20                  25                  30
ccc ctc ggc gcg ctg cgc ctc gac ggt cat ttc agc ttc cat gac gtc    144
Pro Leu Gly Ala Leu Arg Leu Asp Gly His Phe Ser Phe His Asp Val
         35                  40                  45
tcc gcc atg gcg cgg gac ttc ggc aac cag tgc agc ttc ctg ccg gcc    192
Ser Ala Met Ala Arg Asp Phe Gly Asn Gln Cys Ser Phe Leu Pro Ala
     50                  55                  60
gcc gtg ctc cac cca ggc tcg gtc tcc gat atc gcc gcc acc gtg agg    240
Ala Val Leu His Pro Gly Ser Val Ser Asp Ile Ala Ala Thr Val Arg
 65                  70                  75                  80
cac gtc ttc tcc ctg ggc gag ggc tcg ccg ctc acc gtc gcg gcg cgc    288
His Val Phe Ser Leu Gly Glu Gly Ser Pro Leu Thr Val Ala Ala Arg
                 85                  90                  95
ggg cat gga cac tcc ctc atg ggt cag tcc cag gcc gcc cag ggg atc    336
Gly His Gly His Ser Leu Met Gly Gln Ser Gln Ala Ala Gln Gly Ile
            100                 105                 110
gtg gtc agg atg gag tcg ctc cgg ggc gct agg ctc cag gtc cac gac    384
Val Val Arg Met Glu Ser Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gln Val His Asp
        115                 120                 125
ggc ttt gtc gat gcc ccc gga gga gag ctc tgg atc aat gtc ctg cgt    432
Gly Phe Val Asp Ala Pro Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Val Leu Arg
    130                 135                 140
gag acg ctg aag cac ggc ctg gca ccc aag tcg tgg acg gac tat ctc    480
Glu Thr Leu Lys His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu
145                 150                 155                 160
cat ctc acg gtc ggt ggc acc ttg tct aat gcg ggg gtc agc ggc cag    528
His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Val Ser Gly Gln
                165                 170                 175
gcg ttc cgc cac gga ccg cag gtc agc aat gtc aat caa ctg gag att    576
Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Val Ser Asn Val Asn Gln Leu Glu Ile
            180                 185                 190
gtg aca gga agg gga gac gtc gtt acc tgc tca ccc gag gat aac tct    624
Val Thr Gly Arg Gly Asp Val Val Thr Cys Ser Pro Glu Asp Asn Ser
        195                 200                 205
gat ctc ttc tat gct gct ctc ggc ggt ctt ggt cag ttc ggg atc ata    672
Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile
    210                 215                 220
acc aga gca agg att gca ctt gag cct gct cca gag atg gtg agg tgg    720
Thr Arg Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Ala Pro Glu Met Val Arg Trp
225                 230                 235                 240
ata aga gtt ctt tac tcg gat ttt gaa agc ttc acc gaa gac cag gag    768
Ile Arg Val Leu Tyr Ser Asp Phe Glu Ser Phe Thr Glu Asp Gln Glu
                245                 250                 255
atg ttg atc atg gca gag aac tcc ttt gac tac att gaa ggt ttt gtc    816
Met Leu Ile Met Ala Glu Asn Ser Phe Asp Tyr Ile Glu Gly Phe Val
            260                 265                 270
atc ata aac agg aca ggc atc ctc aac aac tgg agg gcg tcc ttc aag    864
Ile Ile Asn Arg Thr Gly Ile Leu Asn Asn Trp Arg Ala Ser Phe Lys
        275                 280                 285
cca cag gac cca gtc caa gca agc cat ttc cag tca gat gga aga gtg    912
Pro Gln Asp Pro Val Gln Ala Ser His Phe Gln Ser Asp Gly Arg Val
    290                 295                 300
cta tac tgc ctc gaa cta acc aag aac ttc aat agt ggc gac act gat    960
Leu Tyr Cys Leu Glu Leu Thr Lys Asn Phe Asn Ser Gly Asp Thr Asp
305                 310                 315                 320
acc atg gaa cag gaa gtt gct gta ctg cta tct cgg ctt aga ttc ata    1008
Thr Met Glu Gln Glu Val Ala Val Leu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Ile
                325                 330                 335
cag tct act cta ttc cac acc gat gtc acg tac ctg gag ttt ttg gac    1056
Gln Ser Thr Leu Phe His Thr Asp Val Thr Tyr Leu Glu Phe Leu Asp
            340                 345                 350
agg gtg cac acc tct gag ctg aag ctg agg gca caa agc ctc tgg gaa    1104
Arg Val His Thr Ser Glu Leu Lys Leu Arg Ala Gln Ser Leu Trp Glu
        355                 360                 365
gtt cca cac cct tgg ttg aat ctt ctg ata ccg agg agc tca atc cgc    1152
Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Leu Ile Pro Arg Ser Ser Ile Arg
    370                 375                 380
aga ttt gct acg gaa gtc ttt ggc agg atc ctg aaa gat agc aac aat    1200
Arg Phe Ala Thr Glu Val Phe Gly Arg Ile Leu Lys Asp Ser Asn Asn
385                 390                 395                 400
ggt cct ata ttg ctt tat cca gtg aac aaa tca aag tgg gac aac aaa    1248
Gly Pro Ile Leu Leu Tyr Pro Val Asn Lys Ser Lys Trp Asp Asn Lys
                405                 410                 415
acg tca gtg gtc ata cca gat gag gaa att ttc tac cta gtg gga ttc    1296
Thr Ser Val Val Ile Pro Asp Glu Glu Ile Phe Tyr Leu Val Gly Phe
            420                 425                 430
ctt tct tca gca ccg tct ctc tca ggt cac ggc agc att gca cat gcg    1344
Leu Ser Ser Ala Pro ger Leu Ser Gly His Gly Ser Ile Ala His Ala
        435                 440                 445
atg agc ctg aac agc caa ata gta gag ttc tgt gaa gag gct gat att    1392
Met Ser Leu Asn Ser Gln Ile Val Glu Phe Cys Glu Glu Ala Asp Ile
    450                 455                 460
ggg atg aaa cag tat cta gca cac tac acc aca cag gag cag tgg aaa    1440
Gly Met Lys Gln Tyr Leu Ala His Tyr Thr Thr Gln Glu Gln Trp Lys
465                 470                 475                 480
acc cac ttt gga gca agg tgg gag aca ttt gaa cgg agg aaa cac aga    1488
Thr His Phe Gly Ala Arg Trp Glu Thr Phe Glu Arg Arg Lys His Arg
                485                 490                 495
tat gat ccc cta gcc atc cta gca cca gga cag aga ata ttc cca aag    1536
Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Pro Lys
            500                 505                 510
gcg tca ctc cca ttg tct ttg tga                                    1560
Ala Ser Leu Pro Leu Ser Leu *
        515
<210>27
<211>519
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>27
Met Lys Pro Pro Ser Leu Val His Cys Phe Lys Leu Leu Val Leu Leu
1                5                   10                  15
Ala Leu Ala Arg Leu Thr Met His Val Pro Asp Glu Asp Met Leu Ser
            20                  25                  30
Pro Leu Gly Ala Leu Arg Leu Asp Gly His Phe Ser Phe His Asp Val
        35                  40                  45
Ser Ala Met Ala Arg Aap Phe Gly Asn Gln Cys Ser Phe Leu Pro Ala
    50                  55                  60
Ala Val Leu His Pro Gly Ser Val Ser Asp Ile Ala Ala Thr Val Arg
65                  70                  75                  80
His Val Phe Ser Leu Gly Glu Gly Ser Pro Leu Thr Val Ala Ala Arg
                85                  90                  95
Gly His Gly His Ser Leu Met Gly Gln Ser Gln Ala Ala Gln Gly Ile
            100                 105                 110
Val Val Arg Met Glu Ser Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gln Val His Asp
        115                 120                 125
Gly Phe Val Asp Ala Pro Gly Gly Glu Leu Trp Ile Asn Val Leu Arg
    130                 135                 140
Glu Thr Leu Lys His Gly Leu Ala Pro Lys Ser Trp Thr Asp Tyr Leu
145                 150                 155                 160
His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Val Ser Gly Gln
                165                 170                 175
Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Val Ser Asn Val Asn Gln Leu Glu Ile
            180                 185                 190
Val Thr Gly Arg Gly Asp Val Val Thr Cys Ser Pro Glu Asp Asn Ser
        195                 200                 205
Asp Leu Phe Tyr Ala Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Ile Ile
    210                 215                 220
Thr Arg Ala Arg Ile Ala Leu Glu Pro Ala Pro Glu Met Val Arg Trp
225                 230                 235                 240
Ile Arg Val Leu Tyr Ser Asp Phe Glu Ser Phe Thr Glu Asp Gln Glu
                245                 250                 255
Met Leu Ile Met Ala Glu Asn Ser Phe Asp Tyr Ile Glu Gly Phe Val
            260                 265                 270
Ile Ile Asn Arg Thr Gly Ile Leu Asn Asn Trp Arg Ala Ser Phe Lys
        275                 280                 285
Pro Gln Asp Pro Val Gln Ala Ser His Phe Gln Ser Asp Gly Arg Val
    290                 295                 300
Leu Tyr Cys Leu Glu Leu Thr Lys Asn Phe Asn Ser Gly Asp Thr Asp
305                 310                 315                 320
Thr Met Glu Gln Glu Val Ala Val Leu Leu Ser Arg Leu Arg Phe Ile
                325                 330                 335
Gln Ser Thr Leu Phe His Thr Asp Val Thr Tyr Leu Glu Phe Leu Asp
            340                 345                 350
Arg Val His Thr Ser Glu Leu Lys Leu Arg Ala Gln Ser Leu Trp Glu
        355                 360                 365
Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Leu Ile Pro Arg Ser Ser Ile Arg
    370                 375                 380
Arg Phe Ala Thr Glu Val Phe Gly Arg Ile Leu Lys Asp Ser Asn Asn
385                 390                 395                 400
Gly Pro Ile Leu Leu Tyr Pro Val Asn Lys Ser Lys Trp Asp Asn Lys
                405                 410                 415
Thr Ser Val Val Ile Pro Asp Glu Glu Ile Phe Tyr Leu Val Gly Phe
            420                 425                 430
Leu Ser Ser Ala Pro Ser Leu Ser Gly His Gly Ser Ile Ala His Ala
        435                 440                 445
Met Ser Leu Asn Ser Gln Ile Val Glu Phe Cys Glu Glu Ala Asp Ile
    450                 455                 460
Gly Met Lys Gln Tyr Leu Ala His Tyr Thr Thr Gln Glu Gln Trp Lys
465                 470                 475                 480
Thr His Phe Gly Ala Arg Trp Glu Thr Phe Glu Arg Arg Lys His Arg
                485                 490                 495
Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Arg Ile Phe Pro Lys
            500                 505                 510
Ala Ser Leu Pro Leu Ser Leu
        515
<210>28
<211>1617
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(1617)
<400>28
atg gca aga agg act cgt ttc gtg gcc atc gcc gcc ctc ctc aca agc    48
Met Ala Arg Arg Thr Arg Phe Val Ala Ile Ala Ala Leu Leu Thr Ser
1                5                   10                  15
ttc ctc aac gtc gca gcc ggg cat tcc cgg cca ctg tcc ggt gcc ggc    96
Phe Leu Asn Val Ala Ala Gly His Ser Arg Pro Leu Ser Gly Ala Gly
             20                  25                  30
ctc ccg ggc gat ctt ttc ggg ctg ggc atc gcg tcg agg atc cgc acg    144
Leu Pro Gly Asp Leu Phe Gly Leu Gly Ile Ala Ser Arg Ile Arg Thr
        35                  40                  45
gac agc aac tcg acg gcg aag gcg gcg acg gac ttc ggc cag atg gtg    192
Asp Ser Asn Ser Thr Ala Lys Ala Ala Thr Asp Phe Gly Gln Met Val
     50                  55                  60
agg gcc gcg ccg gag gcc gtg ttc cac ccc gcc acg ccg gcc gac atc    240
Arg Ala Ala Pro Glu Ala Val Phe His Pro Ala Thr Pro Ala Asp Ile
 65                  70                  75                  80
gcc gcg ctc gtc cgg ttc tcc gcc acg tcg gcg gcg ccg ttc ccc gtt    288
Ala Ala Leu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ser Ala Ala Pro Phe Pro Val
                 85                  90                  95
gcg ccg cgc ggg cag ggc cac tcc tgg cgc ggc cag gcg ctc gcc ccg    336
Ala Pro Arg Gly Gln Gly His Ser Trp Arg Gly Gln Ala Leu Ala Pro
            100                 105                 110
ggc ggc gtc gtc gtg gac atg ggc tcg ctg ggg cgc ggc ccc cgc atc    384
Gly Gly Val Val Val Asp Met Gly Ser Leu Gly Arg Gly Pro Arg Ile
        115                 120                 125
aac gtg tcc gcc gtg gcc ggc gcg gag ccg ttc gtc gac gcc ggc ggg    432
Asn Val Ser Ala Val Ala Gly Ala Glu Pro Phe Val Asp Ala Gly Gly
    130                 135                 140
gag cag ctg tgg gtc gac gtc ctc cgc gcc acg ctg cga cac ggc ctg    480
Glu Gln Leu Trp Val Asp Val Leu Arg Ala Thr Leu Arg His Gly Leu
145                 150                 155                 160
gcg ccc cgc gtg tgg acc gac tac ctc cgg ctc acc gtc ggc ggc acg    528
Ala Pro Arg Val Trp Thr Asp Tyr Leu Arg Leu Thr Val Gly Gly Thr
                165                 170                 175
ctc tcc aac gcg gga atc ggc ggg cag gcg ttc cga cac ggt cog cag    576
Leu Ser Asn Ala Gly Ile Gly Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln
            180                 185                 190
atc gcc aac gtg cat gaa ctc gac gtc gtc aca ggc aca ggt gag atg    624
Ile Ala Asn Val His Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Thr Gly Glu Met
        195                 200                 205
gtg aca tgc tcc atg gac gtg aac tcg gac ctg ttc atg gcg gct cta    672
Val Thr Cys Ser Met Asp Val Asn Ser Asp Leu Phe Met Ala Ala Leu
    210                 215                 220
ggc ggg tta ggc cag ttc ggg gtc ata acc aga gca cgg atc cgg ctt    720
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Arg Leu
225                 230                 235                 240
gag ccg gcg ccc aag agg gtg cgc tgg gtt cga ctt gcc tac acc gac    768
Glu Pro Ala Pro Lys Arg Val Arg Trp Val Arg Leu Ala Tyr Thr Asp
                245                 250                 255
gtc gct act ttc acc aag gat cag gag ttt ctc ata tca aac cgg gct    816
Val Ala Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Phe Leu Ile Ser Asn Arg Ala
            260                 265                 270
agc caa gtc ggg ttc gac tac gtc gaa ggc cag gtc cag ctc agc cgg    864
Ser Gln Val Gly Phe Asp Tyr Val Glu Gly Gln Val Gln Leu Ser Arg
        275                 280                 285
tcc ttg gtc gaa ggc ccc aaa tca aca ccc ttc ttc tcc ggc gcc gat    912
Ser Leu Val Glu Gly Pro Lys Ser Thr Pro Phe Phe Ser Gly Ala Asp
    290                 295                 300
gtt gct agg ctt gct gga ctc gcg tcc agg acc gga cct gct gca atc    960
Val Ala Arg Leu Ala Gly Leu Ala Ser Arg Thr Gly Pro Ala Ala Ile
305                 310                 315                 320
tac tac atc gaa ggc gcc atg tac tac acc aag gac acc gcc ata tct    1008
Tyr Tyr Ile Glu Gly Ala Met Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Ala Ile Ser
                325                 330                 335
gtg gac aag aaa atg aag gca ctc ctg gat cag ctg agc ttc gag cca    1056
Val Asp Lys Lys Met Lys Ala Leu Leu Asp Gln Leu Ser Phe Glu Pro
            340                 345                 350
ggg ttt gcg ttc acc aag gac gtg acg ttc gtg cag ttc ctc gat cgg    1104
Gly Phe Ala Phe Thr Lys Asp Val Thr Phe Val Gln Phe Leu Asp Arg
        355                 360                 365
gtg cgc gag gag gag agg gtg ctc cgg tca gcc ggc gcg tgg gag gtg    1152
Val Arg Glu Glu Glu Arg Val Leu Arg Ser Ala Gly Ala Trp Glu Val
    370                 375                 380
ccg cac cca tgg ctg aac ctc ttc gtc cca cgg tcg cgc atc ctc gac    1200
Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Arg Ser Arg Ile Leu Asp
385                 390                 395                 400
ttc gac gac gga gtg ttc aag gct ctg ctc aag gac tcc aac cca gct    1248
Phe Asp Asp Gly Val Phe Lys Ala Leu Leu Lys Asp Ser Asn Pro Ala
                405                 410                 415
ggg atc atc ctc atg tac ccc atg aac aag gat agg tgg gac gac cgg    1296
Gly Ile Ile Leu Met Tyr Pro Met Asn Lys Asp Arg Trp Asp Asp Arg
            420                 425                 430
atg aca gcg atg acc cca gcc acg gac gac gac gac atg ttc tat gcc    1344
Met Thr Ala Met Thr Pro Ala Thr Asp Asp Asp Asp Met Phe Tyr Ala
        435                 440                 445
gtt agt ttc ctt tgg tca gca ctg tcc gca gac gac gtg ccc cag ctc    1392
Val Ser Phe Leu Trp Ser Ala Leu Ser Ala Asp Asp Val Pro Gln Leu
    450                 455                 460
gag aga tgg aac aag gca gtg ctg gac ttc tgt gat cgg tca gga ata    1440
Glu Arg Trp Asn Lys Ala Val Leu Asp Phe Cys Asp Arg Ser Gly Ile
465                 470                 475                 480
gaa tgc aag cag tac ctg cca cac tac aca tct caa gac ggg tgg cga    1488
Glu Cys Lys Gln Tyr Leu Pro His Tyr Thr Ser Gln Asp Gly Trp Arg
                485                 490                 495
cgg cat ttc ggg gcg aaa tgg agc agg atc gct gag ctg aag gcc aga    1536
Arg His Phe Gly Ala Lys Trp Ser Arg Ile Ala Glu Leu Lys Ala Arg
            500                 505                 510
tat gac cct cgg gca ttg ttg tcg ccg ggc cag agg att ttt ccg gtg    1584
Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Leu Ser Pro Gly Gln Arg Ile Phe Pro Val
        515                 520                 525
cca gta gag gca tct ggc att gct tct gcc tga                        1617
Pro Val Glu Ala Ser Gly Ile Ala Ser Ala *
    530                 535
<210>29
<211>538
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>29
Met Ala Arg Arg Thr Arg Phe Val Ala Ile Ala Ala Leu Leu Thr Ser
 1               5                   10                  15
Phe Leu Asn Val Ala Ala Gly His Ser Arg Pro Leu Ser Gly Ala Gly
            20                  25                  30
Leu Pro Gly Asp Leu Phe Gly Leu Gly Ile Ala Ser Arg Ile Arg Thr
        35                  40                  45
Asp Ser Asn Ser Thr Ala Lys Ala Ala Thr Asp Phe Gly Gln Met Val
    50                  55                  60
Arg Ala Ala Pro Glu Ala Val Phe His Pro Ala Thr Pro Ala Asp Ile
65                  70                  75                  80
Ala Ala Leu Val Arg Phe Ser Ala Thr Ser Ala Ala Pro Phe Pro Val
                85                  90                  95
Ala Pro Arg Gly Gln Gly His Ser Trp Arg Gly Gln Ala Leu Ala Pro
            100                 105                 110
Gly Gly Val Val Val Asp Met Gly Ser Leu Gly Arg Gly Pro Arg Ile
        115                 120                 125
Asn Val Ser Ala Val Ala Gly Ala Glu Pro Phe Val Asp Ala Gly Gly
    130                 135                 140
Glu Gln Leu Trp Val Asp Val Leu Arg Ala Thr Leu Arg His Gly Leu
145                 150                 155                 160
Ala Pro Arg Val Trp Thr Asp Tyr Leu Arg Leu Thr Val Gly Gly Thr
                165                 170                 175
Leu Ser Asn Ala Gly Ile Gly Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln
            180                 185                 190
Ile Ala Asn Val His Glu Leu Asp Val Val Thr Gly Thr Gly Glu Met
        195                 200                 205
Val Thr Cys Ser Met Asp Val Asn Ser Asp Leu Phe Met Ala Ala Leu
    210                 215                 220
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Arg Leu
225                 230                 235                 240
Glu Pro Ala Pro Lys Arg Val Arg Trp Val Arg Leu Ala Tyr Thr Asp
                245                 250                 255
Val Ala Thr Phe Thr Lys Asp Gln Glu Phe Leu Ile Ser Asn Arg Ala
            260                 265                 270
Ser Gln Val Gly Phe Asp Tyr Val Glu Gly Gln Val Gln Leu Ser Arg
        275                 280                 285
Ser Leu Val Glu Gly Pro Lys Ser Thr Pro Phe Phe Ser Gly Ala Asp
    290                 295                 300
Val Ala Arg Leu Ala Gly Leu Ala Ser Arg Thr Gly Pro Ala Ala Ile
305                 310                 315                 320
Tyr Tyr Ile Glu Gly Ala Met Tyr Tyr Thr Lys Asp Thr Ala Ile Ser
                325                 330                 335
Val Asp Lys Lys Met Lys Ala Leu Leu Asp Gln Leu Ser Phe Glu Pro
            340                 345                 350
Gly Phe Ala Phe Thr Lys Asp Val Thr Phe Val Gln Phe Leu Asp Arg
        355                 360                 365
Val Arg Glu Glu Glu Arg Val Leu Arg Ser Ala Gly Ala Trp Glu Val
    370                 375                 380
Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Pro Arg Ser Arg Ile Leu Asp
385                 390                 395                 400
Phe Asp Asp Gly Val Phe Lys Ala Leu Leu Lys Asp Ser Asn Pro Ala
                405                 410                 415
Gly Ile Ile Leu Met Tyr Pro Met Asn Lys Asp Arg Trp Asp Asp Arg
            420                 425                 430
Met Thr Ala Met Thr Pro Ala Thr Asp Asp Asp Asp Met Phe Tyr Ala
        435                 440                 445
Val Ser Phe Leu Trp Ser Ala Leu Ser Ala Asp Asp Val Pro Gln Leu
    450                 455                 460
Glu Arg Trp Asn Lys Ala Val Leu Asp Phe Cys Asp Arg Ser Gly Ile
465                 470                 475                 480
Glu Cys Lys Gln Tyr Leu Pro His Tyr Thr Ser Gln Asp Gly Trp Arg
                485                 490                 495
Arg His Phe Gly Ala Lys Trp Ser Arg Ile Ala Glu Leu Lys Ala Arg
            500                 505                 510
Tyr Asp Pro Arg Ala Leu Leu Ser Pro Gly Gln Arg Ile Phe Pro Val
        515                 520                 525
Pro Val Glu A1a Ser Gly Ile Ala Ser Ala
    530                 535
<210>30
<211>1566
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(1566)
<400>30
atg atg ctc gcg tac atg gac cgc gcg acg gcg gcc gcc gag cca gag    48
Met Met Leu Ala Tyr Met Asp Arg Ala Thr Ala Ala Ala Glu Pro Glu
 1               5                   10                  15
gac gcc ggc cgc gag ccc gcc acc atg gcg ggc ggg tgc gcg gcg gcg    96
Asp Ala Gly Arg Glu Pro Ala Thr Met Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala
             20                  25                  30
gcg acg gat ttc ggc ggg ctg ggg agc gcc atg ccc gcg gcc gtg gtc    144
Ala Thr Asp Phe Gly Gly Leu Gly Ser Ala Met Pro Ala Ala Val Val
         35                  40                  45
cgc ccg gcg agc gcg gac gac gtg gcc agc gcc atc cgc gcg gcg gcg    192
Arg Pro Ala Ser Ala Asp Asp Val Ala Ser Ala Ile Arg Ala Ala Ala
     50                  55                  60
ctg acg ccg cac ctc acc gtg gcc gcc cgc ggg aac ggg cac tcg gtg    240
Leu Thr Pro His Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Asn Gly His Ser Val
 65                  70                  75                  80
gcc ggc cag gcc atg gcc gag ggc ggg ctg gtc ctc gac atg cgc tcg    288
Ala Gly Gln Ala Met Ala Glu Gly Gly Leu Val Leu Asp Met Arg Ser
                 85                  90                  95
ctc gcg gcg ccg tcc cgg cgc gcg cag atg cag ctc gtc gtg cag tgc    336
Leu Ala Ala Pro Ser Arg Arg Ala Gln Met Gln Leu Val Val Gln Cys
            100                 105                 110
ccc gac ggc ggc ggc ggc cgc cgc tgc ttc gcc gac gtc ccc ggc ggc    384
Pro Asp Gly Gly Gly Gly Arg Arg Cys Phe Ala Asp Val Pro Gly Gly
        115                 120                 125
gcg ctc tgg gag gag gtg ctc cac tgg gcc gtc gac aac cac ggg ctc    432
Ala Leu Trp Glu Glu Val Leu His Trp Ala Val Asp Asn His Gly Leu
    130                 135                 140
gcc ccg gcg tcc tgg acg gac tac ctc cgc ctc acc gtg gg cggc acg    480
Ala Pro Ala Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Arg Leu Thr Val Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
ctc tcc aat ggc ggc gtc agc ggc cag tcc ttc cgc tac ggg ccc cag    528
Leu Ser Asn Gly Gly Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Tyr Gly Pro Gln
                165                 170                 175
gtg tcc aac gtg gcc gag ctc gag gtg gtc acc ggc gac ggc gag cgc    576
Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Glu Val Val Thr Gly Asp Gly Glu Arg
            180                 185                 190
cgc gtc tgc tcg ccc tcc tcc cac ccg gac ctc ttc ttc gcc gtg ctc    624
Arg Val Cys Ser Pro Ser Ser His Pro Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu
        195                 200                 205
ggc ggg ctc ggc cag ttt ggc gtc atc acg cgc gcc cgc atc ccg ctc    672
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu
    210                 215                 220
cac agg gcg ccc aag gcg gtg cgg tgg acg cgc gtg gtg tac gcg agc    720
His Arg Ala Pro Lys Ala Val Arg Trp Thr Arg Val Val Tyr Ala Ser
225                 230                 235                 240
atc gcg gac tac acg gcg gac gcg gag tgg ctg gtg acg cgg ccc ccc    768
Ile Ala Asp Tyr Thr Ala Asp Ala Glu Trp Leu Val Thr Arg Pro Pro
                245                 250                 255
gac gcg gcg ttc gac tac gtg gag ggc ttc gcg ttc gtg aac agc gac    816
Asp Ala Ala Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Val Asn Ser Asp
            260                 265                 270
gac ccc gtg aac ggc tgg ccg tcc gtg ccc atc ccc ggc ggc gcc cgc    864
Asp Pro Val Asn Gly Trp Pro Ser Val Pro Ile Pro Gly Gly Ala Arg
        275                 280                 285
ttc gac ccg tcc ctc ctc ccc gcc ggc gcc ggc ccc gtc ctc tac tgc    912
Phe Asp Pro Ser Leu Leu Pro Ala Gly Ala Gly Pro Val Leu Tyr Cys
    290                 295                 300
ctg gag gtg gcc ctg tac cag tac gcg cac cgg ccc gac gac gac gac    960
Leu Glu Val Ala Leu Tyr Gln Tyr Ala His Arg Pro Asp Asp Asp Asp
305                 310                 315                 320
gag gag gac cag gcg gcg gtg acc gtg agc cgg atg atg gcg ccg ctc    1008
Glu Glu Asp Gln Ala Ala Val Thr Val Ser Arg Met Met Ala Pro Leu
                325                 330                 335
aag cac gtg cgg ggc ctg gag ttc gcg gcg gac gtc ggg tac gtg gac    1056
Lys His Val Arg Gly Leu Glu Phe Ala Ala Asp Val Gly Tyr Val Asp
            340                 345                 350
ttc ctg tcc cgc gtg aac cgg gtg gag gag gag gcc cgg cgc aac ggc    1104
Phe Leu Ser Arg Val Asn Arg Val Glu Glu Glu Ala Arg Arg Asn Gly
        355                 360                 365
agc tgg gac gcg ccg cac ccg tgg ctc aac ctc ttc gtc tcc gcg cgc    1152
Ser Trp Asp Ala Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Ser Ala Arg
    370                 375                 380
gac atc gcc gac ttc gac cgc gcc gtc atc aag ggc atg ctc gcc gac    1200
Asp Ile Ala Asp Phe Asp Arg Ala Val Ile Lys Gly Met Leu Ala Asp
385                 390                 395                 400
ggc atc gac ggg ccc atg ctc gtc tac cct atg ctc aag agc aag tgg    1248
Gly Ile Asp Gly Pro Met Leu Val Tyr Pro Met Leu Lys ger Lys Trp
                405                 410                 415
gac ccc aac acg tcg gtg gcg ctg ccg gag ggc gag gtc ttc tac ctg    1296
Asp Pro Asn Thr Ser Val Ala Leu Pro Glu Gly Glu Val Phe Tyr Leu
            420                 425                 430
gtg gcg ctg ctg cgg ttc tgc cgg agc ggc ggg ccg gcg gtg gac gag    1344
Val Ala Leu Leu Arg Phe Cys Arg Ser Gly Gly Pro Ala Val Asp Glu
        435                 440                 445
ctg gtg gcg cag aac ggc gcc atc ctc cgc gcc tgc cgc gcc aac ggc    1392
Leu Val Ala Gln Asn Gly Ala Ile Leu Arg Ala Cys Arg Ala Asn Gly
    450                 455                 460
tac gac tac aag gcc tac ttc ccg agc tac cgc ggc gag gcc gac tgg    1440
Tyr Asp Tyr Lys Ala Tyr Phe Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Ala Asp Trp
465                 470                 475                 480
gcg cgc cac ttc ggc gcc gcc agg tgg agg cgc ttc gtg gac cgc aag    1488
Ala Arg His Phe Gly Ala Ala Arg Trp Arg Arg Phe Val Asp Arg Lys
                485                 490                 495
gcc cgg tac gac ccg ctg gcg atc ctc gcg ccg ggc cag aag atc ttc    1536
Ala Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly Gln Lys Ile Phe
            500                 505                 510
cct cgg gtc ccg gcg tcc gtc gcc gtg tag                            1566
Pro Arg Val Pro Ala Ser Val Ala Val *
        515                 520
<210>31
<211>521
<212>PRT
<213>玉米(Zea maya)
<400>31
Met Met Leu Ala Tyr Met Asp Arg Ala Thr Ala Ala Ala Glu Pro Glu
 1               5                  10                  15
Asp Ala Gly Arg Glu Pro Ala Thr Met Ala Gly Gly Cys Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Ala Thr Asp Phe Gly Gly Leu Gly Ser Ala Met Pro Ala Ala Val Val
        35                  40                  45
Arg Pro Ala Ser Ala Asp Asp Val Ala Ser Ala Ile Arg Ala Ala Ala
    50                  55                  60
Leu Thr Pro His Leu Thr Val Ala Ala Arg Gly Asn Gly His Ser Val
65                  70                  75                  80
Ala Gly Gln Ala Met Ala Glu Gly Gly Leu Val Leu Asp Met Arg Ser
                85                  90                  95
Leu Ala Ala Pro Ser Arg Arg Ala Gln Met Gln Leu Val Val Gln Cys
            100                 105                 110
Pro Asp Gly Gly Gly Gly Arg Arg Cys Phe Ala Asp Val Pro Gly Gly
        115                 120                 125
Ala Leu Trp Glu Glu Val Leu His Trp Ala Val Asp Asn His Gly Leu
    130                 135                 140
Ala Pro Ala Ser Trp Thr Asp Tyr Leu Arg Leu Thr Val Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Leu Ser Asn Gly Gly Val Ser Gly Gln Ser Phe Arg Tyr Gly Pro Gln
                165                 170                 175
Val Ser Asn Val Ala Glu Leu Glu Val Val Thr Gly Asp Gly Glu Arg
            180                 185                 190
Arg Val Cys Ser Pro Ser Ser His Pro Asp Leu Phe Phe Ala Val Leu
        195                 200                 205
Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu
    210                 215                 220
His Arg Ala Pro Lys Ala Val Arg Trp Thr Arg Val Val Tyr Ala Ser
225                 230                 235                 240
Ile Ala Asp Tyr Thr Ala Asp Ala Glu Trp Leu Val Thr Arg Pro Pro
                245                 250                 255
Asp Ala Ala Phe Asp Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Val Asn Ser Asp
            260                 265                 270
Asp Pro Val Asn Gly Trp Pro Ser Val Pro Ile Pro Gly Gly Ala Arg
        275                 280                 285
Phe Asp Pro Ser Leu Leu Pro Ala Gly Ala Gly Pro Val Leu Tyr Cys
    290                 295                 300
Leu Glu Val Ala Leu Tyr Gln Tyr Ala His Arg Pro Asp Asp Asp Asp
305                 310                 315                 320
Glu Glu Asp Gln Ala Ala Val Thr Val Ser Arg Met Met Ala Pro Leu
                325                 330                 335
Lys His Val Arg Gly Leu Glu Phe Ala Ala Asp Val Gly Tyr Val Asp
            340                 345                 350
Phe Leu Ser Arg Val Asn Arg Val Glu Glu Glu Ala Arg Arg Asn Gly
        355                 360                 365
Ser Trp Asp Ala Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Val Ser Ala Arg
    370                 375                 380
Asp Ile Ala Asp Phe Asp Arg Ala Val Ile Lys Gly Met Leu Ala Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ile Asp Gly Pro Met Leu Val Tyr Pro Met Leu Lys Ser Lys Trp
                405                 410                 415
Asp Pro Asn Thr Ser Val Ala Leu Pro Glu Gly Glu Val Phe Tyr Leu
            420                 425                 430
Val Ala Leu Leu Arg Phe Cys Arg Ser Gly Gly Pro Ala Val Asp Glu
        435                 440                 445
Leu Val Ala Gln Asn Gly Ala Ile Leu Arg Ala Cys Arg Ala Asn Gly
    450                 455                 460
Tyr Asp Tyr Lys Ala Tyr Phe Pro Ser Tyr Arg Gly Glu Ala Asp Trp
465                 470                 475                 480
Ala Arg His Phe Gly Ala Ala Arg Trp Arg Arg Phe Val Asp Arg Lys
                485                 490                 495
Ala Arg Tyr Asp Pro Leu Ala Ile Leu Ala Pro Gly G1n Lys Ile Phe
            500                 505                 510
Pro Arg Val Pro Ala Ser Val Ala Val
        515                 520
<210>32
<211>1629
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>CDS
<222>(1)…(1629)
<400>32
atg gag gtt gcc atg gtc gtg agc gca aga gcc agc ctg ctg atc ctc    48
Met Glu Val Ala Met Val Val Ser Ala Arg Ala Ser Leu Leu Ile Leu
 1               5                   10                  15
gtc ctc tcc ctc tgc tct ccg tac aaa ttc ata cag agc ccc atg gac    96
Val Leu Ser Leu Cys Ser Pro Tyr Lys Phe Ile Gln Ser Pro Met Asp
             20                  25                  30
ctg ggc ccc ctg aac ctg ctc ccc acc acc agc acc gcg gcc gcg tcc    144
Leu Gly Pro Leu Asn Leu Leu Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Ser
         35                  40                  45
agc gac ttc ggc agg ata ctc ttc cgc gcc ccg gcc gcg gtg ctg agg    192
Ser Asp Phe Gly Arg Ile Leu Phe Arg Ala Pro Ala Ala Val Leu Arg
     50                  55                  60
ccc cag tcg ccg agg gac atc tcc atg ctg ctc agc ttc ctc tcc ggc    240
Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ile Ser Met Leu Leu Ser Phe Leu Ser Gly
 65                  70                  75                  80
tcg ccc tcg ctg agc agg gtc acg gtg gcg gcc agg ggg gca ggc cac    288
Ser Pro Ser Leu Ser Arg Val Thr Val Ala Ala Arg Gly Ala Gly His
                 85                  90                  95
tcc atc cac ggg cag gcg cag gcc ccg gac ggc att gtg gtg gag acg    336
Ser Ile His Gly Gln Ala Gln Ala Pro Asp Gly Ile Val Val Glu Thr
            100                 105                 110
cgc tcc ttg ccc ggc gag atg gag ttc cac cac gtc cgc ggg gga ggc    384
Arg Ser Leu Pro Gly Glu Met Glu Phe His His Val Arg Gly Gly Gly
        115                 120                 125
gaa ggg cgt gcc tcc tac gcc gac gtg ggc ggc ggg gtt ctg tgg atc    432
Glu Gly Arg Ala Ser Tyr Ala Asp Val Gly Gly Gly Val Leu Trp Ile
    130                 135                 140
gag ctc ctg gag cgg agc ctg aag ctt ggg ctg gct ccc agg tcc tgg    480
Glu Leu Leu Glu Arg Ser Leu Lys Leu Gly Leu Ala Pro Arg Ser Trp
145                 150                 155                 160
acc gac tac ctc tac ctc act gtc ggc ggg acg ctg tcc aat gcc ggc    528
Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly
                165                 170                 175
atc agc ggg cag acg ttc aag cac ggg cca cag atc agc aac gtc ctc    576
Ile Ser Gly Gln Thr Phe Lys His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu
            180                 185                 190
cag ctg gag gta gtc aca gga cga ggg gag att gtg gaa tgc tca ccc    624
Gln Leu Glu Val Val Thr Gly Arg Gly Glu Ile Val Glu Cys Ser Pro
        195                 200                 205
agc aag gag gcc gac ctg ttc aat gcc gtc ctg gga ggc cta ggc cag    672
Ser Lys Glu Ala Asp Leu Phe Asn Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln
    210                 215                 220
ttc ggc atc ata acc agg gcc agg atc ctg ctg cag gag gct ccg gag    720
Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Leu Leu Gln Glu Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
aag gtg acg tgg gtg agg gcc ttc tac gac gac ttg ggc gcc ttc acc    768
Lys Val Thr Trp Val Arg Ala Phe Tyr Asp Asp Leu Gly Ala Phe Thr
                245                 250                 255
agg gac cag gag ctg ctg gtg tcg att ccg gat tcg gtg gac tac gtg    616
Arg Asp Gln Glu Leu Leu Val Ser Ile Pro Asp Ser Val Asp Tyr Val
            260                 265                 270
gaa ggg ttc atg gtc ctg aac gag cgg tcc ctc cac agc tcc tcc atc    864
Glu Gly Phe Met Val Leu Asn Glu Arg Ser Leu His Ser Ser Ser Ile
        275                 280                 285
gcc ttc ccc gcg agc gtg gac ttc agc ccg gat ttc ggc acc agg agc    912
Ala Phe Pro Ala Ser Val Asp Phe Ser Pro Asp Phe Gly Thr Arg Ser
    290                 295                 300
agc cct agg atc tac tac tgc gtc gag ttc gcg gtc cac cac cac cac    960
Ser Pro Arg Ile Tyr Tyr Cys Val Glu Phe Ala Val His His His His
305                 310                 315                 320
ggt tac cag cag cag tct cag gcg gcc gtg gag gcc atc tcg agg cgg    1008
Gly Tyr Gln Gln Gln Ser Gln Ala Ala Val Glu Ala Ile Ser Arg Arg
                325                 330                 335
atg agc cac atg gcg tcc cag ctg tac agc gtg gag gtg tcc tac ttg    1056
Met Ser His Met Ala Ser Gln Leu Tyr Ser Val Glu Val Ser Tyr Leu
            340                 345                 350
gac ttc ctg aac cgg gtc agg atg gag gag gtg agc ctg cgg agc gcc    1104
Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Met Glu Glu Val Ser Leu Arg Ser Ala
        355                 360                 365
ggg atg tgg gag gag gtg cac cac ccg tgg ctc aac atg ttc gtg ccc    1152
Gly Met Trp Glu Glu Val His His Pro Trp Leu Asn Met Phe Val Pro
    370                 375                 380
aag gcc ggg gtc gct ggc ttc agg gat ctg ctc atg gac aac gtc tcg    1200
Lys Ala Gly Val Ala Gly Phe Arg Asp Leu Leu Met Asp Asn Val Ser
385                 390                 395                 400
ccg gat agc ttc cag ggc ctc atc ctc atc tac cca ctc ctc aga gac    1248
Pro Asp Ser Phe Gln Gly Leu Ile Leu Ile Tyr Pro Leu Leu Arg Asp
                405                 410                 415
aag tgg gac acc aac acg tcg gtc gtg atc ccg gac tcc ggg ccc acc    1296
Lys Trp Asp Thr Asn Thr Ser Val Val Ile Pro Asp Ser Gly Pro Thr
            420                 425                 430
gcg gac gac ccg gtg atg tac gtg gtc ggc atc ctc agg tcc gcg aac    1344
Ala Asp Asp Pro Val Met Tyr Val Val Gly Ile Leu Arg Ser Ala Asn
        435                 440                 445
cct ggt cca gaa gaa gac ggt gac ggc tgc tcc cac cgc tgc ctg cac    1392
Pro Gly Pro Glu Glu Asp Gly Asp Gly Cys Ser His Arg Cys Leu His
    450                 455                 460
gag ctc ctc cgc agc cac cgc cgg atc gcc gac gcc gcg gag gcg cgc    1440
Glu Leu Leu Arg Ser His Arg Arg Ile Ala Asp Ala Ala Glu Ala Arg
465                 470                 475                 480
ctc ggc gcc aag cag tac ctg cct cac cac ccg acc ccg gcc cgc tgg    1488
Leu Gly Ala Lys Gln Tyr Leu Pro His His Pro Thr Pro Ala Arg Trp
                485                 490                 495
cag cag cac ctg ggc cgg cgc tgg gag cgc ttc gcg gac cgc aag gcc    1536
Gln Gln His Leu Gly Arg Arg Trp Glu Arg Phe Ala Asp Arg Lys Ala
            500                 505                 510
cgg ttc gac ccg ctg cgc atc ctg ggg ccc ggc cag ggc ata ttc cct    1584
Arg Phe Asp Pro Leu Arg Ile Leu Gly Pro Gly Gln Gly Ile Phe Pro
        515                 520                 525
cgg acg gcc cag gat gct gcc gcc gct gct gcg tac ggg agc tag        1629
Arg Thr Ala Gln Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Gly Ser *
    530                 535                 540
<210>33
<211>542
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>33
Met Glu Val Ala Met Val Val Ser Ala Arg Ala Ser Leu Leu Ile Leu
 1               5                  10                  15
Val Leu Ser Leu Cys Ser Pro Tyr Lys Phe Ile Gln Ser Pro Met Asp
            20                  25                  30
Leu Gly Pro Leu Asn Leu Leu Pro Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Ser
        35                  40                  45
Ser Asp Phe Gly Arg Ile Leu Phe Arg Ala Pro Ala Ala Val Leu Arg
    50                  55                  60
Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ile Ser Met Leu Leu Ser Phe Leu Ser Gly
65                  70                  75                  80
Ser Pro Ser Leu Ser Arg Val Thr Val Ala Ala Arg Gly Ala Gly His
                85                  90                  95
Ser Ile His Gly Gln Ala Gln Ala Pro Asp Gly Ile Val Val Glu Thr
            100                 105                 110
Arg Ser Leu Pro Gly Glu Met Glu Phe His His Val Arg Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Glu Gly Arg Ala Ser Tyr Ala Asp Val Gly Gly Gly Val Leu Trp Ile
    130                 135                 140
Glu Leu Leu Glu Arg Ser Leu Lys Leu Gly Leu Ala Pro Arg Ser Trp
145                 150                 155                 160
Thr Asp Tyr Leu Tyr Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly
                165                 170                 175
Ile Ser Gly Gln Thr Phe Lys His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu
            180                 185                 190
Gln Leu Glu Val Val Thr Gly Arg Gly Glu Ile Val Glu Cys Ser Pro
        195                 200                 205
Ser Lys Glu Ala Asp Leu Phe Asn Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln
    210                 215                 220
Phe Gly Ile Ile Thr Arg Ala Arg Ile Leu Leu Gln Glu Ala Pro Glu
225                 230                 235                 240
Lys Val Thr Trp Val Arg Ala Phe Tyr Asp Asp Leu Gly Ala Phe Thr
                245                 250                 255
Arg Asp Gln Glu Leu Leu Val Ser Ile Pro Asp Ser Val Asp Tyr Val
            260                 265                 270
Glu Gly Phe Met Val Leu Asn Glu Arg Ser Leu His Ser Ser Ser Ile
        275                 280                 285
Ala Phe Pro Ala Ser Val Asp Phe Ser Pro Asp Phe Gly Thr Arg Ser
    290                 295                 300
Ser Pro Arg Ile Tyr Tyr Cys Val Glu Phe Ala Val His His His His
305                 310                 315                 320
Gly Tyr Gln Gln Gln Ser Gln Ala Ala Val Glu Ala Ile Ser Arg Arg
                325                 330                 335
Met Ser His Met Ala Ser Gln Leu Tyr Ser Val Glu Val Ser Tyr Leu
            340                 345                 350
Asp Phe Leu Asn Arg Val Arg Met Glu Glu Val Ser Leu Arg Ser Ala
        355                 360                 365
Gly Met Trp Glu Glu Val His His Pro Trp Leu Asn Met Phe Val Pro
    370                 375                 380
Lys Ala Gly Val Ala Gly Phe Arg Asp Leu Leu Met Asp Asn Val Ser
385                 390                 395                 400
Pro Asp Ser Phe Gln Gly Leu Ile Leu Ile Tyr Pro Leu Leu Arg Asp
                405                 410                 415
Lys Trp Asp Thr Asn Thr Ser Val Val Ile Pro Asp Ser Gly Pro Thr
            420                 425                 430
Ala Asp Asp Pro Val Met Tyr Val Val Gly Ile Leu Arg Ser Ala Asn
        435                 440                 445
Pro Gly Pro Glu Glu Asp Gly Asp Gly Cys Ser His Arg Cys Leu His
    450                 455                 460
Glu Leu Leu Arg Ser His Arg Arg Ile Ala Asp Ala Ala Glu Ala Arg
465                 470                 475                 480
Leu Gly Ala Lys Gln Tyr Leu Pro His His Pro Thr Pro Ala Arg Trp
                485                 490                 495
Gln Gln His Leu Gly Arg Arg Trp Glu Arg Phe Ala Asp Arg Lys Ala
            500                 505                 510
Arg Phe Asp Pro Leu Arg Ile Leu Gly Pro Gly Gln Gly Ile Phe Pro
        515                 520                 525
Arg Thr Ala Gln Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Gly Ser
    530                 535                 540
<210>34
<211>3003
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)…(0)
<223>ZmCkx2的启动子
<400>34
ctgccatcct catgcagatg agacggagag aagatgagaa aagtacaaga tcccagaagc 60
aagcagcagg atggggccat cccccccccc ccccactggg ccccacgggc cgaaagccac 120
cggcgaaaat gtccagaagg ccacgtgggg catgggtccc cggagtccac ttccgcgcga 180
tctcgaggcc gggccgcacc ggcaatcgct ctccggccac ctccctgctt cctcaggtcc 240
ggtctcccat agtccaatgc atgcatgcac gagcatcccc tcagaacgct ggcagtgagt 300
gtcttgctcg cacatcagct tggccagtca gtgcgagaac acagcagcaa caacaacaac 360
aacacctgtg cacaatggcg tctatcattg gtaccatctc aatcggctga cttgtctata 420
actactgtta acggaggtcc cttgtgcatc atgcagtttt agaagagcac ctcgatcgca 480
agcgcctcat tattatcatc attctcttaa actggtcaga aaactgacca tcagctaaag 540
tgatactgac atactgtatc tttgtagata attaaatgga gaaaaatctc cttctgttcc 600
gtctggccgt taaatgccga atccatgcat atataaatct gtacgtaggc tcaaagcaca 660
gtgtgcattt tggctttcca gctagcatac atacatgtga ctgctgacga tgaattgtgt 720
ggaccacatt ggcacaacgg tgcattgcaa cggacgggcg ccgtcaaggt caaacgcata 780
aaaggctgtc atttggcaac acaatgaatc agtggcgcca cgccatccgt ccacgatcca 840
ccgttcttgg tgtagtggtt ggtcccagcg cttgaaggcc aggccgaggc cgtgttctgg 900
aaggtggcct gtggtgagca ctaaacatgt gtgtgctttt gcctttccaa gccagagggc 960
cggtctctta atatacataa catacacacc actttttcat tttgttcatt attacggtct 1020
aatgcaaaca aagccatttg cagaatgtgc tacatagcag gtatgtttct ctttttttcc 1080
ctgtaaaatt tgtagactta tcacaagaat aagtttaacc attactagaa tagttcctca 1140
catgtttgtt taccatcggg gcgggaacag cttgcattgc aaaagctgcg caagtattag 1200
ggccctctag atttttttaa tagtagtagt atatataata tataggtgtt actatttgag 1260
ttgttaggcc atctgcggca gattttctat gacatccctt atttcaaact ttattttgca 1320
aacagttgtc atatacccta ttttaggcga atcactgaag acaggtaagt tttggcacgg 1380
atgaggtgga gagtggacaa gaatctccgt tgtggagtct gcctaccagt accaggcaaa 1440
gtaatgcatg cgcgcggaca ggatggacgg tcgaagtggc ctccctgcct ccaccccgac 1500
gacgacgcat gggctccgtc cccttcgctt gcttcctgct ccagctagct ccatcgccta 1560
gtgctccgct ccgccgcaca ggaacggaac ggaacggacc gaaccacttg gtcgcatccc 1620
gatgcgttgc cgtctgccgg tgtccatcgt gtcggtttca cctctgcact agcataaatt 1680
ccttgacacc aacagcgagc gacatcatcg gctcagccct acaagtcacg agtgttctga 1740
ctgaccagct agcaatagca atctgctgct ctgcttgact tgctcggacg atccgccgct 1800
gcttgcgttc ggctccagta ggctatcctc cgcgacgtcg tcgatctgga ctccatggcg 1860
tccacacaga atcgacacga gcttggtgtg ccgcgtacgc atgtgtgcgt atgtatgcct 1920
cgtcttccac atgcaaacat acgcagagga aggggaaagg cggcagcaaa cgcgacggtc 1980
caagtcgtac cacagaagtg gtcgcgcatg tgtgcccaag ttgccatcac ccggatgcta 2040
ttagatttcc agaaactaac ttgtgaggac ccctggtgtc tgctagctgc tctccaactc 2100
caacctgtca atcaattccc agacggacaa gctgagctca cagctcaagc tcaacaacga 2160
tggccggccg ggtcaccatg gaactgatcc tctacagtac aggcatggga aaatggagga 2220
ggagagcagg gcagtgaggc cacagaatca gaggctgatt agtgttggtg agctccaatc 2280
caacagcata tgaccagcga gcagaacata gggatgtcct gtgggcttgc ccagggacag 2340
acgcatgcaa gccatgtgac tgtccggaga gagagccggt gatactggaa cagaggatcc 2400
gatcctgccc cccttctttt gcctctccct ctctcacaca cacagtctca cctatatgtg 2460
gctatgtcgt ctccattagg ctgttaacta gccaacacat gttcccccgt tgcttaagac 2520
agcagctaca aagcgagaac atcatgctct aaaaagaaac ttccgcaatg caccactagc 2580
acatgtctgc gcctcaattc gcaaccggca agcaagcaag ccggcaagca gacagtcgcc 2640
atacggtttt taccaaacag ctagcgccca cagctgacta gctgaccacc gcaccaccca 2700
cactcctcct cgcgagtcgc gaggcaagcc gcaagctcct atatagagag gccccctccc 2760
tccccctgca tggacagcca ccgccttctt caaccctcct tccgtcttcc tcctctagtc 2820
ttacctcgtt gcacctcaag aaacttggcg cgcaaccagg aaaccccctc ttctctctct 2880
ctctctctct ctctctctgc cttctgattc caagctcccc aactgcccag caccaacctg 2940
ccgaactccc ctcctttttg ttggtttgtc gaattataaa ttgagcccgg ccggctgact 3000
acc                                                               3003
<210>35
<211>2001
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)…(0)
<223>ZmCkx3的启动子
<221>misc_feature
<222>(0)…(0)
<223>n＝A，T，C，或G
<400>35
ccggggtgtg acaggagcat tgaagcatgc atgctctgct cagcatataa ttaaagaaag 60
aagcatcaaa atgcactgga gcagttgacc aaaacttgca gctacgtcaa aatatatacg 120
agggctggca tcaaggtgtg ctcagcccga gccccgtcag gtaacttggt cttttgtttt 180
ctggccttgc ggcttcatta aaggccgccg gccgcgagcg aggcaaaaca gtgaagggga 240
ggggaggtgc ccgccactaa cctctcggtc ggatatatta gtattcaagc agttgacaaa 300
tctgtgcgga tttgatttgg tctgaggaaa atatatatat atatatatat agcccctcgt 360
cgttcatgca ccctctcgca gcctgcaacc ttacaatatt gttcttgcat ccggttttat 420
ttatattttt attttttaaa aaaaaaatcc atagtcctgc cgtcttgaag gatatgtttt 480
tctttaccca tgcacggcgg agtttaaatt tgcgctgacc cgactgctcg tgaacagaga 540
caagtatgac agatatcgtt gagttccaaa ttttaaaaaa aaaatcaata aaaaatttaa 600
aacagaatgt tgacgaggaa aaaaaatatg aaggtgcttg cacacctgtc actccatgcc 660
ggacatcaac aaattaattg ttcaagtggt gggagtcagc tgcttccagt ttaccttcct 720
gcgccagcgg ttggtagaca ggattgttgc cacgtggacg aaatctcctg ccgccagctg 780
gttgatcacg gcaggcagtc acatgcttct tgccaagatt accgcgggtt gtaatcatct 840
gaaatatatt aacctgagca cgtgatagag taaaaaaatt ggtcgactaa gggggtgttt 900
ggtttctagg gactaatgtt tagtccctac attttattcc attttagttc taaaattacc 960
aaatatagaa actaaaactt tattttagtt tctatattag caatttatag actaaaaaag 1020
aataaaatga agggactaaa tattaatccc tagaaaccaa acacccccta actttaggta 1080
agttgtggca tgcattctct ggaacggcag ttctagagag cacttgagat gtcaacaggt 1140
gaagaattga agattggcca acacaggcgt tcaaggagat tcaaccaccc atccacatac 1200
cgcgcaaaca cttggggggc attcttgctg ctgccacatt tggaagaagc gcagcaatgt 1260
ggtgttcaga agaagcacag ctattttagc tcttgataac tatctttttt tttgcataga 1320
ttaatttatt tcttcgatat atactagctt gtaaaaaaat gttttrcaga tatatgtata 1380
aaaatgtgta cctagtacct acgcatgtct tagttcaaca tacttgatag ctgtagtttt 1440
ctgaaaacct gttcaaatta acctttttcc taccctgatg gtgaatagag agaaaagctt 1500
tacctttgtc tgaataagaa aactaacaga aagcttacat tttggccact ctacctgccc 1560
gagtattttc taagcaagca aaggcgcatg aaaattttct cggaatccat gaccttttac 1620
gcgcantgnw aaayawwgwm mattgmtcmg accaatgatc attttgatac tctccacaag 1680
tcaacatctc aaaaaaacca caagatgggg cccatcaaca taagttcacg agtgtgcctt 1740
caggtacatt gttctttttt tttgttttgc taaagtcaat cagctgcaaa atattcagaa 1800
caatttcaat aacccgaaag gctgttgtgc ctccatttgt caacgtttgc gaggccaaat 1860
ggtacccccg ctataaatac catggaagtt cttggcctct aggacacaca agcgatctct 1920
cctcctatag tttctataac cccacaaagc gtccaggtcc cgtagtcacc tccgattgca 1980
ttgcgttgcc gcaagacaag c                                           2001
<210>36
<211>2448
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)…(0)
<223>ZmCkx4的启动子
<400>36
ctttatgttg tagccaagga aagtatactg ttaagatcag aatgaacctt ataggagttg 60
tatgggcata aagccagcaa gtatagccaa aggtacacaa ggctaatata gtcaagttgt 120
tgatgtgtga gacgttcaag gaagtgaact attggaggag tcgactaaaa gtacgattaa 180
taaggtagac atgatggtaa aatctttgat ctagaattta agtggtatgg atgcgagggt 240
gagaatggca agcacaactt caaatatagg gtgatgctta tgcttggctg agccatttca 300
ttcatgagca taggaacatg agacatggtg ggatatggat acttgcacaa aaaaaggaat 360
taagtttatg atattcacct cccagtcagt ttgcatggta aaaaaattcc tatcaatttg 420
gttctcaact agggcctaaa attctcaaaa tatctgttgg ggaccattat cgtcgacgat 480
cctcagaatc tgttattacc aaattaaaag gtgtgtttca ggtactgtgc aaagcagcag 540
cgaagctatc cttcgtcaaa agtggctcaa tgaaccaggt ggagaagcta tggagcttcg 600
tctgcgtaga gcgtgccgga ggaggaagct ttggctctga atgcatcgac ttacgaagca 660
tgggagaaga agactcagaa ggcttgtcca gcgtgggaat aaaaaggaga aaatacaatt 720
ttgcccttgt gggatttgta aatcatgtgc aaggctcatg gatatgtttg taattttata 780
tgatatgttt gtaaatcatg gatatgtttt gtaaatcagg tggactagag gagagggagg 840
gtggacatag tgacttgcat cttgatcatg gtagagtggt catggtagag ggaaaggggt 900
aggtcaattc tggagtgcgg ccacggtggc ttgagtgtcg gccacggtag gggaaagggg 960
tagcccaatt ctagggccgg catcggagaa ggccgacatg tgcacgtcag gaggtagtgt 1020
tagaggtttg aacggaaaaa attgaacatg ttagtatgat gagttgtgta attgctggga 1080
attgtggata atttccactt aactacggcc ctgtttattt acccctagat tataaaatcc 1140
aacttaaaaa agttgagatg taaacaaaca acacatatta ttaggtggat tatgttatct 1200
agaaatctgg atgataataa tttataagtc ggttaatagg tgtttacata atcgataagc 1260
tggattatat aatcctggaa cacggctttc gcgagagcgt attaaaacag gattccgtga 1320
agcacactat ctgaggagct ccaccaaaag ctgaatctag cccgcactct tttttggagg 1380
attcaaattt ggtgtcactg gagcattcgg cattttgttt catggcgtga agctattttt 1440
actaattaca gaagctgttt caaatagacc tttaaatgat ggctgagtat aaaaggaggc 1500
aattttttta tctcgccgat ggagccaggt cgcgtcgcgc cgcggccgtg ctgcgctctc 1560
gacgcgatct agcggcgatg tgcacagtac agttttgcca tgccattggt taagcctgca 1620
tacaacacac cagcgtactg ccctgcacaa gatctcctcg gctcggcctc tcctgatgga 1680
acgttcagct tgaacagcgg agcgtggggg catcccgggg atgggcgccg cggccgagaa 1740
attttgcaac ctggcaaatc tgccctgtcg catactacca tccacctcca ggcgccaaga 1800
acgcctccga gtttcaggct tgcagctcag ctctgtgttg aattggaacg ggcggagttt 1860
ctgggttcca gacttccagt acaaggcgat caattggtag ggcgaattac ttgcaggccc 1920
agatgcatgg cccatctatc tggttctcta tcggttgctt ttacttgcac aatagtggca 1980
gacaaactac aagtcagatc cgatcctatc catccatcca tctcgcagcg cgatgcaaat 2040
atgcaatcgt ctgtggaact cgaaaaaaaa cagaggtccg gcctcgcacg aggttaaggg 2100
aaaaaaaacg aagcgtttgg aactttggtt ggcattcgca gcatgctgtg ctgccaccgt 2160
atgtttttat ttttgctttg tttgtcttct ttgagaaacg tgagggagcc gcgtgtccgc 2220
tcgttataaa acccccccgg cgacccaaac taccacgagc tcaagcctca agcctcaagc 2280
ctcaagcaag cagagcgccg tgacatcacg aaacaaacat atagagctag ctgctctgcc 2340
tctgcttcac caatcacctg cttggccgcg cggaggggag ggtttccccc tttgacacag 2400
ctgagctccc ctccatcagc agccagctcc tcgtcgcaaa gcaagaag              2448
<210>37
<211>2346
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>misc_feature
<222>(0)…(0)
<223>ZmCkx5的启动子
<400>37
tacagatttg cgttcatcaa tggcagcgcg ggatctcatg aggtcactgg gttcttgcaa 60
gtggggagag aaagggagat ctacgaaaga cttgttagtg ggccaccttt tccctctttc 120
cccacaagga cgagatcgtg gattagagta ggaaagtgat tccgcattgg tctcaaatct 180
tggcgaaaga ttgcattgtg tactctccac cactcgaccg gcaacgaggc attttgttat 240
tgcacgatgc atcctttgca catgagctag gcttgtgcct ttgagtattc agttagcatt 300
gcaaccccat ttcaattcac atgcttgtct ttccaaggaa ctttctaagc cacctaacag 360
acattagggt ttatatcaga atcgagctca tggcgtactt tatgctgcac gaacaatggg 420
ttgggggcgt cgtttcttgc atgagagcat gcgcatcctg gtaaggattt cgccaaaaga 480
actttagtcc tctaccgact ttgtgtttgc gtgatctcgt gatttgaagc ctgtggtggt 540
gtgctgaggc agcatattgg aaggtatctc tgtgttgata tggcatccgt ccgtggacaa 600
atcgatacca catactgttc ttggattcta ttcttgggat tgctaaatga tctagataga 660
ttatattctc ttgttgcagc ccctattgct tcaatacgaa gaaaacccaa cgtttagaac 720
ttaataaaac catttgtgag cttagctgct taggcaattc atttttatgc atgacaaata 780
tataataata ttagctatac tattattgat gcaacctgtg ggagcgtata aaatggtact 840
tccccaattc taaattataa gacgttttga ctatatattc tacatacata tgtttaattt 900
tatatttaga taatcgctat gccttaatat atagtaaaaa gtagtatatc tagaaaagat 960
aaaacatctt ataatttaaa aatgggtaga gtattatatt agatatgaac agtgcttaga 1020
tgccaccaaa attttgccat gccatcctaa ggccagcaaa agtttgtgtc ttcttttgtt 1080
ttccaaacca ctagatgcca atatactatt tatcatcgat cgagatgtag gtcttagtta 1140
attgtgtcgg gtgcccttga gaaagaaaag aaaaaggtgg gattttgttt tcgcttagac 1200
gatgattgga tctcttggtc tctgaattcc atcccgaata aacaaatgaa gtaggtcctc 1260
agtcaccctt gccctgttag ctgcaagaga gctcatggtt tccagccaca caatcagtcc 1320
atggctcctt cttcttggcc taagtggtgg ccaatcattg tgggtgatcg agtcttgggc 1380
cctctgaaca gtattacaca acagtaatcc tgcaaaagat ttggtatatc tagattctag 1440
agtgagcgcc gtgttgtgcc cagctaggaa tgggttgtca agtgcaacag gaggaggacc 1500
caggatggtc aggtgtaata ggctctcatt aaaagactgt tcagatggat tagagcaacg 1560
acggggaagc cgggaaaaaa tggttggttc tgctttcctc tcgctccccg gccgggttca 1620
tatatgaatc tgagaacgat attttttgct tcatttttca tttgctatat atttaaactg 1680
tttttttgtg tgtgtgtgtg tgttcattga gctcaatact tgaggcttga tagggagagg 1740
agtgaggcag ctgatcacat ggacctccat ctgaggacag ttcctcttcc gaaacagaaa 1800
ggagagtgca gggaccagcg tggcctgtac agtattgtgt ttgccctttt cctttggcag 1860
ggacagagag cttcaggctt gtcctcttta tgtatgctgc tcgcctgctt cagagtcaga 1920
gcttcccctt ctcacttctc agagagagag agagagaaga gagagagagg agagccctcc 1980
acagctcccc tgtcctgccc tcaggcattc tttgtcacag ggggcgaggg ctgaagatca 2040
tcacatggtg gccttttttg ggtctgtggc ctttggtctt ttagtgcttc ttccttttac 2100
ctcctcatga catgaacccc ctttttaaac ctccctcaaa atcaaatcac cctccttctc 2160
ctttaagagc cctcaacccc ttcccctcat tttccttcat ccctcagcct ttgcacaaag 2220
ggcaagaata acgcagtatg atcatctgat catactcccg ccgccatcac aatcccacac 2280
gaacgtgaga caaaggtaac agacgcaaga agctagcagc tgcaggagat tgctcagccc 2340
atctcc                                                            2346
<210>38
<211>51
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>38
caucaucauc auggatccac caatggatct acgtctaatt ttcggtccaa c          51
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>39
cuacuacuac uagttaactc acattcgaaa tggtggtcct tc                    42

Claims (65)

1.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物能够在发育中的种子或相关的雌性生殖组织中调节细胞分裂素调节基因的表达，所述方法包括：
用能够在发育中的种子或相关雌性生殖组织中在时间或空间上调节细胞分裂素调节基因表达的遗传构建体转化植物宿主细胞；和再生和回收所述转基因植物。
2.权利要求1的方法，其中通过选自电穿孔、PEG穿孔、粒子轰击、硅纤维递送、显微注射和土壤杆菌介导的转化的方法进行所述转化。
3.权利要求2的方法，其中所述转化的方法是粒子轰击。
4.权利要求2的方法，其中所述转化的方法是土壤杆菌介导的转化。
5.权利要求1的方法，其中所述遗传构建体包含在发育中的种子或相关的雌性生殖组织中指导时间或空间基因表达的启动子，所述启动子可操作地连接至细胞分裂素调节基因。
6.权利要求5的方法，其中所述启动子选自zag2.1、zap、tb1、eep1、eep2、F3.7、thxH、Zm40、ESR、PCNA2、lec1、ZmCkx1-2、ZmCkx2、ZmCkx3、ZmCkx4和ZmCkx5。
7.权利要求1的方法，其中所述细胞分裂素调节基因选自编码细胞分裂素生物合成酶、细胞分裂素分解代谢酶、细胞分裂素分解代谢酶拮抗剂和细胞分裂素生物合成酶激动剂的基因。
8.转基因植物，所述转基因植物包含稳定地整合入其基因组的遗传构建体，所述构建体包含可操作地连接至细胞分裂素调节基因的启动子，其中所述启动子在所述植物的发育中的种子或相关雌性生殖组织中指导时间或空间表达。
9.权利要求8的植物，其中所述启动子选自zag2.1、zap、tb1、eep1、eep2、F3.7、thxH、Zm40、ESR、PCNA2、lec1、ZmCkx1-2、ZmCkx2、ZmCkx3、ZmCkx4和ZmCkx5。
10.权利要求9的植物，其中所述细胞分裂素调节基因选自编码细胞分裂素生物合成酶、细胞分裂素分解代谢酶、细胞分裂素分解代谢酶拮抗剂和细胞分裂素生物合成酶激动剂的基因。
11.包含遗传构建体的分离的重组DNA，所述遗传构建体包含在发育中的种子或相关雌性生殖组织中指导时间或空间表达的启动子，所述启动子可操作地连接至细胞分裂素调节基因。
12.宿主细胞，所述宿主细胞具有被稳定地导入其中的权利要求11的遗传构建体。
13.用于在植物中提高协迫耐受性和产量稳定性的方法，所述方法包括：
用优选地在发育中的种子和相关的雌性生殖组织中驱动细胞分裂素调节基因表达的遗传构建体转化植物宿主细胞；
和从所述细胞再生和回收转化的植物。
14.权利要求13的方法，其中所述优选表达在授粉前大约14天至授粉后大约25天发生。
15.权利要求13的方法，其中所述优选表达在授粉后大约0至大约6天发生。
16.权利要求13的方法，其中所述优选表达在授粉后大约0至大约12天发生。
17.权利要求13的方法，其中所述优选表达在授粉后大约4至大约21天发生。
18.包含稳定地整合入其基因组中的重组表达盒的转基因植物，所述盒能够实现细胞分裂素活性上的增加，其中所述转基因植物表现出增强的活力而且没有增强的细胞分裂素活性的显著有害效应。
19.权利要求18的转基因植物的种子。
20.权利要求18的转基因植物，其中所述增强的活力表现在非生物协迫存在或不存在的情况下。
21.在育种程序中利用权利要求18的植物作为遗传材料来源开发玉米植物的方法。
22.权利要求21的方法，所述方法进一步包括一个或多个选自下列的技术：轮回选择、混合选择、集团选择、回交、谱系、合成开发(development of synthetic)和开放传粉。
23.权利要求18的转基因植物，其中所述重组表达盒包含编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
24.权利要求18的转基因植物，其中所述重组表达盒包含编码异戊烯基转移酶的多核苷酸。
25.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含zag2.1启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
26.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含eep1启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
27.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含eep2启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
28.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含有zap启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
29.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含有tb1启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
30.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含有ckx1-2启动子，所述启动子可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
31.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含驱动可操作连接的编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸低水平组成型表达的启动子。
32.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含F3.7启动子。
33.权利要求23的转基因植物，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸的生殖组织优选的启动子和(2)一个或多个高度表达的基因的启动子或增强子元件。
34.权利要求33的转基因植物，其中所述增强子元件包含花椰菜花叶病毒的35S增强子。
35.权利要求34的转基因植物，其中所述35S增强子包含SEQ IDNO：4。
36.权利要求33的转基因植物，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至编码ipt的多核苷酸的zag2.1启动子和(2)花椰菜花叶病毒的35S增强子。
37.权利要求36的转基因植物，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至SEQ ID NO：1的编码区的SEQ ID NO：3和(2)SEQID NO：4。
38.权利要求18的转基因植物，其中所述重组表达盒包含第一个多核苷酸，所述多核苷酸参与沉默编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的基因。
39.权利要求38的转基因植物，其中参与减少活性细胞分裂素库的所述蛋白是细胞分裂素氧化酶。
40.权利要求38的转基因植物，所述植物进一步包含启动子，所述启动子优选地在发育中的种子或相关的雌性生殖组织中驱动表达，可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的第二个多核苷酸。
41.权利要求38的转基因植物，其中所述第一个多核苷酸包含编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的反义序列。
42.权利要求38的转基因植物，其中所述第一个多核苷酸包含有效地共抑制编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的序列。
43.权利要求38的转基因植物，其中所述第一个多核苷酸包含在编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的RNAi中有效的序列。
44.在植物中调节细胞分裂素活性的方法，其中受调节的细胞分裂素活性增强了植物活力而无显著有害效应，所述方法包括稳定地转化所述植物以导致细胞分裂素活性的增加。
45.权利要求44的方法，其中用能够实现增加细胞分裂素活性的重组表达盒稳定地转化所述植物，其中所述转基因植物表现增强的活力而无显著的增加的细胞分裂素活性的有害效应。
46.权利要求45的方法，其中所述增强的活力是在非生物协迫存在或不存在的情况下表现的。
47.权利要求45的方法，其中所述重组表达盒包含编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸。
48.权利要求45的方法，其中所述重组表达盒包含编码异戊烯基转移酶的多核苷酸。
49.权利要求45的方法，其中所述重组表达盒包含选自zag2.1、zap、tb1、eep1、eep2、F3.7、thxH、Zm40、ESR、PCNA2、lec1、ZmCkx1-2、ZmCkx2、ZmCkx3、ZmCkx4和ZmCkx5的启动子。
50.权利要求45的方法，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的蛋白的多核苷酸的雌性生殖组织优选的启动子和(2)一个或多个高度表达的基因的启动子或增强子元件。
51.权利要求50的方法，其中所述增强子元件包含花椰菜花叶病毒的35S增强子。
52.权利要求51的方法，其中所述35S增强子包含SEQ ID NO：4。
53.权利要求50的方法，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至编码ipt的多核苷酸的zag2.1启动子和(2)花椰菜花叶病毒的35S增强子。
54.权利要求53的方法，其中所述重组表达盒包含(1)可操作地连接至SEQ ID NO：1的编码区的SEQ ID NO：3和(2)SEQ ID NO：4。
55.权利要求45的方法，其中所述重组表达盒包含第一个多核苷酸，所述第一个多核苷酸参与沉默编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的基因。
56.权利要求55的方法，其中参与减少活性细胞分裂素库的所述蛋白是细胞分裂素氧化酶。
57.权利要求55的方法，其中用启动子进一步稳定地转化所述植物，所述启动子优选地在发育中的种子或相关的雌性生殖组织中驱动表达，可操作地连接至编码参与细胞分裂素生物合成的第二个多核苷酸。
58.权利要求55的方法，其中所述第一个多核苷酸包含编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的反义序列。
59.权利要求55的方法，其中所述第一个多核苷酸包含有效地共抑制编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的序列。
60.权利要求55的方法，其中所述第一个多核苷酸包含在编码参与减少活性细胞分裂素库的蛋白的多核苷酸的RNAi中有效的序列。
61.能够以种子优选的方式驱动转录的分离的启动子，其中所述启动子包含选自下列的核苷酸序列：
包含SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列的片段的序列；和
SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列。
62.权利要求61的能够以种子优选的方式驱动转录的分离的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列的片段。
63.权利要求61的能够以种子优选的方式驱动转录的分离的启动子，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列。
64.重组表达盒，所述重组表达盒包含启动子和可操作地连接至所述启动子的核苷酸序列，其中所述启动子包含选自下列的核苷酸序列：
包含SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列的片段的序列；和
SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列。
65.一种植物，所述植物是用包含玉米启动子和可操作地连接至所述启动子的核苷酸序列的表达盒稳定地转化的，其中所述启动子包含选自下列的核苷酸序列：
包含SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列的片段的序列；和
SEQ ID NO：7或18所列核苷酸序列。
CNA2004800155350A 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节 Pending CN1798843A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US46071803P 2003-04-04 2003-04-04
US60/460,718 2003-04-04

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008100089946A Division CN101220358A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节
CNA2008100089927A Division CN101220357A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1798843A true CN1798843A (zh) 2006-07-05

Family

ID=33159802

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800155350A Pending CN1798843A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节
CNA2008100089946A Pending CN101220358A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节
CNA2008100089927A Pending CN101220357A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008100089946A Pending CN101220358A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节
CNA2008100089927A Pending CN101220357A (zh) 2003-04-04 2004-04-02 植物中细胞分裂素活性的调节

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1613754A2 (zh)
CN (3) CN1798843A (zh)
AR (1) AR045420A1 (zh)
AU (1) AU2004227360B2 (zh)
BR (1) BRPI0409178A (zh)
CA (1) CA2521497C (zh)
NZ (1) NZ543070A (zh)
WO (1) WO2004090143A2 (zh)
ZA (1) ZA200508006B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104203973A (zh) * 2012-03-13 2014-12-10 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
CN105624190A (zh) * 2016-03-23 2016-06-01 东北农业大学 一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法
CN109735538A (zh) * 2018-12-27 2019-05-10 南京农业大学 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
CN114990112A (zh) * 2021-02-26 2022-09-02 华中农业大学 一种皮刺特异启动子

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7371925B2 (en) * 2001-03-29 2008-05-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cytokinin oxidase promoter from maize
US20040016016A1 (en) * 2002-06-19 2004-01-22 Mankin S. Luke Compositions and methods for improving plant performance
EP1741788A1 (en) * 2005-07-06 2007-01-10 Freie Universität Berlin Transgenic plant with tissue-selectively reduced cytokinin receptor activity
WO2007027866A2 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 Monsanto Technology Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CA2743707A1 (en) 2008-12-04 2010-06-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for enhanced yield by targeted expression of knotted1
EP2440663A1 (en) 2009-06-09 2012-04-18 Pioneer Hi-Bred International Inc. Early endosperm promoter and methods of use
US8440891B2 (en) 2009-09-22 2013-05-14 Board of Trustees of the University of Akransas, N.A. Rice cultivar CL 142-AR
US8440892B2 (en) 2009-10-15 2013-05-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar CL 181-AR
IN2012DN03073A (zh) 2009-10-26 2015-07-31 Pioneer Hi Bred Int
MX2012006936A (es) * 2009-12-17 2012-07-17 Pioneer Hi Bred Int Evento de maiz dp-004114-3 y metodos para su deteccion.
CN101899442B (zh) * 2010-07-13 2012-02-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻rr17启动子及其应用
WO2013096810A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11482
WO2013096818A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 The Curators Of The University Of Missouri Soybean variety s05-11268
WO2013103365A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pollen preferred promoters and methods of use
EP2800816A1 (en) 2012-01-06 2014-11-12 Pioneer Hi-Bred International Inc. Ovule specific promoter and methods of use
CN102629304B (zh) * 2012-04-05 2015-02-04 天津大学 基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法
US20140109259A1 (en) 2012-10-11 2014-04-17 Pioneer Hi Bred International Inc Guard Cell Promoters and Uses Thereof
CA2905743C (en) 2013-03-13 2021-09-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
EP3744727A1 (en) 2013-03-14 2020-12-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP2971000A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Pioneer Hi Bred Int PHI-4 POLYPEPTIDES AND METHOD FOR THEIR USE
EA030896B1 (ru) 2013-08-16 2018-10-31 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
BR122021005579B1 (pt) 2013-09-13 2022-11-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc Construto de dna, método de obtenção de planta transgênica, proteína de fusão, método para controlar uma população de praga de inseto, método para inibir o crescimento ou matar uma praga de inseto
CN117903266A (zh) 2014-02-07 2024-04-19 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
US20170218384A1 (en) 2014-08-08 2017-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ubiquitin promoters and introns and methods of use
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
BR112017007932A2 (pt) 2014-10-16 2018-01-23 Du Pont proteínas inseticidas e métodos para uso das mesmas
WO2016099916A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
CA2985198A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN107771181A (zh) 2015-06-16 2018-03-06 先锋国际良种公司 用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
MX2018001523A (es) 2015-08-06 2018-03-15 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso.
ES2773072T3 (es) 2015-08-28 2020-07-09 Pioneer Hi Bred Int Transformación de plantas mediada por Ochrobactrum
WO2017105987A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3394268B1 (en) 2015-12-22 2023-07-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Tissue-preferred promoters and methods of use
WO2017192560A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
BR112018076047A2 (pt) 2016-06-16 2019-03-26 Pioneer Hi Bred Int elemento de silenciamento, construto de dna, cassete de expressão, célula hospedeira, composição, célula vegetal, planta ou parte de planta, semente transgênica, método para controlar um inseto-praga de planta e kit
CN116334123A (zh) 2016-06-24 2023-06-27 先锋国际良种公司 植物调节元件及其使用方法
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US11021716B2 (en) 2016-11-01 2021-06-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2019060383A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Pioneer Hi-Bred, International, Inc. PROMOTERS HAVING PREFERENCE FOR FABRICS AND METHODS OF USE
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
US20210277409A1 (en) 2018-06-28 2021-09-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for selecting transformed plants
BR112021008329A2 (pt) 2018-10-31 2021-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. composições e métodos para transformação de plantas mediada por ochrobactrum
CN109762837B (zh) * 2018-12-24 2020-12-15 中国医学科学院药用植物研究所 利用丹参长链异戊烯基转移酶基因SmPPS2调控辅酶Q合成的方法
CN111518816B (zh) * 2020-05-12 2021-10-08 广西大学 一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN114807181A (zh) * 2022-04-30 2022-07-29 浙江师范大学 水稻OsCKX3基因在调控水稻叶夹角中的应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0242236B2 (en) 1986-03-11 1996-08-21 Plant Genetic Systems N.V. Plant cells resistant to glutamine synthetase inhibitors, made by genetic engineering
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
US6329570B1 (en) * 1989-07-19 2001-12-11 Calgene, Llc Cotton modification using ovary-tissue transcriptional factors
ES2171391T3 (es) 1990-04-26 2002-09-16 Aventis Cropscience Nv Nueva cepa de bacillus thuringiensis y su gen de codificado de toxina insecticida.
US6329520B1 (en) * 1990-08-09 2001-12-11 Research Triangle Institute Cocaine receptor binding ligands
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
WO1993003154A1 (en) 1991-08-02 1993-02-18 Mycogen Corporation Novel microorganism and insecticide
GB9210273D0 (en) 1992-05-13 1992-07-01 Ici Plc Dna
AU5676394A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5689042A (en) * 1995-03-29 1997-11-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Transgenic plants with altered senescence characteristics
DE69633568T2 (de) * 1995-07-26 2005-12-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Expressionskontrollesequenz zur allgemeinen und effektiven genexpression in pflanzen
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
WO2000011177A1 (en) * 1998-08-20 2000-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoters
MXPA01010439A (es) * 1999-04-16 2003-09-10 Pioneer Hi Bred Int Expresion regulada de genes en semillas.
US7531723B2 (en) 1999-04-16 2009-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of cytokinin activity in plants
US6407315B1 (en) * 1999-11-02 2002-06-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred promoter from barley
US6921815B2 (en) * 2001-03-29 2005-07-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Cytokinin Oxidase Promoter from Maize

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104203973A (zh) * 2012-03-13 2014-12-10 先锋国际良种公司 植物中雄性育性的遗传减少
CN105624190A (zh) * 2016-03-23 2016-06-01 东北农业大学 一种转异戊烯基酰基转移酶基因玉米育种方法
CN109735538A (zh) * 2018-12-27 2019-05-10 南京农业大学 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
CN109735538B (zh) * 2018-12-27 2022-06-21 南京农业大学 一种提高森林草莓叶片再生效率的载体及其制备方法和应用
CN114990112A (zh) * 2021-02-26 2022-09-02 华中农业大学 一种皮刺特异启动子
CN114990112B (zh) * 2021-02-26 2024-03-12 华中农业大学 一种皮刺特异启动子

Also Published As

Publication number Publication date
CN101220357A (zh) 2008-07-16
CA2521497A1 (en) 2004-10-21
CA2521497C (en) 2012-11-27
AU2004227360A1 (en) 2004-10-21
CN101220358A (zh) 2008-07-16
ZA200508006B (en) 2007-01-31
NZ543070A (en) 2008-10-31
AR045420A1 (es) 2005-10-26
WO2004090143A3 (en) 2005-05-12
WO2004090143A2 (en) 2004-10-21
AU2004227360B2 (en) 2009-05-28
EP1613754A2 (en) 2006-01-11
BRPI0409178A (pt) 2006-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1798843A (zh) 植物中细胞分裂素活性的调节
CN1250723C (zh) 植物生长和发育的遗传调控
CA2634925C (en) Nitrogen-efficient monocot plants
US20040237147A1 (en) Modulation of cytokinin activity in plants
US6696619B1 (en) Plant aminoacyl-tRNA synthetases
CN1541270A (zh) 抗除草剂植物
US20170145435A1 (en) Plants having increased tolerance to heat stress
CN1253584A (zh) 提高植物种子中赖氨酸含量的嵌合基因和方法
CN1732266A (zh) 具有改变的生长特性的植物及其生产方法
CN110041416B (zh) GmABCA9基因在提高大豆蛋白含量和粒重中的应用
CN101040050A (zh) 具有改良生长特性的植物及其制备方法
CN1341151A (zh) 除草剂的靶基因和方法
CA2647718C (en) Maize genes for controlling plant growth and organ size and their use in improving crop plants
US20130133110A1 (en) Transcriptional activators involved in abiotic stress tolerance
CN1946848A (zh) 产量增加的植物及其制备方法
US7943753B2 (en) Auxin transport proteins
CN101778942A (zh) 产率相关性状增强的植物及制备其的方法
CN1431309A (zh) 编码植物转录因子的基因
CN1146663C (zh) 选择性标记
CN1950511A (zh) 产量增加的植物及制备其的方法
CN1906304A (zh) 具有增加产量的植物及其生产方法
CN101061228A (zh) 异戊烯基转移酶序列及其使用方法
US20060010512A1 (en) Nitrogen transport metabolism
CN1993039A (zh) 具有改良生长特性的植物及其制备方法
CN1423520A (zh) 调节植物细胞分裂的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20060705