CN104203973A - 植物中雄性育性的遗传减少 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了遗传雄性不育植物，在所述遗传雄性不育植物中补充构建体从而产生对所述子代中的亲本表型的抑制。提供了产生和保持此类植物的方法以及使用所述植物的方法，包括使用亲本植物以产生不育植物以用于杂交种子生产。

Description

植物中雄性育性的遗传减少
交叉引用
本申请要求提交于2012年3月13日的美国临时专利申请61/610,243、提交于2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30455的优先权和权益，其公开内容据此以引用方式并入。
技术领域
本发明整体涉及分子生物学领域，具体地讲涉及植物育性的调节以提高植物胁迫耐受性。
背景信息
许多植物的驯化已与产量显著增加相关。天然群体中发生的大多数表型变异是连续的并且受多种基因影响的作用。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的识别已成为农业研究的重要焦点。
植物在发育生命周期期间在各种植物组织间分配光合产物、矿质营养和其他生长组分。在玉蜀黍中，例如，穗和穗丝为共享某些发育过程并且相互竞争所需营养物质的特定雌性和雄性花序结构。穗丝顶端显性可限制玉蜀黍植物中的穗生长和谷粒产量潜力，本文公开了提高谷粒产量的方法和组合物。
发明内容
一种用于增加植物中的产量或维持产量稳定性的方法，该方法包括减少雄性育性，从而在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实施例中，通过改变遗传雄性育性基因的表达或活性来减少植物中的雄性育性。在一个实施例中，植物在非生物胁迫下生长。在一个实施例中，营养物质限定为氮。在一个实施例中，具有减少的雄性育性的植物具有选自如下的农学参数：增大的SPAD值、增加的抽穗丝、增加的穗长度、增加的穗宽度、增加的每个穗的种子数、增加的每个穗的种子重量和具有增加的胚尺寸的种子。在一个实施例中，植物在干旱胁迫下生长。在一个实施例中，通过雄性不育来提高植物的耐旱性。
一种用于增加玉蜀黍植物中的产量或维持产量稳定性的方法，该方法包括减少雄性育性，从而在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实施例中，植物包含导致显性遗传雄性不育的核基因中的突变。
在一个实施例中，本文公开的植物的雄性育性通过表达编码SEQ IDNOS：14或153的多肽的多核苷酸而减少。在一个实施例中，多核苷酸选自SEQ ID NOS：13、15和152。
在一个实施例中，雄性育性在选自SEQ ID NO：64-106、134、137、142、143、144、149和150的调控元件下通过表达抑制穗丝的核酸而减少。
在一个实施例中，雄性育性在选自SEQ ID NO：64-106、134、137、142、143、144、149和150的调控元件下通过表达核酸而减少，所述核酸抑制编码SEQ ID NO：107的氨基酸序列的多核苷酸的表达。
在一个实施例中，雄性育性通过表达编码多肽的核酸而减少，所述多肽具有对应于SEQ ID NO：14的第37位氨基酸的突变，其中多肽选自SEQID NO：14、108-130。在一个实施例中，突变导致信号肽的不当加工。
在一个实施例中，表现出减少的雄性育性的植物为玉蜀黍非转基因植物。在一个实施例中，雌性组织发育为玉蜀黍中的穗发育。
在一个实施例中，导致减少的雄性育性的突变在植物的内源育性基因中进行改造。
一种在具有第一玉蜀黍植物群体的田地中增加玉蜀黍产量的方法，该方法包括在田地中栽培玉蜀黍植物群体，其中玉蜀黍植株由于存在包含SEQ ID NO：14或其同系物的氨基酸序列的多肽而表现出显性雄性不育，并且其中所述田地还包含第二玉蜀黍植物群体，所述第二玉蜀黍植物群体产生有效量的花粉以使田地中的第一玉蜀黍植物群体受精，从而相较于不包含第一植物群体的对照田地产量增加。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约50％至约90％。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约80％。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约75％。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约85％。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约70％。在一个实施例中，第一植物群体包括田地中玉蜀黍植株的约95％。在一个实施例中，所得的子代是可育的。
在田地中生长的玉蜀黍植物群体，其中玉蜀黍植物群体包括具有减少的雄性育性的第一亚群体和表现出正常的雄性育性的第二亚群体，其中所述玉蜀黍植物群体产生与对照植物群体相比增加的谷粒产量。在一个实施例中，种子由玉蜀黍植株产生，其中所述种子产生可育的植株。
一种具有多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且包括选自如下的序列：
a.SEQ ID NO：13和62、SEQ ID NO：64-106、134、137、142、143、144、149和150的启动子区；
b.SEQ ID NO：13、62、64-106、134、137、142、143、144、149和150的至少100个连续核苷酸；以及
c.与SEQ ID NO：13、62、64-106、134、137、142、143、144、149和150的全长具有至少70％序列同一性的核苷酸序列。
表达盒具有引发如本文所公开的转录并且可操作地连接到目的多核苷酸的多核苷酸。在一个实施例中，载体包括本文所述的表达盒。在一个实施例中，植物细胞已将本文所述的表达盒稳定掺入到其基因组中。在一个实施例中，植物细胞来自单子叶植物。在一个实施例中，单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸麦、高粱或水稻。
在一个实施例中，包括已将本文所述的表达盒稳定掺入到其基因组中的植物。在一个实施例中，植物为单子叶植物。在一个实施例中，植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸麦、高粱或水稻。
公开了本文所述的植物的转基因种子。在一个实施例中，公开了编码基因产物的多核苷酸，所述基因产物赋予病原体或昆虫抗性。
在一个实施例中，植物还包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽涉及营养物质吸收、氮利用效率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成。
一个单位玉蜀黍种子，其包括一部分为转基因的雄性不育种子和一部分为转基因的雄性可育种子，其中雄性不育转基因种子与该单位中总玉蜀黍种子的比例在约50％至约95％的范围内。在一个实施例中，一个单位为一袋玉蜀黍种子。
玉蜀黍种子的种子混合物，其包括一部分为转基因的雄性不育种子和一部分为转基因的雄性可育种子，其中雄性不育转基因种子与该单位中总玉蜀黍种子的比例在约50％至约95％的范围内。在一个实施例中，种子混合物在一袋玉蜀黍种子中。在一个实施例中，雄性不育种子在单独的袋中。在一个实施例中，雄性不育种子与雄性可育种子在相同的袋中混合。
在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQ ID NO：10的蛋白质。在一个实施例中，雄性育性基因包括SEQ ID NO：13的核苷酸序列。在一个实施例中，雄性育性基因编码SEQ ID NO：14的多肽。
在一个实施例中，雄性育性的减少或使植物雄性不育通过在相对于SEQ ID NO：13的第一Met密码子的第118位从G变为A的单个核苷酸置换来实现，得到在第37位氨基酸处的氨基酸改变，在预测的蛋白质中从丙氨酸变为苏氨酸。在一个实施例中，雄性育性的减少或使植物雄性不育通过在相对于SEQ ID NO：2629的第一Met密码子的第119位从C变为T的单个核苷酸置换来实现，得到在第37位氨基酸处的氨基酸改变，在预测的蛋白质中从丙氨酸变为缬氨酸。在一个实施例中，显性雄性育性基因可操作地连接到选自如下的启动子：诱导型启动子、组织优选的启动子、时间调节型启动子或它们的元件。例如，启动子优先地驱动雄性生殖组织中的表达。
在一个实施例中，雄性育性在育种对的雌性植物(例如，雌性自交系)中减少。
在一个实施例中，一种植物或细胞或种子或它们的子代，其包括减少的编码其基因组中的SEQ ID NO：10的第43-101位氨基酸序列的雄性育性序列，并且其中该雄性育性基因的表达赋予显性雄性不育性状。
分离的核酸分子包括能够引发植物细胞中的转录的多核苷酸并且包括选自如下的序列：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：15的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID NO：15的全长具有至少70％序列同一性的序列。在一个实施例中，表达盒或载体包括本文公开的可操作地连接到目的多核苷酸的SEQ ID NO：15。
适用于本文公开的材料和方法的植物包括，例如，玉米、高粱、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、黑小麦、水稻、甘蔗、草坪草、珍珠粟、大豆、棉花。
在一个实施例中，具有减少的育性或本文公开的任何其他性状的植物任选地具有赋予以下目的表型或性状的一种或多种多核苷酸：营养物质吸收、氮利用效率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、除草剂耐性、抗病性、昆虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成。
一种增加植物中的产量或维持产量稳定性的方法，包括通过如下方式减少雄性生殖组织发育：在雄性生殖组织优选的启动子的控制下表达转基因；以及在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。
在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝。在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过表达可操作地连接到启动子的基因而减少，所述启动子包括选自列表SEQ ID NO：64-106的序列的至少100个连续核苷酸。本文公开的启动子序列的子集，例如，SEQ ID NO：64-70、70-75、75-80、85-90、90-95、100-106同样适用于驱动本文公开的目的多核苷酸的组织优选的表达。
在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多核苷酸(例如，具有显性雄性不育突变的Ms44)的植物或植物细胞或种子表现出提高的农学参数，诸如在生殖发育期间增加分配至穗的营养物质。
一种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且包括选自如下的序列：
选自SEQ ID NO：64-106的序列；
选自SEQ ID NO：64-106的序列的至少100个连续核苷酸，以及
与选自SEQ ID NO：64-106的序列的全长或与其子启动子区具有至少
70％至约95％序列同一性的序列。
在一个实施例中，在本文公开的穗丝优选的启动子的控制下转基因地表达目的多核苷酸(例如，靶向涉及穗丝发育的多核苷酸的RNAi抑制序列)的植物或植物细胞或种子表现出提高的农学参数，诸如在生殖发育期间提高分配至穗的营养物质。
一种增加植物中产量或维持产量稳定性的方法，包括减少雄性育性，并且在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。在一个实施例中，通过改变遗传雄性育性基因的表达来减少植物中的雄性育性。在一个实施例中，植物在胁迫下生长。在一个实施例中，植物在营养物质限制条件，例如减少的可用氮下生长。
在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物表现出以下农学相关参数中的一者或多者：增大的SPAD值、增加的抽穗丝、增加的穗长度、增加的穗宽度、增加的每个穗的种子数、增加的每个穗的种子重量和增加的胚尺寸。
在一个实施例中，具有减少的雄性育性并且其中营养物质在雄性和雌性组织同时发育期间更多地分配至雌性生殖组织的植物在干旱胁迫下生长。在一个实施例中，通过雄性不育来提高植物的耐旱性。
分离的核酸分子包含以组织优选的方式引发植物细胞中的转录的多核苷酸，并且包括来自以下序列的序列：
SEQ ID NO：13、62和64-106；
SEQ ID NO：13、62和64-106的至少100个连续核苷酸；以及
与SEQ ID NOS：13、62和64-106的全长具有至少70％序列同一性的序列。
在一个实施例中，一种在胁迫下增加植物中产量稳定性的方法，包括在本文公开的穗丝优选的启动子下表达影响雄性育性的元件从而减小在植物生殖发育阶段期间对营养物质的竞争，并且其中产量增加。
一种在氮限制条件和/或正常氮条件下增加植物中产量或维持产量稳定性的方法，包括减少雄性生殖组织发育并且增加在雄性和雌性组织同时发育期间分配至雌性生殖组织的营养物质。
在一个实施例中，雄性生殖组织为穗丝并且雄性生殖组织发育通过减少NIP3-1或NIP3-1类蛋白质的表达来减少。在一个实施例中，NIP3-1蛋白质具有SEQ ID NO：107的氨基酸序列。雄性生殖组织发育通过增加SEQID NO：63的表达来减少。
在一个实施例中，雄性生殖组织发育通过影响涉及穗丝形成的基因、例如无穗丝基因的功能而减少。
在一个实施例中，雄性生殖组织发育在用靶向基因的抑制的表达盒转化的植物中减少，所述基因编码SEQ ID NO：107的氨基酸序列或与SEQ IDNO：107具有至少70％或80％或85％或90％或95％同一性的序列。本文还公开了在Tls1等位基因中具有天然突变的植物。
在一个实施例中，启动子优先地驱动雄性生殖组织中目的基因的表达。在一个实施例中，启动子为组织特异性启动子、组成型启动子或诱导型启动子。在一个实施例中，组织优选的启动子为穗丝特异性启动子。
一种包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸包括选自如下的序列：SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：63的至少100个连续核苷酸，以及与SEQ ID NO：63的全长具有至少70％序列同一性的序列。分离的核酸分子包括编码TLS1蛋白质的多核苷酸，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：107的氨基酸序列或与SEQ ID NO：107具有至少70％或80％或85％或90％或95％同一性的序列。
一种用于产生雄性不育杂交种子的方法，包括转化对于具有基因构建体的显性雄性不育为杂合的雌性自交系，所述基因构建体包括抑制显性雄性不育表型的元件、破坏花粉功能的第二元件，以及任选地选择性标记，其中在自交系中表达构建体使雄性系可育。在一个实施例中，该方法还包括对这些雄性可育植物自花授粉并且产生为显性雄性不育的纯合子代。该方法还包括鉴别具有雌性自交系的纯合显性雄性不育基因型的那些种子；任选地通过与转基因保持系杂交来增加雌性自交系，得到无构建体的100％纯合显性雄性不育种子；以及将显性雄性不育种子的子代与雄性亲本杂交以产生对于显性雄性不育为杂合的杂交体并且显示显性雄性不育表型。
在一个实施例中，显性雄性不育表型由多核苷酸序列赋予，所述多核苷酸序列包括SEQ ID NO：15的至少100个连续核苷酸并且还包括在第109至111位的密码子，其编码苏氨酸来替代SEQ ID NO：14的第37位的丙氨酸(由SEQ ID NO：15编码的氨基酸序列)。
在一个实施例中，抑制元件包括对于SEQ ID NO：15是特异性的启动子反向重复序列。在一个实施例中，反向重复序列包括SEQ ID NO：15的至少100个连续核苷酸的功能片段。在一个实施例中，抑制元件为设计用于抑制显性Ms44基因在雄性不育雌性自交系中的表达的RNAi构建体。在一个实施例中，抑制元件为以显性方式起作用以抑制植物中Ms44突变的显性表型的遗传抑制因子。任选地，如果内源的正常ms44也受到抑制元件抑制，则构建体可包括恢复ms44基因、例如在其自身启动子或异源启动子控制下的ms44基因的正常功能的元件。
在一个实施例中，公开了从本文所公开的方法得到的植物或植物细胞或种子或植物的子代。
在一个实施例中，用于产生杂交种子的方法包括在雌性自交系中表达可操作地连接到异源启动子的适于反向重复失活的显性雄性不育基因；用来自雄性可育植物的花粉对雄性不育植物授粉，所述雄性可育植物包含对于异源启动子是特异性的反向重复。在一个实施例中，花粉包含对具有反向重复失活特异性的异源启动子是特异性的反向重复。在一个实施例中，显性雄性不育基因连接至水稻5126启动子。
在一个实施例中，在杂交种子生产的上下文中使用的显性雄性不育基因为以显性方式起作用以实现雄性不育并且任选地适于抑制以维持雄性不育雌性自交系的任何基因。在一个实施例中，显性雄性不育基因选自：芽孢杆菌RNA酶、DAM甲基化酶、MS41和MS42。
附图说明
图1-产生雄性不育杂交植物的遗传显性雄性不育体系的图。已发现可利用显性核雄性不育基因、穗丝特异性或穗丝优选的启动子和穗丝特异性或穗丝优选的基因中的一种或多种的植物中的雄性育性的遗传减少可增加穗组织发育、提高正在生长的植物中的营养物质利用率、增加胁迫耐受性和/或增加种子度量值，最终得到提高的产量。
图2-MS44相关序列的比对(图2A-C)。相同的残基以粗体示出并且所有相似的残基以下划线和斜体示出。
图3-利用隐性雄性不育基因产生雄性不育杂交植物的方法的图。雌性亲本和雄性亲本均具有赋予不育性的纯合隐性等位基因。然而，雄性亲本使恢复等位基因在构建体内，其防止恢复等位基因通过花粉传递。所得的杂交种子产生雄性不育的杂交植物。
图4-用于利用下述显性雄性不育基因产生雄性不育杂交种子的方法的图：
4A-对于显性雄性不育为杂合的雌性自交系用基因构建体转化，所述基因构建体包括抑制显性雄性不育的元件、破坏花粉功能的第二元件，以及任选地选择性标记。该构造体在自交系中的表达使植物雄性可育。
4B-植物自花授粉以产生种子。
4C和4D-对种子或子代植物进行基因分型以鉴别对于显性雄性不育为纯合的那些。
4E-雌性自交系可通过将其与转基因保持系杂交而增加，得到100％纯合显性雄性不育种子。
4F-显性雄性不育植物由第二自交系授粉以产生对于显性雄性不育为杂合并且表现出显性雄性不育表型的杂交体。
图5-图5A示出了响应于氮肥力的MS44杂交体产量-试验1。图5B示出了响应于氮肥力的MS44杂交体产量-试验2。
图6示出了与野生型相比较的MS44杂交体穗干重(R1)。
图7-图7A示出了响应于植物群体的MS44杂交体产量-试验1。图7B示出了响应于植物群体的MS44杂交体产量-试验2。
图8示出了tls1突变表型。A)来自野生型植物的穗丝。B)具有小的穗丝表型的纯合tls1植物。C)不具有穗丝的纯合tls1植物。D)具有最严重表型的植物往往具有带长壳并且不抽穗丝的多个穗(箭头)。E)穗表型的范围。F)叶表型的范围。WT＝纯合野生型植物；ST＝具有小的穗丝的纯合tls1植物；NT＝不具有穗丝的纯合tls1植物。
图9示出了tls1的基于图谱的克隆。
图10示出了tls1候选基因验证。ZmNIP3-1的敲除得到tls1表型。图10A-具有完整ZmNIP3-1的野生型植物。图10B-在ZmNIP3.1中具有Mu-插入的植物表现出tls1表型。
图11示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝数。
图12示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗丝分枝长度。
图13示出突变型、野生型和喷以硼的突变型中的穗长度。
图14示出tls1植物较不易受50ppm硼的硼毒性条件影响。图14A-并列放置纯合tls1植物和野生型植物，其中突变型植物看起来更高和更大。图14B-在野生型植物中，第二嫩的完全张开的叶的节在最嫩的完全张开的叶的节的上方延伸，然而突变型植物看起来是正常的。图14C-突变型的最嫩的完全张开的叶比野生型更宽。
图15示出了ZmNIP3-1类似于硼通道蛋白。图15A-系谱树示出ZmNIP3.1与已被表征为硼通道蛋白的OsNIP3.1和AtNIP5.1(突出显示的)密切相关。图15B-在图15A中突出显示的蛋白质序列的比对；ZmNIP3.1与OsNIP3.1和AtNIP5.1的百分比同一性分别为84.4和67.3。
图16-来自所选物种的Ms44序列。在该比对中，Ms44显性多肽序列的氨基酸突变在第42位以粗体和下划线示出，如MS44dom等位基因中的T(SEQ ID NO：14)或Ms44-2629等位基因中的V(SEQ ID NO：153)，其中所有其他序列在该位置具有A。
发明详述
提交于2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30406和提交于2013年3月12日的PCT申请PCT/US2013/30455的内容和公开内容以全文引用方式并入本文。与雄性育性相关的方法及其实施例以引用方式并入本文。
氮利用效率(NUE)基因影响产量并对改善氮在作物(特别是玉蜀黍)中的利用具有实用性。氮使用效率增加可由增加的对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的后续再动员和再利用，以及植物对诸如低氮环境之类的胁迫情况的耐受性增加得到。基因可用于改变植物的遗传组成，从而使得它们在当前的肥料施用标准下更高产或在肥料显著减少或氮可用量显著减少的情况下保持它们的产出率。在氮肥获得受限的发展中国家和在氮使用水平保持较高的发达国家，改善玉米中的NUE都将会增加每单位投入氮肥的玉米可收获产量。氮利用改善还使得能降低在农场上的投入成本，降低对氮肥生产所需的非可再生能源的使用和依赖，以及减少氮肥生产和农业利用的环境影响。
本发明提供了改善植物产量的方法和组合物。在一些实施例中，植物产量在胁迫，特别是非生物胁迫，例如氮限制条件下得以改善。提高植物产量的方法包括抑制植物的育性。植物的雄性育性可用本领域已知的任何方法来抑制，这些方法包括但不限于破坏穗丝发育基因，或者通过利用共抑制、反义或RNA沉默或干扰来降低基因的表达。其他雄性不育植物可通过利用遗传雄性不育突变体来实现。
抑制植物中的雄性育性可改善植物的氮胁迫耐受性，并且这种植物可在显著较低的氮肥投入的情况下保持它们的产出率和/或可表现出增加的氮肥吸收和同化和/或对积聚的氮储备的再动员和再利用。除了产量的总体增加外，通过减少雄性育性改善氮胁迫耐受性还可导致根质量和/或长度增加，穗、叶、种子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些实施例中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选选择表现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
另外，提供了改善非生物胁迫下的产量的方法和组合物，该方法包括：评价耕作区的环境条件的非生物应激源(stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在胁迫环境下栽培具有减少的雄性育性的种子或植物。
本文还提供了构建体和表达盒，所述构建体和表达盒包含可有效减少雄性育性的核苷酸序列。
另外的方法包括但不限于：
一种通过增加植物中的一种或多种产量组分来增加产量的方法，包括通过影响植物中核编码组分的表达或活性来减少雄性育性，以及在植物生长条件下种植植物，其中该组分表现出显性表型。在一个实施例中，核编码组分为具有显性表型的雄性育性基因或雄性不育基因。任选地，雄性育性基因或雄性不育基因为转基因。
正在发育的雌性生殖结构与雄性生殖结构在这些生殖结构发育期间竞争氮、碳和其他营养物质。这在当植物以增加的氮肥水平种植时定量正在发育的玉蜀黍穗和穗丝的氮平衡中进行说明。当玉蜀黍在较低氮肥力水平下生长时，穗的氮平衡为负，或在发育期间当氮受限时，穗丢失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡在提供给植物的氮肥的量增加时提高，直到穗维持氮的正向增加直至抽穗丝。相比之下，无论种植植物的育性水平如何，穗丝都维持正向氮平衡。穗丝和穗在生殖发育期间竞争氮，并且正在发育的穗丝对正在发育的穗占优势。穗和穗丝可能在发育期间竞争多个营养物质，并且竞争在胁迫条件下变得更激烈。穗在开花之前在生殖发育期间与穗丝竞争减少了正在发育的穗在胁迫下积聚营养物质的能力，得到具有较少籽粒的较小、发育较差的穗。更严重的、延长的胁迫可导致穗无法抽穗丝(exert silk)和产生谷粒。雄性育性的遗传减少将减少穗丝发育所需的营养物质，导致开花时穗发育提高。遗传雄性不育和可育近亲在不同氮肥力水平下生长并且在约50％花粉散出时取样。雄性不育植物在两种氮肥水平下均产生更大的穗。抽穗丝的雄性不育植物的比例也大于可育近亲植物。虽然生物量(总地上植物干重减去穗干重)在较高氮肥下生长的植物中较大，但是雄性不育对生物量无影响。这表明雄性不育具体地对植物产生更重、更完全发育的(抽穗丝)穗的能力的正面影响，而不影响总体营养生长。
尚未对遗传雄性不育衍生的杂交体进行产量实验，因为直到最近还没有利用该雄性不育源产生杂交种子的适当方法。由于大多数遗传雄性不育为隐性的，因此产生雄性不育杂交体将需要雄性不育源回交到杂交体的两个亲本中。对于杂交体雌性亲本将必须为纯合隐性(雄性不育)的并且雄性亲本必须为杂合(雄性可育)的以对雄性不育1∶1分离。相比之下，显性遗传雄性不育MS44仅需要回交到雌性亲本中以产生对雄性不育1∶1分离的杂交种子。显性雄性不育在多倍体植物诸如小麦中特别有用，其中纯合隐性不育的维持更为复杂。
已发现表达植物中显性遗传雄性不育基因的过程，所述植物任选地结合穗丝组织特异性启动子和穗丝优选的基因，以增加穗组织发育、提高正在生长的植物中的营养物质利用率并且增加种子度量值，最终得到提高的产量。(图1)
遗传雄性不育极可能产生产量响应，因为花粉发育在遗传雄性不育突变体中停滞得更早。大多数雄性不育突变体在花粉四分体释放后很快就失效(Albertson and Phillips，(1981)Can.J.Genet.Cytol.23：195-208(Albertson和Phillips，1981年，《加拿大遗传学与细胞学杂志》，第23卷，第195-208页)，其出现在雌性(穗)发育的非常早的阶段。直到开花前10天才能确定CMS衍生的雄性不育，如通过与CMS稳定性相关联的环境相互作用所判断的(Weider，et al.，(2009)Crop Sci.49：77-84(Weider等人，2009年，《作物科学》，第49卷，第77-84页))。穗的主体发育将发生在开花前10天之前。然而，当穗在早期发育阶段时，遗传雄性不育的早期停滞将是减少正在发育的穗与穗丝发育对营养物质的竞争的一种方法。与通过提高穗发育引导的雄性不育杂交体相关联的产量提高与穗发育和穗丝发育竞争的减少一致。
在恢复的(雄性可育)和未恢复的(雄性不育)细胞质雄性不育(CMS)杂交体中测试对氮肥力的产量响应。一个杂交体在开花期间由于环境条件变为雄性可育，而另一个杂交体由于雄性不育未表现出显著的产量效应。这些结果表明通过细胞质基因确定的雄性不育可能直到穗丝和穗发育的较晚期才能确定，如通过与CMS稳定性相关联的环境相互作用所判断的。穗的主体发育已在确定CMS雄性不育之前(开花前10天)发生，从而在穗发育期间提供极少减轻的穗丝竞争。因此在遗传雄性不育中的穗丝发育将在较长的穗发育时间段期间减少，并因此与穗发育竞争较少。遗传雄性不育突变体不受环境条件的显著影响。
减轻正在发育的穗丝和穗之间的竞争还可通过化学诱导雄性不育来实现。化学物质和遗传操纵的组合也可诱导雄性不育。通过雄性生殖组织中具有较低功效的启动子或通过使用杀配子剂前体(pro-gametocide)(Dotson，et al.，(1996)The Plant Journal10：383-392((Dotson等人，1996年，《植物杂志》，第10卷，第383-392页)和(Mayer and Jefferson，(2004)Molecular Methods for Hybrid Rice Production(Mayer和Jefferson，2004年，《用于杂交水稻生产的分子方法》))来修改除草剂耐性。组织特异性方式的抑制剂也将是实施本发明的有效方法。
在多种情况下，特定的植物性状通过维持纯合隐性条件来表达。当转基因恢复基因必须用于维持时，需要另外的步骤来维持纯合条件。例如，玉蜀黍中的MS45基因(美国专利No.5,478,369)有助于雄性育性。由于MS45育性性状的孢子体性质，因此显性MS45等位基因的杂合或半合植物是完全可育的。MS45基因中指定为ms45的天然突变在该突变型等位基因处于纯合状态时赋予植物雄性不育表型。当通过普通杂交或转基因互补方法将非突变形式的基因引入植物中时，此不育性可逆转(即，育性被恢复)。然而，通过杂交对育性的恢复移除了所需的纯合隐性条件，并且两种方法都恢复了全部雄性育性并且阻止了对纯的雄性不育母系的维持。
维持所需的纯合隐性条件的方法在美国专利No.7,696,405和7,517,975中有所描述，其中保持系用于杂交到纯合隐性雄性不育姊妹体上。保持系在雄性不育所需的纯合隐性条件下，而且还包含由显性雄性育性基因组成的半合转基因构建体以补充雄性不育条件；花粉消融基因，其阻止通过转基因构建体的花粉转移至雄性不育姊妹体，但允许隐性雄性不育等位基因通过非转基因花粉粒的转移；以及种子标记基因，其允许对转基因保持系种子或植物和转基因无效雄性不育种子或植物进行分选。
制种技术(SPT)提供了维持植物中雄性不育基因的纯合隐性条件的方法。参见(例如)美国专利No.7,696,405。SPT将为花粉源的保持系用于其纯合隐性雄性不育姊妹体的受精。保持系在雄性不育所需的纯合隐性条件下，而且还包含半合转基因构建体(“SPT构建体”)。在某些实施例中，SPT构建体包含以下三种元件：(1)显性雄性育性基因，以补充雄性不育隐性条件；(2)编码干扰雄性配子的形成、功能或传播的产物的基因和(3)标记基因，其允许从那些不含该转基因的种子/植物中分选该转基因保持系种子/植物。对花粉的形成、功能或传播的干扰阻止了通过转基因构建体的花粉转移；功能性花粉不含该转基因。所得的种子产生为雄性不育的植物。然后将这些雄性不育自交系植物用于通过用雄性亲本授粉的杂交体生产，所述雄性亲本对于雄性育性基因的显性等位基因可为不相关的自交系纯合体。所得的杂交种子产生为雄性可育的植物。
要产生杂交雄性不育子代，雄性亲本将用作保持系以杂交到雄性不育雌性自交系上(利用单独的雌性保持系增加)以得到完全雄性不育的杂交植物。参见(例如)图3。
使用显性方法是实现雄性不育或减少的雄性育性的另一种方法。显性雄性不育方法优于隐性雄性不育的使用，因为完全不育仅需要显性基因的单拷贝。然而，如果方法不可用于产生纯合显性雄性不育系，那么所得的子代将对雄性不育50％分离。该情况可通过转基因地将筛选性或选择性标记连接到显性雄性不育基因并且筛选或选择携带标记的子代种子或植物来减轻。对于显性雄性不育等位基因，连接的遗传标记或连接的表型可用于分选子代。描述可逆显性雄性不育体系的方法在将化学物质施加于显性雄性不育植物的美国专利No.5,962,769中有所描述，所述可逆显性雄性不育体系逆转表型并且得到雄性育性，从而允许自花授粉使得可获得纯合显性雄性不育植物。可预想用于产生纯合显性雄性不育植物的其他方法，所述方法使用控制抑制或干扰显性雄性不育基因功能的基因的诱导型启动子。植物为组成型不育的，仅当启动子被诱导时变为可育的，从而允许破坏显性雄性不育基因功能的阻遏子的表达。阻遏子可为靶向显性雄性不育基因自身或其启动子或能够结合显性雄性不育基因产物或使其失活的基因产物的反义基因、RNAi、反向重复序列。
另一个在显性雄性不育的子代中产生100％雄性不育的方法将使用自动剪接蛋白质序列。自动剪接蛋白质序列为能够自行切除并且以肽键重新结合剩余的一个或多个部分的蛋白质片段。自动剪接蛋白质序列可自剪接并且将剩余部分归为顺式和反式两种状态。显性雄性不育基因可进行修饰使得对N和C蛋白质区域编码的区域被分成不同的转基因构建体，与对自动剪接蛋白质序列编码的序列结合。由于蛋白质为截短和无功能的，所以包含单个构建体的植物将为雄性可育的，其允许自体受精以产生纯合植物。然后可将对于N-DMS-N-自动剪接蛋白质序列为纯合的植物与对于C-自动剪接蛋白质序列-C-DMS蛋白质为纯合的植物杂交。所有来自此杂交的子代通过切除每个自动剪接蛋白质序列以及N和C序列的归类将为雄性不育的，以产生功能性的显性雄性不育蛋白质。
一系列田地实验用于定量在各种环境变量下遗传雄性不育的产量响应。使用两个变量：施氮量和植物密度，以使植物经受各种程度的胁迫。胁迫处理的连续性由于对遗传雄性不育植物的穗的更大程度的同化物分配，允许对植物性能的清晰分离。这些方法用于定量和说明田地中代表性的作物冠层环境中的正向产量效应。这些数据验证了在温室研究中测量的早期单个植株响应。
雄性不育表现为在特定植物组织的发育中的变化。玉蜀黍穗和穗丝为共享共同的发育过程并且受共同的一组基因控制的两种花序结构。组织彼此竞争所需的营养物质。然而穗丝具有优于穗的顶端优势的优点，其不利于玉蜀黍植物中的穗生长和产量潜力。减小穗丝顶端优势可用于将更多资源转向穗生长、籽粒数量或尺寸，并且最终可得到增加的谷粒产量。
有多种方法减少穗丝的竞争，诸如雄性不育、穗丝尺寸减少或穗丝消除(无穗丝玉蜀黍植物)。当基因的遗传突变(突变体)诸如雄性不育基因可用于减少穗丝与穗的竞争时，转基因操作提供用于此目的的替代方案或使能工具。由于涉及穗丝发育的基因通常涉及穗发育，所以通过中断这些基因减少穗丝发育也可影响穗发育。无穗丝基因(Tsl1)突变为其中无穗丝植物也是无穗的例子。要使穗丝生长减少而不干扰穗发育，则需要穗丝特异性启动子靶向仅在穗丝组织中的基因破坏。
提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并采用下文所示的定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，诸如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principles andApplications，Persing，et al.，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是微球菌(Micrococcus rubens)，对于它来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka，et al.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))可进行修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种隐匿的变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白质的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还可参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.Freeman公司，1984年)。
如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包括额外的序列：额外的序列不会严重影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。
术语“构建体”用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对目的基因实现了遗传变更(如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)遗传上与受试植物或植物细胞相同但未暴露于会诱导所关注基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于其中所关注基因不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的下调构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))，或纤毛虫大核(ciliateMacronucleus)中存在的通用密码的变体，当用这些生物体表达该核酸时。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，将其以引用的方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语“非天然存在的”、“突变的”、“重组的”、“重组表达的”、“异源的”或“异源表达的”为不存在于其天然存在环境中的代表性生物材料。
术语“NUE核酸”意指包含编码完全长度或部分长度多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建，在诸如以下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger and Kimmel，(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques，from the series Methods in Enzymology，vol.152，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger和Kimmel，1987年，《分子克隆技术指南》，来自《酶学方法》系列第152卷，学术出版社，加州圣地亚哥)；Sambrook，etal.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，vols.1-3(Sambrook等人，1989年，《分子克隆实验指南》，第2版，第1-3卷)；以及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，et al.，eds，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司(1994年增刊))。
本文所用的“可操作地连接”包括指涉第一序列(诸如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(茄属)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zeamays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数目(针对谷粒水分进行了调整，例如玉蜀黍的水分通常为15％)，和指所产生的生物量的体积(对于草料作物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植株根尺寸)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位磅/蒲式耳。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或它们的类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指指定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子被称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下，在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
术语“多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白质”包含多肽。除非另有规定，否则术语“NUE核酸”意指包含编码多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为有意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，最优选100％的序列同一性(即互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在用30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液37℃下杂交，并在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格性条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交和在0.1X SSC中在60至65℃下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据Meinkoth and Wahl，(1984)，Anal.Biochem.，138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)中的Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L来大致估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes，part I，chapter2，“Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，NewYork(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针杂交》，第I部分，第2章，“核酸探针测定法的杂交原理和策略概览”，Elsevier出版社，纽约，1993年)；以及Current Protocols in MolecularBiology，chapter2，Ausubel，et al.，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版公司与约翰威立出版公司，纽约，1995年)。除非另有规定，否则在本专利申请中，高严格性定义为在4X SSC、5X Denhardt′s(5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白于500mL水中)、0.1mg/mL煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65℃下杂交，和在0.1X SSC、0.1％SDS中在65℃下洗涤。
如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“基本上全同”。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列进行比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源性比对算法(GAP)；相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：Intelligenetics(加州山景城(Mountain View，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software第8版(可得自Genetics Computer Group(程序(Accelrys公司(加州圣地亚哥(SanDiego，CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献详细说明：Higginsh and Sharp，(1988)Gene73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第7卷，第237-244页)；Higgins and Sharp，(1989)CABIOS5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，et al.，(1992)ComputerApplications in the Biosciences8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)以及Pearson et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.，24：307-31(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24第307-310页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng and Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于Higginsand Sharp，(1989)CABIOS5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，将文献以引用的方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular Biology，Chapter19，Ausubel et al.，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《现代分子生物学实验技术》，第19章，Ausubel等人(编辑)，威利-英特科学出版公司，纽约，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学》，第17卷，第149-163页))和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201(Claverie和States，1993年，《计算化学》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers and Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California，USA))中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
在肽的情形中，术语“基本上相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。“基本上上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
表1
核酸的构建
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施例中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页))和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页))和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao，et al.，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284(Rao等人，1988年，《分子与细胞生物化学》，第8卷，第284页))。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子使用。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(诸如可得自University of Wisconsin Genetics Computer Group的“CodonPreference”)进行统计分析。参见Devereaux，et al.，(1984)Nucleic AcidsRes.12：387-395(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)或MacVector4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(Eastman Kodak Co.，New Haven，CN))。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.1996/19256中有描述。也可参见Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)和Zhao，et al.，(1998)Nature Biotech16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供出用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以是能用筛选系统选择或检测的任何性质或属性，可以包括如下性质：所编码的蛋白质、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白质结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施方案中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白质而言改变了的Km和/或Kcat。在其它实施方案中，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其它实施方案中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白质或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可为野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白质的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标记。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可采用会引导本发明多核苷酸在基本上再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，et al.，(1985)Nature313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)中所述；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)Plant Cell163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.，18：675-89)(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-30(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))以及玉米H3组蛋白(Lepetit，etal.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子遗传学和基因组学》，第231卷，第276-285页)和Atanassvoa et al.，(1992)Plant Journal2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页))；ALS启动子，如PCT申请号WO1996/30530中所描述，以及其他来自技术人员知道的各种植物基因的转录起始区。对于本发明而言，泛素启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。此类启动子可为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。在昼夜节律期间的不同时间都有活性的昼夜启动子也是已知的(美国专利申请公布No.2011/0167517，以引用方式并入本文)。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(诸如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3’末端和/或聚腺苷酸化区域，诸如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan，et al.，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-385页))；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，et al.，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)以及An，et al.，(1989)Plant Cell1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV19S基因(Mogen，et al.，(1990)Plant Cell2：1261-72(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页))。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在动物和植物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能增加基因表达最高达1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-200(Callis等人，1987年，《基因和发育》，第1卷，第1183-1200页))。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、Adh1-S内含子2和Adh1-S内含子6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见The Maize Handbook，Chapter116，Freeling and Walbot，eds.，Springer，New York(1994)(《玉蜀黍手册》，第116章，Freeling和Walbot编辑，施普林格出版，纽约，1994年)。
植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白质靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-4900页))，例如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)延伸基因(DeLoose et al.，(1991)Gene99：95-100(DeLoose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页))；将蛋白质靶向液泡的信号肽，例如甘薯贮藏蛋白基因(Matsuka，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：834(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页))和大麦凝集素基因(Wilkins，et al.，(1990)Plant Cell，2：301-13(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-313页))；导致蛋白质被分泌的信号肽，例如PRIb信号肽(Lind，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)，以引用方式并入本文)或者将蛋白质靶向质体的信号肽，例如油菜烯脂酰ACP还原酶(Verwaert，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页))可用于本发明中。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。通常，选择性标记基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草丁膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
可用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域公知的，包括衍自根瘤农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers，et al.，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77(Rogers等人，1987年，《酶学方法》，第153卷，第253-277页)所描述。这些载体是植物整合型载体，因为在转化时，这些载体将载体DNA的一部分整合进宿主植物的基因组中。可用于本发明的示例性的根瘤农杆菌载体是Schardl，et al.，(1987)Gene61：1-11(Schardl等人，1987年，《基因》，第61卷，第1-11页)和Berger，et al.，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6(Berger等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第8402-8406页)的质粒pKYLX6和pKYLX7。本发明中可用的另一种载体是质粒pBI101.2，其可得自加利福尼亚州山景城的科隆达生物技术实验室有限公司(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA)。
蛋白质在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白质。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白质，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白质。
可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本发明的蛋白质的核酸的表达体系。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白质的各种方法。
技术人员将认识到，可对本发明的蛋白质进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最常由多种大肠杆菌菌株代表；然而，也可以使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核生物控制序列，包括诸如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang，et al(1977)Nature 198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，et al.，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake，et al.，(1981)Nature292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本发明的蛋白质的表达系统可用芽孢杆菌属(Bacillussp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva，et al.，(1983)Gene22：229-35(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach，et al.，(1983)Nature302：543-5(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。得自法玛西亚(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白质。
异源蛋白质在酵母中的合成是众所周知的。Sherman，et al.，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室出版社)是描述多种可用于在酵母中产生蛋白质的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方法是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白质，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白质分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白质印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白质的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，例如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(Schneider，1987年，《胚胎学和实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页))。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入到载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，(1983)J.Virol.45：773-81(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入到载体，如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些(Saveria-Campo，“BovinePapilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”(牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体)，载于DNA Cloning：A Practical Approach，vol.II，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985)(《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年)。
另外，可将置于适当植物表达载体中的NUE基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白质提取和纯化技术。
植物转化方法
有多种用于将外来基因引入植物中的方法是已知的并可用来将NUE多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki et al.，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick and Thompson，eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)(Miki等人，“将外来DNA引入植物中的程序”，《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，波卡拉顿的CRC出版社，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch，et al.，(1985)Science227：1229-31(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber，et al.，“Vectors for PlantTransformation，”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，supra，pp.89-119(Gruber等人，“植物转化载体”，《植物分子生物学和生物技术方法》，出处同上，第89-119页)。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括直接基因转移(Paszkowski et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见，例如，Sanford等人，美国专利No.4,945,050；WO 1991/10725和McCabe，et al.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。还可参见Tomes，et al.，“Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment”。pp.197-213in PlantCell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods.eds.Gamborg andPhillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995(Tomes等人，“通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中”，第197-213页，《植物细胞、组织和器官培养基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林海德堡纽约，1995年)；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford，et al.，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(Sanford等人，1987年，《颗粒科学与技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou，et al.，(1988)Plant Physiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；Datta，et al.，(1990)Biotechnology8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Biotechnology6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；WO 91/10725(玉蜀黍)；Klein，et al.，(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)和Gordon-Kamm，et al.，(1990)Plant Cell2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren andHooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bytebierm，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(Bytebierm等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合)；De Wet，et al.，(1985)In The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.G.P.Chapman，et al.，pp.197-209.Longman，NY(De Wet等人，1985年，《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，第197-209页，朗文，纽约)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声波处理)；D’Halluin，et al.，(1992)Plant Cell4：1495-1505(D’Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda，et al.，(1996)Nature Biotech.14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)；农杆菌介导的玉米转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，et al.，(1994)Plant J.6：941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页))；激光方法(Guo，et al.，(1995)Physiologia Plantarum93：19-24(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页))；超声处理方法(Bao，et al.，(1997)Ultrasound in Medicine&Biology23：953-959(Bao等人，1997年，《医学与生物学超声》，第23卷，第953-959页)；Finerand Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10(Finer和Finer，2000，《应用微生物学通讯》，第30卷，第406-410页)；Amoah，et al.，(2001)J ExpBot52：1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第1135-1142页))；聚乙二醇方法(Krens，et al.，(1982)Nature296：72-77(Krens等人，1982年，《自然》，第296卷，第72-77页))；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824-5828(Fromm等人，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第5824-5828页))和显微注射(Crossway，et al.，(1986)，Mol.Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)进行转化；将这些文献全部以引用的方式并入本文。
农杆菌介导的转化
将表达载体引入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根瘤农杆菌和毛根农杆菌是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论》，第10卷，第1页)。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人，出处同上和Moloney，et al.，(1989)Plant CellReports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。
相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfeyand Chua，(1989)Science244：174-81(Benfey和Chua，1989年，第244卷，第174-181页)。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种靶植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其他可用的控制序列包括来自胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因必须也存在，要么与T-DNA部分一起存在，要么通过双元系统存在，在该系统中该vir基因存在于一另外的载体上。这类系统、其中所用的载体、以及转化植物细胞的方法在美国专利No.4,658,082；1986年10月1日提交的第913,914号美国专利申请，其公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306中引用，和Simpson，et al.，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(Simpson等人，1986年，《植物分子生物学》，第6卷，第403-415页)(也在‘306专利中引用)，所有文献均全文以引用方式并入。
一旦构建，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员在内。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。欧洲专利申请No.604 662 A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672 752 A1公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(Nature Biotechnology14：745-50(1996)(《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)，1996年)。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植株可通过使该植株产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植株的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40(Shahin，1985年，《理论和应用遗传学》，第69卷，第235-240页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人，出处同上和均于1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306引用，将上述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。
直接基因转移
尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在稻中获得了一定的成功(Hiei，et al.，(1994)The Plant Journal6：271-82(Hiei等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第271-282页))。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，et al.，(1987)Part Sci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页))；Sanford，(1988)Trends Biotech6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页))；Sanford，(1990)Physiol.Plant79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)和Klein，et al.，(1992)Biotechnology10：268(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页))。
降低多肽的活性和/或水平
提供了方法通过用表达可抑制多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的多肽的活性。该多核苷酸可通过防止信使RNA的转录或翻译来直接抑制多肽的表达，或者通过编码能抑制编码多肽的基因的转录或翻译的多肽来间接抑制多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制多肽的表达。
根据本发明，如果多肽的蛋白质水平为该同一多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到70％，则多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据发明的经修饰的植物中的蛋白质水平，为该同一多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白质水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量该多肽在植物细胞或植物中的氮吸收活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的其他实施例中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制多肽活性的多肽的多核苷酸。如果该多肽的活性为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的活性的植物中的活性的不到70％，则根据本发明抑制多肽的增加的氮利用活性。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据本发明的经修饰的植物中的活性，为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的表达的植物中的活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当多肽的活性不能通过本文其他地方所描述的测定法检测时，则根据本发明该活性被“消除”了。测定多肽的氮利用活性的改变的方法在本文其他地方描述。
在其他实施例中，可通过破坏编码多肽的基因来降低或消除多肽的活性。本发明涵盖携带基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少基因的表达或抑制编码的多肽的氮利用活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施例中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白质或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白质或多肽，而蛋白质或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白质或多肽。
可抑制多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植株。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的全部或部分、多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含多肽的编码区的全部或部分的一些实施例中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白质产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白质而言具有不可检测的蛋白质水平的植物。参见例如Broin，et al.，(2002)Plant Cell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)。共抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3490-3496(Flavell等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第3490-3496页)；Jorgensen，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973(Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页)；Johansen and Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938(Johansen和Carrington，2001年，《植物生理学》，第126卷，第930-938页)；Broin，et al.，(2002)Plant Cell14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Yu，et al.，(2003)Phytochemistry63：753-763(Yu等人，2003年，《植物化学》，第63卷，第753-763页)和美国专利No.5,034,323、5,283,184和5,942,657，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置包括poly-dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有相当大的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和5,034,323，将它们以引用的方式并入本文。
ii.反义抑制
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过表达可导致靶基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植株。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的互补序列的全部或部分、靶转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与目标序列完全互补(即与目标序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植株中的多种蛋白质的表达。参见(例如)第5,942,657号美国专利。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和5,942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用的方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和聚腺苷酸化信号的5′位置处包括poly-dT区来提高。参见第2002/0048814号美国专利申请公开，将其以引用的方式并入本文。
iii.双链RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植株进行筛选以鉴别显示出所需的多肽表达抑制程度的植株。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13959-13964页)，Liu，et al.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页))以及WO 1999/49029、WO 1999/53050、WO1999/61631和WO 2000/49035，将每个文献和专利以引用方式并入本文。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献中有描述。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。或者，碱基配对茎区可对应于控制其表达待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因此，该分子的碱基配对茎区通常确定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因表达中很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。参见例如Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)以及Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。使用hpRNA干扰来抑制或消除基因表达的方法在例如以下文献和专利中有描述：Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfini et al.，BMC Biotechnology3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)，以及美国专利申请公布No.2003/0175965，每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)，该文献以引用方式并入本文。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区尺寸在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见，例如，Smith，et al.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源基因表达受到100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在Smith，et al.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《植物生物学新见》，第5卷，第146-150页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Helliwell and Waterhouse，(2003)Methods30：289-295(Helliwell和Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)和美国专利申请公布No.2003/0180945中有所描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施方案中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO2002/00904；Mette，et al.，(2000)EMBO J19：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新见》，第11卷，第221-227页)；Scheid，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99：13659-13662(Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页)；Aufsaftz，et al.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)；Sijen，et al.，Curr.Biol.(2001)11：436-440(Sijen等人，《当代生物学》，2001年，第11卷，第436-440页))，将它们以引用方式并入本文。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。使用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Angelland Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684(Angell和Baulcombe，1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第16卷，第3675-3684页)，Angelland Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362(Angell和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362页)以及美国专利No.6,646,805，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
vi.核酶
在一些实施例中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致多肽的表达的降低。这个方法例如在第4,987,071号美国专利中进行了描述，将该专利以引用的方式并入本文。
vii.小干扰RNA或微RNA
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因经RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂，miRNA在抑制内源基因表达方面很高效。参见例如Javier，et al.，(2003)Nature425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，该文献以引用的方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。例如，该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制NUE表达，从NUE转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述NUE序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。育性基因，无论内源还是外源，均可为miRNA靶基因。miRNA分子在抑制内源基因表达方面很高效，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。
2.基因表达的基于多肽的抑制
在一个实施例中，所述多核苷酸编码与编码多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施例中，该锌指蛋白结合至NUE基因的调控区。在其他实施例中，该锌指蛋白结合至编码多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在第6,453,242号美国专利进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在第2003/0037355号美国专利申请公开中进行了描述，将这些专利每一个以引用的方式全文并入本文。
3.蛋白质活性的基于多肽的抑制
在一些本发明的实施例中，多核苷酸编码结合至少一条多肽并且降低多肽的增加的氮利用活性的抗体。在另一个实施例中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-NUE复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白质来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad and Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36(Conrad和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页)，将该文献以引用的方式并入本文。
4.基因破坏
在本发明的一些实施例中，通过破坏编码多肽的基因，降低或消除多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施方案中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏所述基因。
i.转座子标签法
在本发明的一个实施例中，使用转座子标签法降低或消除一个或多个多肽的活性。转座子标签法包括在内源NUE基因内插入转座子以降低或消除所述多肽的表达。“NUE基因”意指编码根据本发明的多肽的基因。
在该实施例中，通过在编码多肽的基因的调控区或编码区内插入转座子来降低或消除一种或多种多肽的表达。处于NUE基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于降低或消除所编码多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标记的方法是本领域所熟知的。参见例如Maes，et al.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4卷，第90-96页)；Dharmapuri and Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59(Dharmapuri和Sonti，1999年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第179卷，第53-59页)；Meissner，et al.，(2000)Plant J.22：265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》，第22卷，第265-274页)；Phogat，et al.，(2000)J.Biosci.25：57-63(Phogat等人，2000年，《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页)；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107(Walbot，2000年，《当代植物生物学观点》，第2卷，第103-107页)；Gai，et al.，(2000)NucleicAcids Res.28：94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页)；Fitzmaurice，et al.，(1999)Genetics153：1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第153卷，第1919-1928页)。此外，在Bensen，et al.，(1995)Plant Cell7：75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第75-84页)；Mena，et al.，(1996)Science274：1537-1540(Mena等人，1996年，《科学》，第274卷，第1537-1540页)和美国专利No.5,962,764中描述了在选择的基因中选择Mu插入的TUSC方法，以上每个文献和专利以引用的方式并入本文。
ii.活性降低的突变体植物
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植株。如需这些方法的例子，请参见Ohshima，et al.，(1998)Virology243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，et al.，(1994)Genetics137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)和Quesada，et al.，(2000)Genetics154：421-436(Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)，以上每个文献以引用的方式并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(Targeting Induced LocalLesions In Genomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，以引用方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白质的功能(增加的氮利用活性)的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白质的活性方面是特别有效的。植物多肽的适于以消除活性为目标进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同NUE基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，et al.，(2002)Plant Cell14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
在本发明的另一个实施例中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，et al.，(2003)Plant Cell15：1455-1467(Kusaba等人，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页)。
本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA：DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350、5,731,181、5,756,325、5,760,012、5,795,972和5,871,984，以上每个专利以引用的方式并入本文。另参见WO 1998/49350、WO 1999/07865、WO 1999/25821和Beetham，etal.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)，以上每个文献和专利以引用的方式并入本文。
iii.调节氮利用活性
在特定的方法中，通过增加植物中的多肽的水平或活性来降低植物中NUE调节剂的水平和/或活性。负调控分子的表达增加可降低下游造成改善的NUE表型的一个或多个基因的表达水平。
提高植物中的多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，这种方法包括提供本发明的多肽给植物，从而增加该多肽的水平和/或活性。在其他实施例中，可通过这样来提供编码多肽的NUE核苷酸序列：向植物中引入包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸，表达该NUE序列，提高该多肽的活性，并因此减少植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，植物组织的生长通过降低植物中多肽的水平和/或活性而增加。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一这样的方法中，将NUE核苷酸序列引入植物中，所述NUE核苷酸序列的表达可降低多肽的活性并从而增加植物或植物部分中的组织生长。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
如上面论述的，技术人员将认识到用于调节植物中的NUE的水平/活性的适当启动子。在本文其他地方已经公开了该实施方案的示例性启动子。
在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该序列可操作地连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
iv.调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张度。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所述方法包括调节该多肽在植物中的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的NUE序列提供给植物。在另一种方法中，通过这样来提供NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更根发育。在另外其他的方法中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，通过改变多肽在植物中的水平或活性来调节根发育。活性的改变可导致以下对根发育的改变中的至少一项或多项：包括但不限于根生物量的改变和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公开No.2003/0074698和Werner，et al.，(2001)PNAS18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，将这两篇文献以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根优选的启动子。示例性的根优选的启动子已在本文别处公开。
通过降低多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根的重量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利(环境)条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过改变多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根重量也在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。
此外，由于活性所致的较高的根生物量生产对产量具有直接的作用，并对根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物所产生的化合物的生产具有间接作用。在根培养物中产生的关注化合物的一个实例是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性和具有增强了的根生长和/或根生物量。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该序列可操作地连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
v.调节苗和叶发育
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在这些系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner，et al.，(2001)PNAS98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公开No.2003/0074698，将这两篇文献各以引用的方式并入本文。
调节植物中苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的多肽的活性和/或水平。在一个实施例中，提供本发明的NUE序列。在其他实施例中，可如下来提供该NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更苗和/或叶发育。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的实施例中，通过改变多肽在植物中的水平和/或活性来调节苗或叶发育。活性的变化可导致与对照植物相比，苗和/或叶发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)叶数量的变化、叶表面的改变、维管结构的改变、节间和植株生长以及叶衰老的改变。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、苗优选的启动子、苗分生组织优选的启动子和叶优选的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
提高植物中的活性和/或水平可导致节间和生长的改变。因此，本发明的方法可用于产生经修饰的植物。另外，如上所讨论，植物中的活性同时调节根和苗生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可通过改变植物中的多肽的水平和/或活性，来进一步调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性。在其他实施例中，本发明的植物具有降低了的本发明的多肽的水平/活性。
vi.调节繁殖组织发育
提供了用于调节繁殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中多肽的活性或水平还未受调节的对照植株相比，植株的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(即花发育时刻的延迟或提前)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：繁殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间段，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成繁殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的活性。在一个方法中，提供本发明的NUE序列。可以通过这样来提供NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更花的发育。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的方法中，通过增加多肽在植物中的水平或活性来调节花发育。活性的变化可导致与对照植物相比，花发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)开花的改变、花数量的变化、雄性不育的修饰和结籽的改变。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，et al.，(2002)The Plant Cell S111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，将该献以引用的方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗优选的启动子、花序优选的启动子。
在其他方法中，通过改变本发明的NUE序列的水平和/或活性来调节花发育。这种方法可包括将NUE核苷酸序列引入植物中并改变多肽的活性。在其他方法中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。改变本发明的NUE序列的表达能调节胁迫期间的花发育。这种方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有改变的本发明的多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有经修饰的本发明多肽水平/活性的植物，其中该植物在胁迫期间保持或继续进行开花过程。
还提供了使用本发明的NUE序列来增加种子尺寸和/或重量的方法。该方法包括提高植物或植物部分(诸如种子)中的NUE序列的活性。种子尺寸和/或重量的增加包括种子尺寸或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚芽、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的尺寸或重量增加。
如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子尺寸和/或种子重量的适当启动子。该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子优选的启动子、胚优选的启动子和胚乳优选的启动子。
用于改变植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法包括提高植物中的活性。在一个实施例中，可如下来提供该NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而降低种子重量和/或尺寸。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
还认识到，增加种子尺寸和/或重量可以还伴随有籽苗生长速度的增加或早期活力的增加。本文所用的术语“早期活力”是指植物在早期发育过程中快速生长的能力，涉及到萌发之后发育良好的根系和发育良好的光合器的成功建立。此外，当与对照比较时，种子尺寸和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子尺寸的植物。在其它实施方案中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有经修饰的本发明的多肽的水平/活性和具有增加了的种子重量和/或种子尺寸。在其他实施例中，这种植物在其基因组中稳定掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该序列可操作地连接至能驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
vii.NUE多核苷酸、表达盒和另外的多核苷酸的使用方法
本文所公开的核苷酸、表达盒和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
目的基因反映了作物开发的参与者的商业市场和利益。目的作物和市场在变化，并且随着发展中国家面向世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解的增加，对用于转化的基因的选择将会相应变化。目的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(诸如锌指)、涉及通信的那些基因(诸如激酶)和涉及看家的那些基因(诸如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特征和商业产品重要的性状的基因。一般而言，所关注基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响仁尺寸、蔗糖载量等的那些。
在某些实施例中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本发明的多核苷酸可以与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状例如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利No.5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO1998/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，et al.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)和Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))、提高的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请No.10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请No.10/005,429))，将上述公开内容以引用的方式并入本文。本发明的多核苷酸也可与抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状堆叠(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白质(美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,737,514、5723,756、5,593,881、Geiser，et al.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(Van Damme，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825(Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒基因和抗病基因(Jones，et al.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，et al.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草丁膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))以及加工或处理产品所需的性状例如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO 1994/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用的方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响例如雄性不育(例如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或者例如细胞周期调控或基因靶向(例如WO 1999/61619；WO2000/17364；WO 1999/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上公开内容以引用的方式并入本文。
包括或源于植物细胞或原生植物的具有本发明的减少的雄性育性的转基因植物还可用堆叠性状增强，例如，具有由本文公开的DNA的表达结合除草剂耐性和/或害虫抗性性状得到的性状增强的作物。例如，具有减少的雄性育性的植物可与所关注的其他农学性状堆叠，诸如提供除草剂抗性和/或昆虫抗性的性状，诸如利用来自苏云金芽孢杆菌的基因以提供对鳞翅目、鞘翅目(coliopteran)、同翅目、半翅目(hemiopteran)和其他昆虫中的一者或多者的抗性。已知的赋予对除草剂(诸如，生长素、HPPD、草甘膦、麦草畏、草胺膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂)的耐受性的基因可作为分子堆叠或育种堆叠与表达本文所公开性状的植物堆叠。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子包括但不限于编码在美国专利No.39,247、6,566,587中公开的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)并且用于赋予草甘膦耐性的多核苷酸分子；编码在美国专利No.5,463,175中公开的草甘膦氧化还原酶(GOX)和在美国专利No.7,622,641、7,462,481、7,531,339、7,527,955、7,709,709、7,714,188和7,666,643中公开的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、还用于提供草甘膦耐性的多核苷酸分子；在美国专利No.7,022,896和WO 2007/146706 A2中公开的用于提供麦草畏耐性的麦草畏单氧酶；编码在美国专利申请公布No.2005/731044或WO 2007/053482A2中公开的AAD12或编码在美国专利申请公布No.2011/0124503 A1或美国专利No.7,838,733中公开的AAD1以用于提供对生长素除草剂(2，4-D)的耐受性的多核苷酸分子；编码羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)以用于提供对HPPD抑制剂(例如，羟基苯丙酮酸双加氧酶)的耐受性的多核苷酸分子，所述HPPD抑制剂在例如美国专利No.7,935,869、美国专利申请公布No.2009/0055976 A1和2011/0023180 A1中公开，每个公布全文以引用方式并入本文。
可与本文公开的性状结合的除草剂耐受性性状的其他例子包括由编码外源草丁膦乙酰转移酶的多核苷酸赋予的那些，如美国专利No.5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616和5,879,903中所述。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物可表现出对抑制谷氨酰胺合成酶的草胺膦除草剂的改善的耐受性。除草剂耐受性性状的其他例子包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸所赋予的那些，如美国专利No.6,288,306 B1、6,282,837 B1和5,767,373以及国际公开WO 2001/12825中所述。包含此类多核苷酸的植物可对靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的多种除草剂中的任一种表现出改善的耐受性。
在一个实施方案中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias，et al.，(1996)Plant Cell8：1533-44(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-1544页))；AKT1，即拟南芥中钾摄取组织的组分(Spalding，et al.，(1999)JGen Physiol113：909-18(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-918页))；RML基因，其在根尖细胞中激活细胞分裂周期(Cheng，et al.，(1995)Plant Physiol108：881(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页))；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，et al.，(1994)Plant Mol Biol26：1935-46(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-1946页))和血红蛋白(Duff，et al.，(1997)J.Biol.Chem27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)和本文引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因反义核苷酸序列。
另外，除了利用传统的育种方法外，还可遗传改变诸如油脂、淀粉和蛋白质含量之类的农学上重要的性状。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中描述了Hordothionin蛋白质修饰，将这些文献以引用的方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，和在Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)中所述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将所述文献的公开内容以引用方式并入本文。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物来增加预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。例如，编码大麦高赖氨酸多肽的基因(BHL)源于大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂，参见于1996年11月1日提交的美国专利申请No.08/740,682和WO 1998/20133，将这两篇文献的公开内容以引用的方式并入本文。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，诸如来自葵花籽(Lilley，et al.，(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable ProteinUtilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，ed.Applewhite(AmericanOil Chemists Society，Champaign，Illinois)，pp.497-502(Lilley等人，1989年，植物蛋白在人类食品和动物饲料中的利用世界大会会议录，Applewhite编辑(美国油类化学家学会，伊利诺伊州香巴尼市)，第497-502页))；以引用方式并入本文)；玉米(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，et al.，(1988)Gene71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)，这两篇文献均以引用方式并入本文)和水稻(Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页)，将其以引用方式并入本文)。其他农学上重要的基因编码胶乳、Floury2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白质基因(美国专利No.5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881和Geiser，et al.，(1986)Gene48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等等。
编码抗病性状的基因包括解毒基因，例如对抗伏马毒素的基因(美国专利No.5,792,931)；无毒(avr)和抗病性(R)基因(Jones，et al.，(1994)Science266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，et al.，(1993)Science262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)以及Mindrinos，et al.，(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))等等。
除草剂抗性性状可包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变，特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码针对起到抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这类基因。bar基因编码针对除草剂basta的抗性，nptII基因编码针对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变编码针对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供另选方案。可以这类方式使用的基因的例子包括雄性组织优选的基因和具有雄性不育表型的基因诸如QM，其在第5,583,210号美国专利中进行了描述。其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些。
谷粒的质量反映在诸如以下的性状：饱和及不饱和油的含量和类型、必需氨基酸的质量和数量、纤维素的含量。在玉米中，修饰的hordothionin蛋白在美国专利No.5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389中进行了描述。
还可在基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，诸如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白质，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
可操作地连接到核苷酸序列的启动子可为在植物细胞中是活性的任何启动子，特别是在植物的生殖组织(例如，雄蕊或子房)中是活性(或可被激活)的启动子。同样地，启动子可为，例如，组成型活性启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。另外，第一外源核酸分子的启动子可与第二外源核酸分子的启动子相同或不同。
一般来讲，启动子基于，例如，要被抑制的内源育性基因是雄性育性基因还是雌性育性基因来选择。因而，在要被抑制的内源基因为雄性育性基因(例如，BS7基因和SB200基因)的情况下，启动子可为雄蕊特异性和/或花粉特异性启动子，诸如MS45基因启动子(美国专利No.6,037,523)、5126基因启动子(美国专利No.5,837,851)、BS7基因启动子(WO 2002/063021)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)、TA29基因启动子(Nature347：737(1990)(《自然》，第347卷，第737页，1990年))、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085、美国专利No.5,545,546、Plant J3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,837,850和5,589,610)等，使得hpRNA在花粉囊和/或花粉中或在产生花药细胞和/或花粉的组织中表达，从而减少或抑制内源雄性育性基因的表达(即，使内源雄性育性基因失活)。相比之下，在要被抑制的内源基因为雌性育性基因的情况下，启动子可为，例如子房特异性启动子。然而，如本文所公开的，引导在目的组织中的表达的任何可用启动子，包括例如，组成型活性启动子，诸如遍在蛋白启动子，其通常影响在大多数或所有植物细胞中的转录。
基因组编辑和诱导的诱变
一般来讲，修改或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。例如，本文所述的经过遗传修饰的细胞或植物使用“定制的”大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(参见例如WO 2009/114321；Gao，et al.，(2010)Plant Journal1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页))。另一个定点工程改造通过使用限制性酶的限制特性结合的锌指结构域识别。参见例如Urnov，et al.，(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46(Urnov等人，2010年，《自然综述遗传学》，第11卷，第9期，第636-646页)；Shukla，et al.，(2009)Nature459(7245)：437-41(Shukla等人，2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441页)。
一般来讲，修改或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。
锌指介导的基因组编辑
例如，本文所述的遗传修饰细胞或植物使用锌指核酸酶介导的基因组编辑过程生成。用于编辑染色体序列的过程包括例如：(a)将编码锌指核酸酶的至少一条核酸引入细胞，所述锌指核酸酶识别染色体序列中的靶序列并且能够切割染色体序列中的位点，并且任选地引入(i)至少一条供体多核苷酸，其包括用于侧接上游序列和下游序列而整合的序列，所述序列表现出与切割位点的任一侧的基本序列同一性，或(ii)至少一条交换多核苷酸，其包括与染色体序列的一部分在切割位点处基本上相同并且还包括至少一个核苷酸变化的序列；以及(b)培养细胞以允许锌指核酸酶的表达，使得锌指核酸酶将双链断裂引入染色体序列，并且其中双链断裂通过如下过程修复(i)非同源末端连接修复过程，使得将失活突变引入染色体序列，或(ii)同源性引导的修复过程，使得供体多核苷酸中的序列整合到染色体序列中或交换多核苷酸中的序列与染色体序列的一部分交换。
锌指核酸酶包括DNA结合结构域(即，锌指)和切割结构域(即，核酸酶)。编码锌指核酸酶的核酸可包括DNA或RNA。锌指结合结构域可经工程改造以识别并结合到所选的任何核酸序列。参见例如Beerli et al.(2002)Nat.Biotechnol.20：135-141(Beerli等人，2002年，《自然生物技术》，第20卷，第135-141页)；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340(Pabo等人，2001年，《生物化学年评》，第70卷，第313-340页)；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416(Choo等人，2000年，《结构生物学评论》，第10卷，第411-416页)；以及Doyon et al.(2008)Nat.Biotechnol.26：702-708(Doyon等人，2008年，《自然生物技术》，第26卷，第702-708页)；Santiago et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105：5809-5814(Santiago等人，2008年，《美国国家科学院院刊》，第105卷，第5809-5814页)；Urnov，et al.，(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46(Urnov等人，2010年，《自然综述遗传学》，第11卷，第9期，第636-646页)；以及Shukla，et al.，(2009)Nature459(7245)：437-41(Shukla等人，2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441页)。经工程改造的锌指结合结构域与天然存在的锌指蛋白质相比，可具有新型结合特异性。例如，在美国专利No.6,453,242中描述的算法可用于设计锌指结合结构域以靶向预选序列。非简并识别代码表也可用于设计锌指结合结构域以靶向特定序列(Sera et al.(2002)Biochemistry41：7074-7081(Sera等人，2002年，《生物化学》，第41卷，第7074-7081页))。可使用用于鉴别DNA序列中潜在的靶位点并设计锌指结合结构域的工具(Mandell et al.(2006)Nuc.Acid Res.34：W516-W523(Mandell等人，2006年，《核酸研究》，第34卷，第W516-W523页)；Sander et al.(2007)Nuc.Acid Res.35：W599-W605(Sander等人，2007年，《核酸研究》，第35卷，第W599-W605页))。
示例性的锌指DNA结合结构域识别并结合与所需靶序列具有至少约80％序列同一性的序列。在其他实施例中，序列同一性可为约81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
锌指核酸酶还包括切割结构域。锌指核酸酶的切割结构域部分可由任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。由其可得到切割结构域的核酸内切酶的非限制性例子包括但不限于，限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如，2010-2011Catalog，New England Biolabs，Beverly，Mass.(2010-2011年目录，新英格兰生物实验室，马萨诸塞州贝弗利)；以及Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388(Belfort等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3379-3388页)。切割DNA的另外的酶是已知的(例如，S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶)。这些酶的一种或多种(或其功能性片段)可用作切割结构域的源。
基于大范围核酸酶的基因组编辑
遗传修饰本文所述的细胞或植物的另一个例子为通过使用产生用于修饰植物基因组的“定制的”大范围核酸酶(参见例如WO 2009/114321；Gao et al.(2010)Plant Journal1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页))。术语“大范围核酸酶”通常指在识别序列处结合双链DNA的天然存在的归巢核酸内切酶，所述识别序列大于12个碱基对并且涵盖对应的内含子插入位点。天然存在的大范围核酸酶可以为单体(例如，I-SceI)或二聚体(例如，I-CreI)。如本文所用，术语大范围核酸酶可用于指单体大范围核酸酶、二聚体大范围核酸酶，或指缔合以形成二聚体大范围核酸酶的单体。
天然存在的大范围核酸酶，例如来自LAGLIDADG家族，已用于促进植物、酵母、果蝇属、哺乳动物细胞和小鼠中的位点特异性基因组修饰。经工程改造的大范围核酸酶，例如识别和切割存在于玉米(玉蜀黍)的基因组中22碱基对DNA序列的LIG-34大范围核酸酶是已知的(参见例如，US 20110113509)。
TAL核酸内切酶(TALEN)
来自植物病原性黄单胞菌属(Xanthomonas)的TAL(类转录激活因子)效应子是重要的毒力因子，其充当植物细胞核中的转录激活因子，其中它们通过串联重复序列的中央结构域直接结合到DNA。类转录激活因子(TAL)效应子-DNA修饰酶(TALE或TALEN)也用于工程改造遗传变化。参见例如，US20110145940，Boch et al.，(2009)，Science326(5959)：1509-12(Boch等人，2009年，《科学》，第326卷，第5959期，第1509-1512页)。TAL效应子与FokI核酸酶的融合体提供在特定位置处结合并切割DNA的TALEN。靶标特异性通过在TAL效应子中形成定制的氨基酸重复序列来确定。
“TILLING”或“定向诱导基因组局部突变”是指用于生成和/或鉴别并且最终分离具有受调节的表达和/或活性的特定核酸的诱变变体的诱变技术(McCallum，et al.，(2000)，Plant Physiology123：439-442(McCallum等人，2000年，《植物生理学》，第123卷，第439-442页)；McCallum，etal.，(2000)Nature Biotechnology18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)和Colbert，et al.，(2001)PlantPhysiology126：480-484(Colbert等人，2001年，《植物生理学》，第126卷，第480-484页))。
也可采用其他诱变方法将突变引入MS44基因。用于将基因突变引入植物基因并且选择具有所需性状的植物的方法是熟知的。例如，可根据标准技术用诱变化学物质处理种子或其他植物材料。此类化学物质包括但不限于以下物质：硫酸二乙酯、乙烯亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。或者，可使用来自源诸如X射线或γ射线的电离辐射。
本发明的实施例反映了确定生物体的基因型可经修饰以包含显性抑制因子等位基因或转基因构建体，所述显性抑制因子等位基因或转基因构建体抑制(即，减少但不消除)基因的活性，其中生物体的表型基本上不受影响。
在一些实施例中，本发明结合植物育性示出，并且更具体地讲结合植物雄性育性示出。
杂交种子生产需要消除由雌性亲本产生的花粉或使其失活。花粉的不完全移除或失活提供了自交的可能性，提高了不经意自花授粉的种子将被无意中收获并且与杂交种子包装在一起的风险。一旦种子被种植，就可对自交植物进行鉴别和选择；自交植物在遗传上等同于用于产生杂交体的雌性自交系。通常，自交植物基于其相对于杂交植物减少的活力来进行鉴别和选择。例如，玉蜀黍的雌性自交植物通过其较少活力的植物外观和/或生殖特性，包括较短的植物高度、小的穗尺寸、穗和籽粒形状、穗轴颜色或其他特性来鉴别。自交系也可使用分子标记分析来鉴别(参见例如，Smithand Wych，(1995)Seed Sci.Technol.14：1-8(Smith和Wych，1995年，《种子科学与技术》，第14卷，第1-8页))。使用此类方法，自花授粉系的纯合性可通过分析在基因组中的不同基因座处的等位基因组成来验证。
因为杂交植物是重要和有价值的大田作物，所以植物育种工作者一直致力于开发基于稳定自交系的农学上无害的高产杂交体。此类杂交体的可用性允许通过所用的投入产生最大量的作物，同时尽量减少对昆虫和环境胁迫的敏感性。要实现此目标，植物育种工作者必须通过鉴别和选择出现在分离群体中的基因独特个体来开发用于制备杂交体的优良自交亲本系。本发明有助于实现此目标，例如通过提供在杂交时生成雄性不育子代的植物，其可用作用于生成杂交植物的雌性亲本植物。
大量基因已在其表达模式中被鉴别为穗丝优选的。如本文所公开的，玉蜀黍中的抑制方法提供另选的鉴别与玉蜀黍中的花粉发育直接相关的基因的快速方式。如本文所用，术语“内源”在参考基因使用时意指通常存在于指定生物体的细胞的基因组中并且以其常态存在于细胞中(即，以其通常存在于自然中的状态存在于基因组中)的基因。术语“外源”在本文中是指被引入细胞的任何材料。术语“外源核酸分子”或“转基因”是指通常不存在于细胞基因组中或被引入细胞中的任何核酸分子。此类外源核酸分子通常为使用如本文所公开的重组DNA方法或者本领域中已知的其他方式生成的重组核酸分子。在各种实施例中，如本文所公开的转基因非人类生物体可包含，例如，第一转基因和第二转基因。此类第一和第二转基因可引入到细胞中，例如，转基因生物体的祖细胞，作为单独核酸分子或作为单个单元(例如，分别包含在不同载体或包含在单个载体中)。在任一种情况下，可确定待从中得到转基因生物体的细胞包含使用常规和已知方法诸如标记基因的表达，或核酸杂交或PCR分析的两种转基因。作为另外一种选择或除此之外，转基因存在的确定可较晚进行，例如，在植物由推定的转化细胞再生后进行。
用于表达目的核酸分子的启动子可以为根据需要，已知在植物或动物中有效的众多天然存在的启动子中的任一个。引导在植物的雄性或雌性生殖器官的细胞中表达的启动子可用于生成转基因植物或本发明植物的育种对。用于本发明的启动子可包括通常在植物的大多数或所有组织中是活性的组成型启动子；诱导型启动子，其通常为失活的或表现出低的基础表达水平，并且可在用适当的诱导剂接触细胞时被诱导达到相对高的活性；组织特异性(或组织优选的)启动子，其通常仅在一个或少量特定细胞类型(例如，植物花粉囊细胞)中表达，以及发育特异性或阶段特异性启动子，其仅在植物生长或发育期间的限定时期内是活性的。如有必要，通常可修饰启动子以改变表达水平。某些实施例包括被操纵的物种外源的启动子。例如，引入到ms45ms45玉蜀黍种质中的Ms45基因可被从另一个植物物种分离的启动子驱动；然后发夹构建体可设计用于靶向外源植物启动子，减小与非靶标、内源玉蜀黍启动子的发夹相互作用的可能性。
示例性组成型启动子包括35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子(Odell，et al.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、玉蜀黍遍在蛋白启动子(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；Rsyn7启动子的核心启动子和WO 1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)Plant Cell2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.5,641,876、WO 2000/70067)、玉蜀黍组蛋白启动子(Brignon，et al.，(1993)Plant Mol Bio22(6)：1007-1015(Brignon等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第62期，第1007-1015页)；Rasco-Gaunt，et al.，(2003)Plant Cell Rep.21(6)：569-576(Rasco-Gaunt等人，2003年，《植物细胞报告》，第21卷，第6期，第569-576页))等等。其他组成型启动子包括，例如，在美国专利No.5,608,144和6,177,611以及PCT公开No.WO 2003/102198中所述的那些。
组织特异性、组织优选的或阶段特异性调控元件还包括，例如，AGL8/FRUITFULL调控元件，其在成花诱导时被激活(Hempel，et al.，(1997)Development124：3845-3853(Hempel等人，1997年，《发育》，第124卷，第3845-3853页))；根特异性调控元件，诸如来自RCP1基因和LRP1基因的调控元件(Tsugeki and Fedoroff，(1999)Proc.Natl.Acad.，USA96：12941-12946(Tsugeki和Fedoroff，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第12941-12946页)；Smith and Fedoroff，(1995)Plant Cell7：735-745(Smith和Fedoroff，1995年，《植物细胞》，第7卷，第735-745页))；花特异性调控元件，诸如来自LEAFY基因和APETALAl基因的调控元件(Blazquez，et al.，(1997)Development124：3835-3844(Blazquez等人，1997年，《发育》，第124卷，第3835-3844页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；种子特异性调控元件，诸如来自油质蛋白基因的调控元件(Plant，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.25：193-205(Plant等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第193-205页))以及开裂区特异性调控元件。另外的组织特异性或阶段特异性调控元件包括Zn13启动子，其为花粉特异性启动子(Hamilton，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页))；异常花器官(UFO)启动子，其在顶端苗分生组织中是活性的；苗分生组织中是活性的启动子(Atanassova，et al.，(1992)Plant J.2：291(Atanassova等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第291页))；cdc2启动子和cyc07启动子(参见例如，Ito，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：863-878(Ito等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第863-878页)；Martinez，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：7360(Martinez等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第7360页))；分生组织优选的meri-5和H3启动子(Medford，et al.，(1991)Plant Cell3：359(Medford等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第359页)；Terada，etal.，(1993)Plant J.3：241(Terada等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第241页))；大麦中Myb相关基因的分生组织和韧皮部优选的启动子(Wissenbach，et al.，(1993)Plant J.4：411(Wissenbach等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第411页))；拟南芥属cyc3aAt和cyc1At(Shaul，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872(Shaul等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第4868-4872页))；长春花(C.roseus)细胞周期蛋白CYS和CYM(Ito，et al.，(1997)Plant J.11：983-992(Ito等人，1997年，《植物杂志》，第11卷，第983-992页))；和烟草属细胞周期蛋白B1(Trehin，et al.，(1997)Plant Mol.Biol.35：667-672(Trehin等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第667-672页))；APETALA3基因的启动子，其在花分生组织中是活性的(Jack，et al.，(1994)Cell76：703(Jack等人，1994年，《细胞》，第76卷，第703页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；agamous-like(AGL)家族成员的启动子，例如，AGL8，其在过渡到开花时在苗分生组织中是活性的(Hempel等人，出处同上，1997年)；花离区启动子；L1特异性启动子；增强催熟的番茄聚半乳糖醛酸酶启动子(Nicholass，et al.，(1995)Plant Mol.Biol.28：423-435(Nicholass等人，1995年，《植物分子生物学》，第28卷，第423-435页))，E8启动子(Deikman，et al.，(1992)Plant Physiol.100：2013-2017(Deikman等人，1992年，《植物生理学》，第100卷，第2013-2017页))以及果实特异性2A1启动子、来自玉蜀黍的U2和U5snRNA启动子、来自编码Z422kD玉米醇溶蛋白的基因的Z4启动子、来自编码10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10启动子、来自编码27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27启动子、来自编码19kD玉米醇溶蛋白的基因的A20启动子等等。另外的组织特异性启动子可使用熟知的方法进行分离(参见例如，美国专利No.5,589,379)。苗优选的启动子包括苗分生组织优选的启动子，诸如在Weigel，et al.，(1992)Cell69：843-859(Weigel等人，1992年，《细胞》，第69卷，第843-859页)(登录号M91208)中公开的启动子；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF049870以及在McAvoy，et al.，(2003)Acta Hort.(ISHS)625：379-385(McAvoy等人，2003年，《园艺学报》，国际园艺学会(ISHS)，第625卷，第379-385页)中公开的苗优选的启动子。花序优选的启动子包括查尔酮合酶的启动子(Van der Meer，et al.，(1992)Plant J.2(4)：525-535(Vander Meer等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第4期，第525-535页))，花粉囊特异性LAT52(Twell，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.217：240-245(Twell等人，1989年，《分子遗传学和基因组学》，第217卷，第240-245页))，花粉特异性Bp4(Albani，et al.，(1990)Plant MolBiol.15：605(Albani等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第605页)，玉蜀黍花粉特异性基因Zm13(Hamilton，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页)；Guerrero，et al.，(1993)Mol.Gen.Genet.224：161-168(Guerrero等人，1993年，《分子遗传学和基因组学》，第224卷，第161-168页))，小孢子特异性启动子诸如apg基因启动子(Twell，et al.，(1993)Sex.Plant Reprod.6：217-224(Twell等人，1993年，《有性植物繁殖》，第6卷，第217-224页))以及绒毡层特异性启动子，诸如TA29基因启动子(Mariani，et al.，(1990)Nature347：737(Mariani等人，1990年，《自然》，第347卷，第737页)；美国专利No.6,372,967)以及其他雄蕊特异性启动子诸如MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546、Plant J3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,8937,850；美国专利No.5,589,610)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)等等(参见实例1)。组织优选的目的启动子还包括向日葵花粉表达基因SF3(Baltz，et al.，(1992)The Plant Journal2：713-721(Baltz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第713-721页))、甘蓝型油菜(B.napus)花粉特异性基因(Arnoldo，et al.，(1992)J.Cell.Biochem，Abstract Number Y101204(Arnoldo等人，1992年，《细胞生物化学杂志》，摘要编号Y101204))。组织优选的启动子还包括由如下文献所报告的那些：Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)(psaDb)；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)(PsPAL1)；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)(ORF13)；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)(糯性蛋白基因启动子或ZmGBS；27kDa玉米醇溶蛋白启动子，ZmZ27；osAGP；osGT1)；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)(来自棉花的Fbl2A)；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)(烟草属SodA1和SodA2)；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)(烟草属ltp1)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)(松属(Pinus)cab-6启动子)；Lam，(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)(菠菜二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(Rca))；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)(PPDK启动子)和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)(农杆菌pmas启动子)。在雄性或雌性生殖器官的细胞中是活性的组织特异性启动子可在本发明的某些方面特别有用。
“种子优选的”启动子包括“种子发育”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson，et al.，(1989)BioEssays10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)。此类种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)、cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)、mi1ps(肌醇-1-磷酸合酶)；参见，WO 2000/11177和美国专利No.6,225,529。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。还参见WO 2000/12733和美国专利No.6,528,704，其中公开了来自end1和end2基因的种子优选的启动子。另外的胚特异性启动子在如下文献中公开：Sato，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122(Sato等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第8117-8122页)(水稻同源盒，OSH1)和Postma-Haarsma，et al.，(1999)Plant Mol.Biol.39：257-71(Postma-Haarsma等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第257-271页)(水稻KNOX基因)。另外的胚乳特异性启动子在如下文献中公开：Albani，et al.，(1984)EMBO3：1405-15(Albani等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1405-1415页)；Albani，et al.，(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62(Albani等人，1999年，《理论与应用遗传学》，第98卷，第1253-1262页)；Albani，et al.，(1993)Plant J.4：343-55(Albani等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第343-355页)；Mena，et al.，(1998)ThePlant Journal116：53-62(Mena等人，1998年，《植物杂志》，第116卷，第53-62页)(大麦DOF)；Opsahl-Ferstad，et al.，(1997)Plant J12：235-46(Opsahl-Ferstad等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第235-246页)(玉蜀黍Esr)和Wu，et al.，(1998)Plant Cell Physiology39：885-889(Wu等人，1998年，《植物细胞生理学》，第39卷，第885-889页)(水稻GluA-3、GluB-1、NRP33、RAG-1)。
诱导型调控元件是能够响应诱导物而直接或者间接激活一个或者多个DNA序列或者基因的转录的调控元件。诱导物可以是化学剂诸如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或者酚类化合物，或生理胁迫(诸如通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加的，或通过病原体或病害物诸如病毒的作用间接施加的)，或其他生物制剂或物理因素或环境条件。可通过以下方式使含有可诱导调控元件的植物细胞暴露于诱导物：通过将该诱导物例如通过喷雾、喷淋、加热或类似方法而外施于该细胞或者植物。用于诱导来自诱导型启动子的表达的诱导剂基于特定的诱导型调控元件进行选择。响应于在诱导剂下暴露，来自诱导型调控元件的转录通常被从头引发或增加超过基础或组成表达水平。通常特异性结合到诱导型调控元件以激活转录的蛋白质因子以失活形式存在，然后其由诱导物直接或间接转化为活性形式。任何诱导型启动子均可用于本发明(参见，Ward，et al.，(1993)PlantMol.Biol.22：361-366(Ward等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页))。
诱导型调控元件的例子包括金属硫蛋白调控元件、铜诱导型调控元件或四环素诱导型调控元件，来自所述调控元件的转录可分别响应于二价金属离子、铜或四环素而实现(Furst，et al.，(1988)Cell55：705-717(Furst等人，1988年，《细胞》，第55卷，第705-717页)；Mett，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页)；Gatz，et al.，(1992)Plant J.2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；Roder，et al.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Roder等人，1994年，《分子遗传学和基因组学》，第243卷，第32-38页))。诱导型调控元件还包括蜕皮激素调控元件或糖皮质类固醇调控元件，来自所述调控元件的转录可响应于蜕皮激素或其他类固醇而实现(Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；美国专利No.6,504,082)；冷响应调控元件或热休克调控元件，所述调控元件的转录可响应于分别暴露在冷或热下而实现(Takahashi，et al.，(1992)Plant Physiol.99：383-390(Takahashi等人，1992年，《植物生理学》，第99卷，第383-390页))；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach，et al.，(1982)PNAS USA79：2981-2985(Gerlach等人，1982年，《美国国家科学院院刊》，第79卷，第2981-2985页)；Walker，et al.，(1987)PNAS84(19)：6624-6628(Walker等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第19期，第6624-6628页))，可无氧条件诱导；以及源于豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导型启动子(Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页))；光诱导型调控元件(Feinbaum，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.226：449(Feinbaum等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第226卷，第449页)；Lam and Chua，(1990)Science248：471(Lam和Chua，1990年，《科学》，第248卷，第471页)；Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；Orozco，et al.，.(1993)Plant Mol.Bio.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页))，植物激素诱导型调控元件(Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：905(Yamaguchi-Shinozaki等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第905页)；Kares，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：225(Kares等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第225页))等等。诱导型调控元件还可为玉蜀黍In2-1或In2-2基因的启动子，其对应于苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey，et al.，(1991)Mol.Gen.Gene.227：229-237(Hershey等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页)；Gatz，et al.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Gatz等人，1994年，《分子遗传学和基因组学》，第243卷，第32-38页))和转座子Tn10的Tet阻遏子(Gatz，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页))。胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫-诱导型启动子，诸如P5CS(Zang，et al.，(1997)Plant Sciences129：81-89(Zang等人，1997年，《植物科学》，第129卷，第81-89页))；冷-诱导型启动子，诸如cor15a(Hajela，et al.，(1990)Plant Physiol.93：1246-1252(Hajela等人，1990年，《植物生理学》，第93卷，第1246-1252页))、cor15b(Wlihelm，et al.，(1993)Plant Mol Biol23：1073-1077(Wlihelm等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1073-1077页))、wsc120(Ouellet，et al.，(1998)FEBS Lett.423：324-328(Ouellet等人，1998年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第423卷，第324-328页))、ci7(Kirch，et al.，(1997)Plant Mol Biol.33：897-909(Kirch等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第897-909页))、ci21A(Schneider，et al.，(1997)Plant Physiol.113：335-45(Schneider等人，1997年，《植物生理学》，第113卷，第335-345页))；干旱-诱导型启动子，诸如Trg-31(Chaudhary，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.30：1247-57(Chaudhary等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第1247-1257页))、rd29(Kasuga，et al.，(1999)Nature Biotechnology18：287-291(Kasuga等人，1999年，《自然生物技术》，第18卷，第287-291页))；渗透诱导型启动子，诸如Rab17(Vilardell，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.17：985-93(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-993页))和渗透蛋白(Raghothama，et al.，(1993)Plant Mol Biol23：1117-28(Raghothama等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1117-1128页))和热诱导型启动子，诸如热休克蛋白(Barros，et al.，(1992)Plant Mol.19：665-75(Barros等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第665-675页)；Marrs，et al.，(1993)Dev.Genet.14：27-41(Marrs等人，1993年，《发育遗传学》，第14卷，第27-41页))、smHSP(Waters，et al.，(1996)J.Experimental Botany47：325-338(Waters等人，1996年，《实验植物学杂志》，第47卷，第325-338页))和来自欧芹遍在蛋白启动子的热休克诱导型元件(WO 03/102198)。其他胁迫-诱导型启动子包括rip2(美国专利No.5,332,808和美国专利申请公布No.2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1993)Mol.Gen.Genetics236：331-340(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993年，《分子遗传学和基因组学》，第236卷，第331-340页))。某些启动子通过创伤诱导，包括农杆菌pmas启动子(Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页))和农杆菌ORF13启动子(Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页))。
在植物细胞中活跃并且可用于本发明的方法或组合物的另外的调控元件包括，例如，菠菜亚硝酸盐还原酶基因调控元件(Back，et al.，(1991)Plant Mol.Biol.17：9(Back等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第9页))；γ玉米醇溶蛋白启动子、油质蛋白ole16启动子、球蛋白I启动子、肌动蛋白I启动子、肌动蛋白cl启动子、蔗糖合成酶启动子、INOPS启动子、EXM5启动子、球蛋白2启动子、b-32、ADPG-焦磷酸化酶启动子、LtpI启动子、Ltp2启动子、油质蛋白ole17启动子、油质蛋白ole18启动子、肌动蛋白2启动子、花粉特异性蛋白启动子、花粉特异性果胶裂解酶基因启动子或PG47基因启动子、花粉囊特异性RTS2基因启动子、SGB6基因启动子、或G9基因启动子、绒毡层特异性RAB24基因启动子、邻氨基苯甲酸合酶α亚基启动子、α玉米醇溶蛋白启动子、邻氨基苯甲酸合酶β亚基启动子、二氢吡啶二羧酸合酶启动子、Thi 1启动子、醇脱氢酶启动子、cab结合蛋白启动子、H3C4启动子、RUBISCO SS淀粉分支酶启动子、肌动蛋白3启动子、肌动蛋白7启动子、调节蛋白GF14-12启动子、核糖体蛋白L9启动子、纤维素生物合成酶启动子、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、过氧化物歧化酶启动子、C-激酶受体启动子、磷酸甘油酸变位酶启动子、根特异性RCc3mRNA启动子、葡萄糖-6磷酸异构酶启动子、焦磷酸-果糖6-磷酸-1-磷酸转移酶启动子、β-酮乙基-ACP合酶启动子、33kDa光合体系11启动子、含氧蛋白质启动子、69kDa空泡ATP酶亚基启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、ABA-和成熟-诱导样蛋白启动子、苯丙氨酸解氨酶启动子、三磷酸腺苷酶S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶启动子、查尔酮合酶启动子、玉米醇溶蛋白启动子、球蛋白-1启动子、生长素结合蛋白启动子、UDP葡萄糖类黄酮糖基-转移酶基因启动子、NTI启动子、肌动蛋白启动子和opaque2启动子。
适合本发明目的的植物可为单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉蜀黍、小麦、大麦、裸麦、甘薯、大豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁甘蓝、小红萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、夏南瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、桃子、蜜桃、杏子、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥和木本植物诸如针叶树和落叶树，达到雄性育性的改变视情况得到增加的营养物质利用率或谷粒产量的程度。
纯合性为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。杂合性为当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。半合子状态为当仅存在基因(或基因组)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时存在的遗传条件。
本文所用的植物育种方法是本领域技术人员公知的。对于植物育种技术的讨论参见Poehlman，(1987)Breeding Field Crops AVI Publication Co.，Westport Conn(Poehlman，1987年，《大田作物育种》，AVI出版公司，美国康涅狄格州韦斯特波特)。许多在本方法中可能是最优选的植物均通过利用植物授粉方法的技术育种。
可使用回交方法将基因引入植物。该技术已使用了数十年以将性状引入植物。描述该技术的例子以及人们所熟知的其他植物育种方法可在如下参考文献中找到，例如Plant Breeding Methodology，edit.Neal Jensen，JohnWiley&Sons，Inc.(1988)(《植物育种方法》，Neal Jensen编辑，约翰·威利父子出版公司，1988年)。在典型的回交方案中，原始目的品种(回交亲本)与携带待转移的单个目的基因的第二品种(非回交亲本)杂交。然后将这次杂交所得的子代再次与回交亲本杂交，并且重复该过程直至获得植株，其中除了来自非回交亲本的单个转移基因之外，回交亲本的基本所有所需形态和生理特性都在该转换的植株上恢复。
转基因是指通过基因工程技术被引入细胞的基因组的任何核酸序列。转基因可为天然DNA序列或异源DNA序列(即，“外来DNA”)。术语天然DNA序列是指天然存在于细胞中但可能已由其原始形式进行了修饰的核苷酸序列。
本文所述的某些构建体包含干扰雄性配子的形成、功能或传播的元件。通过举例但非限制的方式，其可包括使用这样的基因：表达对雄性配子具有细胞毒性的产物(参见例如美国专利No.5,792,853、5,689,049、PCT/EP89/00495)；抑制对雄性配子的功能或形成重要的另一个基因的产物形成(参见美国专利No.5,859,341、6,297,426)；与另一个基因产物结合以产生防止基因的形成或功能的物质(参见美国专利No.6,162,964、6,013,859、6,281,348、6,399,856、6,248,935、6,750,868、5,792,853)；与对雄性配子的功能或形成至关重要的基因反义或引起共抑制(参见美国专利No.6,184,439、5,728,926、6,191,343、5,728,558、5,741,684)；通过使用发夹式形成物干扰表达(Smith，et al.，(2000)Nature407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)、WO 1999/53050和WO 1998/53083)等等。抑制花粉的形成或功能的许多核苷酸序列是已知的，并且实现该功能的任何序列都是满足条件的。可影响适当的发育或功能的基因的讨论包括在美国专利No.6,399,856中，并且其包括显性负基因诸如细胞毒素基因、甲基化酶基因和生长抑制基因。显性负基因包括白喉毒素A链基因(Czako and An，(1991)Plant Physiol.95：687-692(Czako和An，1991年，《植物生理学》，第95卷，第687-692页)和Greenfield，etal.，(1983)PNAS80：6853(Greenfield等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第6853页)，Palmiter，et al.，(1987)Cell50：435(Palmiter等人，1987年，《细胞》，第50卷，第435页))；细胞周期分裂突变体诸如玉蜀黍中的CDC(Colasanti，et al.，(1991)PNAS88：3377-3381(Colasanti等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第3377-3381页))；WT基因(Farmer，et al.，(1994)Hum.Mol.Genet.3：723-728(Farmer等人，1994年，《人类分子遗传学》，第3卷，第723-728页))和P68(Chen，et al.，(1991)PNAS88：315-319(Chen等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第315-319页))。
所谓的“细胞毒性”基因的另外的例子如上所述，并且可包括但不限于来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthermi)的果胶裂解酶基因pelE(Kenn，etal.，(1986)J.Bacteroil168：595(Kenn等人，1986年，《细菌学杂志》，第168卷，第595页))；来自cms-T玉蜀黍线粒体基因组的T-urf13基因(Braun，et al.，(1990)Plant Cell2：153(Braun等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第153页)；Dewey，et al.，(1987)PNAS84：5374(Dewey等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5374页))；引起细胞膜破坏的来自苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensisIsraeliensis)的CytA毒素基因(McLean，et al.，(1987)J.Bacteriol169：1017(McLean等人，1987年，《细菌学杂志》，第169卷，第1017页)，美国专利No.4,918,006))；DNA酶、RNA酶(美国专利No.5,633,441)；蛋白酶或表达反义RNA的基因。合适的基因还可编码涉及抑制雌蕊发育、花粉和柱头的相互作用、花粉管生长或受精或它们的组合的蛋白质。此外，干扰淀粉在花粉中的正常积聚或影响花粉内的渗透平衡的基因也可能是合适的。这些基因可包括例如玉蜀黍α-淀粉酶基因、玉蜀黍β-淀粉酶基因、脱支酶基因诸如Sugary1和支链淀粉酶基因、葡聚糖酶基因和SacB。
在图示实施例中，使用DAM-甲基化酶基因，其在上文以及美国专利No.5,792,852和5,689,049中有所讨论，其表达产物催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化。在另一个实施例中，可与雄性组织优选的启动子一起使用α-淀粉酶基因。在谷类种子的初始萌发期期间，糊粉层细胞将会合成α-淀粉酶，其参与水解淀粉以形成葡萄糖和麦芽糖，从而提供胚芽生长所需要的营养物质(Rogers and Milliman，(1984)J.Biol.Chem.259(19)：12234-12240(Rogers和Milliman，1984年，《生物化学杂志》，第259卷，第19期，第12234-12240页)；Rogers，(1985)J.Biol.Chem.260：3731-3738(Rogers，1985年，《生物化学杂志》，第260卷，第3731-3738页))。在一个实施例中，所用的α-淀粉酶基因可为玉米α-淀粉酶-1基因。参见例如Young，et al.，Plant Physiol.105(2)：759-760(Young等人，《植物生理学》，第105卷，第2期，第759-760页)和GenBank登录号L25805，GI：426481。还参见美国专利8,013,218。编码α-淀粉酶的序列通常不存在于花粉细胞中，并且当表达涉及雄性组织时，结果是用于花粉粒的能量源被分解并且花粉功能受抑制。
本领域中的技术人员易于理解，本文所述的方法尤其适用于具有远交的可能性的任何其他作物。通过举例但非限制的方式，其可包括玉蜀黍、大豆、高粱或具有远交能力的任何植物。
本发明设想使用提供组织优选的表达的启动子，包括优先地对植物的雄性或雌性配子组织表达的启动子。本发明不需要任何特定配子组织优选的启动子用于该过程，并且可使用本领域中的技术人员已知的许多此类启动子中的任一者。通过举例但非限制的方式，一个此类启动子为5126启动子，其优先地将其连接至的基因的表达引导向植物的雄性组织，如在美国专利No.5,837,851和5,689,051中所述。其他例子包括美国专利No.6,037,523中所述的MS45启动子、美国专利No.6,452,069中所述的SF3启动子、WO 2002/063021中所述的BS92-7或BS7启动子、WO 2002/26789中所述的SBMu200启动子、美国专利No.5,470,359中所述的SGB6调控元件和TA39(Koltunow，et al.，(1990)Plant Cell2：1201-1224(Koltunow等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1201-1224页)；Goldberg，et al.，(1993)Plant Cell5：1217-1229(Goldberg等人，1993年，《植物细胞》，第5卷，第1217-1229页)和美国专利No.6,399,856)。另外参见Nadeau，etal.，(1996)Plant Cell8(2)：213-39(Nadeau等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第2期，第213-239页)和Lu，et al.，(1996)Plant Cell8(12)：2155-68(Lu等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第12期，第2155-2168页)。
优选地，植物包括玉蜀黍、大豆、向日葵、红花、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、苜蓿和高粱。
整个启动子序列或其一部分可用作能够与对应的启动子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸，并且最优选地长为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过熟知的聚合酶链反应(PCR)的过程来扩增来自所选的生物体的对应启动子序列。该技术可用于从所需的生物体分离另外的启动子序列，或用作诊断分析以确定启动子序列在生物体中的存在。例子包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落；参见例如Innis，et al.，(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，eds.，AcademicPress(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社))。
一般来讲，对应于本发明的启动子序列并且与本文公开的启动子序列杂交的序列将与所公开的序列具有至少50％同源性、55％同源性、60％同源性、65％同源性、70％同源性、75％同源性、80％同源性、85％同源性、90％同源性、95％同源性和甚至98％同源性或更多。
可操作本文所公开的具体启动子序列的片段以促进可操作地连接的分离的核苷酸序列的花粉优选的表达。这些片段将包含本文所公开的具体启动子核苷酸序列的至少约20个连续核苷酸、优选地至少约50个连续核苷酸、更优选地至少约75个连续核苷酸、甚至更优选地至少约100个连续核苷酸。这类片段的核苷酸将通常包含该具体启动子序列的TATA识别序列。这类片段可通过使用限制性内切酶切割本文所公开的天然启动子序列来获得；通过合成来自天然DNA序列的核苷酸序列来获得；或者通过使用PCR技术来获得。具体参见Mullis，et al.，(1987)Methods Enzymol.155：335-350(Mullis等人，1987年，《酶学方法》，第155卷，第335-350页)和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press，New York)(Erlich编辑，1989年，《PCR技术》，美国纽约斯托克顿出版社))。此外，这些片段的变体，诸如得自定点诱变的那些，都涵盖在本发明的组合物中。
因此，涵盖包含下列示出的序列的至少约20个连续核苷酸的核苷酸序列：SEQ ID NO：64-106、134-137、142、144、149、150。这些序列可通过杂交、PCR等等分离。此类序列涵盖能够驱动花粉优选的表达的片段、用作鉴别类似序列的探针的片段，以及负责时间特异性或组织特异性的元件。
启动子序列的生物活性变体也涵盖在本发明的组合物中。调控“变体”是其中已经修饰、移除或添加一个或多个碱基的启动子的修饰形式。例如，移除DNA序列的一部分的常规方法为结合DNA扩增使用核酸外切酶以生成双链DNA克隆的单向嵌套缺失。用于该目的的商业试剂盒以商品名Exo-SizeTM(美国马萨诸塞州贝弗利的新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.))销售。简单地说，该程序需要与DNA一起温育核酸外切酶III，以在3′至5′方向上在DNA模板的5′突出端、钝端或切口处逐步移除核苷酸。然而，核酸外切酶III不能移除3′，4-碱基突出端的核苷酸。用该酶定时的克隆的消化产生单向嵌套缺失。
调控序列变体的一个例子是通过在较大启动子中引起一个或多个缺失形成的启动子。可实现达到转录起始位点附近的TATA盒的启动子的5′部分的缺失，而不会消除启动子活性，如Zhu，et al.，(1995)The Plant Cell7：1681-89(Zhu等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第1681-1689页)所述。此类变体应保持启动子活性，特别是驱动在特定组织中表达的能力。生物活性变体包括例如本发明的具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的天然调控序列。可通过RNA印迹分析测量活性，当使用转录融合体时测量报告基因活性等等。参见例如Sambrook，et al.，(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual(2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.)(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，美国纽约冷泉港)，其以引用方式并入本文。
本发明中公开的花粉优选的启动子的核苷酸序列及其变体和片段在与分离的核苷酸序列可操作地连接时可用于任何植物的遗传操纵，所述分离的核苷酸序列的表达将受控制以实现所需的表型响应。
雄性育性的调控通常根据其对各个细胞的影响来测量。例如，需要抑制99.99％的花粉粒以实现对于商业用途而言可靠的不育。然而，在较低的严格性下可实现成功抑制或恢复其他性状的表达。例如，在特定组织内98％、95％、90％、80％或更少细胞中的表达可产生所需的表型。另外，为了修改同化物分配和/或减少雄性和雌性生殖结构之间对氮的竞争，将雄性育性抑制50％或甚至更少可能是有效且所需的。
实例
实例1：Ms44分离和表征
显性雄性不育基因Ms44通过W23玉蜀黍品系的基于种子的EMS诱变处理而出现，并且被认为是紧密连接至4号染色体上的C2基因座(Linkage between Ms44and C2，Albertsen and Trimnell，(1992).MNL66：49(Ms44和C2之间的连接，Albertsen和Trimnell，1992年，《医疗营养实验室》，第66卷，第49页))。采用图位克隆方法来鉴别Ms44基因。使用414个个体的初始群体来将Ms44粗略定位至4号染色体。使用另外的2686个个体的群体来精细作图。标记实验室基因分型使突变的区域缩小至4号染色体上的0.43cm间隔。
使用39个重组体开发另外的标记以用于精细作图。Ms44突变被定位至由序列AZM5_9212(5个重组体)和AZM5_2221(2个重组体)制成的标记之间的约80kb区域。
引物AZM5_9212For4(SEQ ID NO：1)和AZM5_9212Rev4(SEQ IDNO：2)用于初始轮PCR，然后第二轮PCR使用引物AZM5_9212ForNest4(SEQ ID NO：3)和AZM5_9212RevNest4(SEQ ID NO：4)。用MspI消化PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
引物AZM5_2221For3(SEQ ID NO：5)和AZM5_2221Rev3(SEQ IDNO：6)用于初始轮PCR，然后第二轮PCR使用引物AZM5_2221ForNest3(SEQ ID NO：7)和AZM5_2221RevNest3(SEQ ID NO：8)。用BsgI消化PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
在约80kb Ms44间隔内，在BAC之间存在测序空位。对空位测序，并且在该区域内鉴别基因pco641570。第一Met密码子存在于核苷酸1201处，其中101bp内含子在核苷酸1505-1605处并且终止密码子终止于核苷酸1613(SEQ ID NO：9)。该基因具有312bp的开放阅读框，其对104个氨基酸(包含终止密码子)(SEQ ID NO：10)的预定蛋白质编码。预测蛋白质与多种蛋白质具有同源性，并且包含InterProscan登录结构域IPR003612，其是存在于植物脂质转移蛋白/种子贮藏/胰蛋白酶-α淀粉酶抑制剂中的结构域。使用SigCleave分析在氨基酸23处预测分泌信号序列(SSS)切割位点。(von Heijne，G.“A new method for predicting signal sequence cleavagesites”Nucleic Acids Res.：14：4683(1986)(von Heijne，G.，“预测信号序列切割位点的新方法”，《核酸研究》，第14卷，第4683页，1986年)。Improved prediction of signal peptides：SignalP3.0.，Bendtsen JD，Nielsen H，von Heijne G，Brunak S.，J Mol Biol.2004Jul 16；340(4)：783-95(改善的信号肽的预测：SignalP3.0.，Bendtsen JD、Nielsen H、von Heijne G、BrunakS，《分子生物学杂志》，2004年7月16日，第340卷，第4期，第783-795页)。Von Heijne，G.“Sequence Analysis in Molecular Biology：TreasureTrove or Trivial Pursuit”Acad.Press(1987)113-117(Von Heijne，G.，“分子生物学中的序列分析：埋藏或追根究底”，学术出版社，1987年，第113-117页)。还参见在线应用的EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件包(European Molecular Biology Open Software Site))程序包中的SIGCLEAVE程序)。
然而，ms44直系同源基因在相关的单子叶物种中的SigCleave分析表明在氨基酸37和38之间存在另一个潜在的切割位点。该蛋白质富含半胱氨酸，并且BlastP分析表明与植物花粉囊或绒毡层特异性基因诸如Lims或A9基因的最高同源性。(The characterization of tapetum-specific cDNAsisolated from a Lilium henryi L.meiocyte subtractive cDNA library.Crossley，etal.，(1995)Planta.196(3)：523-529(从麝香百合性母细胞消减cDNA文库中分离的绒毡层特异性cDNA的表征，Crossley等人，1995年，《植物》，第196卷，第3期，第523-529页)。The isolation and characterization of thetapetum-specific Arabidopsis thaliana A9gene.Paul，et al.，(1992)Plant MolBiol.19(4)：611-22(绒毡层特异性拟南芥A9基因的分离和表征，Paul等人，1992年，《植物分子生物学》，第19卷，第4期，第611-622页))。
对正在发育的花粉囊和叶cDNA进行RT-PCR分析以评估ms44基因的表达。Ms44特异性引物pco641570-5’(SEQ ID NO：11)和pco641570-3’-2(SEQ ID NO：12)用于RT-PCR反应，其中cDNA模板来自0.5mm、1.0mm、1.5mm和2.0mm的花粉囊、花粉母细胞(PMC)处的花粉囊、四分孢子、小孢子/花粉发育和叶的早期单核和双核阶段。也使用基因组DNA作为模板。ms44的表达早期开始于PMC阶段，并且继续通过四分孢子和早期成核小孢子阶段，但是到花粉发育的双核阶段时不存在。在叶中未检测到表达。
pco641570基因从Ms44突变体中测序。第一Met密码子存在于核苷酸1222处，其中101bp内含子在核苷酸1526-1626处并且终止密码子终止于核苷酸1634(SEQ ID NO：13)。序列分析表明了核苷酸变化，其导致从丙氨酸至预测蛋白质中的氨基酸37处的苏氨酸残基的翻译变化(SEQ ID NO：14)。该核苷酸变化还在突变体等位基因中形成未存在于野生型中的BsmF1限制位点，其能够通过以下方式区分两个等位基因：通过PCR扩增两个Ms44等位基因，并随后通过BsmF1消化产物。
MsD-2629是存在于玉蜀黍中的另一个显性雄性不育突变体，并且还通过EMS诱变产生。该突变体定位至并发现位于4号染色体上非常靠近Ms44基因。为了确定MsD-2629是否为Ms44的等位基因，将Ms44基因进行PCR扩增并从MsD-2629雄性不育植物中测序。通过测序发现两种不同的等位基因。一种为野生型等位基因，并且第二等位基因具有单个核苷酸变化(SEQ ID NO：152)，其导致从相同的丙氨酸残基如Ms44至预测蛋白质中的氨基酸37处的缬氨酸的翻译变化(SEQ ID NO：153)。该等位基因存在于所有测试的MsD-2629雄性不育植物中，并且不存在于雄性可育姊妹体中。MsD-2629突变体表示第二Ms44等位基因，并称为Ms44-2629。
两个Ms44突变体均影响位置37处的相同丙氨酸残基，并且该氨基酸通过SignalCleave分析涉及成为可能的-1SS切割位点，进行体外转录/翻译(TnT)反应(EasyXpress Insect Kit II，凯杰公司(Qiagen)，目录号32561)以评估Ms44蛋白质变体的切割，所述变体基于SS切割位点周围氨基酸的保守性已经用各种氨基酸置换进行工程改造(Patterns of Amino Acids nearSignal-Sequence Cleavage Sites.Gunnar Von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133，17-21(信号序列切割位点附近的氨基酸模式，Gunnar Von Heijne，1983年，《欧洲生物化学杂志》，第133卷，第17-21页))。体外TnT分析表明野生型ms44蛋白质(-1Ala)被加工成较小的成熟形式，而突变体Ms44(-1Thr)并非如此。Ms44-2629蛋白质(-1Val)未加工，+1Pro也未加工，但对照-1Gly蛋白质正常加工(图16)。该结果确定了SS切割位点在氨基酸37和38之间。
为了确定该突变负责显性雄性不育表型，为该等位基因克隆基因组区域，包含大约1.2Kb上游序列(推定启动子)和约0.75KB终止密码子下游的序列。将该基因组序列亚克隆进入转化载体，并称为PHP42163。载体用于通过农杆菌介导的转化来转化玉蜀黍植物。36个T0植株生长成熟，并且针对花粉的存在或不存在对穗丝进行表型分型。36个植株中的34个为完全雄性不育的。使用PCR反应中的引物pco641570-5’(SEQ ID NO：11)和pco641570-3’-2(SEQ ID NO：12)对来自这些转基因植物的DNA进行基因分型，然后用BsmF1消化，并在1％琼脂糖凝胶上运行。所有34个雄性不育植株均包含突变体Ms44等位基因，如通过BsmF1消化产生的两个较小的带的存在所证实的那样。通过基因分型发现剩余的两个雄性可育植株不包含Ms44等位基因，并且最可能通过在转化过程中在载体中进行一些重排而出现。这确定了Ms44等位基因中的单个核苷酸变化导致显性雄性不育表型。
Ms44基因中的点突变改变了丙氨酸至苏氨酸的密码子，其中第二等位基因具有丙氨酸至苏氨酸的变化。提出受影响的氨基酸处于SS切割位点的-1位置，并且两个突变去除了MS44的SS切割，如通过体外TnT分析所示。不受到任何理论的束缚，突变的显性可能是由于通过内质网(ER)的蛋白质加工中的缺陷，而不是由于ms44基因产物作为脂质转移蛋白的功能作用。因为MS44蛋白质富含半胱氨酸，因此ER-系留的Ms44蛋白质可通过二硫键交联，并且抑制雄性育性最终所需的花粉囊中的所有蛋白质加工。
实例2：穗丝优选的启动子鉴别
在转基因学中，人们可将穗丝优选的启动子驱动的负基因或雄性不育突变体的载体与提高营养生长或穗生长的其他载体堆叠。穗丝减少和其他器官的增强的组合可有效地将营养物质转向穗以实现产量增益。
穗丝优选的启动子可用于靶向穗丝中的Tls1基因的沉默，从而敲低或敲除该基因在该组织中的功能。这将减少穗丝的发育，同时穗中的基因功能保持不受显著影响。穗丝优选的启动子的用途并不限于Tls1基因，其可应用于驱动穗丝组织中的任何基因表达，所述穗丝组织递送对组织生长的负面影响，以例如影响花粉囊、花粉或最终干扰雄性育性的任何细胞。穗丝优选的候选启动子基于其天然表达模式进行鉴别、克隆并且在转基因植物中测试以确定其穗丝特异性。
在一个实施例中，穗丝优选的启动子还可用于表达或抑制基因，据此该表达或抑制导致提高的穗丝发育。
实例3：tls1突变体鉴别和表征
描述无穗丝(tls1)突变体并将其定位在1号染色体的长臂上(Albertsen，et al.，(1993)Maize Genetics Newsletter67：51-52(Albertsen等人，1993年，《玉蜀黍遗传学时事通讯》，第67卷，第51-52页))。将通过使纯合tls1植物(背景未知)与Mo17杂交生成的75个个体的小的F2群体基因分型以确定之前鉴别的tls1位置。发现突变位于两个SNP标记MZA5484-22和MZA10765-46之间。这些标记用于筛选2985个个体的较大F2群体中的重组体。选择所有的重组体以用于自花授粉，并且收获177个F3穗。177个F3家系在田地中成排的生长。采用成排的所有个体的表型以确定作为纯合野生型、杂合或纯合tls1的每个F2系。每个F3家系的8个个体的叶圆片合并在一起以进行基因分型。使用这些系确定tls1在标记MZA5484和MZA10765之间，其转变为CAPS标记。
引物MZA5484-F768(SEQ ID NO：28)和MZA5484-R(SEQ ID NO：29)用于扩增MZA5484基因座。用MwoI消化PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
引物MZA10765-F429(SEQ ID NO：30)和MZA10765-R1062(SEQ IDNO：31)用于扩增MZA10765基因座。用BslI消化PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
另外的标记用于用177个F3家系对tsl1突变精细作图。tls1突变最终定位在标记c0375b06 10和c0260e13 35之间。
引物c0375b06_10-For(SEQ ID NO：32)和c0375b16_10-Rev(SEQ IDNO：33)用于扩增c0375b06_10基因座。该反应的PCR产物用作使用引物c0375b06_10-ForNest(SEQ ID NO：34)和c0375b06_10-RevNest(SEQ ID NO：35)的第二反应的模板。用MboII消化该PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
引物c0260e13_35-For(SEQ ID NO：36)和c0260e13_35-Rev(SEQ IDNO：37)用于扩增c0260e13_35基因座。该反应的PCR产物用作使用引物c0260e13_35-ForNest(SEQ ID NO：38)和c0260e13_35-RevNest(SEQ ID NO：39)的第二反应的模板。用HphI消化该PCR产物，并且分析带型以确定该基因座处的基因型。
侧翼标记c0375b06_10和c0260e13_35之间的物理间隔包含大约4个基于B73物理图谱测序的BAC克隆。在该间隔内测序低拷贝区域表明了极低水平的多态性和与tls1表型共分离的极少可用标记。对该间隔中的所有标注的基因进行测序以鉴别致病突变。一个基因，标注为NOD26样整合膜蛋白/水通道蛋白/ZmNIP3-1(下文称为NIP3-1)(SEQ ID NO：62，来自B73的基因组序列；SEQ ID NO：63，来自B73的CDS，SEQ ID NO：107，NIP3-1蛋白质)，不能在纯合tls1个体中扩增，但可在纯合野生型和杂合系中扩增。
引物对c0297o12_75-For(SEQ ID NO：40)和c0297o12_75-Rev(SEQ IDNO：41)、c0297o12_76-For(SEQ ID NO：44)和c0297o12_76-Rev(SEQ IDNO：45)、c0297o12_77-For(SEQ ID NO：48)和c0297o12_77-Rev(SEQ IDNO：49)、c0297o12_78-For(SEQ ID NO：52)和c0297o12_78-Rev(SEQ IDNO：53)用于扩增横跨NIP3-1的基因组区域。这些反应的PCR产物用作使用对应引物对：c0297o12_75-ForNest(SEQ ID NO：42)和c0297o12_75-RevNest(SEQ ID NO：43)、c0297o12_76-ForNest(SEQ ID NO：46)和c0297o12_76-RevNest(SEQ ID NO：47)、c0297o12_77-ForNest(SEQ ID NO：50)和c0297o12_77-RevNest(SEQ ID NO：51)、c0297o12_78-ForNest(SEQID NO：54)和c0297o12_78-RevNest(SEQ ID NO：55)的第二反应的模板。
BAC文库由纯合tls1植物构建以确定突变的性质。对覆盖tls1基因座的BAC克隆进行测序表明与对应于NIP3-1区域的B73参照基因组相比大约6.6kb的缺失。此外，在其位置中存在大约9kb重复序列。因此，tls1表型可能是由于纯合突变型植物中NIP3-1的缺失。
候选基因验证
鉴别在NIP3.1中具有增变基因(Mu)插入的TUSC系以验证候选基因。两个独立的TUSC系put-tls1-P30D5和put-tls1-P177F10通过PCR和测序确定在NIP3-1内具有Mu插入。
NIP3-1特异性引物DO143578(SEQ ID NO：56)、DO143579(SEQ IDNO：57)、DO143584(SEQ ID NO：58)或DO143583(SEQ ID NO：59)与Mu-特异性引物MuExt22D(SEQ ID NO：60)结合使用以扩增NIP3-1和增变基因连接区域。这些反应的PCR产物用作将相同NIP3-1特异性引物与另一种Mu-特异性引物MuInt19(SEQ ID NO：61)结合使用的第二反应的模板。PCR产物在凝胶上运行，主要带被切除，使用凝胶纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))提取DNA并进行测序。测序结果通过BLAST程序处理以确定NIP3-1中的Mu插入。
在NIP3-1中含有Mu插入的上述TUSC系用于等位性测试。对于Mu插入是杂合的TUCS系用于在tls1基因座处对杂合的F3植物授粉。对所得的子代进行表型分型和基因分型。如下所述对植物进行基因分型：
为了确定等位性测试的子代在NIP3-1中包含Mu插入，c0297o12_75-Rev(SEQ ID NO：41)、c0297o12_76-For(SEQ ID NO：44)、c0297o12_76-Rev(SEQ ID NO：45)、c0297o12_77-For(SEQ ID NO：48)、c0297o12_77-Rev(SEQ ID NO：49)、DO143583(SEQ ID NO：59)和DO143584(SEQ IDNO：58)与Mu-特异性引物MuExt22D(SEQ ID NO：60)结合使用。这些反应的PCR产物用作将c0297o12_75-RevNest(SEQ ID NO：43)、c0297o12_76-ForNest(SEQ ID NO：46)、c0297o12_76-RevNest(SEQ ID NO：47)、c0297o12_77-ForNest(SEQ ID NO：50)、c0297o12_77-RevNest(SEQ ID NO：51)、DO143583(SEQ ID NO：59)和DO143584(SEQ ID NO：58)分别与Mu-特异性引物MuInt19(SEQ ID NO：61)结合使用的第二反应的模板。阳性PCR产物表明Mu插入的存在。
为了确定等位性测试的子代是否继承了野生型或参照tls1等位基因，将c0297o12_75-For(SEQ ID NO：40)与c0297o12_75-Rev(SEQ ID NO：41)结合使用并且将c0297o12_77-For(SEQ ID NO：48)与c0297o12_77-Rev(SEQID NO：49)结合使用。这些反应的PCR产物用作分别将c0297o12_75-ForNest(SEQ ID NO：42)和c0297o12_75-RevNest(SEQ ID NO：43)结合使用以及将c0297o12_77-ForNest(SEQ ID NO：50)和c0297o12_77-RevNest(SEQID NO：51)结合使用的第二反应的模板。
将等位性测试的表型分型结果与基因分型结果进行比较。没有Mu插入的个体为野生型。含有Mu插入的个体中，含有NIP3-1的野生型等位基因的那些具有野生型表型，而具有NIP3-1的突变等位基因的那些最可能具有tls1表型。极少的畸变是由tsl1表型的不完全外显造成的，所述tsl1表型已在tls1突变体的初始描述(MNL67：51-52(《医疗营养实验室》，第67卷，第51-52页))和当前研究中观察到。
实例4：低氮籽苗测定方案
利用种子颜色标记将转基因植物产生的种子分成转基因种子(杂合种子)和无效种子。对每一区组54盆(以6行9列布置)作两种不同的随机处理分配，对全部处理采用9次重复。在一种情况下，将相同构建体的5个事件的无效种子混合并用作对照，用于该区组中5个阳性事件的对比，从而在每个区组中构成6个处理组合。在第二种情况下，将3种转基因阳性处理和它们对应的无效处理随机分配给该区组的54个盆，从而对每一区组产生6个处理组合，含有所有处理组合的9个重复。在第一种情况下，将转基因参数与批量构建体无效对照进行比较；在第二种情况下，将转基因参数与相应的事件无效对照进行比较。在其中构建体中有10、15或20个事件的情况下，将这些事件分配成5个事件一组，对每一区组54盆计算方差，但在进行平均值比较前将各区组的区组无效平均值汇集起来。
将每种处理的两粒种子在8英寸错列中心台上的装有-MVP的4英寸见方的盆中种植，每天用含有如下营养物质的溶液浇四次水：
出苗后，将植物稀疏至每盆一粒种子。处理按常规在周一栽培，在随后的周五萌发，在栽培18天后收获。收获后，从盆移取植物，将从根洗掉。将根从苗分离，置于纸袋中并在70℃下干燥70小时。将干燥的植物部分(根和苗)称重并置于带有大约20个5/32英寸的钢球的50ml锥形管中，并通过在涂料振荡器中振荡进行研磨。将大约30mg经研磨的组织(记录重量以在后面作调整)在2ml的20％H2O2和6M H2SO4中在170℃下水解30分钟。冷却后，将水添加至20ml，充分混合，移出50μL的等分试样并添加至950μL1M Na2CO3。通过将100μl该溶液置于96孔板的各个孔中然后添加50μl OPA溶液，将该溶液中的氨用于估计总还原植物氮。测定荧光(激发＝360nM/发射＝530nM)并将其与溶解于类似溶液并用OPA溶液处理的NH4Cl标准品比较。
OPA溶液-5μl巯基乙醇+1ml OPA母液(每天新鲜制备)OPA母液-溶解于1.5ml甲醇中的50mg邻苯二甲醛(OPA-Sigma#P0657)+4.4ml1M硼酸盐缓冲液pH9.5(50ml水中3.09g H3BO4+1g NaOH)+0.55ml20％SDS(每天新鲜制备)
使用这些数据，测量如下参数并利用Student t检验将平均值与无效对照参数平均值相比较：
总植物生物量
根生物量
苗生物量
根/苗比率
植物氮浓度
总植物氮
采用最近邻计算法以及通过采用完全随机设计(CRD)模型的方差分析，计算每个区组内的方差。通过将总体区组处理均方除以总体区组误差均方，利用F统计计算每个区组的总体处理效应。
实例5：氮限制条件下Gaspe Bay Flint衍生的玉蜀黍品系的筛选
转基因植物将含有两或三剂量的带一剂量的GS3的Gaspe Flint-3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)并将对显性转基因1∶1分离。将植物栽培于(一种商业盆栽培养基)并每天用1mM KNO3生长培养基和用2mM KNO3或更高浓度的生长培养基每天浇水四次。在1mMKNO3培养基中生长的对照植物将较不绿，产生较少生物量并且在花期具有较小的穗。对结果的统计显著性进行了分析。
在与转基因无效对照相比时，转基因的表达将导致植物在1mM KNO3中具有改善的植物生长。因而将对生长期间的生物量和绿度进行监测并与转基因无效对照进行比较。花期时的生长、绿度和穗大小的改善将指示氮利用效率的增加。
实例6：用于确定玉蜀黍的根构型的改变的测定法
测定转基因玉米植物在籽苗阶段、花期或成熟期时根构型的变化。用于测量玉蜀黍植物的根构型的改变的测定法包括但不限于下面列出的方法。为了便于对根构型改变的人工或自动测定，可将玉米植物栽培于透明盆中。
1)根质量(干重)将植物栽培于中，为一种便于使根容易分开的生长培养基。将烘箱干燥的苗和根组织称重并计算根/苗比率。
2)侧根分支的水平通过对整个根系进行二次抽样，用平板扫描仪或数字相机成像并用WinRHIZOTM软件(Regent Instruments Inc.)分析，确定侧根分支的程度(例如侧根数量、侧根长度)。
3)根带宽度测量根带为随植物成熟而在温室盆的底部形成的根的带或群体。在成熟期测量根带的毫米厚度作为对根质量的粗略估计值。
4)节根计数在将根从支持培养基(例如盆栽混合物(potting mix))分离后，可测定脱离较高节位的冠根的数目。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节根和节根分支量进行的数字分析，构成对上述人工方法的另一个扩充。
将所取得的关于根表型的所有数据进行统计分析，通常是t检验，以将转基因根与非转基因姊妹植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体参与该分析的情形中，还可使用单因素方差分析。
实例7：植物生长的NUE分析
将哥伦比亚生态型拟南芥(对照和转基因系)的种子进行表面消毒(Sanchez等人，2002)，然后接种于含有0.8％(w/v)BactoTM-Agar(Difco)的Murashige和Skoog(MS)培养基上。将平板在4℃下在黑暗中温育3天以打破休眠(积层)，随后转移至20℃温度下处于16小时光照/8小时黑暗周期的生长室(加拿大曼尼托巴康威恩公司(Conviron，Manitoba，Canada))。平均光强度为120μE/m2/s。将籽苗培育12天，然后转移至装土壤的盆。将盆栽的植株如上所述在生长室中在各个1.5英寸盆(拟南芥系统；美国德克萨斯州朗德罗克的Lehle Seeds公司(Lehle Seeds，Round Rock，TX，USA))中在无营养物的土壤LB2200(美国俄亥俄州马里斯维尔的Scott’s Sierra Horticultural Products公司(Scott’s Sierra Horticultural Products，Marysville，OH，USA))上生长。给植物浇注基于Murashige和Skoog(无氮MS)培养基的营养溶液中的0.6或6.5mM硝酸钾。相对湿度保持在70％左右。16-18天后，收集植株苗进行生物量和SPAD读数的评价。
实例8：农杆菌介导的向玉蜀黍中的转化
可转化玉蜀黍植物来过量表达目的的核酸序列以便检验所得的表型。
农杆菌介导的玉蜀黍的转化基本上如Zhao，et al.，(2006)Meth Mol.Biol.318：315-323(Zhao等人，2006年，《分子生物学方法》，第318卷，第315-323页)中所述来进行(还参见Zhao，et al.，(2001)Mol.Breed.8：323-333(Zhao等人，2001年，《分子育种》，第8卷，第323-333页)和1999年11月9日发布的美国专利No.5,981,840，其以引用方式并入本文)。转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。
1.未成熟胚制备
从颖果解剖出未成熟胚并置于含有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。
2.胚的农杆菌感染和共培养
2.1感染步骤
用1mL微量移液器移除PHI-A培养基并添加1mL农杆菌悬浮液。将管轻轻地倒转进行混合。将混合物在室温下温育5分钟。
2.2共培养步骤
用1mL微量移液器从感染步骤移除农杆菌悬浮液。使用无菌刮刀，将胚从管刮脱并转移至100×15mm培养皿中的PHI-B培养基平板。将胚以胚轴向下定向在培养基的表面上。将带有胚的平板在黑暗中20℃下培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。对于标准双元载体，提供有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对回收稳定的转基因事件是关键的。
3.推定的转基因事件的选择
向100×15mm培养皿中的每个PHI-D培养基板转移10个胚，保持取向，用将培养皿密封。将各平板在黑暗中在28℃下温育。活跃生长的推定事件预计在6-8周可见，为浅黄色胚性组织。不产生事件的胚可能是褐色的并且坏死，极少看到脆性组织生长。取决于生长速率，以2-3周的间隔将推定的转基因胚性组织分培至新鲜的PHI-D平板。记录事件。
4.T0植株的再生
将在PHI-D培养基上繁殖的胚性组织分培至PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)；在100×25mm培养皿中并在黑暗中在28℃下温育，直到体细胞胚成熟，持续约10-18天。将具有明确盾片和胚芽鞘的单独的成熟体细胞胚转移至PHI-F胚萌发培养基并在光照(约80μE，来自冷白色荧光灯或等同的荧光灯)下于28℃下温育。在7-10天后，将再生的植株(约10cm高)盆栽于园艺混合物(horticultural mix)中并用标准的园艺方法使之茁壮。
用于植物转化的培养基
1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。在使用前添加100μM乙酰丁香酮，过滤灭菌。
2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并补充有0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌)、3.0g/L100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH5.8。
3.PHI-C：无和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1.5mg/L并补充有8.0g/L琼脂、0.5g/L Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、100mg/L羧苄青霉素(过滤灭菌)。
4.PHI-D：补加3mg/L双丙氨膦的PHI-C(过滤灭菌)。
5.PHI-E：4.3g/L Murashige和Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)、0.5mg/L烟酸、0.1mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、2.0mg/L甘氨酸、0.1g/L肌醇、0.5mg/L玉米素(西格玛公司(Sigma)，目录号Z-0164)、1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)、60g/L蔗糖、3mg/L双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L琼脂，pH5.6。
6.PHI-F：无玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L代替琼脂；pH5.6。
可通过首先将组织簇转移到补加有0.2mg2，4-D/升的N6培养基，从转基因愈伤组织再生出植株。两个星期后，可将组织转移到再生培养基(Fromm，et al.，(1990)Bio/Technology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页))。
可进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。
可分析T1植株的表型变化。使用图象分析，可在植物生长期间多次分析T1植株在植株面积、体积、生长速率和颜色分析方面的表型变化。可如本文所述测定根构型的改变。
可进行对农学特性的改变的后续分析，以确定含有目的核酸序列的植物在与未进行这种转化的对照(参比)植物比较时是否具有至少一种农学特性的改善。还可在各种环境条件下研究这些改变。
导致根和/或苗生物量显著改变、绿色改善、花期较大穗或较高产量的含有目的核酸序列的表达构建体，将被视为该目的核酸序列在玉蜀黍中起到改变氮利用效率的作用的证据。
实例9：根瘤农杆菌LBA4404的电穿孔
将电穿孔感受态细胞(40μl)，如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523)，在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌低拷贝数质粒复制起点、四环素抗性基因和用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔小槽在冰上冷冻。将电穿孔仪设置调整为2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(美国专利No.7,087,812)亲本DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的、同时仍在冰上的农杆菌细胞混合。将混合物转移到电穿孔杯的底部并在冰上静置1-2分钟。通过按下“Pulse”键两次(理想的是实现4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后将0.5ml2xYT培养基(或SOC培养基)添加至小槽并转移至15ml Falcon管。将细胞在28-30℃、200-250rpm下温育3小时。
将250μL等分试样铺展于#30B(YM+50μg/mL壮观霉素)板上并在28-30℃下温育3天。为增加转化体的数目，可进行以下两个任选的步骤之一：
选项1：用30μL15mg/mL利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这个额外的选择消除了当使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时所观察到的某些污染性菌落。
选项2：该电穿孔重复进行两次，以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴别：
挑选四个独立菌落并划线接种于AB基本培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#12S培养基)以分离单一菌落。将平板在28℃下温育2-3天。
对每一推定的共整合子挑选单个菌落并接种4ml具有50mg/l壮观霉素的#60A。将混合物在振荡下于28℃温育24小时。用Qiagen Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选用PB洗涤。将DNA在30μL中洗脱。将2μL等分试样用于如上所述对20μL的DH10b+20μL的dd H2O进行电穿孔。
任选地，可将15μL等分试样用于转化75-100μL InvitrogenTM LibraryEfficiency DH5α。将细胞铺展于LB培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#34T培养基)上，并在37℃下温育过夜。
对每种推定的共整合子挑选三至四个独立的菌落并接种4ml具有50μg/ml壮观霉素的2xYT(#60A)。将细胞在振荡下在37℃下温育过夜。
用Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选进行PB洗涤(在50μl中洗脱)，并将8μl用于SalI消化(将JT亲本和PHP10523用作对照)。
对代表2种具有正确Sall消化模式(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)的推定共整合子的4个质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化。为了比较，建议电子凝胶(electronic gel)。
实例10：用于玉蜀黍转化的粒子介导轰击
可通过粒子轰击将载体转化到胚发生玉蜀黍愈伤组织中，Tomes，et al.，Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，Eds.Gamborg和Phillips编辑，第8章，197-213(1995)(Tomes等人，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，第8章，第197-213页，1995年)中对此作了总体描述，在下文中也有简述。可通过用缔合DNA质粒的钨粒子轰击胚发生响应性未成熟胚来产生转基因玉蜀黍植株。质粒通常包含选择性标记和未经选择的结构基因、或选择性标记和多核苷酸序列或亚序列等，或者由选择性标记和未经选择的结构基因、或选择性标记和多核苷酸序列或亚序列等组成。
粒子的制备
将15mg钨粒子(General Electric)，0.5至1.8μ，优选1至1.8μ，最优选1μ，添加至2ml浓硝酸。将这个悬浮液在0℃下超声处理20分钟(450型Branson Sonifier，40％输出功率，恒定负载循环)。通过以10000rpm离心(Biofuge)将钨粒子沉淀一分钟，移除上清液。将两毫升无菌蒸馏水添加至沉淀物，并简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。使该悬浮液沉淀，将一毫升无水乙醇添加至该沉淀物并简单进行超声处理以使粒子再次悬浮。用无菌蒸馏水再对粒子进行冲洗、离心沉淀并再悬浮两次，最后将粒子再悬浮于两毫升无菌蒸馏水中。将粒子细分成250μl等分试样并冷冻保存。
粒子-质粒DNA缔合物的制备
将钨粒子的原液在水浴超声波仪(450型Branson Sonifier，20％输出功率，恒定负载循环)中简单进行超声处理，然后将50μl转移至微量离心管。载体通常是同域的(cis)：即选择性标记和目的基因(或其他多核苷酸序列)处于同一质粒上。
将质粒DNA添加至所述粒子，最终的DNA量为0.1至10μg，总体积为10μL，简单进行超声处理。优选地，将10μg(TE缓冲液中1μg/μL)总DNA用来混合DNA和粒子以进行轰击。添加五十微升(50μL)2.5M CaCl2无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。添加二十微升(20μL)0.1M亚精胺无菌水溶液，将混合物短暂超声处理并涡旋。将混合物在室温下温育20分钟，伴随间歇的短暂超声处理。将粒子悬浮液离心并移除上清液。将二百五十微升(250μL)无水乙醇添加至所得沉淀物，然后短暂超声处理。将悬浮液离心沉淀，移除上清液并添加60μl无水乙醇。将悬浮液短暂超声处理，然后将粒子-DNA附聚物加载至巨载体(macrocarrier)上。
组织的制备
玉蜀黍的未成熟胚为粒子轰击介导的转化的靶标。将来自F1植株的穗自交或同胞杂交(sibbed)，并在盾片开始变得不透明时将胚从发育中的颖果无菌解剖出来。这个阶段在授粉后约9-13天，最通常授粉后约10天发生，这取决于生长条件。胚为约0.75至1.5毫米长。用20-50％对穗进行表面灭菌30分钟，然后用无菌蒸馏水清洗三次。
在胚发生诱导培养基上以盾片取向朝上培养未成熟胚，该培养基包含N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/L盐酸硫胺、30g/ml蔗糖、2.88g/ml L-脯氨酸、1mg/L2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml和8.5mg/L AgNO3，Chu，et al.，(1975)Sci.Sin.18：659(Chu等人，1975年，《中国科学》，第18卷，第659页)；Eriksson，(1965)Physiol.Plant18：976(Eriksson，1965年，《植物生理学》，第18卷，第976页)。将该培养基通过在121℃下高压灭菌15分钟进行灭菌，然后分配进100×25mm培养皿中。将AgNO3过滤灭菌并添加至高压灭菌后的培养基。将组织在28℃下在完全黑暗中培养。约3至7天，最通常约4天后，胚的盾片膨胀至其初始大小的两倍，盾片的胚根鞘表面的隆起指示胚发生组织的开始。最高达100％的胚显示出这个响应，但最通常是，胚发生响应频率为约80％。
当观察到胚发生响应时，将胚转移至由经改进而含有120g/ml蔗糖的诱导培养基构成的培养基。将胚定向，使胚根鞘轴(胚发生响应组织)从培养基朝上。每个培养皿有十个胚放置在培养皿中央直径约2cm的区域中。就在用与含有选择性和非选择性标记基因的质粒DNA缔合的粒子轰击之前，将胚在28℃下在完全黑暗中保持在这个培养基上3至16小时，优选4小时。
为了实现对胚的粒子轰击，用DuPont PDS-1000粒子加速装置加速所述粒子-DNA附聚物。将粒子-DNA附聚物进行短暂超声处理，将10μl沉积于巨载体上，让乙醇蒸发。通过使聚合物隔膜(可裂膜圆片(rupture disk))破裂将聚载体加速至不锈钢阻挡屏上。通过加压氦气实现破裂。根据可裂膜圆片破裂压力确定粒子-DNA加速的速度。使用200至1800psi的可裂膜圆片压力，650至1100psi是优选的，约900psi是最高度优选的。将多个圆片用于实现一系列破裂压力。
将装有带胚的平板的搁架放置在巨载体平台的底部下面5.1cm(3号搁架)。为了实现对培养的未成熟胚的粒子轰击，将可裂膜圆片和具有干燥的粒子-DNA附聚物的巨载体安装于该装置中。将传递至该装置的氦气压力调节至比可裂膜圆片破裂压力高200psi。将带靶标胚的培养皿放置进真空室内，并定位在加速粒子的弹射途径中。在该室中产生真空，优选约28英寸汞柱。在操作该装置后，释放真空，移出培养皿。
在轰击过程中以及随后的1至4天，使受轰击的胚保持在渗透压调节培养基上。将胚转移至选择培养基，该选择培养基由如下组分构成：N6基础盐、Eriksson维生素、0.5mg/l盐酸硫胺、30g/ml蔗糖、1mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、2g/ml0.85mg/l Ag NO3和3mg/l双丙氨膦(Herbiace，Meiji)。双丙氨膦是过滤灭菌添加。以10至14天的间隔将胚分培至新鲜的选择培养基。约7周后，推定转化了选择性和非选择性标记基因两者的胚胎发生组织从一部分经轰击的胚增殖出来。救援推定的转基因组织，源于各单独胚的组织被视为事件并使其在选择培养基上独立地繁殖。通过视觉选择组织化的(organized)胚发生组织的最小连续片段来实现两个克隆繁殖周期。
处理来自每个事件的组织样品以回收DNA。将DNA用限制性内切核酸酶进行限制性酶切并用引物序列探测，所述引物序列设计用于扩增重叠质粒的编码和非编码部分的DNA序列。将具有可扩增序列的胚发生组织增进(advance)至植物再生。
为了再生转基因植物，将胚发生组织分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素(Murashige and Skoog，(1962)，Physiol.Plant15：473(Murashige和Skoog，1962年，《植物生理学》，第15卷，第473页))，100mg/L肌醇、60g/ml蔗糖、3g/ml0.5mg/L玉米素、1mg/L吲哚-3-乙酸、26.4ng/L顺式-反式-脱落酸和3mg/L双丙氨膦的培养基，于28℃下在黑暗中温育直至见到良好成形的、成熟的体细胞胚的发育。这要求约14天。良好成形的体细胞胚是不透明的且为奶油色的，由可辨认的盾片和胚芽鞘构成。将各胚分别分培至100×25mm培养皿中的包含MS盐和维生素、100mg/L肌醇、40g/mL蔗糖和1.5g/mL的发芽培养基，并在16小时光照：8小时黑暗光周期和40meinsteinsm sec(来自冷白色荧光管)下温育。约7天后，体细胞胚发芽并产生轮廓分明的苗和根。将各单独植株分培至125×25mm玻璃管中的发芽培养基以让植株进一步发育。将植物维持在16小时光照：8小时黑暗光周期和40meinsteinsm sec(来自冷白色荧光管)下。约7天后，植株良好确立，将其移植至园艺土壤使其茁壮并盆栽至商业温室土壤混合物中，在温室中栽培至性成熟。将优良近交系用作雄株以给再生的转基因植株授粉。
实例11：大豆胚转化
如下用质粒轰击大豆胚，该质粒包含可操作地连接至异源核苷酸序列的优选启动子，该异源核苷酸序列包含多核苷酸序列或亚序列。为了诱导体细胞胚，从大豆栽培种A2872的经表面消毒的未成熟种子解剖出长35mm的子叶，然后将其在适当的琼脂糖培养基上于26℃在光照或黑暗中培养六至十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在重复选择增殖为早期球形期胚的体细胞胚簇后，如下所述维持悬浮液。
可将大豆胚发生悬浮培养物维持在26℃下旋转振荡器(150rpm)上的35ml液体培养基中，使用16：8小时白天/黑夜时间安排的荧光光照。通过将大约35mg组织接种进35ml液体培养基中，每两周对培养物进行分培。
可然后通过粒子枪轰击方法(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》(伦敦)，第327卷，第70-73页)，美国专利No.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。可将DuPontBiolisticTM PDS1000/HE仪(氦气改型)用于这些转化。
可用于促进大豆转化的选择性标记基因，是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，et al.，(1985)Nature313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz，et al.，(1983)Gene25：179-188(Gritz等人，198年，《基因》，第25卷，第179-188页)的潮霉素磷酸转移酶基因和来自根瘤农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合酶基因的3′区所组成的转基因。包含优选的启动子和异源多核苷酸的目的表达盒，可作为限制性酶切片段分离。然后可将这个片段插入携带标记基因的载体的独特限制性酶切位点中。
向50μL的60mg/ml1μm金粒子悬浮液加入(按顺序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl亚精胺(0.1M)和50μl CaCl2(2.5M)。然后将粒子制备物搅动三分钟，在微量离心机中离心10秒，移除上清液。然后将DNA包被的粒子在400μl70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μl无水乙醇中。可将DNA/粒子悬浮液超声处理三次，每次1秒。然后将五微升DNA包被的金粒子加载至每个巨载体盘上。
将大约300 400mg两周龄悬浮培养物置于空的60×5mm培养皿中，用移液管将残余液体从组织移除。对于每次转化实验，通常轰击大约5-10个组织平板。将膜破裂压力设定为1100psi，将室抽至28英寸汞柱的真空。将组织距离阻滞屏(retaining screen)大约3.5英寸放置，轰击三次。轰击后，可将组织一分为二并放回进液体中，如上所述进行培养。
轰击后五至七天，可将液体培养基与新鲜培养基交换，轰击后七至十二天与含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基交换。可每周更新这个选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并接种进单独的烧瓶中以产生新的、克隆繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当作独立的转化事件。然后可将这些悬浮物传代培养，并作为未成熟胚簇维持或者通过使各单独体细胞胚成熟和发芽而再生成完整植株。
实例12：在不育与可育的不同氮水平下的穗发育
雄性不育将减少穗丝发育所需的营养物质，得到开花时提高的穗发育。在该实验中，雄性不育近亲在不同氮肥水平下生长并且在约50％花粉散出时取样。雄性不育植物在两种氮肥水平下均产生更大的穗。具有吐出的丝的雄性不育植物的比例也大于可育近亲植物。虽然生物量(总地上植物干重减去穗干重)在较高氮肥下生长的植物中较大，但是雄性不育对生物量无影响。这示出了雄性不育具体地对于植物产生更重、更完全发育的(丝)穗的能力的正面影响，而不影响总体营养生长。
实例13：氮平衡研究
进行这样一项研究，当植物以增加的氮肥水平种植时定量正在发育的玉蜀黍穗和穗丝的氮平衡。当玉蜀黍在较低氮肥水平下生长时，穗的氮平衡为负，或在发育期间当氮受限时，穗丢失氮至植物的其他部分。穗的氮平衡随着提供至植物的氮肥的量增加而提高，直到穗维持氮的正向增加直至吐丝。相比之下，穗丝无论种植植物的育性水平如何都维持正向氮平衡。该结果明确的示出了穗丝和穗在生殖发育期间竞争氮，并且正在发育的穗丝对正在发育的穗占优势。通过提高的穗发育引导的与雄性不育杂交体相关联的产量提高与穗发育和穗丝发育竞争的减少完全一致。
实例14：用雄性不育植株进行田间实验
遗传的雄性不育杂交体在田间实验中也表现良好。进行两个田间实验。在一个实验中，氮肥随在各个氮肥内分离的雄性不育和雄性可育杂交体而变化。在第二实验中植物群体密度有所变化，另外，植物群体密度随在植物群体密度内分离的雄性不育和雄性可育杂交体而变化。两个实验的实验设计均为裂区设计。施氮量为多个率(multiple rate)氮实验中的主区，并且雄性不育或雄性可育为副区。在群体实验中，植物群体为主区，并且雄性不育或雄性育性为副区。用于多N实验中的施氮量为在发育的V3阶段施加的0、30、60、90、120和150单位(磅英亩)。用于施氮量实验中的植物群体为32,000株植物英亩-1，然而在植物群体研究中使用32,000、48,000和64,000株植物英亩-1的密度。群体研究中氮肥方案为对于所有群体在种植前施加180单位氮英亩-1，然后在所有区中于V6时侧施95单位氮英亩-1(275总单位氮英亩-1)。在开花前10天将另外50单位氮英亩-1补加至48,000株植物英亩-1区(325总单位氮英亩-1)，并且在开花前10天将另外100单位氮英亩-1补加至64,000株植物英亩-1区(375总单位氮英亩-1)。
在两个实验中均观察到了雄性不育的显著效果。还观察到了氮肥对产量的显著效果，但没有观察到群体密度对产量的显著效果。每个实验的结果在下文中示出。
多N实验
分析各个参数的总体显著水平(P＞F)。总体雄性不育植物具有统计上显著(P＞F＜0.001)较大的谷粒产量、穗区-1数目、较高的SPAD、更多的穗丝、具有更长和更宽的穗以及更多籽粒穗-1。这些参数也随氮肥显著变化。在穗区-1和籽粒穗-1中存在显著的氮肥×雄性不育/可育交互作用。这是因为育性植物穗数区-1随氮肥的增加而增加，而不育植物在整个氮肥水平中具有恒定数目的穗区-1这一事实。穗丝数目和籽粒穗-1也具有显著的处理交互作用，并且可能是因为在雄性不育植物中穗丝数目随氮肥的增长率比在雄性可育植物中更陡。在低氮水平下雄性可育和雄性不育植物之间的产量差值比在较高氮水平下更高。在0氮英亩-1下雄性不育和雄性可育植物之间的差值为84％，而在150磅英亩-1施氮量下雄性不育和雄性可育植物之间的产量差值为15％。在涉及MS44突变体的杂交体试验中，观察到平均增加约37蒲式耳英亩-1。在另一个杂交体试验中，平均增加13蒲式耳英亩-1。(图5A-5B)。
SPAD响应于氮肥和响应于雄性不育是显著不同的，但对雄性不育和雄性可育植物的氮肥的响应是相同的，这表明SPAD不是造成雄性不育和雄性可育植物响应于氮肥的产量差值的原因。
雄性不育和雄性可育植物响应于氮肥的籽粒数目显示不同的斜率，与在雄性不育和雄性可育产量响应于氮肥中类似，其可表明雄性不育植物的产量增加可能与籽粒数目增加相关。在整个氮肥水平上的雄性不育和雄性可育杂交体之间的产量差值可近似通过在整个氮肥水平上的雄性不育和雄性可育杂交体之间的穗区-1和籽粒穗-1的差值的和来估计。这些数据与如下假设一致：在雄性不育植物中穗发育受到穗丝发育阻碍较少，从而形成更完全发育的穗(籽粒穗-1)，其在低氮条件下具有较大的穗生产成功率(穗区-1)。在其中一个杂交体试验中，与来自正常可育植物的穗相比穗干重增加约62％。
群体/雄性不育实验
在群体胁迫实验中遗传雄性不育杂交体也比雄性可育杂交体响应更好。虽然群体胁迫对谷粒产量没有影响，但在所有测试群体中遗传雄性不育杂交体超过雄性可育杂交体40％(59蒲式耳英亩-1)(参见图7A)。另外，在单独的试验中，观察到平均增加约8蒲式耳英亩-1(参见图7B)。
实例15：tls1基因的表征及其用于产量的提高
tls1突变体的表型示于图8中。采用定位克隆方法来克隆tls1(图9)。tls1区域使用来自tls1×Mo17F2群体的75个个体粗略定位在Chr1上。A)第一轮精细作图由红色字体表示。使用2985F2个体将tls1缩小至15cm区域。所得的177个重组体是自花授粉的，并且各个系的子代合并在一起以用于进一步精细作图，由绿色字体表示。177个F3家系用于将tls1间隔缩小成4个BAC区域，不包含另外的信息标记。对4个BAC间隔中的基因进行测序，并且仅有的明显差异为ZmNIP3；1在突变体中不能PCR扩增。创建来自纯合tls1植物的BAC文库，并且对横跨ZmNIP3；1基因的BAC进行测序以确定突变的性质。B)BAC测序结果。黄色线表明可对齐到B73参考序列的序列。蓝色线表明不可对齐到B73参考序列的重复序列。在突变体中ZmNIP3；1丢失，并且在其位置中为约9kb的重复序列。表明了最近的相邻基因、细胞色素P450和IMP脱氢酶。图2A和2B未按比例绘制。来自玉蜀黍的NIP3-1的序列分析表明与来自拟南芥的NIP5；1(AtNIP5；1)和来自水稻的NIP3；1(OsNIP3；1)具有高的相似性水平，并且系统发育研究表明它们是NIP II子组中密切相关的蛋白质(Liu，et al.，(2009)BCM Genomics10：1471-2164(Liu等人，2009年，《BCM基因组学》，第10卷，第1471-2164页))。(图15)。这些结果表明玉蜀黍中的NIP3-1涉及硼的吸收，并且生殖发育需要硼。
可以进行调控tls1在杂交玉蜀黍中的表达以用于在正常和胁迫条件下(例如，氮和水胁迫)提高产量的研究。NIP3-1可以组织特异性方式(即，在穗丝中)下调，从而形成不具有穗丝的植物，其不表现出与硼缺乏相关的任何其他多效性作用(如，未充分发育的穗)。在这种情况下，可将穗丝发育所需的资源分配给穗，并且穗丝的遮蔽效果将最小化，从而得到高于存在穗丝的其他雄性不育技术的增加的产量。这种相同的方法可应用于涉及硼的转运的任何基因。
用硼应用来救援tls1突变表型
种植来自tls1×Mo17的F2作图群体的野生型和突变型植物。一半的突变型和野生型植物用由0.0792％B2O2和0.0246％元素硼组成的叶面硼喷雾从～V2至～V6阶段每周处理一次。据观察，用硼喷雾处理的突变型植物表现出增加的穗丝分枝数目，所述穗丝分枝与未处理的突变型植物相比更长并且近似于野生型。此外，处理的突变型植物的穗也表现为恢复的。用硼处理的野生型植物与未处理的野生型植物不具有可辨别的差异。恢复的突变型植物对于子代测试而言是自花授粉的。
来自对可恢复的突变型植物自花授粉的子代与用于对照的野生型一起种植。一半的突变型子代用如上所述的硼喷雾进行处理，并且留下一半未处理。穗丝分枝数目(图11)，分枝长度(图12)和穗长度(图13)由24个野生型植物、用硼喷雾处理的26个突变型植物和29个未处理的突变型植物进行测量。与未处理的突变型植物相比，用硼喷雾处理的突变型植物具有增加的穗丝分枝数目、增加的穗丝分枝长度和增加的类似于野生型植物的穗长度(图11至13)。此外，观察到，当留下未处理的植物表明用硼喷雾处理的效果未传递到后代时，恢复的突变型植物的子代仍表现出tls1表型。
tls1突变体更耐硼毒性
初步结果表明tls1突变体可比野生型植物更耐硼毒性条件。野生型和突变型植物使用含有正常硼浓度(0.5ppm)或50ppm硼的Hoagland培养基进行水培种植。在～V7阶段，不能辨别在正常硼条件下生长的突变型和野生型植物(图14)。然而，当在50ppm硼中生长时，突变型植物整体表现更大并且具有更宽的叶。此外，在野生型植物在50ppm硼中生长时，第二嫩的完全张开的叶的节在最嫩的完全张开的叶的节的上方延伸，而突变型植物看起来是正常的。
通过硼应用救援突变体并产生种子
纯合tls1植物具有减少的穗丝生长或基本上不含用于正常穗发育的功能穗丝。因此，来自tls1突变型植物或由于缺乏硼的吸收而具有减少的穗丝发育的植物的种子的数量未达到大规模种子生产所需的水平。因为外源硼应用救援了tls1突变型背景中的穗丝发育和生长，因此硼应用是增加tls1植物的种子生产的一种选择。根据应用的需要和模式，外源硼(例如，作为叶面喷雾)可施加在生殖生长的各个阶段(例如V2-V12或V2-V8)，并且以各种硼水平(例如，10-1000ppm)施加。在一个实施例中，根据植物生长条件，硼应用可与从营养态至生殖态例如V4-V5的过渡一致。
tls1的等位基因
基于本文提供的公开内容和指导内容，通过进行有效的筛选，例如通过定向诱导基因组局部突变(TILLING)获得tls1的另外的较弱或较强等位基因，McCallum，et al.，(2000)Nat Biotechnol18：455-457(McCallum等人，2000年，《国家生物科技》，第18卷，第455-457页)。Tls1的另外的等位基因可包括完全阻止硼转运从而导致基本失去穗丝生长和发育的那些变体，以及导致穗丝发育减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的那些变体，如通过花粉生产减少或其他本领域中的技术人员已知的合适的参数所证实的那样。
实例16：在干旱胁迫处理下对减少雄性育性的植物进行田间实验
在田间研究中评估减少的雄性育性对在干旱胁迫条件下生长的玉蜀黍的产量的影响。田间研究在受管理的胁迫田间环境中进行。在生长季节中田间位置很少或几乎不下雨，从而允许通过在发育的各个阶段中移除灌溉来施加干旱胁迫。田间位置在干旱条件下没有干扰杂交体性能的判读的昆虫或病害压力。
单个杂交体的雄性不育和可育变体在裂区设计的10次重复中使用标准种植实践种植。将植物间苗至标准密度，使得植物用水区应为均匀的。通过消除开始于发育的V8阶段的区的灌溉来施加胁迫处理。植物继续使用土壤剖面中残留的水。在大约3周后，发生植物水分亏缺，如卷叶病和植物生长减小所指示。植物仍在该水分亏缺条件下直至开花后大约2周，此时对干旱胁迫的区充分复水。因此，胁迫处理的总的持续时间为约5-6周，包括发育的开花期。
玉蜀黍在开花期中对干旱胁迫是极其敏感的。通常，穗的发育、穗丝的伸出和子房的授粉均受干旱胁迫抑制。这些过程的敏感性是在干旱胁迫下减产的主要因素。缓解该敏感度是改善玉蜀黍中干旱胁迫的有效方法。在该临界期中雄性不育植物将分配更多同化物至穗，因此使其更耐该胁迫。雄性不育植物更快速的抽出穗丝，从而使得这些子房更有效的授粉以及更高的最终籽粒数目植物-1。该临界生殖过程的改善在收获时得到更大的产量。
在该研究中，数据证实了通过减少雄性育性提高了耐旱性。胁迫处理中的雄性不育植物的产量为106.7蒲式耳英亩-1，而胁迫处理中的雄性可育植物的产量为62.6蒲式耳英亩-1。雄性不育植物中的总籽粒数目穗-1为204.3，而雄性可育植物中为130.2，证实了在胁迫下穗发育和籽粒结实在雄性不育植物中有所改善。
实例17：雄性不育杂交体子代的形成
提供了制备雄性不育杂交植物的方法。在杂交体生产田地中，在一个实施例中，对于雄性育性基因是纯合隐性的自交系A的雌性亲本(雄性不育)植物通过自交系B的植物授粉。自交系B对于雄性育性基因相似地为纯合隐性的；然而，自交系B对于异源构建体是半合的。该构建体包含(a)雄性育性基因的显性等位基因，其补充隐性基因型并恢复对自交系B的育性；(b)导致破坏花粉的形成、功能或传播的遗传元件；(c)任选地标记基因，其可为在种子中表达的标记。因此，在自交系A上产生的种子对于雄性育性基因是纯合隐性的，并且将产生雄性不育子代。这些子代相对于所描述的构建体是非转基因的，因为元件“b”防止构建体通过花粉传递。参见(例如)图3。
因为这些杂交植物是雄性不育的，因此有必要提供传粉媒介。为了在谷粒生产田地中种植这些杂交种子，将杂交种子与传粉媒介种子共混是实用的。传粉媒介种子将以实现对共混种子产生的植物的相当大一部分进行足够授粉所需的最小量存在。优选地，至少1％至50％，更优选地少于25％，最优选地少于15％的共混物(按重量计)将为传粉媒介种子。特别优选的为其中传粉媒介种子以约1重量％至10重量％的量存在的共混物。相当大一部分可为所产生的植物的约90％、更优选地约95％、最优选地为由共混物产生的植物的约98％或更多。
实例18：使用显性Ms44形成杂交雄性不育子代
在该例子中，克隆的显性雄性不育基因Ms44用于制备雄性不育杂交植物。参见(例如)图4。杂合状态的含有Ms44的雌性自交系用异源SAM构建体转化，所述构建体包含(1)抑制元件，例如工程改造成Ms44启动子或Ms44编码区的反向重复序列(IR)；(2)花粉消融基因，其导致花粉的形成、功能、传播的破坏；(3)标记基因，其可为种子颜色基因。抑制元件破坏显性Ms44等位基因的转录或翻译，使得另外的雄性不育植物为雄性可育的并且可自花授粉。因为元件2防止转基因通过花粉传递，穗上所得的子代将相对于半合SAM构建体50∶50分离，并且25％的所有子代对于Ms44显性等位基因将是纯合的。包含SAM构建体的种子可通过标记的存在来鉴别。来自这些种子的子代可基因分型以鉴别具有SAM构建体的纯合Ms44子代；这些也称为保持系。没有SAM构建体的纯合Ms44子代被称为雄性不育雌性自交系(或“雄性不育自交系”)。
雄性不育自交系种子可通过将保持系杂交至雄性不育雌性自交系上来增加。所得的子代为雄性不育纯合Ms44雌性自交系，因为SAM构建体未通过花粉传递至子代。这样转基因保持系用于保持、繁殖或增加雄性不育植物。
在杂交体生产杂交中，雄性自交系通常杂交至该雄性不育雌性自交系上，并且不需要去雄。然而，因为Ms44基因为显性雄性不育基因并且在雌性自交系中为纯合的，因此100％的杂交种子将包含显性Ms44等位基因并且由这些种子产生的植物将为雄性不育的。
当将该杂交种子种植在谷粒生产田地中时，使其与传粉媒介的种子共混是实用的。传粉媒介种子以足以允许对由共混物制备的植物进行足够授粉的最小所需量存在。优选地，至少1％至50％、更优选地少于25％、最优选地少于15％的共混物(按重量计)将为传粉媒介种子。特别优选的为其中传粉媒介种子以约1重量％至10重量％的量存在的共混物。传粉媒介种子应仅以足以对共混物产生的植物的相当大一部分进行授粉的量存在于共混物中。相当大一部分可为所产生的植物的约90％、更优选地约95％、最优选地为由共混物产生的植物的约98％或更多。
或者，杂交谷类作物中的传粉媒介共混物可为在种子生产田地中通过共混杂合MS44雌性自交系亲本与纯合MS44雌性自交系亲本来预先确定。由于杂合显性雄性不育杂交中产生的子代中的一半将作为雄性可育分离，因此传粉媒介在杂交谷类作物中的比例可通过共混两倍杂合MS44雌性自交系的比例作为所需的雄性可育传粉媒介在杂交谷类作物中的比例来预先设定。如果所需的雄性可育传粉媒介的最终比例为10％，则可共混20％种子生产雌性作为杂合MS44雌性自交系。传粉媒介在杂交谷类作物中最多至50％的任何比例均可以这种方式产生。杂合MS44雌性亲本可通过杂交纯合MS44自交系与相同自交系的野生型变体来产生。来自该杂交的所有子代将为杂合MS44且雄性不育的，从而影响种子生产田地中的杂交授粉。
或者，显性Ms44基因可转基因地引入、可操作地连接到适于IR失活但表达的异源启动子，从而实现显性雄性不育。这可确保天然ms44表达不被IR抑制。水稻5126启动子可为适当的，因为其具有类似于ms44基因的表达模式，并且其已成功用于启动子IR失活。
该方法通过减少远交的倾向并使不定存在的风险最小化不仅应用于胁迫期间的产量增益，还用于可与杂草型物种远交的任何作物，诸如高粱。例如，生物燃料行业以转基因方式利用酶以有助于用于乙醇生产的底物(即纤维素)的消化性。将这些类型的转基因连接至Ms44基因可防止在生产田地中通过花粉远交。可将一个或多个显性性状连接至Ms44以防止与杂草型物种的无意远交。
实例19：杂交体中的显性雄性不育
显性雄性不育(DMS)基因Ms44渗入雌性自交系玉蜀黍系。因为该基因表现显性，这些系的自花授粉是不可能的，并且突变体将在所得的远交子代中50∶50分离。可采用连接的遗传标记来鉴别含有DMS基因的这些植物，使得玉蜀黍雄性自交系可用于与这些植物特定杂交，从而形成F1杂交种子。另外，该杂交种子将对雄性不育50％分离。Ms41和Ms42是在玉蜀黍中为显性的其他已知DMS突变体。(Liu and Cande，(1992)MNL66：25-26(Liu和Cande，1992年，《医疗营养实验室》，第66卷，第25-26页)；以及Albertsen，et al.，(1993)MNL67：64(Albertsen等人，1993年，《医疗营养实验室》，第67卷，第64页))。
替代性方法是将转基因Ms44基因用于显性不育。该基因可连接至种子标记基因并且转化到雌性自交系中。然后来自该系的种子可基于种子标记基因的存在来分选，从而确保来自雌性系的纯的Ms44雄性不育子代的群体。这些子代然后可与杂交体生产田地中的雄性自交系杂交以在所得的杂合体子代中产生50％雄性不育。
实例20：所公开序列的变体
另外的MS44突变序列可通过已知的方法产生，包括但不限于截短和点突变。可通过使用标准转化、再生和评估方案来评估这些变体对雄性育性的影响。
A.不改变所编码的氨基酸序列的变体核苷酸序列
用所公开的核苷酸序列产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列所具有的开放阅读框核苷酸序列与相应的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准密码子表产生的。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。这些变体与确定生物量生产和质量的组分性状相关。然后显示相关性的变体用作标记来选择每个组分性状。
B.非编码区中的变体核苷酸序列
本文所公开的核苷酸序列用于产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列具有5’-未翻译区、3’-未翻译区或启动子区的核苷酸序列，其与相应的SEQ ID NO的起始核苷酸序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％和95％同一性。这些变体然后与种质中与生物量生产和质量相关的组分性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标记单倍型来选择所期望的性状。
C.所公开的多肽的变体氨基酸序列
产生了所公开的多肽的变体氨基酸序列。在这个实例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白质比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白质比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。这些变体然后与种质中与生物量生产和质量相关的组分性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标记单倍型来选择所期望的性状。
D.所公开的多肽的另外的变体氨基酸序列
在该实例中，产生出相对于参比蛋白质序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白质序列。这后一种尝试需要从比对鉴定保守区域和可变区域并然后审慎应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，基于所公开的蛋白质之间或其他所公开的多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，将所公开的多肽的很可能要进行改变的不同区域以小写字母表示，而保守区域用大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，技术人员会理解，本发明所公开的序列的功能变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始蛋白质序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白质序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表2中提供。
表2.置换表
首先，鉴定出蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。名单的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的所公开的多肽的变体。
E.所公开的干扰信号肽处理的多肽的变体氨基酸序列
产生了所公开的多肽的变体氨基酸序列。在该实例中，对一个或多个氨基酸进行变更。具体地讲，观察N-端分泌性信号序列(SS)以确定可能的氨基酸变更。通过使用可用的预测程序诸如SignalP(von Heijne，G.“Anew method for predicting signal sequence cleavage sites”Nucleic Acids Res.：14：4683(1986)(von Heijne，G.，“预测信号序列切割位点的新方法”，《核酸研究》，第14卷，第4683页，1986年)。Improved prediction ofsignal peptides：SignalP3.0.，Bendtsen JD，Nielsen H，von Heijne G，Brunak S.，JMol Biol.2004Jul 16；340(4)：783-95(改进信号肽的预测：SignalP3.0，Bendtsen JD、Nielsen H、von Heijne G、Brunak S，《分子生物学杂志》，2004年7月16日，第340卷，第4期，第783-795页))预测SS切割位点来选择要改变的氨基酸。选择认为对于适当的蛋白质加工和分泌是必要的氨基酸。分泌性蛋白质在结合到粗糙内质网的核糖体上合成。在植物细胞中，信号序列(通常在N-端的疏水氨基酸的序列)由信号识别颗粒(SRP)限定，而信号识别颗粒又由粗糙内质网膜上的SRP受体限定。SRP引导核糖体结合到内质网膜，并使蛋白质螺纹通过跨膜通道，称为易位子，在其中蛋白质通过SS的信号肽酶切割而被加工成其成熟形式。破坏SRP结合或信号肽酶切割的氨基酸改变可抑制蛋白质的正常加工和分泌。对于Ms44蛋白质，这些类型的氨基酸置换可导致显性雄性不育表型。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用的方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用的方式并入本文一样。
本文藉着各个具体的和优选的实施例和技术描述了本发明。但是，应理解，在保持在本发明的精神和范围的前提下可以作出许多变化和修改。

Claims (18)

1.一种用于通过下列方式增加植物中产量或维持植物中产量稳定性的方法：a)通过在雄性生殖组织优选的启动子的控制下表达转基因来减少雄性生殖组织发育；以及b)在雄性和雌性组织同时发育期间增加分配至雌性生殖组织的营养物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述雄性生殖组织为穗丝。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述雄性生殖组织发育通过表达可操作地连接到启动子的基因而减少，所述启动子包括选自列表的序列的至少100个连续核苷酸。
4.由根据权利要求1所述的方法得到的植物。
5.根据权利要求4所述的植物的细胞。
6.根据权利要求4所述的植物的种子或子代。
7.包含多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸引发植物细胞中的转录并且包括选自如下的序列：
a)选自SEQ ID NO：64-106、134-137、142、144、149、150的序列；
b)选自SEQ ID NO：64-106、134-137、142、144、149、150的序列的至少100个连续核苷酸，以及
c)与选自SEQ ID NO：64-106、134-137、142、144、149、150的序列的全长具有至少70％序列同一性的序列。
8.表达盒，其包含可操作地连接到目的多核苷酸的根据权利要求7所述的多核苷酸。
9.载体，其包含根据权利要求8所述的表达盒。
10.植物细胞，所述植物细胞在其基因组中稳定掺入根据权利要求8所述的表达盒。
11.根据权利要求10所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
12.根据权利要求11所述的植物细胞，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸麦、高粱或水稻。
13.植物，所述植物在其基因组中稳定掺入根据权利要求8所述的表达盒。
14.根据权利要求13所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求14所述的植物，其中所述单子叶植物为玉蜀黍、大麦、小麦、燕麦、裸麦、高粱或水稻。
16.根据权利要求13所述的植物的转基因种子。
17.根据权利要求13所述的植物，其中所述目的多核苷酸编码赋予病原体或昆虫抗性的基因产物。
18.根据权利要求13所述的植物，其中所述表达盒编码涉及营养物质吸收、氮利用效率、耐旱性、根强度、根耐倒伏性、土壤害虫管理、玉米根虫抗性、碳水化合物代谢、蛋白质代谢、脂肪酸代谢或植物激素生物合成的多肽。
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