CN104812902A - 用于作物改良的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的操纵 - Google Patents

用于作物改良的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的操纵 Download PDF

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Abstract

本发明公开了涉及改变植物中的氮利用和/或吸收或产量的方法和组合物。本发明描述了重组表达盒、宿主细胞和转基因植物。丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶改良作物植物的农学性状。

Description

用于作物改良的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的操纵
技术领域
本发明整体涉及分子生物学领域，具体地讲涉及植物育性的调节以改善植物胁迫耐受性。
背景技术
许多植物的驯化已与产量显著增加相关。天然群体中发生的大多数表型变异是连续的并且受多种基因影响的作用。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的鉴别已成为农业研究的重要焦点。
用于农业生产的氮(N)肥的全球需求(已达约9,000万公吨/年)预计到2050年为止将增长到24,000万公吨。由于硝酸盐在土壤中的流动性非常高，大量所施用的氮因淋溶、径流和反硝化而损失。除了作物生产成本的增加，从长远看来，氮损失的这些过程不仅会污染地下水并对土壤结构产生不利影响，还对环境具有有害影响，诸如增加一氧化氮、臭氧等。因此，开发具有改善的氮吸收和利用效率的作物品种将在一定程度上帮助缓解这些问题。“信号传导”影响着生命的几乎所有方面而蛋白磷酸化/去磷酸化则在调节“信号传导”和许多其他生物过程中起主要作用。磷酸化和去磷酸化分别由蛋白激酶和磷酸酶催化，这些酶占据拟南芥属(Arabidopsis)基因组的约5％，从而表明它们在植物的生命周期中的主要作用。在蛋白磷酸酶之中，丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)是在包括玉蜀黍的高等植物中的主要多基因家族。
发明内容
一个实施例涉及分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含选自以下的核苷酸序列：(a)包含SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的核苷酸序列，(b)编码包含SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115和117的氨基酸序列的核苷酸序列，以及(c)与SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码影响NUE活性和/或产量的多肽。
组合物包含分离的多肽，该分离的多肽包含选自以下的氨基酸序列：(a)包含SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115和117的氨基酸序列，以及(b)与SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115和117具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽对NUE和/或产量有影响。
调节植物中STPP的表达可改善植物的氮胁迫耐受性，并且这种植物可在显著较低的氮肥投入的情况下保持它们的产出率和/或可表现出增加的氮肥吸收和同化和/或对积聚的氮储备的再动员和再利用。除了产量的总体增加外，通过STPP的表达来改善氮胁迫耐受性还可导致根质量和/或长度增加，穗、叶、种子和/或胚乳尺寸增加，和/或抗倒伏性改善。因此，在一些实施例中，所述方法还包括在氮限制条件下栽培所述植物，并任选地选择表现出对低氮水平有较大耐受性的那些植物。
另外，提供了改善非生物胁迫下的产量的方法和组合物，该方法包括：评价耕作区的环境条件的非生物应激源(stressor)(例如，土壤中的低氮水平)，并在胁迫环境下栽培具有减少的雄性育性的种子或植物。
本文还提供了构建体和表达盒，该构建体和表达盒包含可有效改变STPP的表达的核苷酸序列。
描述了包含本文所公开的核酸的重组表达盒。含有该重组表达盒的载体可有利于该核酸在宿主细胞中的转录和翻译。描述了能够表达该多核苷酸的宿主细胞。有多种宿主细胞可以使用，诸如但不限于微生物、植物或昆虫细胞。
含有本文所公开的多核苷酸的植物包括但不限于玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、番茄和小米。在另一个实施例中，转基因植物为玉蜀黍植物或植物细胞。另一个实施例是得自可操作地连接到在植物中驱动表达的启动子的本发明的转基因丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶多肽的转基因种子。本发明的植物与对照植物相比可具有改变了的NUE。在一些植物中，NUE在营养组织、生殖组织、或营养组织和生殖组织中发生改变。植物可具有至少一种如下表型，包括但不限于：增加的根质量、增加的根长度、增大的叶尺寸、增大的穗尺寸、增大的种子尺寸、增强的绿色、增大的胚乳尺寸。
在基因组基因座处经遗传修饰的植物，其中该基因组基因座编码本文所公开的I型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，例如增加内源性丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶的表达的重组调控元件。
提供了增加丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶在植物中的活性的方法。该方法可包括向该植物中引入丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶多核苷酸。
一种提高产量或有助于产量的农学参数的方法，该方法包括：增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性；以及使该植物在植物生长环境中生长。
在一个实施例中，丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶为1型。在一个实施例中，STPP为玉蜀黍STPP3。
一种改善植物的农学特性的方法，该方法包括：增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中该STPP多肽包含金属磷(metallophos)结构域(PFAM PF00149.22)；以及通过使该植物在植物生长环境中生长而改善该植物的农学特性。
在一个实施例中，STPP多肽包含N端附近的基序和C端附近的基序，该N端附近的基序包含L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列。
在一个实施例中，STPP多肽包含VRTARPGKQV(SEQ ID NO：123)的氨基酸序列。
在一个实施例中，STPP多肽包含选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117至少90％相似的变体。
一种植物在其基因组中包含重组的丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)，其中该蛋白磷酸酶包含N端附近的基序和C端附近的基序、RVxF结合位点、催化亚基以及调节亚基，该N端附近的基序包含L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列，并且其中该植物表现出改善的农学特性。在一个实施例中，该植物与在其基因组中不含重组STPP的对照植物相比表现出氮使用效率的增加。
一种植物在其基因组中包含可操作地连接到丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的异源调控元件，其中该异源调控元件增加该蛋白磷酸酶的表达，该蛋白磷酸酶包含N端附近的基序和C端附近的基序、RVxF结合位点、催化亚基以及调节亚基，该N端附近的基序包含L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列，并且其中该植物表现出改善的农学特性。在一个实施例中，该异源调控元件为增强子。在一个实施例中，该异源调控元件为启动子。
一种鉴定并选择ZmSTPP3的等位基因的方法，该等位基因导致ZmSTPP3多肽的表达增加和/或酶活性的增加，该方法包括：对突变型玉蜀黍植物群体进行遗传筛选；鉴定表现出该ZmSTPP3多肽的表达增加和/或酶活性增加的一株或多株突变型玉蜀黍植物；以及鉴定该突变型玉蜀黍植物中的该ZmSTPP3等位基因。在一个实施例中，在包含ZmSTPP3的基因座处对突变型玉蜀黍植物测序。
一种增加植物中的氮吸收的方法，该方法包括：增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中该STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)；以及通过使该植物在植物生长环境中生长而改善该植物的氮吸收。
在一个实施例中，STPP多肽包含VRTARPGKQV(SEQ ID NO：123)的氨基酸序列。
一种能够在植物细胞中表达的重组DNA构建体，该构建体包含在植物中表达丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的多核苷酸，其中该STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)；可操作地连接到该蛋白磷酸酶并在植物细胞中具有功能性的异源启动子；以及在植物细胞中具有功能性的转录终止子。
一种玉蜀黍植物包含本文所述的DNA构建体。在一个实施例中，该DNA构建体编码STPP，该STPP包含编码蛋白磷酸酶的多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含与选自以下的一者至少80％相似的序列：SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118。
一种改善单子叶植物的氮利用效率的方法，该方法包括：增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中该STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，该N端附近的基序包含L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列；以及使该植物在植物生长条件下生长，其中氮肥的施用率低于约140至160磅/英亩。
一种通过改善单子叶植物的氮利用效率而提高单子叶植物的田间产量的方法，该方法包括：增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中该STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，该N端附近的基序包含L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)的氨基酸序列，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列；以及使该植物在植物生长条件下生长，其中氮肥的施用率为约140至160磅/英亩。
一种植物在其基因组中包含重组的DNA构建体，该重组的DNA构建体包含可操作地连接到在植物中具有功能性的启动子的分离多核苷酸，其中该多核苷酸包含(a)选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的核苷酸序列；(b)基于Clustal V比对方法，在与选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的一者相比时，具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；或(c)可在严格条件下与(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，并且其中该植物当与不包含重组DNA构建体的对照植物相比时，表现出至少一种选自以下的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植株高度、生物量和产量。
在一个实施例中，植物选自：拟南芥属、番茄、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
本文所述的植物的种子当与不包含重组DNA构建体的对照植物相比时，表现出至少一种选自以下的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植株高度、生物量和产量。
一种在植物中编码丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的重组多核苷酸，其中该STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149.22)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，该N端附近的基序包含氨基酸L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)，以及该C端附近的基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列。
一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，该方法包括：提供在其基因组中具有重组多核苷酸的玉蜀黍植物，该重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽；以及通过使该玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高该玉蜀黍植物的谷粒产量。在一个实施例中，该转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。
一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，该方法包括：提供在其基因组中包含重组多核苷酸的玉蜀黍植物，该重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽；以及通过使该玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高该玉蜀黍植物的谷粒产量。
一种转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽。一种转基因单子叶作物植物在其基因组中包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽。
一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，该方法包括：提供在其基因组中包含重组多核苷酸的玉蜀黍植物，该重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少85％相同的多肽；以及通过使该玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高该玉蜀黍植物的谷粒产量。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO：1约87％相同。
一种转基因玉蜀黍植物在其基因组中包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少85％相同的多肽。在一个实施例中，该玉蜀黍植物包含与SEQ ID NO：1约87％相同的多肽。在一个实施例中，该转基因玉蜀黍植物与不含该重组多核苷酸的对照植物相比产量高至少约3-5蒲式耳/英亩。
提供了用于降低或消除植物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶多肽水平的方法。该多肽的水平或活性还可以在特定的组织中降低或消除，从而导致植物生长速率的改变。降低该丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶多肽的水平和/或活性可导致植物更低的株高或更慢的生长。
附图说明
图1(图1A-1I)显示了STPP序列的比对，这些STPP序列具有以下鉴定的保守基序：L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)、L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)或LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)，以及C端附近的基序，该基序包含GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)、GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)或GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)的氨基酸序列。
图2显示了系统树图，其包含STPP序列与它们在进化枝中的身份(identification)的关系。表1的簇命名(cluster designation)对应于图2内的关键分支点。以基于JTT矩阵的模型为基础，使用最大似然法推断了进化史。显示了具有最高对数似然值(-5257.1242)的树。如下自动获得了启发式搜索的起始树。当共同位点的数量＜100或小于位点总数的四分之一时，使用最大简约法；否则，使用具有MCL距离矩阵的BIONJ方法。树按比例绘制，而分支长度以每个位点的置换数来度量。分析涉及55个氨基酸序列。包含空位和缺失数据的所有位置均被排除。在最终的数据集中存在总共273个位置。在MEGA5中进行了进化分析。
图3展示了在低和正常氮条件下测试的转基因过表达ZmSTPP3的多事件/年/测试者/位置产量数据分析。在低氮(下图)、正常氮(中图)和组合的低氮/正常氮(上图)中对事件的BLUP分析显示出2-5蒲式耳/英亩的增加。蓝色条代表具有统计显著性差异的事件。得自81个重复样的数据在该图中示出。
图4代表得自ZmSTPP3的两个转基因快速循环玉米事件的数据以展示在NUE繁殖测定中改善的穗性状。绘制的值是转基因事件相对于对照的增加百分比。*指示P＜0.1。
具体实施方式
ZmSTPP3在多年的试验中显示出在正常和低氮条件下提高的玉蜀黍谷粒产量。过表达STPP3的玉蜀黍株系具有比对照明显更高的氮使用效率。
氮利用效率(NUE)基因影响产量并对改善氮在作物植物(特别是玉蜀黍)中的利用具有实用性。氮使用效率增加可由增加的对氮肥的吸收和同化和/或对积聚的氮储备的后续再动员和再利用，以及植物对诸如低氮环境之类的胁迫情况的耐受性增加得到。基因可用于改变植物的遗传组成，从而使得它们在当前的肥料施用标准下更高产或在肥料显著减少或氮可用量显著减少的情况下保持它们的产出率。在氮肥获得受限的发展中国家和在氮使用水平保持较高的发达国家，改善玉米中的NUE都将会增加每单位投入氮肥的玉米可收获产量。氮利用改善还使得能降低在农场上的投入成本，降低对氮肥生产所需的非可再生能源的使用和依赖，以及减少氮肥生产和农业利用的环境影响。
本发明提供了改善植物产量的方法和组合物。在一些实施例中，植物产量在胁迫，特别是非生物胁迫，例如氮限制条件下得以改善。
本发明公开了在植物的氮代谢中涉及的STPP基因的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。
本发明公开了改变作物植物特别是玉蜀黍的遗传组成，使得这些作物能够在当前的施肥状况下产出更高和/或在肥料投入显著减少的情况下产出不变的方法。本发明公开了产量提高和肥料成本降低，同时对环境的影响相应降低。
所述STPP分子由2个亚基组成：第一个是高度保守且无所不在的催化亚基；以及第二个是限定多种功能和特异性的调节亚基。调节亚基将蛋白靶向细胞位置并调节其活性。丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶基于其底物特异性和药理性质而最初被归为两组：PP1和PP2(PP2A、PP2B、PP2C)。PP1是存在于所有真核生物中的无所不在且高度保守的酶。哺乳动物的PP1涉及对糖原生物合成、细胞周期和肌肉收缩的调控。植物PP1的功能尚不清楚。PP2A调节诸如硝酸还原酶和蔗糖磷酸合酶之类的关键酶的活性、激素信号传导和防御信号传导。
提到的所有参考文献均以引用方式并入本文。
除非另外明确定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。
单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。
在描述本发明时，将采用下面的术语，并旨在以如下所示进行定义。
所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。
所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链式反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省米西索加市加拿大基因公司(Cangene，Mississauga，Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology：Principlesand Applications，Persing，et al.，eds.，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)(《诊断分子微生物学：原理和应用》，Persing等人编辑，美国微生物学会，华盛顿特区，1993年)。扩增的产物称为扩增子。
术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens)，对于它来说GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka，et al.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32(Ishizuka等人，1993年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))可进行修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种沉默变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用方式并入本文。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，对于其天然底物而言，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
下面的六个组各自含有对彼此而言是保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
还可参见Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Co.(1984)(Creighton，《蛋白质》，W.H.弗里曼公司，1984年)。
如本文所用，“基本上由...组成”意指在如下情况下目标多核苷酸或多肽可包括额外的序列：额外的序列不会严重影响受权利要求保护的多核苷酸或多肽序列的基本功能。
术语“构建体”用来主要指多核苷酸序列的人工组合，即在自然界中不会发生的、通常包含一个或多个调节元件和一个或多个编码序列的组合。该术语可包括指表达盒和/或载体序列，视上下文而定。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对所关注基因实现了遗传变更(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此变更的植物或细胞遗传而来，且会包含该变更。
对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或细胞，即具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)遗传上与受试植物或植物细胞相同但未暴露于会诱导所关注基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于其中所关注基因不表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。对照植物还可以是用另选的下调构建体转化的植物。
就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白的信息。编码蛋白的核酸可以包含在该核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当使用这些生物体表达该核酸时，可以使用诸如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Yamao，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9(Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核(ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray，et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，其以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉蜀黍优选密码子可由来自玉蜀黍的已知基因序列得出。关于来自玉蜀黍植物的28种基因的玉蜀黍密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性修饰的核酸。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。
所谓“宿主细胞”意指包含本发明的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞诸如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞诸如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉蜀黍、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉蜀黍宿主细胞。
术语“杂交复合体”包括指涉由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“分离的”指诸如核酸或蛋白之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。术语“非天然存在的”、“突变的”、“重组的”、“重组表达的”、“异源的”或“异源表达的”为不存在于其天然存在环境中的代表性生物材料。
术语“NUE核酸”意指包含编码完全长度或部分长度多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且实质上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性核酸文库诸如基因组文库和cDNA文库的构建，在诸如以下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger and Kimmel，(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques，from the series Methods in Enzymology，vol.152，Academic Press，Inc.，SanDiego，CA(Berger和Kimmel，1987年，《分子克隆技术指南》，来自丛书《酶学方法》，第152卷，学术出版社，加州圣地亚哥)；Sambrook，etal.，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，vols.1-3(Sambrook等人，1989年，《分子克隆：实验室手册》，第2版，第1-3卷)；以及Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，et al.，eds，Current Protocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.and John Wiley&Sons，Inc.(1994Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司)。
如本文所用，“可操作地连接”包括指涉第一序列(诸如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始并介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
如本文所用，术语“植物”包括指涉整个植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zeamays)。
本文所用的“产量”可包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳数目(针对谷粒水分进行了调整，例如玉蜀黍的水分通常为15％)，和指所产生的生物量的体积(对于草料作物诸如苜蓿而言，以及复种作物的植物根尺寸)。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的经调整的测试重量确定为针对收获时的谷粒水分水平进行了调整的重量，单位为磅/蒲式耳。生物量测量为所产生的可收获植物材料的重量。
如本文所用，“多核苷酸”包括指涉脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列实质上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指涉指定的序列及其互补序列。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
本文所用的“启动子”包括指涉DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌诸如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。此类启动子被称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的例子包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子为在发育或细胞分化的大多数环境条件和状态下，在植物的基本上所有组织中都有活性的启动子。
术语“多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“NUE蛋白”包含多肽。除非另有规定，否则术语“NUE核酸”意指包含编码多肽的多核苷酸(“NUE多核苷酸”)的核酸。
如本文所用，“非基因组核酸序列”或“非基因组核酸分子”是指与天然或基因组核酸序列相比在核酸序列中具有一个或多个改变的核酸分子。在一些实施例中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：因遗传密码简并性而导致的核酸序列的改变；为在植物中表达而对核酸序列进行的密码子优化；为了相比于天然或基因组序列所编码的多肽引入至少一个氨基酸置换、插入、缺失和/或添加而发生的核酸序列中的改变；在基因组DNA内包括另外的或异源的剪接位点；移除一个或多个与基因组核酸序列相关的内含子；插入一个或多个异源内含子；插入一个或多个异源上游或下游调控区；以及插入异源5’和/或3’非翻译区。
如本文所用，“重组的”包括指涉已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。本文所用的术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
本文所用的“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和异源启动子。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，且最优选100％的序列同一性(即，互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且将在不同环境下不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性的低严格性条件包括在37℃下用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55℃下在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37℃下在40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并在55至60℃下在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃下杂交，并在0.1X SSC中于60-65℃下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可根据Meinkoth and Wahl，(1984)，Anal.Biochem.，138：267-84(Meinkoth和Wahl，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)：的方程Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm为50％的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每1％的错配，Tm降低约1℃；因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，则Tm可降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤；利用该公式，杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸的杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with NucleicAcid Probes，part I，chapter 2，“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays，”Elsevier，New York(1993)(Tijssen，《生物化学和分子生物学实验室技术-核酸探针杂交》，第I部分，第2章，“核酸探针测定法的杂交原理和策略概览”，爱思唯尔出版社，纽约，1993年)；以及Current Protocols in Molecular Biology，chapter 2，Ausubel，et al.，eds，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章，Ausubel等人编辑，格林出版公司与约翰威立出版公司，纽约，1995年)。除非另外指明，否则在本专利申请中，高严格性定义为在65℃下在4X SSC、5X Denhardt’s(500ml水中的5g Ficoll，5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸鲑精DNA和25mM磷酸钠中杂交，并在65℃下在0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
如本文所用，“转基因植物”包括指涉在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
如本文所用，“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。
以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分数”和(e)“实质同一性”。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。
如本文所用，“比较窗口”意在包括指涉多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列的部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个多核苷酸的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中纳入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman and Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的同源性比对算法(GAP)；相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson and Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：Intelligenetics(加州山景城(Mountain View，California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package，第8版(可得自Genetics Computer Group(程序(Accelrys公司(加州圣地亚哥(SanDiego，CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献详细说明：Higginsh and Sharp，(1988)Gene73：237-44(Higgins和Sharp，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页)；Higgins and Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet，etal.，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang，et al.，(1992)ComputerApplications in the Biosciences 8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)以及Pearson et al.，(1994)Meth.Mol.Biol.，24：307-31(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24第307-310页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng and Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化学杂志》，第25卷，第351-360页)，其类似于Higginsand Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53(Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)中描述的方法，将文献以引用方式并入本文。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in MolecularBiology，第19章，Ausubel等人(编辑)，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics软件包第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。
GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。威斯康星遗传学软件包版本10中所用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2.0程序包，采用默认参数获得的值(Altschul等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-402)。
如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白之间比对，尽管该蛋白的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten and Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63(Wooten和Federhen，1993年，《计算化学》，第17卷，第149-163页))和XNU(Claverie and States，(1993)Comput.Chem.17：191-201(Claverie和States，1993年，《计算化学》，第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。
在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，如本文所用的“序列同一性”或“同一性”包括指涉当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers andMiller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17(Meyers和Miller，1988年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(美国加利福尼亚州山景城Intelligenetics公司(Intelligenetics，Mountain View，California，USA))中所实现的。
本文所用的“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
在肽的情形中，术语“实质同一性”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100％之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55％的序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选地，利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是实质上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽实质上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时，如果抗体识别的表位实质上相同，则它们实质上相同。“实质上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。
表1
核酸的构建
可用(a)标准的重组方法、(b)合成技术或二者的组合产生分离的本发明核酸。在一些实施例中，本发明的多核苷酸将从真菌或细菌克隆、扩增或以别的方式构建。
UTR和密码子偏好性
一般而言，已发现翻译效率受RNA的5′非编码区或非翻译区(5′UTR)中的特定序列元件的调控。正序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125(Kozak，1987年，《核酸研究》，第15卷，第8125页))和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond，et al.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375(Drummond等人，1985年，《核酸研究》，第13卷，第7375页))。负元件包括稳定的分子内5′UTR茎-环结构(Muesing，et al.，(1987)Cell 48：691(Muesing等人，1987年，《细胞》，第48卷，第691页))和5′UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao，et al.，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284(Rao等人，1988年，《分子与细胞生物学》，第8卷，第284页))。因此，本发明提供了用于调节异源编码序列的翻译的5′和/或3′UTR区。
另外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。可采用改变了的密码子使用，来改变翻译效率和/或优化编码序列在所需宿主中的表达或为了在玉蜀黍中表达而优化异源序列中的密码子使用。本发明的多核苷酸的编码区中的密码子使用可用可商购获得的软件包(诸如可得自威斯康星大学遗传学计算机集团(University of Wisconsin GeneticsComputer Group)的“密码子偏好性(Codon Preference)”)进行统计分析。参见Devereaux，et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395(Devereaux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)或MacVector 4.1(康涅狄格州纽黑文的伊士曼柯达公司(Eastman Kodak Co.，New Haven，CN))。因而，本发明提供了本发明多核苷酸中的至少一者的编码区的密码子使用频率特性。可用于确定密码子使用频率的多核苷酸的数目(每个氨基酸3个核苷酸)可以为从3至本文所提供的本发明多核苷酸的数目的任何整数。任选地，多核苷酸将为全长序列。用于统计分析的序列的示例性数目可以为至少1、5、10、20、50或100。
序列改组
本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法以及由此得到的组合物。序列改组在PCT公开No.1996/19256中有描述。也可参见Zhang，et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9(Zhang等人，1997年，《美国国家科学院院刊》，第94卷，第4504-4509页)和Zhao，et al.，(1998)Nature Biotech 16：258-61(Zhao等人，1998年，《自然生物技术》，第16卷，第258-261页)。一般来讲，序列改组提供用于产生具有所需特性的多核苷酸的文库的手段，可对该文库进行选择或筛选。从一群包含具有实质序列同一性并可在体外或体内进行同源重组的序列区的相关序列多核苷酸产生重组多核苷酸的文库。序列重组的多核苷酸的群体包含具有所需的或有利的特性并且可通过合适的选择或筛选方法来选择的多核苷酸的亚群。所述特性可以是能用筛选系统选择或检测的任何性质或属性，可以包括如下性质：所编码的蛋白、转录元件、控制转录的序列、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、基因或转基因的翻译或其他表达性质、复制元件、蛋白结合元件等等的性质，例如赋予可选择或可检测性质的任何特征。在一些实施例中，选择的特性将为相对于本文所提供的野生型蛋白而言改变了的Km和/或Kcat。在其他实施例中，序列改组所产生的蛋白或多核苷酸具有的配体结合亲和力将比非改组的野生型多核苷酸的高。在另外其他实施例中，与非改组的野生型多核苷酸相比，序列改组所产生的蛋白或多核苷酸将具有改变了的最佳pH。这类性质的提高可占野生型值的至少110％、120％、130％、140％或高于150％。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明的核酸的重组表达盒。可将编码所需的本发明多核苷酸的核酸序列，例如编码长度足以编码本发明的活性蛋白的多肽的cDNA或基因组序列用于构建重组表达盒，可将该表达盒引入所需的宿主细胞。重组表达盒将通常包含可操作地连接至转录起始调控序列的本发明多核苷酸，所述转录起始调控序列将引导所述多核苷酸在预期的宿主细胞(如转化植物的组织)中的转录。
例如，植物表达载体可包含(1)处于5′和3′调控序列的转录控制下的克隆植物基因和(2)显性选择性标记。如果需要，这种植物表达载体还可含有启动子调控区(例如，赋予诱导型表达或组成型表达，由环境或发育调节的表达，或细胞或组织特异性/选择性表达的启动子调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
可采用会引导本发明多核苷酸在基本上再生植物的所有组织中表达的植物启动子片段。这种启动子在本文中称为“组成型”启动子并且在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下是活跃的。组成型启动子的例子包括源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1′或2′启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，如Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-2(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页)中所述；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)Plant Cell 163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第163-171页))；泛素(Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.，18：675-89(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-30(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))以及玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit，et al.，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85(Lepetit等人，1992年，《分子遗传学和基因组学》，第231卷，第276-285页)和Atanassvoa et al.，(1992)PlantJournal 2(3)：291-300(Atanassvoa等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第3期，第291-300页))；ALS启动子，如PCT申请号WO 1996/30530中所描述，以及其他来自技术人员知道的各种植物基因的转录起始区。对于本发明而言，泛素启动子是用于单子叶植物中表达的优选启动子。
或者，植物启动子可指导本发明的多核苷酸在特定组织中的表达或者可另外在更精确的环境或发育控制下的表达。此类启动子可为“诱导型”启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件包括病原体攻击、无氧条件或光的存在。诱导型启动子的例子是Adh1启动子(其可通过低氧或寒冷胁迫诱导)、Hsp70启动子(其可通过热胁迫诱导)和PPDK启动子(其可通过光诱导)。在昼夜节律期间的不同时间都有活性的昼夜启动子也是已知的(美国专利申请公布No.2011/0167517，以引用方式并入本文)。
在发育控制下的启动子的例子包括仅仅或优先在某些组织(诸如叶、根、果实、种子或花)中起始转录的启动子。取决于启动子在基因组的位置，启动子的操作也可以变化。因而，诱导型启动子在某些位置可变为完全或部分组成型的。
如果多肽表达是所需的，则通常期望在多核苷酸编码区的3′-端包括多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源于多种植物基因，或源于T-DNA。待添加的3′端序列可源于(例如)胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者源于另一植物基因，或较不优选地，源自任何其他真核基因。这种调控元件的例子包括但不限于3’末端和/或多腺苷酸化区，诸如根瘤农杆菌胭脂氨酸合酶(nos)基因的那些(Bevan，et al.，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85(Bevan等人，1983年，《核酸研究》，第12卷，第369-385页))；马铃薯蛋白酶抑制剂II(PINII)基因(Keil，et al.，(1986)Nucleic Acids Res.14：5641-50(Keil等人，1986年，《核酸研究》，第14卷，第5641-5650页)以及An，et al.，(1989)Plant Cell 1：115-22(An等人，1989年，《植物细胞》，第1卷，第115-122页))和CaMV 19S基因(Mogen，et al.，(1990)Plant Cell 2：1261-72(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页))。
可将内含子序列添加至部分编码序列的5′非翻译区或编码序列以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体中的转录单位中包含可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白水平上都能增加基因表达最高达1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405(Buchman和Berg，1988年，《分子细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页)；Callis，et al.，(1987)Genes Dev.1：1183-200(Callis等人，1987年，《基因与发育》，第1卷，第1183-1200页))。当设置在接近转录单位的5′端时，这种基因表达的内含子增强通常是最大的。玉蜀黍内含子Adh1-S内含子1、Adh1-S内含子2和Adh1-S内含子6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。一般参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，New York(1994)。
植物信号序列包括但不限于：编码将蛋白靶向植物细胞的胞外基质的信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos，et al.，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900(Dratewka-Kos等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第4896-4900页))，例如皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)延伸基因(DeLoose et al.，(1991)Gene 99：95-100(DeLoose等人，1991年，《基因》，第99卷，第95-100页))；将蛋白靶向液泡的信号肽，例如甘薯贮藏蛋白基因(Matsuka，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834(Matsuka等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第834页))和大麦凝集素基因(Wilkins，et al.，(1990)Plant Cell，2：301-13(Wilkins等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第301-313页))；导致蛋白被分泌的信号肽，例如PRIb信号肽(Lind，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53(Lind等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第47-53页))或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119(Rahmatullah等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第119页)，以引用方式并入本文)或者将蛋白靶向质体的信号肽，例如油菜烯脂酰Acp还原酶(Verwaert，et al.，(1994)PlantMol.Biol.26：189-202(Verwaert等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第189-202页))可用于本发明中。
包含来自本发明多核苷酸的序列的载体将通常包含标记基因，该标记基因可在植物细胞上赋予选择性表型。通常，选择性标记基因将编码抗生素抗性，合适的基因包括编码对壮观霉素这种抗生素的抗性的基因(例如aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草剂，特别是磺酰脲类除草剂的抗性的基因(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)、编码对起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂如草胺膦或basta的抗性的基因(例如bar基因)，或本领域已知的其他这种基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。
蛋白在宿主细胞中的表达
使用本发明的核酸，可以在重组工程改造的细胞如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或优选植物细胞中表达本发明的蛋白。这类细胞在非天然条件下(例如，在数量、组成、位置和/或时间方面)产生蛋白，因为它们已通过人为干预被遗传改变成在非天然条件下产生蛋白。
可以预期，本领域的技术人员知晓多种可用于表达编码本发明的蛋白的核酸的表达系统。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中表达蛋白的各种方法。
简单概括而言，编码本发明蛋白的分离核酸的表达通常可通过使例如DNA或cDNA可操作地连接至启动子(组成型或诱导型)、然后整合进表达载体中来实现。该载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有可用于调控编码本发明蛋白的DNA的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建表达载体，该表达载体在最低程度上含有用以指导转录的强启动子(如泛素启动子)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子。组成型启动子被分类为可提供一系列组成型表达。因而，某些是弱组成型启动子，而另一些是强组成型启动子。一般来讲，所谓“弱启动子”意指驱动编码序列以低水平表达的启动子。所谓“低水平”意指处于约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平。相反，“强启动子”以“高水平”或者约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物来驱动编码序列的表达。
技术人员将认识到，可对本发明的蛋白进行修饰而不减低其生物活性。可进行某些修饰以有利于目标分子的克隆、表达或掺入进融合蛋白中。这种修饰是本领域技术人员所熟知的，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一端设置额外的氨基酸(例如多聚His)以产生便利地定位的限制性位点或终止密码子或纯化序列。
在原核生物中的表达
原核细胞可用作表达的宿主。原核生物最常由多种大肠杆菌菌株代表；然而，也可以使用其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合位点序列的常用原核生物控制序列，包括诸如以下的常用启动子：β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和λ衍生PL启动子之类的常用启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature 292：128)。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标志物也是有用的。这种标志物的例子包括规定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得将所关注基因引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。用于表达本发明的蛋白的表达系统可用芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)(Palva，et al.，(1983)Gene 22：229-35(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页)；Mosbach，et al.，(1983)Nature 302：543-5(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。得自法玛西亚(Pharmacia)的pGEX-4T-1质粒载体是本发明的优选大肠杆菌表达载体。
在真核生物中的表达
多种真核表达系统如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞是本领域技术人员已知的。如下面简单解释的，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施例中，将转化的/转染的植物细胞(如下文所论述的)用作表达系统，用于产生本发明的蛋白。
异源蛋白在酵母中的合成是众所周知的。Sherman等人，(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory是描述多种可用于在酵母中产生蛋白的方法的广泛认可的著作。两种广泛采用的用于产生真核蛋白的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酵母属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia)中表达的载体、菌株和方案是本领域已知的并可从商业供应商(例如英杰公司(Invitrogen))获得。根据需要，合适的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸激酶或醇氧化酶启动子)和复制起始区、终止序列等等。
本发明的蛋白，一旦表达，可通过裂解细胞并向溶胞产物或离心沉淀物应用标准蛋白分离技术来从酵母分离。可通过使用蛋白印记技术或其他标准免疫测定技术的放射免疫测定法来完成对纯化过程的监测。
还可将编码本发明的蛋白的序列连接到多种用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物的表达载体。哺乳动物细胞系统通常会是单层细胞的形式，但也可使用哺乳动物细胞悬浮液。本领域已开发了多种能够表达完整蛋白的合适宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子(例如CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子)、增强子(Queen，et al.，(1986)Immunol.Rev.89：49(Queen等人，1986年，《免疫学评论》，第89卷，第49页))和必要的加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag多聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明的蛋白的其他动物细胞可从例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(《细胞系和杂交瘤目录》)(第7版，1992)获得。
用于在昆虫细胞中表达本发明的蛋白的适当载体通常源于SF9杆状病毒。合适的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、行军虫、蛾和果蝇(Drosophila)细胞系，例如Schneider细胞系(参见例如Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65(Schneider，1987年，《胚胎学和实验形态学杂志》，第27卷，第353-365页))。
如使用酵母一样，当采用高等动物或植物宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止子序列掺入进载体中。终止子序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于转录物的精确剪接的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，(1983)J.Virol.45：773-81(Sprague等人，1983年，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页))。另外，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列掺入到载体，诸如牛乳头瘤病毒类型的载体中存在的那些(Saveria-Campo，“BovinePapilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector”(牛乳头瘤病毒DNA：一种真核克隆载体)，载于DNA Cloning：APractical Approach，vol.II，Glover，ed.，IRL Press，Arlington，VA，pp.213-38(1985)(《DNA克隆：一种实用方法》，第II卷，Glover编辑，IRL出版社，弗吉尼亚州阿灵顿，第213-238页，1985年)。
另外，可将置于适当植物表达载体中的NUE基因用于转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织分离多肽或可将转化的细胞用于再生转基因植物。可收获这种转基因植物，将适当的组织(例如，种子或叶)进行大规模蛋白提取和纯化技术。
植物转化方法
有多种用于将外来基因引入植物中的方法是已知的并可用来将NUE多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki et al.，，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，MethodsinPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick and Thompson，eds.，CRCPress，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993)(Miki等人，“将外来DNA引入植物中的程序”，《植物分子生物学和生物技术方法》，Glick和Thompson编辑，波卡拉顿的CRC出版社，第67-88页，1993年)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法诸如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移诸如农杆菌介导的基因转移(Horsch，et al.，(1985)Science227：1229-31(Horsch等人，1985年，《科学》，第227卷，第1229-1231页))、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber，et al.，“Vectors for PlantTransformation，”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，supra，pp.89-119(Gruber等人，“植物转化载体”，《植物分子生物学和生物技术方法》，出处同上，第89-119页)。
可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞的技术将分离的多核苷酸或多肽引入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方案可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway，et al.，(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页)和美国专利No.6,300,543)、电穿孔(Riggs，et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页))，直接基因转移(Paszkowski et al.，(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))以及弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利No.4,945,050；WO 1991/10725和McCabe，et al.，(1988)Biotechnology6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))。还可参见Tomes，et al.，“Direct DNA Transfer intoIntact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment”pp.197-213in Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Fundamental Methods.eds.Gamborg and Phillips.Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995(Tomes等人，“通过微粒轰击将DNA直接转移到完整的植物细胞中”，第197-213页，《植物细胞、组织和器官培养基本方法》，Gamborg和Phillips编辑，施普林格出版社，柏林海德堡纽约，1995年)；美国专利No.5,736,369(分生组织)；Weissinger，et al.，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford等人，(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein，et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉蜀黍)；WO 1991/10725(玉蜀黍)；Klein等人，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉蜀黍)；Fromm，et al.，(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)和Gordon-Kamm，et al.，(1990)Plant Cell 2：603-618(Gordon-Kamm等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第603-618页)(玉蜀黍)；Hooydaas-Van Slogteren andHooykaas，(1984)Nature(London)311：763-764(Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，1984年，《自然》(伦敦)，第311卷，第763-764页)；Bytebierm，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet，et al.，(1985)In The Experimental Manipulation of OvuleTissues，ed.G.P.Chapman，et al.，pp.197-209.Longman，NY(De Wet等人，1985年，《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，第197-209页，朗文，纽约)(花粉)；Kaeppler，et al.，(1990)Plant Cell Reports 9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler，et al.，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(触须介导的转化)；美国专利No.5,693,512(超声波降解)；D’Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li，et al.，(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)以及Christou and Ford，(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda等人，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉蜀黍转化(美国专利No.5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame，et al.，(1994)Plant J.6：941-948(Frame等人，1994年，《植物杂志》，第6卷，第941-948页))；激光方法(Guo，et al.，(1995)Physiologia Plantarum 93：19-24(Guo等人，1995年，《植物生理学》，第93卷，第19-24页))；超声处理方法(Bao，et al.，(1997)Ultrasound in Medicine & Biology 23：953-959(Bao等人，1997年，《医学与生物学超声》，第23卷，第953-959页)；Finer和Finer，(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah，et al.，(2001)J Exp Bot52：1135-42(Amoah等人，2001年，《实验植物学杂志》，第52卷，第1135-1142页))；聚乙二醇方法(Krens，et al.，(1982)Nature 296：72-77(Krens等人，1982年，《自然》，第296卷，第72-77页))；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm，et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)，82：5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)，Mol.Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)进行转化；将这些文献全部以引用方式并入本文。
农杆菌介导的转化
根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1(Kado，1991年，《植物科学评论》，第10卷，第1页)。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人，出处同上和Moloney，et al.，(1989)Plant Cell Reports8：238(Moloney等人，1989年，《植物细胞报道》，第8卷，第238页)。
一旦构建后，可将这些质粒置于毛根农杆菌或根瘤农杆菌中并将这些载体用于转化植物物种的细胞，所述植物物种的细胞通常对镰孢属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染而言是易感的。本发明还可以想到若干其他转基因植物，包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。根瘤农杆菌或者毛根农杆菌的选择将取决于用其转化的植物。通常，根瘤农杆菌是用于转化的优选生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根瘤农杆菌感染是易感的。毛根农杆菌也具有广泛的宿主，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员在内。单子叶植物现在可以一定的成功率进行转化。欧洲专利申请No.604 662 A1公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请No.672 752 A1公开了使用未成熟胚的盾片用农杆菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人论述了通过使未成熟胚暴露于根瘤农杆菌来转化玉蜀黍的方法(Nature Biotechnology 14：745-50(1996)(《自然生物技术》，第14卷，第745-750页，1996年))。
一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植物可通过使该植物产生伤口，然后将载体引入该伤口位点来用这些载体进行感染。可使植物的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物组织来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。再生植物组织的此类方法的例子公开于Shahin，(1985)Theor.Appl.Genet.69：235-40(Shahin，1985年，《理论和应用遗传学》，第69卷，第235-240页)；美国专利No.4,658,082；Simpson等人，出处同上和均于1986年10月1日提交的美国专利申请序列号913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306所引用，将上述文献的全部公开内容以引用方式并入本文。
直接基因转移
已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。
一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在约1至4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolisticdevice)将表达载体引入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford，et al.，(1987)Part Sci.Technol.5：27(Sanford等人，1987年，《粒子科学与技术》，第5卷，第27页))；Sanford，(1988)Trends Biotech 6：299(Sanford，1988年，《生物技术趋势》，第6卷，第299页))；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206(Sanford，1990年，《植物生理学》，第79卷，第206页)和Klein，et al.，(1992)Biotechnology 10：268(Klein等人，1992年，《生物技术》，第10卷，第268页))。
物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)BioTechnology 9：996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes，et al.，(1985)EMBO J.4：2731(Deshayes等人，1985年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第4卷，第2731页)和Christou，et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962(Christou等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第3962页)。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中已有报道。参见例如Hain，et al.，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161(Hain等人，1985年，《分子遗传学和基因组学》，第199卷，第161页)和Draper，et al.，(1982)Plant Cell Physiol.23：451(Draper等人，1982年，《植物细胞生理学》，第23卷，第451页)。
降低多肽的活性和/或水平
提供了方法通过用表达可抑制多肽的表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞来降低或消除本发明的多肽的活性。该多核苷酸可通过防止信使RNA的转录或翻译来直接抑制多肽的表达，或者通过编码能抑制编码多肽的基因的转录或翻译的多肽来间接抑制多肽的表达。用于抑制或消除基因在植物中的表达的方法是本领域所熟知的，任何这种方法可用于本发明中来抑制多肽的表达。
根据本发明，如果多肽的蛋白水平为该同一多肽在未经过遗传修饰或诱变以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到70％，则多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据发明的经修饰的植物中的蛋白水平，为该同一多肽在不属于突变体的植物或者未经过遗传修饰以抑制该多肽的表达的植物中的蛋白水平的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％、不到5％或不到2％。多肽的表达水平可例如通过测定在植物细胞或植物中表达的多肽的水平来直接测量，或者例如通过测量该多肽在植物细胞或植物中的氮吸收活性或通过测量植物中的表型变化来间接测量。进行这种测定的方法在本文的其他地方进行了描述。
在本发明的其他实施例中，通过用表达盒转化植物细胞来降低或消除多肽的活性，所述表达盒包含编码可抑制多肽活性的多肽的多核苷酸。如果该多肽的活性为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的活性的植物中的活性的不到70％，则根据本发明抑制多肽的增加的氮利用活性。在本发明的具体实施例中，该多肽在根据本发明的经修饰的植物中的活性，为该同一多肽在未经过修饰以抑制该多肽的表达的植物中的活性的不到60％、不到50％、不到40％、不到30％、不到20％、不到10％或不到5％。当多肽的活性不能通过本文其他地方所描述的测定法检测时，则根据本发明该活性被“消除”了。测定多肽的氮利用活性的改变的方法在本文其他地方描述。
在其他实施例中，可通过破坏编码多肽的基因来降低或消除多肽的活性。本发明涵盖携带基因中的突变的诱变的植物，其中所述突变减少基因的表达或抑制编码的多肽的氮利用活性。
因而，有许多方法可用于降低或消除多肽的活性。此外，有不止一种方法可用于减少单种多肽的活性。
1.基于多核苷酸的方法：
在本发明的一些实施例中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本发明的多肽的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本发明的目的，能够表达可抑制至少一种多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本发明的至少一种多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白或多肽，而蛋白或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白或多肽。
可抑制多肽的表达的多核苷酸的例子在下面给出。
i.有义抑制/共抑制
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码多肽的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于共抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的全部或部分、多肽转录物的5′和/或3′非翻译区的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含多肽的编码区的全部或部分的一些实施例中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白产物。
共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白而言具有不可检测的蛋白水平的植物。参见例如Broin，et al.，(2002)PlantCell 14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)。共抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。使用共抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell，et al.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496(Flavell等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第3490-3496页)；Jorgensen，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973(Jorgensen等人，1996年，《植物分子生物学》，第31卷，第957-973页)；Johansen and Carrington，(2001)Plant Physiol.126：930-938(Johansen和Carrington，2001年，《植物生理学》，第126卷，第930-938页)；Broin，et al.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432(Broin等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1417-1432页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Yu，et al.，(2003)Phytochemistry63：753-763(Yu等人，2003年，《植物化学》，第63卷，第753-763页)和美国专利No.5,034,323、No.5,283,184和No.5,942,657，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置包括poly-dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质上的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利No.5,283,184和No.5,034,323，将它们以引用方式并入本文。
ii.反义抑制
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子与编码多肽的信使RNA的全部或部分互补。该反义RNA分子的过表达可导致靶基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别那些显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。
用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码多肽的序列的互补序列的全部或部分、靶转录物的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、或者编码多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补序列的全部或部分。此外，反义多核苷酸可与靶序列完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列的同一性低于100％)。反义抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白的表达。参见(例如)美国专利No.5,942,657。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般来讲，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、400、450、500、550或更多个核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中的内源基因的表达的方法在例如如下文献和专利中有描述：Liu，et al.，(2002)PlantPhysiol.129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)，以及美国专利No.5,759,829和No.5,942,657，将这些参考文献和专利的每一个以引用方式并入本文。反义抑制的效率可通过在表达盒中在反义序列的3′和多腺苷酸化信号的5′位置处包括poly-dT区来提高。参见美国专利申请公布No.2002/0048814，将其以引用方式并入本文。
iii.双链RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源信使RNA的表达的抑制。
有义和反义分子的表达可通将表达盒子设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。对用(一个或多个)dsRNA干扰表达盒转化的多个植物株系进行筛选以鉴别显示出所需的多肽表达抑制程度的植物株系。使用dsRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse，et al.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-13964(Waterhouse等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第13959-13964页)，Liu，et al.，(2002)Plant Physiol.，129：1732-1743(Liu等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1732-1743页)以及WO 1999/49029、WO1999/53050、WO 1999/61631和WO 2000/49035，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
在本发明的一些实施例中，对多肽表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。参见Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)及其中引用的参考文献中有描述。
对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。或者，碱基配对茎区可对应于控制其表达待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因此，该分子的碱基配对茎区通常确定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因表达中很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。参见例如Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)以及Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法在例如以下文献和专利中有描述：Chuang and Meyerowitz，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990(Chuang和Meyerowitz，2000年，《美国国家科学院院刊》，第97卷，第4985-4990页)；Stoutjesdijk，et al.，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731(Stoutjesdijk等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第1723-1731页)；Waterhouse and Helliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Pandolfini et al.，BMC Biotechnology 3：7(Pandolfini等人，《BMC生物技术》，第3卷，第7页)，以及美国专利申请公布No.2003/0175965，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140(Panstruga等人，2003年，《分子生物学报道》，第30卷，第135-140页)，该文献以引用方式并入本文。
对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环区大小在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如，Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源基因表达受到100％抑制。使用ihpRNA干扰来抑制内源植物基因的表达的方法例如在Smith，et al.，(2000)Nature 407：319-320(Smith等人，2000年，《自然》，第407卷，第319-320页)；Wesley，et al.，(2001)Plant J.27：581-590(Wesley等人，2001年，《植物杂志》，第27卷，第581-590页)；Wang and Waterhouse，(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150(Wang和Waterhouse，2001年，《当代植物生物学观点》，第5卷，第146-150页)；Waterhouse andHelliwell，(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38(Waterhouse和Helliwell，2003年，《自然综述遗传学》，第4卷，第29-38页)；Helliwell andWaterhouse，(2003)Methods30：289-295(Helliwell和Waterhouse，2003年，《方法》，第30卷，第289-295页)和美国专利申请公布No.2003/0180945中有所描述，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源RNA。在这个实施例中，该反义和有义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO2002/00904；Mette，et al.，(2000)EMBO J 19：5194-5201(Mette等人，2000年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第19卷，第5194-5201页)；Matzke，et al.，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227(Matzke等人，2001年，《遗传学与发育新见》，第11卷，第221-227页)；Scheid，et al.，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 99：13659-13662(Scheid等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第13659-13662页)；Aufsaftz，et al.，(2002)Proc.Nat’l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506(Aufsaftz等人，2002年，《美国国家科学院院刊》，第99卷，第4期，第16499-16506页)；Sijen，et al.，Curr.Biol.(2001)11：436-440(Sijen等人，《当代生物学》，2001年，第11卷，第436-440页))，将这些文献和专利以引用方式并入本文。
v.扩增子介导的干扰
扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能指导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。使用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在以下文献和专利中有描述：Angelland Baulcombe，(1997)EMBO J.16：3675-3684(Angell和Baulcombe，1997年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第16卷，第3675-3684页)，Angelland Baulcombe，(1999)Plant J.20：357-362(Angell和Baulcombe，1999年，《植物杂志》，第20卷，第357-362页)以及美国专利No.6,646,805，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
vi.核酶
在一些实施例中，由本发明的表达盒表达的多核苷酸是多肽的信使RNA特异性的催化性RNA或具有多肽的信使RNA特异性的核酶活性。因而，该多核苷酸引起内源信使RNA的降解，从而导致多肽的表达的降低。这个方法例如在美国专利No.4,987,071中进行了描述，将该专利以引用方式并入本文。
vii.小干扰RNA或微RNA
在本发明的一些实施例中，多肽表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因经RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂，miRNA在抑制内源基因表达方面很高效。参见例如Javier，et al.，(2003)Nature 425：257-263(Javier等人，2003年，《自然》，第425卷，第257-263页)，将该文献以引用方式并入本文。
对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源miRNA基因的RNA分子。例如，该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为了抑制NUE表达，从NUE转录物序列选择该22核苷酸序列，其含有有义取向的所述NUE序列的22个核苷酸和与该有义序列互补的相应反义序列的21个核苷酸。育性基因，无论内源还是外源，均可为miRNA靶基因。miRNA分子在抑制内源基因表达方面很高效，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。
2.基因表达的基于多肽的抑制
在一个实施例中，所述多核苷酸编码与编码多肽的基因结合的锌指蛋白，从而导致所述基因的表达降低。在特定实施例中，该锌指蛋白结合至NUE基因的调控区。在其他实施例中，该锌指蛋白结合至编码多肽的信使RNA并防止其翻译。选择被锌指蛋白靶向的位点的方法已例如在美国专利No.6,453,242中进行了描述，利用锌指蛋白来抑制植物中的基因表达的方法例如在美国专利申请公布No.2003/0037355中进行了描述，将这些专利每一个以引用方式全文并入本文。
3.蛋白活性的基于多肽的抑制
在本发明的一些实施例中，多核苷酸编码结合至少一条多肽并且降低多肽的增加的氮利用活性的抗体。在另一个实施例中，抗体的结合导致由细胞质量控制机制进行的抗体-NUE复合物的周转增加。抗体在植物细胞中的表达以及通过抗体表达并结合至植物细胞中的蛋白来抑制分子途径是本领域所熟知的。参见例如Conrad and Sonnewald，(2003)Nature Biotech.21：35-36(Conrad和Sonnewald，2003年，《自然生物技术》，第21卷，第35-36页)，将该文献以引用方式并入本文。
4.基因破坏
在本发明的一些实施例中，通过破坏编码多肽的基因，降低或消除多肽的活性。可通过本领域已知的任何方法来破坏编码多肽的基因。例如，在一个实施例中，通过转座子标签法破坏所述基因。在另一个实施例中，通过利用随机诱变或定向诱变来对植物进行诱变处理并选择具有减低了的氮利用活性的植物来破坏所述基因。
i.转座子标签法
在本发明的一个实施例中，使用转座子标签法降低或消除一个或多个多肽的活性。转座子标签法包括在内源NUE基因内插入转座子以降低或消除所述多肽的表达。“NUE基因”意指编码根据本发明的多肽的基因。
在该实施例中，通过在编码多肽的基因的调控区或编码区内插入转座子来降低或消除一种或多种多肽的表达。处于NUE基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其他调控序列内的转座子可用于降低或消除所编码多肽的表达和/或活性。
用于对植物中的特定基因进行转座子标记的方法是本领域所熟知的。参见例如Maes，et al.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96(Maes等人，1999年，《植物科学趋势》，第4卷，第90-96页)；Dharmapuri and Sonti，(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59(Dharmapuri和Sonti，1999年，《FEMS微生物学通讯》，第179卷，第53-59页)；Meissner，et al.，(2000)Plant J.22：265-274(Meissner等人，2000年，《植物杂志》，第22卷，第265-274页)；Phogat，et al.，(2000)J.Biosci.25：57-63(Phogat等人，2000年，《生物科学杂志》，第25卷，第57-63页)；Walbot，(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107(Walbot，2000年，《当代植物生物学观点》，第2卷，第103-107页)；Gai，et al.，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96(Gai等人，2000年，《核酸研究》，第28卷，第94-96页)；Fitzmaurice，et al.，(1999)Genetics 153：1919-1928(Fitzmaurice等人，1999年，《遗传学》，第153卷，第1919-1928页)。此外，在Bensen，et al.，(1995)Plant Cell 7：75-84(Bensen等人，1995年，《植物细胞》，第7卷，第75-84页)；Mena，et al.，(1996)Science 274：1537-1540(Mena等人，1996年，《科学》，第274卷，第1537-1540页)和美国专利No.5,962,764中描述了在选择的基因中选择Mu插入的TUSC方法，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
ii.活性降低的突变体植物
用于降低或消除植物中的内源基因的表达的另外方法也是本领域已知的，并且可类似地应用于本发明。这些方法包括其他形式的诱变，例如甲磺酸乙酯诱导的诱变、缺失诱变和快中子缺失诱变，快中子缺失诱变以反向遗传学方式(使用PCR)用于鉴别其中内源基因已缺失的植物株系。如需这些方法的例子，请参见Ohshima，et al.，(1998)Virology 243：472-481(Ohshima等人，1998年，《病毒学》，第243卷，第472-481页)；Okubara，et al.，(1994)Genetics 137：867-874(Okubara等人，1994年，《遗传学》，第137卷，第867-874页)和Quesada，et al.，(2000)Genetics154：421-436(Quesada等人，2000年，《遗传学》，第154卷，第421-436页)，将以上文献的每一个以引用方式并入本文。此外，一种用于筛选化学诱导的突变的快速且可自动化的方法TILLING(Targeting Induced LocalLesions In Genomes(定向诱导基因组局部突变))也适用于本发明，该方法利用变性HPLC或者对选定的PCR产物的选择性内切核酸酶消化。参见McCallum，et al.，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)，以引用方式并入本文。
影响基因表达或干扰所编码的蛋白的功能(增加的氮利用活性)的突变是本领域所熟知的。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变在抑制所编码的蛋白的活性方面是特别有效的。植物多肽的适于以消除活性为目标进行的诱变的保守残基已得到描述。可根据熟知的程序分离这种突变体，并且可通过遗传杂交对不同NUE基因座中的突变进行堆叠。参见例如Gruis，et al.，(2002)Plant Cell 14：2863-2882(Gruis等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第2863-2882页)。
在本发明的另一个实施例中，显性突变体由于基因倒位和重复基因座的重组可用于引发RNA沉默。参见例如Kusaba，et al.，(2003)Plant Cell15：1455-1467(Kusaba等人，2003年，《植物细胞》，第15卷，第1455-1467页)。
本发明涵盖另外的用于降低或消除一种或多种多肽的活性的方法。用于改变或突变植物中的基因组核苷酸序列的其他方法的例子是本领域已知的，包括但不限于使用RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链寡核苷酸、自互补RNA：DNA寡核苷酸以及重组工程寡核碱基(recombinogenic oligonucleobase)。这种载体和使用方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,565,350、No.5,731，181、No.5,756,325、No.5,760,012、No.5,795,972和No.5,871,984，将以上专利的每一个以引用方式并入本文。另参见WO 1998/49350、WO 1999/07865、WO 1999/25821和Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
iii.调节氮利用活性
在特定的方法中，通过在植物中增加多肽的水平或活性来降低植物中NUE调节剂的水平和/或活性。负调控分子的表达增加可降低下游造成改善的NUE表型的一个或多个基因的表达水平。
提高植物中的多肽的水平和/或活性的方法在本文其他地方进行了论述。简而言之，此类方法包括提供本发明的多肽给植物，从而增加该多肽的水平和/或活性。在其他实施例中，可通过这样来提供编码多肽的NUE核苷酸序列：向植物中引入包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸，表达该NUE序列，提高该多肽的活性，并因此减少植物或植物部分中的组织细胞的数目。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，植物组织的生长通过降低植物中多肽的水平和/或活性而增加。这种方法在本文其他地方进行了详细公开。在一个这样的方法中，将NUE核苷酸序列引入植物中，所述NUE核苷酸序列的表达降低了多肽的活性并从而增加植物或植物部分中的组织生长。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
如上面论述的，技术人员将认识到用于调节植物中的NUE的水平/活性的适当启动子。在本文其他地方已经公开了该实施例的示例性启动子。
在其他实施例中，此类植物在其基因组中已稳定地掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该NUE核苷酸序列可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
iv.调节根发育
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所谓“调节根发育”意指在与对照植物比较时植物根的发育的任何改变。根发育的这种改变包括但不限于：初生根的生长速率、根鲜重、侧根和不定根形成的程度、维管系统、分生组织发育或径向扩张度。
提供了用于调节植物中的根发育的方法。所述方法包括调节该多肽在植物中的水平和/或活性。在一种方法中，将本发明的NUE序列提供给植物。在另一种方法中，通过这样来提供NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更根发育。在另外其他的方法中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定掺入到植物的基因组中。
在其他方法中，通过改变多肽在植物中的水平或活性来调节根发育。活性的改变可导致以下对根发育的改变中的至少一项或多项：包括但不限于根生物量的改变和长度的改变。
本文所用的“根生长”涵盖单子叶植物和双子叶植物中构成根系的不同部分在根系发育的不同阶段的生长的所有方面。应当理解，根生长增强可由其各部分(包括初生根、侧根、不定根等)中的一者或多者的生长增强引起。
测量根系中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如美国专利申请公布No.2003/0074698和Werner，et al.，(2001)PNAS 18：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第18卷，第10487-10492页)，将这两篇文献以引用方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的根发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子和根偏好的启动子。示例性的根偏好的启动子已在本文别处公开。
通过降低多肽的活性和/或水平来刺激根生长和增加根的重量也在改善植物的抗倒伏性方面得到应用。术语“耐倒伏性”或“抗倒伏性”指植物使其自身固定至土壤的能力。对于具有竖立或半竖立生长习性的植物，该术语还指在不利(环境)条件下保持直立位置的能力。该性状涉及根系的尺寸、深度和形态。此外，通过改变多肽的水平和/或活性来刺激根生长和增加根重量也在促进外植体的体外繁殖方面得到应用。
此外，由于活性所致的较高的根生物量生产对产量具有直接的作用，并对根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物所产生的化合物的生产具有间接作用。在根培养物中产生的关注化合物的一个例子是紫草素(shikonin)，其产量可通过所述方法有利地增强。
因此，本发明还提供了与对照植物的根发育相比较时具有受调节的根发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性和具有增强了的根生长和/或根生物量。在其他实施例中，此类植物在其基因组中已稳定地掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该NUE核苷酸序列可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
v.调节苗和叶发育
还提供了用于调节植物中的苗和叶发育的方法。所谓“调节苗和/或叶发育”其意指植物苗和/或叶的发育的任何改变。苗和/或叶发育中的这种改变包括但不限于在苗分生组织发育方面、在叶数目、叶尺寸、叶和茎维管系统、节间长度和叶衰老方面的改变。本文所用的“叶发育”和“苗发育”涵盖在单子叶植物和双子叶植物中分别构成叶系统和苗系统的不同部分在这些系统发育的不同阶段中的生长的所有方面。测量苗和叶系统中的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Werner，et al.，(2001)PNAS98：10487-10492(Werner等人，2001年，《美国国家科学院院刊》，第98卷，第10487-10492页)和美国专利申请公布No.2003/0074698，将这两篇文献中的每一个以引用方式并入本文。
调节植物中苗和/或叶发育的方法包括调节本发明的多肽的活性和/或水平。在一个实施例中，提供本发明的NUE序列。在其他实施例中，可如下来提供该NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更苗和/或叶发育。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的实施例中，通过改变多肽在植物中的水平和/或活性来调节苗或叶发育。活性的变化可导致与对照植物相比，苗和/或叶发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)叶数量的变化、叶表面的改变、维管结构的改变、节间和植物生长以及叶衰老的改变。
如上面所论述的，技术人员将会认识到用于调节植物的苗和叶发育的适当启动子。用于这个实施例的示例性启动子包括组成型启动子、苗偏好的启动子、苗分生组织偏好的启动子和叶偏好的启动子。示例性的启动子已在本文别处公开。
提高植物中的活性和/或水平可导致节间和生长的改变。因此，本发明的方法可用于产生经修饰的植物。另外，如上所讨论，植物中的活性同时调节根和苗生长。因而，本发明还提供了用于改变根/苗比的方法。可通过改变植物中的多肽的水平和/或活性，来进一步调节苗或叶发育。
因此，本发明还提供了与对照植物相比较时具有受调节的苗和/或叶发育的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有提高了的本发明的多肽的水平/活性。在其他实施例中，本发明的植物具有降低了的本发明的多肽的水平/活性。
vi.调节生殖组织发育
提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施例中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(即花发育时刻的延迟或提前)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：生殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间周期，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。
调节植物中的花发育的方法包括调节植物中的活性。在一个方法中，提供本发明的NUE序列。可以通过这样来提供NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而变更花的发育。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
在具体的方法中，通过增加多肽在植物中的水平或活性来调节花发育。活性的变化可导致与对照植物相比，花发育的以下改变中的至少一项或多项：(包括但不限于)开花的改变、花数量的变化、雄性不育的修饰和结籽的改变。诱导开花延迟或抑制开花可用于增强诸如苜蓿之类的饲料作物的产量。用于测量花发育的这种发育改变的方法是本领域已知的。参见例如Mouradov，et al.，(2002)The Plant Cell S111-S130(Mouradov等人，2002年，《植物细胞》，第S111-S130页)，将该文献以引用方式并入本文。
如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好的启动子以及花序偏好的启动子。
在其他方法中，通过改变本发明的NUE序列的水平和/或活性来调节花发育。此类方法可包括将NUE核苷酸序列引入植物中并改变多肽的活性。在其他方法中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。改变本发明的NUE序列的表达能够调节胁迫期间的花发育。此类方法在本文别处进行了描述。因此，本发明还提供了与对照植物的花发育相比具有受调节的花发育的植物。组合物包括具有改变的本发明的多肽的水平/活性且具有改变的花发育的植物。组合物还包括具有经修饰的本发明多肽水平/活性的植物，其中该植物在胁迫期间保持或继续进行开花过程。
还提供了使用本发明的NUE序列来增加种子尺寸和/或重量的方法。该方法包括提高植物或植物部分(诸如种子)中的NUE序列的活性。种子尺寸和/或重量的增加包括种子尺寸或重量增加和/或一个或多个种子部分(包括例如胚芽、胚乳、种皮、糊粉或子叶)的尺寸或重量增加。
如上面所论述的，技术人员将认识到用于增加种子大小和/或种子重量的适当启动子。该实施例的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子偏好的启动子、胚偏好的启动子和胚乳偏好的启动子。
用于改变植物中的种子尺寸和/或种子重量的方法包括提高植物中的活性。在一个实施例中，可如下来提供该NUE核苷酸序列：将包含本发明的NUE核苷酸序列的多核苷酸引入植物中，表达该NUE序列，从而降低种子重量和/或尺寸。在其他实施例中，引入植物中的NUE核苷酸构建体被稳定地掺入到植物的基因组中。
还认识到，增加种子尺寸和/或重量可以还伴随有籽苗生长速度的增加或早期活力的增加。如本文所用，术语“早期活力”是指植物在早期发育过程中快速生长的能力，涉及到萌发之后发育良好的根系和发育良好的光合器的成功建立。此外，当与对照比较时，种子尺寸和/或重量的增加还可导致植物产量的增加。
因此，本发明还提供了当与对照植物比较时具有增加的种子重量和/或种子尺寸的植物。在其他实施例中，还提供了具有增加的活力和植物产量的植物。在一些实施例中，本发明的植物具有经修饰的本发明的多肽的水平/活性和具有增加了的种子重量和/或种子尺寸。在其他实施例中，此类植物在其基因组中已稳定地掺入了包含本发明的NUE核苷酸序列的核酸分子，该NUE核苷酸序列可操作地连接至驱动在该植物细胞中的表达的启动子。
vii.NUE多核苷酸、表达盒和另外的多核苷酸的使用方法
本文所公开的核苷酸、表达盒和方法可用于调控任何异源核苷酸序列在宿主植物中的表达以便改变植物表型。有多种表型变化是值得关注的，包括修饰植物中的脂肪酸组成、变更植物的氨基酸含量、变更植物的病原体防御机制等等。这些结果可通过在植物中表达异源产物或增加内源产物的表达来实现。或者，这些结果可通过在植物中减少一种或多种内源产物(特别是酶或辅因子)的表达来实现。这些改变导致转化植物的表型变化。
在某些实施例中，可将本发明的核酸序列与所关注的其他多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。生成的组合可包括所关注多核苷酸中的任何一者或多者的多个拷贝。本发明的多核苷酸可以与任何基因或基因的组合堆叠以产生具有多种所需的性状组合的植物，所述性状包括但不限于动物饲料所需的性状例如高油基因(例如美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionins(美国专利No.5,990,389、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)和WO1998/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen，et al.，(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara，et al.，(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)和Musumura，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))、提高了的消化性(例如经修饰贮藏蛋白(于2001年11月7日提交的美国专利申请序列号10/053,410)和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国专利申请序列号10/005,429))，将上述公开内容以引用方式并入本文。本发明的多核苷酸也可与抗虫、抗病或抗除草剂所需的性状堆叠(例如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,737,514、No.5723,756、No.5,593,881；Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))；凝集素(Van Damme，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825(Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页))；伏马毒素解毒基因(美国专利No.5,792,931)；无毒基因和抗病基因(Jones，et al.，(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martin，et al.，(1993)Science 262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos，et al.，(1994)Cell 78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草丁膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))以及加工或处理产品所需的性状例如高油(例如美国专利No.6,232,529)；改性油(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO 1994/11516))；改性淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉去分支酶(SDBE))和聚合物或生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)，上述公开内容以引用方式并入本文。还可以将本发明的多核苷酸与影响例如雄性不育(例如参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农学性状或者例如细胞周期调控或基因靶向(例如WO 1999/61619；WO2000/17364；WO 1999/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸组合，以上公开内容以引用方式并入本文。已知的赋予对除草剂(诸如，生长素、HPPD、草甘膦、麦草畏、草胺膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂)的耐受性的基因可作为分子堆叠或育种堆叠与表达本文所公开性状的植物堆叠。编码涉及除草剂耐受性的蛋白的多核苷酸分子包括但不限于编码在美国专利No.39,247、No.6,566,587中公开的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)并且用于赋予草甘膦耐性的多核苷酸分子；编码在美国专利No.5,463,175中公开的草甘膦氧化还原酶(GOX)和在美国专利No.7,622,641、No.7,462,481、No.7,531,339、No.7,527,955、No.7,709,709、No.7,714,188和No.7,666,643中公开的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)，还用于提供草甘膦耐性的多核苷酸分子；在美国专利No.7,022,896和WO 2007/146706 A2中公开的用于提供麦草畏耐性的麦草畏单氧酶；编码在美国专利申请公布No.2005/731044或WO 2007/053482 A2中公开的AAD12或编码在美国专利申请公布No.2011/0124503 A1或美国专利No.7,838,733中公开的AAD1以用于提供对生长素除草剂(2，4-D)的耐受性的多核苷酸分子；编码羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)以用于提供对HPPD抑制剂(例如，羟基苯丙酮酸双加氧酶)的耐受性的多核苷酸分子，所述HPPD抑制剂在例如美国专利No.7,935,869、美国专利申请公布No.2009/0055976 A1和No.2011/0023180 A1中公开，每个公布均全文以引用方式并入本文。
可与本文公开的性状结合的除草剂耐受性性状的其他例子包括由编码外源草丁膦乙酰转移酶的多核苷酸赋予的那些，如美国专利No.5,969,213、No.5,489,520、No.5,550,318、No.5,874,265、No.5,919,675、No.5,561,236、No.5,648,477、No.5,646,024、No.6,177,616和No.5,879,903中所述。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物可表现出对抑制谷氨酰胺合成酶的草胺膦除草剂的改善的耐受性。除草剂耐受性性状的其他例子包括由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸所赋予的那些，如美国专利No.6,288,306 B1、No.6,282,837 B1和No.5,767,373以及国际公开WO 2001/12825中所述。包含此类多核苷酸的植物可对靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的多种除草剂中的任一种表现出改善的耐受性。
在一个实施例中，所关注序列可改善植物生长和/或作物产量。例如，所关注序列包括可导致初生根系或侧根系改善的农学上重要的基因。这类基因包括但不限于营养物质/水转运蛋白和生长诱导。这类基因的例子包括但不限于玉蜀黍质膜H+-ATP酶(MHA2)(Frias，et al.，(1996)Plant Cell8：1533-44(Frias等人，1996年，《植物细胞》，第8卷，第1533-1544页))；AKT1，即拟南芥中钾吸收组织的组分(Spalding，et al.，(1999)JGen Physiol 113：909-18(Spalding等人，1999年，《普通生理学杂志》，第113卷，第909-918页))；RML基因，其在根尖细胞中激活细胞分裂周期(Cheng，et al.，(1995)Plant Physiol 108：881(Cheng等人，1995年，《植物生理学》，第108卷，第881页))；玉蜀黍谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya，et al.，(1994)Plant Mol Biol 26：1935-46(Sukanya等人，1994年，《植物分子生物学》，第26卷，第1935-1946页))和血红蛋白(Duff，et al.，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752(Duff等人，1997年，《生物化学杂志》，第27卷，第16749-16752页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第115卷，第1259-1266页)；Arredondo-Peter，et al.，(1997)Plant Physiol 114：493-500(Arredondo-Peter等人，1997年，《植物生理学》，第114卷，第493-500页)以及其中引用的参考文献)。所关注序列还可用于表达负面影响根发育的基因反义核苷酸序列。
另外，除了利用传统的育种方法外，还可遗传改变诸如油脂、淀粉和蛋白含量之类的农学上重要的性状。修饰包括增加油酸、饱和或不饱和油的含量、增加赖氨酸或硫的水平、提供必需氨基酸以及修饰淀粉。美国专利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修饰，将这些专利以引用方式并入本文。另一个例子是美国专利No.5,850,016中所描述的由大豆2S白蛋白编码的富赖氨酸和/或富硫种子蛋白，以及在Williamson，et al.，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)中所述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，将所述专利和文献的公开内容以引用方式并入本文。
昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这类基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,736,514、No.5,723,756、No.5,593,881和Geiser，et al.，(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页))等等。
还可在基因上编码商业性状，所述基因可增加例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白的表达。转化植物的另一重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，如在美国专利No.5,602,321中描述的。诸如β-酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶之类的基因(参见Schubert，et al.，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))可促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和产物以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些。这类产物包括酶、辅因子、激素等等。可增加蛋白，特别是具有改善的氨基酸分布以改善植物营养价值的修饰蛋白的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白来实现。
可操作地连接到核苷酸序列的启动子可为在植物细胞中是活性的任何启动子，特别是在植物的生殖组织(例如，雄蕊或子房)中是活性(或可被激活)的启动子。同样地，启动子可为，例如，组成型活性启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或发育阶段特异性启动子。另外，第一外源核酸分子的启动子可与第二外源核酸分子的启动子相同或不同。
一般来讲，启动子基于，例如，要被抑制的内源育性基因是雄性育性基因还是雌性育性基因来选择。因而，在要被抑制的内源基因为雄性育性基因(例如，BS7基因和SB200基因)的情况下，启动子可为雄蕊特异性和/或花粉特异性启动子，诸如MS45基因启动子(美国专利No.6,037,523)、5126基因启动子(美国专利No.5,837,851)、BS7基因启动子(WO 2002/063021)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)、TA29基因启动子(Nature 347：737(1990)(《自然》，第347卷，第737页，1990年))、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085、美国专利No.5,545,546、Plant J 3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,837,850和No.5,589,610)等，使得hpRNA在花粉囊和/或花粉中或在产生花药细胞和/或花粉的组织中表达，从而减少或抑制内源雄性育性基因的表达(即，使内源雄性育性基因失活)。相比之下，在要被抑制的内源基因为雌性育性基因的情况下，启动子可为(例如)子房特异性启动子。然而，如本文所公开的，可使用引导在所关注组织中的表达的任何启动子，包括例如，组成型活性启动子，诸如泛素启动子，其通常在大多数或所有植物细胞中进行转录。
基因组编辑和诱导的诱变
一般来讲，修改或改变宿主内源基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也用于使核酸靶向基因组中预先工程改造的靶标识别序列。例如，本文所述的经过遗传修饰的细胞或植物使用“定制的”大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(参见例如WO 2009/114321；Gao，et al.，(2010)Plant Journal 1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页))。另一个定点工程改造通过使用限制性酶的限制特性结合的锌指结构域识别。参见例如Urnov，et al.，(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46(Urnov等人，2010年，《自然综述遗传学》，第11卷，第9期，第636-646页)；Shukla，et al.，(2009)Nature 459(7245)：437-41(Shukla等人，2009年，《自然》，第459卷，第7245期，第437-441页)。
“TILLING”或“定向诱导基因组局部突变”是指用于生成和/或鉴别并且最终分离具有受调节的表达和/或活性的特定核酸的诱变变体的诱变技术(McCallum，et al.，(2000)，Plant Physiology 123：439-442(McCallum等人，2000年，《植物生理学》，第123卷，第439-442页)；McCallum，etal.，(2000)Nature Biotechnology 18：455-457(McCallum等人，2000年，《自然生物技术》，第18卷，第455-457页)和Colbert，et al.，(2001)PlantPhysiology 126：480-484(Colbert等人，2001年，《植物生理学》，第126卷，第480-484页))。TILLING的方法是本领域中所熟知的(美国专利No.8,071,840)。
也可采用其他诱变方法将突变引入STPP基因。用于将基因突变引入植物基因并且选择具有所需性状的植物的方法是熟知的。例如，可根据标准技术用诱变化学物质处理种子或其他植物材料。此类化学物质包括但不限于以下物质：硫酸二乙酯、乙烯亚胺和N-亚硝基-N-乙基脲。或者，可使用来自源诸如X射线或γ射线的电离辐射。
示例性组成型启动子包括35S花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子(Odell，et al.，(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、玉蜀黍泛素启动子(Christensen，et al.，(1989)PlantMol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；Rsyn7启动子的核心启动子和WO 1999/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；水稻肌动蛋白(McElroy，etal.，(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；pEMU(Last，et al.，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten，et al.，(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.5,641,876、WO 2000/70067)、玉蜀黍组蛋白启动子(Brignon，et al.，(1993)Plant Mol Bio 22(6)：1007-1015(Brignon等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第6期，第1007-1015页)；Rasco-Gaunt，et al.，(2003)Plant Cell Rep.21(6)：569-576(Rasco-Gaunt等人，2003年，《植物细胞报告》，第21卷，第6期，第569-576页))等等。其他组成型启动子包括，例如，在美国专利No.5,608,144和No.6,177,611以及PCT公开No.WO 2003/102198中所述的那些。
组织特异性、组织偏好的或阶段特异性调控元件还包括，例如，AGL8/FRUITFULL调控元件，其在成花诱导时被激活(Hempel，et al.，(1997)Development 124：3845-3853(Hempel等人，1997年，《发育》，第124卷，第3845-3853页))；根特异性调控元件，诸如来自RCP1基因和LRP1基因的调控元件(Tsugeki and Fedoroff，(1999)Proc.Natl.Acad.，USA96：12941-12946(Tsugeki和Fedoroff，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第12941-12946页)；Smith and Fedoroff，(1995)Plant Cell7：735-745(Smith和Fedoroff，1995年，《植物细胞》，第7卷，第735-745页))；花特异性调控元件，诸如来自LEAFY基因和APETALAl基因的调控元件(Blazquez，et al.，(1997)Development 124：3835-3844(Blazquez等人，1997年，《发育》，第124卷，第3835-3844页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；种子特异性调控元件，诸如来自油质蛋白基因的调控元件(Plant，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.25：193-205(Plant等人，1994年，《植物分子生物学》，第25卷，第193-205页))以及开裂区特异性调控元件。另外的组织特异性或阶段特异性调控元件包括Zn13启动子，其为花粉特异性启动子(Hamilton，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页))；异常花器官(UFO)启动子，其在顶端苗分生组织中是活性的；苗分生组织中是活性的启动子(Atanassova，et al.，(1992)Plant J.2：291(Atanassova等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第291页))；cdc2启动子和cyc07启动子(参见例如，Ito，et al.，(1994)Plant Mol.Biol.24：863-878(Ito等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第863-878页)；Martinez，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 89：7360(Martinez等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第7360页))；分生组织偏好的meri-5和H3启动子(Medford，et al.，(1991)Plant Cell 3：359(Medford等人，1991年，《植物细胞》，第3卷，第359页)；Terada，etal.，(1993)Plant J.3：241(Terada等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第241页))；大麦中Myb相关基因的分生组织和韧皮部偏好的启动子(Wissenbach，et al.，(1993)Plant J.4：411(Wissenbach等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第411页))；拟南芥属cyc3aAt和cyclAt(Shaul，etal.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：4868-4872(Shaul等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第4868-4872页))；长春花(C.roseus)细胞周期蛋白CYS和CYM(Ito，et al.，(1997)Plant J.11：983-992(Ito等人，1997年，《植物杂志》，第11卷，第983-992页))；和烟草属细胞周期蛋白B1(Trehin，et al.，(1997)Plant Mol.Biol.35：667-672(Trehin等人，1997年，《植物分子生物学》，第35卷，第667-672页))；APETALA3基因的启动子，其在花分生组织中是活性的(Jack，et al.，(1994)Cell 76：703(Jack等人，1994年，《细胞》，第76卷，第703页)；Hempel等人，出处同上，1997年)；agamous-like(AGL)家族成员的启动子，例如，AGL8，其在过渡到开花时在苗分生组织中是活性的(Hempel等人，出处同上，1997年)；花离区启动子；L1特异性启动子；增强催熟的番茄聚半乳糖醛酸酶启动子(Nicholass，et al.，(1995)Plant Mol.Biol.28：423-435(Nicholass等人，1995年，《植物分子生物学》，第28卷，第423-435页))，E8启动子(Deikman，et al.，(1992)Plant Physiol.100：2013-2017(Deikman等人，1992年，《植物生理学》，第100卷，第2013-2017页))以及果实特异性2Al启动子、来自玉蜀黍的U2和U5snRNA启动子、来自编码Z4 22kD玉米醇溶蛋白的基因的Z4启动子、来自编码10kD玉米醇溶蛋白的基因的Z10启动子、来自编码27kD玉米醇溶蛋白的基因的Z27启动子、来自编码19kD玉米醇溶蛋白的基因的A20启动子等等。另外的组织特异性启动子可使用熟知的方法进行分离(参见例如，美国专利No.5,589,379)。苗偏好的启动子包括苗分生组织偏好的启动子，诸如在Weigel，et al.，(1992)Cell69：843-859(Weigel等人，1992年，《细胞》，第69卷，第843-859页)(登录号M91208)中公开的启动子；登录号AJ131822；登录号Z71981；登录号AF049870以及在McAvoy，et al.，(2003)Acta Hort.(ISHS)625：379-385(McAvoy等人，2003年，《园艺学报》，国际园艺学会(ISHS)，第625卷，第379-385页)中公开的苗偏好的启动子。花序偏好的启动子包括查尔酮合酶的启动子(Van der Meer，et al.，(1992)Plant J.2(4)：525-535(Vander Meer等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第4期，第525-535页))，花粉囊特异性LAT52(Twell，et al.，(1989)Mol.Gen.Genet.217：240-245(Twell等人，1989年，《分子遗传学和基因组学》，第217卷，第240-245页))，花粉特异性Bp4(Albani，et al.，(1990)Plant MolBiol.15：605(Albani等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第605页)，玉蜀黍花粉特异性基因Zm13(Hamilton，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：211-218(Hamilton等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第211-218页)；Guerrero，et al.，(1993)Mol.Gen.Genet.224：161-168(Guerrero等人，1993年，《分子遗传学和基因组学》，第224卷，第161-168页))，小孢子特异性启动子诸如apg基因启动子(Twell，et al.，(1993)Sex.Plant Reprod.6：217-224(Twell等人，1993年，《有性植物繁殖》，第6卷，第217-224页))以及绒毡层特异性启动子，诸如TA29基因启动子(Mariani，et al.，(1990)Nature 347：737(Mariani等人，1990年，《自然》，第347卷，第737页)；美国专利No.6,372,967)以及其他雄蕊特异性启动子诸如MS45基因启动子、5126基因启动子、BS7基因启动子、PG47基因启动子(美国专利No.5,412,085；美国专利No.5,545,546；Plant J 3(2)：261-271(1993)(《植物杂志》，第3卷，第2期，第261-271页，1993年))、SGB6基因启动子(美国专利No.5,470,359)、G9基因启动子(美国专利No.5,8937,850；美国专利No.5,589,610)、SB200基因启动子(WO 2002/26789)等等(参见实例1)。组织偏好的所关注启动子还包括向日葵花粉表达基因SF3(Baltz，et al.，(1992)The Plant Journal 2：713-721(Baltz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第713-721页))、甘蓝型油菜(B.napus)花粉特异性基因(Arnoldo，et al.，(1992)J.Cell.Biochem，Abstract Number Y101204(Arnoldo等人，1992年，《细胞生物化学杂志》，摘要编号Y101204))。组织偏好的启动子还包括由如下文献所报告的那些：Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)(psadb)；Kawamata，et al.，(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)(PsPAL1)；Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)(ORF13)；Russell，et al.，(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)(糯性蛋白基因启动子或ZmGBS；27kDa玉米醇溶蛋白启动子，ZmZ27；osAGP；osGT1)；Rinehart，et al.，(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)(来自棉花的Fb12A)；Van Camp，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)(烟草属SodA1和SodA2)；Canevascini，et al.，(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)(烟草属ltp1)；Yamamoto，et al.，(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)(松属(Pinus)cab-6启动子)；Lam，(1994)Results Probl.CellDiffer.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)(菠菜二磷酸核酮糖羧化酶活化酶(Rca))；Matsuoka，et al.，(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)(PPDK启动子)和Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)(农杆菌pmas启动子)。在雄性或雌性生殖器官的细胞中是活性的组织特异性启动子可在本发明的某些方面特别有用。
“种子偏好的”启动子包括“种子发育”启动子(那些启动子在种子发育期间活跃，例如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(那些启动子在种子萌发期间活跃)。参见Thompson，et al.，(1989)BioEssays 10：108(Thompson等人，1989年，《生物学论文集》，第10卷，第108页)。此类种子偏好的启动子包括但不限于Ciml(细胞分裂素诱导信息)、cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)、milps(肌醇-1-磷酸合酶)；参见WO 2000/11177和美国专利No.6,225,529。γ-玉米醇溶蛋白基因启动子是胚乳特异性启动子。球蛋白-1(Glob-1)基因启动子是代表性的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆素基因启动子、油菜籽蛋白(napin)基因启动子、β-伴球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。对于单子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子、糯性蛋白基因启动子、超甜蛋白1基因启动子、超甜蛋白2基因启动子、球蛋白1基因启动子等。还参见WO 2000/12733和美国专利No.6,528,704，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好的启动子。另外的胚特异性启动子在如下文献中公开：Sato，et al.，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93：8117-8122(Sato等人，1996年，《美国国家科学院院刊》，第93卷，第8117-8122页)(水稻同源盒，OSH1)和Postma-Haarsma，et al.，(1999)Plant Mol.Biol.39：257-71(Postma-Haarsma等人，1999年，《植物分子生物学》，第39卷，第257-271页)(水稻KNOX基因)。另外的胚乳特异性启动子在如下文献中公开：Albani，et al.，(1984)EMBO 3：1405-15(Albani等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第1405-1415页)；Albani，et al.，(1999)Theor.Appl.Gen.98：1253-62(Albani等人，1999年，《理论与应用遗传学》，第98卷，第1253-1262页)；Albani，et al.，(1993)Plant J.4：343-55(Albani等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第343-355页)；Mena，et al.，(1998)ThePlant Journal 116：53-62(Mena等人，1998年，《植物杂志》，第116卷，第53-62页)(大麦DOF)；Opsahl-Ferstad，et al.，(1997)Plant J 12：235-46(Opsahl-Ferstad等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第235-246页)(玉蜀黍Esr)和Wu，et al.，(1998)Plant Cell Physiology 39：885-889(Wu等人，1998年，《植物细胞生理学》，第39卷，第885-889页)(水稻GluA-3、GluB-1、NRP33、RAG-1)。
诱导型调控元件是能够响应诱导物而直接或者间接激活一个或者多个DNA序列或者基因的转录的调控元件。诱导物可以是化学剂诸如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或者酚类化合物，或生理胁迫(诸如通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加的，或通过病原体或病害物诸如病毒的作用间接施加的)，或其他生物制剂或物理因素或环境条件。可通过以下方式使含有可诱导调控元件的植物细胞暴露于诱导物：通过将该诱导物例如通过喷雾、喷淋、加热或类似方法而外施于该细胞或者植物。用于诱导来自诱导型启动子的表达的诱导剂基于特定的诱导型调控元件进行选择。响应于在诱导剂下暴露，来自诱导型调控元件的转录通常被从头引发或增加超过基础或组成表达水平。通常特异性结合到诱导型调控元件以激活转录的蛋白因子以失活形式存在，然后其由诱导物直接或间接转化为活性形式。任何诱导型启动子均可用于本发明(参见Ward，et al.，(1993)PlantMol.Biol.22：361-366(Ward等人，1993年，《植物分子生物学》，第22卷，第361-366页))。
诱导型调控元件的例子包括金属硫蛋白调控元件、铜诱导型调控元件或四环素诱导型调控元件，来自所述调控元件的转录可分别响应于二价金属离子、铜或四环素而实现(Furst，et al.，(1988)Cell 55：705-717(Furst等人，1988年，《细胞》，第55卷，第705-717页)；Mett，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 90：4567-4571(Mett等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第4567-4571页)；Gatz，et al.，(1992)Plant J.2：397-404(Gatz等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第397-404页)；Roder，et al.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Roder等人，1994年，《分子遗传学和基因组学》，第243卷，第32-38页))。诱导型调控元件还包括蜕皮激素调控元件或糖皮质类固醇调控元件，来自所述调控元件的转录可响应于蜕皮激素或其他类固醇而实现(Christopherson，et al.，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Schena，et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-10425(Schena等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第10421-10425页)；美国专利No.6,504,082)；冷响应调控元件或热休克调控元件，所述调控元件的转录可响应于分别暴露在冷或热下而实现(Takahashi，et al.，(1992)Plant Physiol.99：383-390(Takahashi等人，1992年，《植物生理学》，第99卷，第383-390页))；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach，et al.，(1982)PNAS USA 79：2981-2985(Gerlach等人，1982年，《美国国家科学院院刊》，第79卷，第2981-2985页)；Walker，et al.，(1987)PNAS 84(19)：6624-6628(Walker等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第19期，第6624-6628页))，可无氧条件诱导；以及源于豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导型启动子(Yamamoto，et al.，(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页))；光诱导型调控元件(Feinbaum，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.226：449(Feinbaum等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第226卷，第449页)；Lam and Chua，(1990)Science 248：471(Lam和Chua，1990年，《科学》，第248卷，第471页)；Matsuoka，et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；Orozco，et al.，(1993)Plant Mol.Bio.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页))，植物激素诱导型调控元件(Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：905(Yamaguchi-Shinozaki等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第905页)；Kares，et al.，(1990)Plant Mol.Biol.15：225(Kares等人，1990年，《植物分子生物学》，第15卷，第225页))等等。诱导型调控元件还可为玉蜀黍In2-1或In2-2基因的启动子，其对应于苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey，et al.，(1991)Mol.Gen.Gene.227：229-237(Hershey等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页)；Gatz，et al.，(1994)Mol.Gen.Genet.243：32-38(Gatz等人，1994年，《分子遗传学和基因组学》，第243卷，第32-38页))和转座子Tn10的Tet阻遏子(Gatz，et al.，(1991)Mol.Gen.Genet.227：229-237(Gatz等人，1991年，《分子遗传学和基因组学》，第227卷，第229-237页))。胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫-诱导型启动子，诸如P5CS(Zang，et al.，(1997)Plant Sciences129：81-89(Zang等人，1997年，《植物科学》，第129卷，第81-89页))；冷-诱导型启动子，诸如cor15a(Hajela，et al.，(1990)Plant Physiol.93：1246-1252(Hajela等人，1990年，《植物生理学》，第93卷，第1246-1252页))、corl5b(Wlihelm，et al.，(1993)Plant Mol Biol 23：1073-1077(Wlihelm等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1073-1077页))、wsc120(Ouellet，et al.，(1998)FEBS Lett.423：324-328(Ouellet等人，1998年，《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》，第423卷，第324-328页))、ci7(Kirch，et al.，(1997)Plant Mol Biol.33：897-909(Kirch等人，1997年，《植物分子生物学》，第33卷，第897-909页))、ci21A(Schneider，et al.，(1997)Plant Physiol.113：335-45(Schneider等人，1997年，《植物生理学》，第113卷，第335-345页))；干旱-诱导型启动子，诸如Trg-31(Chaudhary，et al.，(1996)Plant Mol.Biol.30：1247-57(Chaudhary等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第1247-1257页))、rd29(Kasuga，et al.，(1999)Nature Biotechnology 18：287-291(Kasuga等人，1999年，《自然生物技术》，第18卷，第287-291页))；渗透诱导型启动子，诸如Rab17(Vilardell，et al.，(1991)PlantMol.Biol.17：985-93(Vilardell等人，1991年，《植物分子生物学》，第17卷，第985-993页))和渗透蛋白(Raghothama，et al.，(1993)Plant Mol Biol23：1117-28(Raghothama等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第1117-1128页))和热诱导型启动子，诸如热休克蛋白(Barros，et al.，(1992)Plant Mol.19：665-75(Barros等人，1992年，《植物分子》，第19卷，第665-675页)；Marrs，et al.，(1993)Dev.Genet.14：27-41(Marrs等人，1993年，《发育遗传学》，第14卷，第27-41页))、smHSP(Waters，et al.，(1996)J.Experimental Botany 47：325-338(Waters等人，1996年，《实验植物学杂志》，第47卷，第325-338页))和来自欧芹泛素启动子的热休克诱导型元件(WO 03/102198)。其他胁迫-诱导型启动子包括rip2(美国专利No.5,332,808和美国专利申请公布No.2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki，et al.，(1993)Mol.Gen.Genetics 236：331-340(Yamaguchi-Shinozaki等人，1993年，《分子遗传学和基因组学》，第236卷，第331-340页))。某些启动子通过创伤诱导，包括农杆菌pmas启动子(Guevara-Garcia，et al.，(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页))和农杆菌ORF13启动子(Hansen，et al.，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学和基因组学》，第254卷，第3期，第337-343页))。
适合本发明目的的植物可为单子叶植物或双子叶植物，并且包括但不限于玉蜀黍、小麦、大麦、裸麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁甘蓝、小红萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、夏南瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、桃子、蜜桃、杏子、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高梁、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥和木本植物诸如针叶树和落叶树。因而，本发明的转基因植物或经过遗传修饰的植物细胞可以为被子植物或裸子植物。
谷类植物，其产生可食用谷粒，包括例如，玉米、水稻、小麦、大麦、燕麦、裸麦、鸭茅、羊草和高粱。豆科植物包括碗豆家族(豆科(Fabaceae))的成员并且产生已知为豆类的特征性果实。豆科植物的例子包括，例如，大豆、豌豆、鹰嘴豆、乌头叶菜豆、蚕豆、菜豆、利马豆、兵豆、豇豆、干豆和花生，以及苜蓿、百脉根、三叶草和红豆草。具有用作油的来源的种子的油料植物包括大豆、向日葵、油菜籽(卡诺拉油菜)和棉籽。被子植物还包括阔叶树，其为通常具有单个茎(干)的多年生木本植物。此类树的例子包括桤木、白蜡树、山杨、椴木(椴树)、山毛榉、桦木、樱桃树、三角叶杨、榆树、桉树、山核桃树、刺槐、槭树、橡树、柿子树、白杨、悬铃木、胡桃、红杉和柳树。树可用作，例如，纸浆、纸、结构材料和燃料的来源。
纯合性为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。杂合性为当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座时存在的遗传条件。半合子状态为当仅存在基因(或基因组)的一个拷贝，而在姊妹染色体上没有对应等位基因时存在的遗传条件。
本文所用的植物育种方法是本领域技术人员公知的。对于植物育种技术的讨论参见Poehlman，(1987)Breeding Field Crops AVI Publication Co.，Westport Conn(Poehlman，1987年，《大田作物育种》，AVI出版公司，美国康涅狄格州韦斯特波特)。许多在本方法中可能是最优选的植物均通过利用植物授粉方法的技术育种。
可使用回交方法将基因引入植物。该技术已使用了数十年以将性状引入植物。描述该技术的例子以及人们所熟知的其他植物育种方法可在如下参考文献中找到，例如Plant Breeding Methodology，edit.Neal Jensen，JohnWiley & Sons，Inc.(1988)(《植物育种方法》，Neal Jensen编辑，约翰·威利父子出版公司，1988年)。在典型的回交方案中，初始所关注品种(回交亲本)与携带待转移的单个所关注基因的第二品种(非回交亲本)杂交。然后将这次杂交所得的子代再次与回交亲本杂交，并且重复该过程直至获得植物，其中除了来自非回交亲本的单个转移基因之外，回交亲本的基本所有所需形态和生理特性都在该转换的植物上恢复。
转基因是指通过基因工程技术被引入细胞的基因组的任何核酸序列。转基因可为天然DNA序列或异源DNA序列(即，“外来DNA”)。术语天然DNA序列是指天然存在于细胞中但可能已由其原始形式进行了修饰的核苷酸序列。
使用熟知的技术，可基于其序列同源性分离另外的启动子序列。在这些技术中，将已知的启动子序列的全部或者一部分用作探针，所述探针与来自所选生物体的克隆的基因组DNA片段群体(即基因组文库)中存在的其他序列选择性杂交。本领域中易得的用于核酸序列杂交的方法可用于获得对应于物种中的这些启动子序列的序列，所述物种包括但不限于玉蜀黍(玉米(Zea mays))、卡诺拉油菜(Brassica napus，Brassica rapa ssp.)、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高梁(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuus)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘属(Citrus spp.)、可可(Theobromacacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选地，植物包括玉蜀黍、大豆、向日葵、红花、卡诺拉油菜、小麦、大麦、裸麦、苜蓿和高粱。
整个启动子序列或其一部分可用作能够与对应的启动子序列特异性杂交的探针。为实现在多种条件下的特异性杂交，这类探针包括独特的序列，并且优选地长为至少约10个核苷酸，并且最优选地长为至少约20个核苷酸。此类探针可用于通过熟知的聚合酶链反应(PCR)的过程来扩增来自所选的生物体的对应启动子序列。该技术可用于从所需的生物体分离另外的启动子序列，或用作诊断分析以确定启动子序列在生物体中的存在。例子包括杂交筛选铺板的DNA文库(噬斑或菌落；参见例如Innis，et al.，(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，eds.，AcademicPress(Innis等人编辑，1990年，《PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社))。
一般来讲，对应于本发明的启动子序列并且与本文公开的启动子序列杂交的序列将与所公开的序列具有至少50％同源性、55％同源性、60％同源性、65％同源性、70％同源性、75％同源性、80％同源性、85％同源性、90％同源性、95％同源性和甚至98％同源性或更多。
特定启动子序列的片段可用于驱动所关注基因的表达。这些片段将包含本文所公开的具体启动子核苷酸序列的至少约20个连续核苷酸、优选地至少约50个连续核苷酸、更优选地至少约75个连续核苷酸、甚至更优选地至少约100个连续核苷酸。这类片段的核苷酸将通常包含该具体启动子序列的TATA识别序列。这类片段可通过使用限制性内切酶切割本文所公开的天然启动子序列来获得；通过合成来自天然DNA序列的核苷酸序列来获得；或者通过使用PCR技术来获得。具体参见Mullis，et al.，(1987)Methods Enzymol.155：335-350(Mullis等人，1987年，《酶学方法》，第155卷，第335-350页)和Erlich，ed.(1989)PCR Technology(Stockton Press，New York)(Erlich编辑，1989年，《PCR技术》，美国纽约斯托克顿出版社))。此外，这些片段的变体，诸如得自定点诱变的那些，都涵盖在本发明的组合物中。
可操作地连接至本文公开的调控元件的核苷酸序列可以为目标基因的反义序列。“反义DNA核苷酸序列”意在指与该核苷酸序列的5’-至-3’正常取向成相反取向的序列。当被递送到植物细胞中时，反义DNA序列的表达能防止目标基因的DNA核苷酸序列的正常表达。该反义核苷酸序列所编码的RNA转录物与目标基因的DNA核苷酸序列的转录所产生的内源信使RNA(mRNA)互补并能够与该内源信使RNA杂交。在这个情况下，由目标基因编码的天然蛋白的产生被抑制，以实现所需的表型响应。因此，受本文权利要求保护的调控序列可可操作地连接至反义DNA序列以降低或抑制植物中天然或外源蛋白的表达。
实例
实例1：拟南芥属群体的形成
形成了源自花椰菜花叶病毒35S启动子的包含四个多聚化增强子元件的构建体。该构建体还包含允许质粒拯救的载体序列(pUC9)，转座子序列(Ds)，以及允许对转基因植物进行草胺磷选择的bar基因。这些增强子元件可在DNA于基因组中整合后诱导基因组基因座的顺式激活。对拟南芥属植物进行转化，生成了携带增强子元件的拟南芥属植物群体以供进一步分析。
选择了总共100,000株耐草胺磷的T1籽苗。将得自各株系的T2种子保持分离。
实例2：进行筛选以鉴定具有改变了的根构型的株系
在实例1中所述的群体的早期发育期间，分析了在无限制氮条件下生长的带激活标签的拟南芥属籽苗与对照籽苗相比时改变的根系构型。
将得自本公司内部筛选的经验证的先导物进行垂直板测定，以评估增强了的根生长。结果用如下所述的进行验证。将T1或T2种子用50％家用漂白剂0.01％triton X-100溶液进行灭菌，然后以4粒种子/板的密度接种在含有以下培养基的平板上：0.5x无氮Hoagland’s、60mMKNO3、0.1％蔗糖、1mM MES和1％PhytagelTM，或以4粒种子/板的密度接种在含有以下培养基的平板上：0.5x无氮Hoagland’s、4mM KNO3、1％蔗糖、1mM MES和1％PhytagelTM。将各板在4℃下保持三天以对种子进行层积处理(stratify)，然后在22℃光照和20℃黑暗下垂直保持11天。光周期为16h光照和8h黑暗，且平均光强度为约160μmol/m2/s。将各板垂直放入具有10个板的架子的八个中央位置，第一个和最后一个位置放空白板。每隔一天旋转架子和架子内的板。对每个板拍两组照片。第一组照片是在第14-16天拍摄，此时大多数株系的初生根已到达板的底部，第二组照片是在两天后更多侧根发育后拍摄。后一组照片通常用于进行数据分析。用软件(丽晶仪器有限公司(Regent Instruments Inc.))分析这些在垂直板上生长的籽苗的根生长情况，该软件是一种专门设计用来进行根的测量的图像分析系统。使用像素对比度来将浅色根与较深色的背景相区分。为在不拾取背景的情况下鉴定到最大数量的根，像素分级为150-170，并且使用过滤特征来除去长宽比小于10.0的目标。各板上被分析的区域是从植物叶的边缘至离板底部约1cm处。使用完全相同的设置和分析区域来分析一个批次内的所有板。将给某板赋予的总根长度分数除以已萌发并向下生长至板的一半处的植物的数目。每个株系生长八个板，将它们的分数取平均值。然后将这个平均值与同时生长的含有野生型种子的八个板的平均值进行比较。
具有增强的根生长特性的株系预期位于根面积分布的上限。使用滑窗方法来评估给定的架子的根面积的方差，假定该架子中最多可有两个离群值(outlier)。各个因素的环境变化，包括生长培养基、温度和湿度在内，可造成根生长的显著变化，特别是在播种日期之间。因此，将各株系按播种日期和架层(shelf)进行分组以进行数据分析。然后按平均根面积对特定的播种日期/架层组中的架子进行分类。通过将某架子的数据ri与下一层架子的数据ri-1和上一层架子的平均根面积ri+1进行组合，执行滑窗的根面积分布。然后使用Grubbs型方法(Barnett，et al.，Outliers in Statistical Data，JohnWiley & Sons，3rd edition(1994)(Barnett等人，《统计数据中的离群值》，约翰威立国际出版公司，第3版，1994年))对组合的分布的方差进行分析以鉴定ri中的离群值。
在该测定中评估了单独过表达ZmSTPP3、AtPP1或其他AtTOPP家族成员的T1转基因植物。过表达这些序列(ZmSTPP3，SEQ ID NO：48；AtTOPP4，SEQ ID NO：53；AtTOPP2，SEQ ID NO：66；以及AtTOPP8，SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：114)中的每一者的转基因植物显示出在无限制硝酸盐条件下改善的根生长，而使用CaMV 35S启动子表达AtPP1(SEQID NO：85)、AtTOPP1(SEQ ID NO：64)、AtTOPP3(SEQ ID NO：75)、AtTOPP5(SEQ ID NO：65)、AtTOPP6(SEQ ID NO：74)和AtTOPP7(SEQID NO：67、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：118)的转基因植物在60mMKNO3的这些氮条件下被认为未表现出与对照植物不同的根构型表型。过表达ZmSTPP3(SEQ ID NO：48)的转基因植物当在含有4mM KNO3的板上生长时也显示出增强的根生长。
实例3：用于鉴定在硝酸盐吸收中涉及的基因的pH指示剂染料测定
使用以下pH指示剂染料测定进行了分析以鉴定与硝酸盐吸收有关的基因，如在2007年7月3日提交的美国专利申请序列号12/166,473中所详述。使用在2007年7月3日提交的美国专利申请序列号12/166,473中所详述的方案，使用CaMV 35S启动子过表达AtPP1(SEQ ID NO：85)的拟南芥属株系在培养基中剩余的硝酸盐比野生型对照明显更少(p＜0.05)。
除了AtPP1之外，使用CaMV 35S启动子过表达了ZmSTPP3(SEQ IDNO：48)和TOPP家族的其他拟南芥属成员(AtTOPP1-8；SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：65、SEQID NO：74、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：114、SEQ ID NO：86)，然后转化进拟南芥属并在该测定中进行了分析。过表达这些序列中的每一个导致在培养基中剩余的硝酸盐比野生型对照明显更少(p＜0.05)。表现出在培养基中剩余的硝酸盐更少的拟南芥属家族成员代表图2中的每个进化枝。
实例4：在氮限制条件下在拟南芥属中筛选基因
对于通过存在荧光标记YFP而选出的转基因种子，还可筛选它们在氮限制条件下生长的耐受性。将表达所关注的拟南芥属基因的转基因个体接种在低氮培养基(0.5x无氮Hoagland’s、0.4mM硝酸钾、0.1％蔗糖、1mMMES和0.25％PhytagelTM)上，使得在一个平板上有32个转基因个体在32个野生型个体旁边生长。在第10、11、12和13天对植株进行评估。如果某个株系与对照相比显示统计学上显著的差异，则认为该株系是经验证的氮缺陷耐受株系。在遮盖平板图像以去除背景颜色后，对每个个体收集两个不同的测量值：总莲座型叶丛面积和落入绿颜色仓的颜色的百分比。使用色调、饱和度、亮度数据(HIS)，绿颜色仓由色调50-66组成。总莲座型叶丛面积用作植物生物量的度量，而绿颜色仓已被剂量响应研究证实为氮同化的指标。
在该氮限制测定中评价了单独过表达AtPP1、ZmSTPP3和另外的拟南芥属TOPP家族成员的转基因植物。过表达AtPP1(SEQ ID NO：85)、AtTOPP8-1(SEQ ID NO：114)或AtTOPP4(SEQ ID NO：53)的转基因植物显示出总莲座型叶丛面积的增加和绿颜色仓的颜色改善，而表达ZmSTPP3(SEQ ID NO：48)、AtTOPP7-2(SEQ ID NO：116)或AtTOPP3(SEQ ID NO：75)的转基因拟南芥属植物被认为不与对照植物在莲座型叶丛面积方面有所不同，但显示出绿颜色仓的较浅颜色。AtTOPP1(SEQ ID NO：64)、AtTOPP7-1(SEQ ID NO：67)显示出总莲座型叶丛面积的增加。此外，使用CaMV 35S启动子表达AtTOPP5(SEQ ID NO：65)或AtTOPP6(SEQ ID NO：74)的转基因植物显示出两个参数(总莲座型叶丛面积和绿颜色仓的颜色)的减小。
实例5：在拟南芥属中测试增强的硝酸盐吸收
可将候选基因转化进拟南芥属中并在诸如35S或玉蜀黍泛素启动子的启动子下过表达。如果在转基因株系中观察到与在亲本带激活标签的株系中相同或相似的表型，则认为将该候选基因是拟南芥属中经验证的“先导基因”。可直接测试拟南芥属AtPP1(SEQ ID NO：85)基因增强拟南芥属中的硝酸盐吸收的能力。
使用标准转化程序将35S-At-PP1基因构建体引入到野生型拟南芥属生态型Col-0中。
可通过荧光YFP标记的存在而选择得自多个独立T1株系的转基因T2种子。使荧光种子经受按照本文所述程序的pH和硝酸盐吸收测定。针对每个构建体使用3或4个平板重新筛选转基因T2种子。每个平板包含非转化的哥伦比亚(Columbia)种子以用作对照。
实例6：NUE氮：碳测定
对拟南芥(对照和转基因株系)哥伦比亚生态型的种子进行表面灭菌，然后接种在含有5mM KNO3、5％蔗糖和0.75％(w/v)PhytagelTM(西格玛公司(Sigma))的0.5X无氮Murashige and Skoog(MS)培养基上，使得在同一平板上具有18粒野生型种子和18粒转基因种子。将平板在4℃下在黑暗中温育3天以打破休眠(层积)，随后转移至22℃的温度下处于16小时光照和20℃的温度下处于8小时黑暗的生长室。平均光强度为140μE/m2/s。使籽苗生长14天，且在第7天和第10天测量每条叶轴的长度。
实例7：NUE籽苗测定方案
使用种子颜色标记将转基因事件的种子分成转基因种子(杂合种子)和无效种子。对全部处理采用多次重复，对布置的每个区组的盆进行处理的随机分配。将同一构建体的若干事件的无效种子混合并用作对照，用于该区组中的阳性事件的比较。将转基因参数与批量(bulked)构建体无效对照进行比较，而在第二种情况下，将转基因参数与相应的事件无效对照进行比较。使用了标准统计分析。
将每种处理的两粒种子在8英寸错列中心台上的含有-MVP的4英寸见方的盆中种植，每天用含有如下营养物质的溶液浇四次：
出苗后，将植物稀疏至每盆一粒种子。处理植物按常规在周一栽培，在随后的周五萌发，在栽培18天后收获。收获时，从盆移取植物，并将Turface从根洗掉。将根与苗分离，置于纸袋中并在70℃下干燥70小时。将干燥的植物部分(根和苗)称重并置于带有大约20个5/32英寸的钢球的50ml锥形管中，并通过在涂料振荡器中振荡进行研磨。在170℃下将大约30mg经研磨的组织(记录重量以在后面作调整)在2ml 20％H2O2和6MH2SO4中水解30分钟。冷却后，将水添加至20ml，充分混合，移出50μl的等分试样并添加至950μl 1M Na2CO3。通过将100μl该溶液置于96孔板的各个孔中然后添加50μl OPA溶液，将该溶液中的氨用于估计总还原植物氮。测定荧光(激发＝360nm/发射＝530nm)并将其与溶解于类似溶液并用OPA溶液处理的NH4Cl标准品比较。
OPA溶液-5μl巯基乙醇+1ml OPA母液(每天新鲜制备)
OPA母液-溶解于1.5ml甲醇中的50mg邻苯二甲醛(OPA-Sigma#P0657)+4.4ml 1M硼酸盐缓冲液pH9.5(50ml水中3.09g H3BO4+1gNaOH)+0.55ml 20％SDS(每周新鲜制备)
使用这些数据，测量如下参数并利用学生t检验将平均值与无效对照参数平均值相比较：
总植物生物量
根生物量
苗生物量
根/苗比率
植物氮浓度
总植物氮
采用最近邻计算法以及通过采用完全随机设计(CRD)模型的方差分析，计算每个区组内的方差。通过将总体区组处理均方除以总体区组误差均方，利用F统计计算每个区组的总体处理效应。
实例8：相关蛋白的相互关系
拟南芥、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、高梁(Sorghum bicolor)、大豆(Glycine max)、珍珠粟(Pennisetum glaucum)、草香碗蕨(Dennstaedtiapunctilobula)和百喜草(Paspalum notatum)中PP1基因的系统发育和基序分析
丝氨酸/苏氨酸特异性磷蛋白磷酸酶(STPP)代表了使Ser/Thr侧链去磷酸化的一大家族磷酸酶。该较大的STPP家族包括PP1、PP2A和其他亚家族。蛋白序列在每个STPP亚家族内是高度保守的。STPP催化亚基的活性、特异性和定位在很大程度上由其相互作用调节亚基决定。以下分析关注于STPP蛋白的PP1亚家族。
收集了拟南芥属(TAIR10)PP1样蛋白的在玉蜀黍、大豆、高粱、水稻、蕨类植物、珍珠粟和百喜草中的STPP相关基因同源物。在所有其他七种植物物种中发现了与PP1蛋白具有至少70％同一性和80％覆盖度的总共58个同源物。这些序列彼此高度相似并且共有共同的Pfam金属磷结构域(PF00149)。所有58个PP1序列更详细地在表1中列出。使用MEGA5软件构造了58个PP1序列的系统发育树(图2)。相对于系统树图中的关键分支点，将PP1序列进一步分成不同的簇。
Pfam结构域分析表明，对于所分析的PP1蛋白而言，中心区(大约第69至第261位氨基酸)包含保守的金属磷结构域。包含PP1亚家族内的基因的任何差异的功能关系可能由C端和N端的差异导致。使用MEME(Multiple EM for Motif Elicitation)和ClustalX工具进行了基序分析，以鉴定STPP3蛋白的保守N端和C端基序。在一个实施例中，鉴定了STPP3蛋白的N端基序L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL和C端基序GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ。这些基序在图1中的多序列比对图谱中指出。这些基序可能通过与调节亚基的相互作用而发挥STPP3的功能作用。
实例9：cDNA文库的组成；cDNA克隆的分离和测序
制备了代表来自美人蕉(Canna edulis)、苦瓜(Momordica charantia)、芸苔属(Brassica)(芥菜)、瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)、玉米(Zea mays)(玉蜀黍)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthusannuus)和小麦(Triticum aestivum)的各种组织的mRNA的cDNA文库。可通过许多可用方法中的任何一种来制备cDNA文库。例如，可通过首先根据制造商方案(加利福利亚州拉荷亚吉泰克隆系统公司(Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA))在Uni-ZAPTM XR载体中制备cDNA文库来将cDNA引入质粒载体中。
利用改良的转座方案产生全长插入序列(FIS)数据。从存档的甘油原种(stock)将针对FIS鉴定出的克隆作为单一菌落回收，随后通过碱性裂解分离质粒DNA。使分离的DNA模板与载体引导的M13正向寡核苷酸和反向寡核苷酸在基于PCR的测序反应中反应并上样至自动测序仪上。克隆身份的确认通过与从中作出FIS请求的初始EST序列进行序列比对来进行。
通过Primer Island转座试剂盒(加利福尼亚州福斯特城PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems，Foster City，CA))对确认的模板进行转座，该试剂盒基于酿酒酵母Ty1转座元件(Devine and Boeke，(1994)NucleicAcids Res.22：3765-3772(Devine和Boeke，1994年，《核酸研究》，第22卷，第3765-3772页))。该体外转座系统在整个一群大DNA分子中随机地设置独特的结合位点。从每一转座反应随机地选择多个亚克隆，通过碱性裂解制备质粒DNA并利用对转座子内的结合位点有特异性的独特引物从转座事件位点向外对模板进行测序(ABI Prism dye-terminatorReadyReaction混合物)。
收集序列数据(ABI Prism Collections)并使用Phred和Phrap进行组装(Ewing，et al.，(1998)Genome Res.8：175-185(Ewing等人，1998年，《基因组研究》，第8卷，第175-185页)；Ewing and Green，(1998)GenomeRes.8：186-194(Ewing和Green，1998年，《基因组研究》，第8卷，第186-194页))。使用商业试剂盒并按照制造商方案将所得的DNA片段连接进pBluescript载体中。这个试剂盒选自可从若干厂商获得的许多试剂盒，这些厂商包括英杰公司(InvitrogenTM)(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad，CA))、普洛麦格生物技术公司(Promega Biotech)(威斯康辛州麦迪逊(Madison，WI))和吉比克/BRL生命技术公司(Gibco-BRL)(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD))。通过碱性裂解方法分离质粒DNA并提交用于测序和用Phred/Phrap进行组装，如上所述。
实例10：cDNA克隆的鉴定
通过针对与包含在BLAST“nr”数据库(包含所有非冗余的GenBankCDS翻译、源于三维结构Brookhaven Protein Data Bank、SWISS-PROT蛋白质序列数据库的最新主要发布版本、EMBL和DDBJ数据库的序列)中的序列的相似性执行BLAST(基本局部比对搜索工具；Altschul，et al.，(1993)J.Mol.Biol.215：403-410(Altschul等人，1993年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页)；另参见美国国立卫生研究院国立医学图书馆(National Library of Medicine of the National Institutes of Health)国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)万维网站上的BLAST算法的解释)搜索，鉴定了编码硝酸盐吸收相关样多肽的cDNA克隆。使用由美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法分析如本文所述获得的cDNA序列与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的DNA序列的相似性。将DNA序列在所有阅读框中翻译并使用由NCBI提供的BLASTX算法(Gish and States，(1993)Nat.Genet.3：266-272(Gish和States，1993年，《自然遗传学》，第3卷，第266-272页))将其与包含在“nr”数据库中的所有可公开获得的蛋白质序列比较相似性。为方便起见，通过BLAST计算观察到仅因为偶然原因cDNA序列与包含在所搜索数据库中的序列匹配的P值(概率)在本文中报道为“pLog”值，该值表示所报道P值的对数的负数。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST“命中序列”代表同源蛋白质的可能性就越高。
如上所述将提交进行分析的EST与Genbank数据库进行比较。含有更多5′或3′端序列的EST可通过针对共有序列同源的共同或重叠区域的核苷酸序列使用BLASTn算法(Altschul，et al.，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))来找到。当两个或更多个核酸片段之间存在共同的或重叠的序列时，可将这些序列组装成单条连续的核苷酸序列，因而在5′或3′端方向延伸了初始片段。一旦鉴定了最5′端的EST，便可通过如本文所述的全长插入测序来确定其完整序列。属于不同物种的同源基因可通过使用tBLASTn算法将已知基因(来自专有来源或公开数据库)的氨基酸序列对EST数据库进行比较来找到。tBLASTn算法针对在全部6个阅读框中翻译的核苷酸数据库搜索氨基酸查询。该搜索考虑到不同物种之间的核苷酸密码子用法的不同和密码子简并性。
实例11：植物表达载体的制备
可将用本领域技术人员已知的方法获得的PCR产物与供体载体诸如pDONRTM/Zeo(InvitrogenTM)组合。使用InvitrogenTM ClonaseTM技术，然后可将得自入门克隆的同源At3g05580基因转移到合适的目标载体以获得与拟南芥属和玉米一起使用的植物表达载体。例如，表达载体包含由玉蜀黍泛素启动子表达的At3g05580、除草剂抗性盒和种子分类盒(sorting cassette)。
实例12：农杆菌介导的向玉蜀黍中的转化
可转化玉蜀黍植物以过表达经验证的拟南芥属先导基因或得自各种物种的相应同源物以便检查所得的表型。
农杆菌介导的玉蜀黍的转化基本上如Zhao，et al.，(2006)Meth.Mol.Biol.318：315-323(Zhao等人，2006年，《分子生物学方法》，第318卷，第315-323页)所述来进行(另参见Zhao，et al.，(2001)Mol.Breed.8：323-333(Zhao等人，2001年，《分子育种》，第8卷，第323-333页)和1999年11月9日公布的美国专利No.5,981,840，将所述文献和专利以引用方式并入本文)。转化过程涉及细菌接种、共培养、静息、选择和植物再生。
可进行对转基因T0植物和T1植物的表型分析。
可分析T1植物的表型变化。使用图像分析，可分析T1植物在植物面积、体积、生长速率方面的表型变化，且在植物生长过程中的多个时间进行颜色分析。可如本文所述测定根构型的改变。
随后可分析农学特性的变化，以确定含有经验证的拟南芥属先导基因的植物与不含有经验证的拟南芥属先导基因的对照(或参照)植物相比，是否有至少一个农学特性的改善。还可在各种环境条件下研究这些变化。
实例13：使用粒子轰击通过经验证的先导基因转化玉蜀黍
可转化玉蜀黍植物以过表达经验证的拟南芥属先导基因或其他先导基因或得自各种物种的相应同源物以便检查所得的表型。
可使用实例12中所述的入门克隆将每个基因定向克隆到玉蜀黍转化载体中。基因在玉蜀黍中的表达可处于组成型启动子诸如玉蜀黍泛素启动子的控制下(Christensen，et al.，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen，et al.，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))。
然后可通过以下程序将以上所述的重组DNA构建体引入玉蜀黍细胞中。可从由玉蜀黍近交系H99和LH132的杂交得到的发育中的颖果切取玉蜀黍不成熟胚。在授粉后十至十一天在胚为1.0至1.5mm长时将胚分离。然后将胚以轴侧朝下放置，使其接触琼脂糖固化的N6培养基(Chu，et al.，(1975)Sci.Sin.Peking 18：659-668(Chu等人，1975年，《中国科学》，北京，第18卷，第659-668页))。将胚保持在暗处27℃下。从这些不成熟胚的盾片增生出由未分化的细胞团组成的脆性胚性愈伤组织，在胚柄结构上具有体细胞原胚状体和胚状体。从原代外植体分离的胚性愈伤组织可在N6培养基上进行培养并每隔两到三周在此培养基上分培。
可使用粒子轰击方法(Klein，et al.，(1987)Nature 327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》，第327卷，第70-73页))将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，用以下技术给金粒子(直径1μm)包被上DNA。将10μg质粒DNA加至50μL的金粒子悬浮液(60mg/mL)。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)添加至该粒子。在加入这些溶液的过程中将悬浮液旋涡混合。十分钟后，将管子稍作离心(15,000rpm下5秒)，除去上清液。将粒子重悬于200μL的无水乙醇中，再次离心，除去上清液。再次进行乙醇清洗，将粒子重悬于最终体积30μL的乙醇中。可将包被DNA的金粒子的等分试样(5μL)置于KaptonTM飞碟(flying disc)(伯乐公司(Bio-Rad Labs))的中央。然后用PDS-1000/He(加利福利亚州赫拉克勒斯伯乐仪器公司(Bio-Rad Instruments，Hercules CA))，以1000psi的氦压力、0.5cm的间隙距离和1.0cm的飞行距离，将粒子加速进玉蜀黍组织中。
为了进行轰击，将胚性组织置于覆盖琼脂糖固化的N6培养基的滤纸上。将组织安排成稀草坪(thin lawn)，覆盖约直径5cm的圆形区域。可将含有组织的培养皿放在PDS-1000/He的腔室中，离终止屏大约8cm。然后将腔室中的空气抽真空至28英寸Hg。使用可裂膜(rupture membrane)以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1000psi时破裂。
在轰击后七天，可将组织转移至含有双丙氨膦(5mg/l)而缺乏酪蛋白或脯氨酸的N6培养基。组织在此培养基上继续缓慢生长。再过两个星期，可将组织转移至含有双丙氨膦的新鲜N6培养基。六个星期后，可在一些含有补加了双丙氨膦的培养基的板上鉴定到直径约1cm的活跃生长的愈伤组织区域。这些愈伤组织当在选择性培养基上分培时可继续生长。
可通过首先将组织簇转移到补加有0.2mg 2，4-D/升的N6培养基，从转基因愈伤组织再生出植物。两个星期后，可将组织转移到再生培养基(Fromm，et al.，(1990)Bio/Technology8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页))。可再生出转基因T0植物并按照HTP程序确定它们的表型。可收集T1种子。
可使T1植物生长并分析表型变化。可使用图像分析对以下参数定量：可采集并定量植株面积、体积、生长速率和颜色分析。与合适的对照植物相比导致了根构型或以上所列农学特性中的任何一者的改变的表达构建体，可认为是该拟南芥属先导基因在玉蜀黍中起到改变根构型或植物构型的作用的证据。
此外，含有经验证的拟南芥属基因的重组DNA构建体可通过直接转化引入到玉蜀黍株系中，或者通过从单独转化的株系渗入来引入到玉蜀黍株系中。
转基因植物，无论是近交的还是杂交的，都可进行更严酷的大田实验，以在各种环境条件下(例如营养物和水可获得性的变化)研究根或植物构型、产量提升和/或根倒伏抗性。
随后还可以进行产量分析，以确定含有经验证的拟南芥属先导基因的植物与不含有经验证的拟南芥属先导基因的对照(或参照)植物相比，是否有产量表现的改善。含有经验证的拟南芥属先导基因的植物相对于对照植物而言会改善产量，优选地在不利环境条件下的产量损失减少50％，或者在不同的环境条件下相对于对照植物而言会具有提高的产量。
实例14：根瘤农杆菌LBA4404的电穿孔
将电穿孔感受态细胞(40μL)如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523)在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌低拷贝数质粒复制起点、四环素抗性基因和用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔小槽在冰上冷冻。将电穿孔仪设置调整为2.1kV。
将DNA等分试样(0.5μL JT(美国专利No.7,087,812)亲本DNA，在低盐缓冲液或双蒸H2O中浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的、同时仍在冰上的农杆菌细胞混合。将混合物转移到电穿孔小槽的底部并在冰上静置1-2分钟。按Eppendorf电穿孔仪2510的“Pulse”按键两次(理想地实现4.0毫秒(ms)脉冲)将细胞进行电穿孔。随后将0.5ml 2x YT培养基(或SOC培养基)添加至小槽并转移至15ml Falcon管。将细胞在28-30℃、200-250rpm下温育3小时。
将250μl等分试样铺展于#30B(YM+50μg/mL壮观霉素)板上并在28-30℃下温育3天。为增加转化体的数目，可进行以下两个任选的步骤之一：
选项1：用30μL 15mg/ml利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这个额外的选择消除了当使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时所观察到的某些污染性菌落。
选项2：该电穿孔重复进行两次，以补偿较差的电感受态细胞。
转化体的鉴定：
挑选四个独立菌落并划线接种于AB基本培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#12S培养基)以分离单一菌落。将平板在28℃下温育2-3天。
对每一推定的共整合子挑选单个菌落并接种4ml具有50mg/l壮观霉素的#60A。将混合物在振荡下于28℃温育24小时。使用Qiagen Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选用PB洗涤。将DNA在30μl中洗脱。将2μL等分试样用于如上所述对20μL的DH10b+20μL的双蒸H2O进行电穿孔。
任选地，可将15μl等分试样用于转化75-100μl InvitrogenTM LibraryEfficiency DH5α。将细胞铺展于LB培养基加50mg/mL壮观霉素平板(#34T培养基)上，并在37℃下温育过夜。
对每种推定的共整合子挑选三至四个独立的菌落并接种4ml具有50μg/ml壮观霉素的2xYT(#60A)。将细胞在振荡下于37℃下温育过夜。
用Miniprep从4ml培养物分离质粒DNA，任选进行PB洗涤(在50μl中洗脱)，并将8μl用于SalI消化(将JT亲本和PHP10523用作对照)。
对代表2种具有正确Sall消化模式(使用亲本DNA和PHP10523作为对照)的推定共整合子的4个质粒，使用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化。推荐使用电子凝胶来进行比较。
实例15：用经验证的先导基因和得自其他物种的相应同源物转化 Gaspe Bay Flint衍生的玉蜀黍株系
可以如实例13-15所述转化玉蜀黍植物，它们过表达ZmSTPP3(SEQID NO：48)基因和得自其他物种的相应同源物，诸如表1中所列的同源物，以便检查所得的表型。包括但不限于玉蜀黍泛素启动子、S2A启动子、玉蜀黍ROOTMET2启动子、玉蜀黍Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81和其他启动子的启动子可用于指导ZmSTPP3的同源物在玉蜀黍中的表达。此外，多种终止子，诸如但不限于PINII终止子，可用于实现所关注基因在GaspeBay Flint衍生的玉蜀黍株系中的表达。
受体植物
受体植物细胞可来自生活周期短(“快速循环”)、大小降低且转化潜力高的一致的玉蜀黍株系。对于玉蜀黍而言典型的这些植物细胞是来自任何可公开获得的Gaspe Bay Flint(GBF)株系品种的植物细胞。一种可能的候选植物株系品种是Tomes等人的美国专利申请公布No.2003/0221212中所公开的GBF×QTM(快速周转玉蜀黍，一种可公开获得的Gaspe BayFlint形式，被选择用于在温室条件下生长)的F1杂种。从这个株系获得的转基因植物其大小减小，使得它们可在四英寸盆中生长(为正常大小的玉蜀黍植物所需的空间的1/4)并不到2.5个月就成熟。(传统上，一旦转基因植物适应了温室，需要3.5个月才能获得转基因T0种子。)另一个合适的株系是GS3(高度可转化的株系)X Gaspe Flint的双单倍体株系。又一个合适的株系是携带会造成开花早、株高降低或者同时造成这两方面的转基因的可转化良种近交系。
转化方案
任何合适的方法都可用于将转基因引入玉蜀黍细胞中，包括但不限于如实例13和实例14中所述的使用基于农杆菌的载体的接种型程序。可在受体(目标)植物的不成熟胚上进行转化。
植物生长和鉴定
使用改进的随机区组设计，将从转化的玉蜀黍胚得到的转基因(T0)植物的事件群体在受控的温室环境中生长，以减少或消除环境误差。随机区组设计是植物布局，其中将实验植物分成组(例如每组三十株植物)，这些组称为“区组”，并且为每株植物随机分配区组的位置。
对于一组三十株植物，将二十四株转化的实验植物和六株对照植物(具有规定的表型的植物)(统称“复制组”)放在各盆中，将这些盆在位于温室内的桌子上排成阵列(亦称做复制组或区组)。每株植物，无论是对照植物还是实验植物，都随机分配区组的位置，其被定位到独特的物理温室位置以及到复制组。多个三十株植物的复制组各自可在单个实验中在相同的温室中生长。应确定各复制组的布局(安排)以使空间需求以及温室内的环境效应减至最低。这种布局可称为压缩的温室布局。
代替加入特定的对照组的一种方式是鉴定那些不表达所关注基因的转基因植物。有多种技术如RT-PCR可应用于定量评估所引入的基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植物与那些表达转基因的T0植物进行比较。
在整个评估过程中鉴定事件群体中的每株植物，并将从该植物收集的数据与该植物建立关联，使得收集的数据可与该植物携带的转基因建立关联。
使用三维成像技术进行表型分析
对T0事件群体中的每株温室植物(包括任何对照植物在内)分析所关注农学特性，并记录或保存每株植物的农学数据，使得该数据与该植物的识别数据(见上)建立关联。可用与以上所述类似的实验设计，在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。在植物的整个温室生活周期内，使用定量的非破坏性成像技术在表型水平上对T0植物进行分析，以评估所关注性状。可以使用任何合适的成像仪器。
软件
成像分析系统包括用于颜色和构型分析的软件程序以及用于保存来自约500,000个分析的数据(包括分析日期在内)的服务器数据库。将原始的图像和经分析的图像一起保存以让使用者能按需进行尽可能多的再分析。可将数据库连接到成像硬件以进行自动数据收集和保存。可使用多种可商购获得的软件系统来对成像数据进行定量解析，任何这些软件系统都可应用于图像数据集。
照明
任何合适的照明方式都可用于图像采集。例如，可采用在黑色背景上的顶光。或者，可采用使用白色背景的顶光和背光组合。照明区域应关在房屋里以确保恒定的照明条件。房屋应比测量区域长，使得不需要开门关门就存在恒定的光条件。或者，可改变照明以造成转基因荧光团(例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))或内源性荧光团(例如叶绿素)的激发。
基于三维成像的生物量估计
为很好地估计生物量，从三个轴获取植物图像，优选顶部和两侧(侧面1和2)视图。然后分析这些图像以将植物与背景、盆和花粉对照袋(如适用的话)分开。植物的体积可通过以下计算来估计：
在以上公式中，体积和面积的单位是“任意单位”。任意单位完全足以检测这个系统中基因对植物大小和生长的效应，因为所需要的是检测与实验平均值或对照平均值的差异(正差异(更大)和负差异(更小))。可通过给成像过程加入物理参照物，将大小(例如面积)的任意单位容易地(trivially)转换成物理测量。例如，可在顶部和侧面成像过程中包括已知面积的物理参照物。基于这些物理参照物的面积，可确定换算系数以便于从像素换算成面积单位如平方厘米(cm2)。物理参照物可以是或不是独立的样品。例如，具有已知的直径和高度的盆可充当恰当的物理参照物。
颜色分类
成像技术还可用于测定植物颜色并将植物颜色指派到各种颜色类别。将图像颜色指派到颜色类别是软件的特征。对于其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法确定颜色分类。
为测定植物大小和生长参数，有用的分类方案是定义简单的颜色方案，其包括两个或三个色度的绿色，另外如果出现萎黄病、坏死和脱色情况的话，还包括针对这些情况的颜色类别。还使用背景颜色类别，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，将这些像素特地排除出对大小的测定。在受控的恒定照明下分析植物，使得在一株植物内随时间推移出现的任何变化或者各植物或不同批次的植物之间的任何变化(例如季节差异)可以被量化。
颜色分类除了可用于确定植物大小生长之外，还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他的产量构成性状，可使用另外的颜色分类方案。例如，被称为“持绿性”的性状(已将其与产量的改进相关联)可通过将绿色色调与黄色和棕色色调(其表示衰老组织)分开的颜色分类来评估。通过将这个颜色分类应用于在接近T0或T1植物的生活周期结束时获取的图像，可鉴定出绿色颜色数量相对于黄色和棕色颜色增加(例如以绿色/黄色比表示)的植物。具有此绿色/黄色比的显著差异的植物可被鉴定为携带有影响这个重要农学性状的转基因。
植物生物学技术人员将认识到，会出现可指示植物健康或应激应答的其他植物颜色(例如花青素)，且其他的颜色分类方案可提供关于基因在与这些应答相关的性状中的作用的进一步度量。
植物构型分析
也可鉴定会改变植物构型参数的转基因，包括诸如以下的参数在内：最大高度和宽度、节间距离、叶和茎之间的角度、在节处长出的叶的数量和叶长度。可如下使用软件来确定植物构型。在第一个成像步骤中将植物简化至其主要几何构型，然后基于这个图像可进行不同构型参数的参数化识别。可通过应用之前所描述的统计方法，鉴定各种单独地或组合在一起修饰任何这些构型参数的转基因。
花粉散出日期
花粉散出日期是要在被转化植物中分析的一个重要参数，可通过活性(active)雄花在植物上的第一次出现来确定。为找到雄花目标，将茎的上末端按颜色进行分类以检测黄色或紫色花粉囊。然后用这个颜色分类分析来确定活性花，而活性花可用来计算花粉散出日期。
或者，可由负责进行植物看护的人员记录花粉散出日期和其他容易目视检测的植物属性(例如授粉日期、第一抽丝日期)。为使数据完整性和过程效率最大化，通过采用由光谱数字分析装置所采用的相同条形码来跟踪这个数据。可使用带条形码读取器的计算机、掌上型装置或笔记本电脑，以方便观察的数据采集记录时间、植物检验者和采集数据的操作者。
植物的取向
以模拟商业栽培的密度生长的成熟玉蜀黍植物常常具有平坦的构型。也即，植物具有明显可看到的宽侧面，还有窄侧面。从宽侧测定了植物的图像。给每株植物分配明确的基本取向，以获得宽侧图像和边侧图像之间的最大差异。使用顶部图像来确定植物的主轴。
实例16：氮限制条件下Gaspe Bay Flint衍生的玉蜀黍株系的筛选
转基因植物将含有两或三剂量的带一剂量的GS3的Gaspe Flint-3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)并将对显性转基因1∶1分离。将植物栽培于(一种商业盆栽培养基)并每天用1mM KNO3生长培养基和用2mM KNO3或更高浓度的生长培养基浇水四次。在1mM KNO3培养基中生长的对照植物将较不绿，产生较少生物量并且在花期具有较小的穗。使用统计分析来判断在处理之间所看到的差异是否不同。
在与转基因无效对照相比时，转基因的表达将导致植物在1mM KNO3中具有改善的植物生长。因而对生长期间的生物量和绿度进行监测，并与转基因无效对照进行比较。花期时的生长、绿度和穗尺寸的改善将指示氮耐受性的增强。
实例17：转基因玉蜀黍植物
产生了含有在启动子控制下的所关注基因的T0转基因玉蜀黍植物。使这些植物在针对源自Gaspe的玉米植物的温室条件下生长，如美国专利申请公布No.2003/0221212、美国专利申请序列号10/367,417中所述。
从栽培到收获期间，在最佳KNO3条件下用T0转基因植物进行了FASTCORN T0测定。对生长监测至花期，此时针对转基因阳性事件和转基因无效对照测定累积的植物生长、生长速率、穗重量、穗长度、穗面积、穗体积和单穗籽粒数。将个体植物的表型分布与实验中的转基因无效对照事件的分布进行比较。通过与转基因无效对照组的方差进行比较，用Z得分评价了每个事件的方差。Z得分越高表示事件与对照组之间的方差越大，从而指示对KNO3的响应越大。
使用玉米UBI启动子转基因表达一组STPP3同源物在FASTCORN T0测定中增强了穗生长和发育。如表4中所示，在事件水平上，据发现多个构建体使若干事件显示出在与非转基因对照相比时，测得的五个穗参数中的一个或多个明显增加，其中分别使用+/-1.00和+/-1.65的双尾Z得分。
使用双尾T检验(p≤0.1)在构建体水平上分析得自FASTCORN的T0结果(其中个体事件被视为重复样)，多个构建体显示出在与实验中的转基因无效对照的平均值相比时，若干穗参数有显著的百分比增加。百分比增加结果在表5中示出，其中NS是指与转基因无效对照相比时无显著变化(p≤0.1)。一般来讲，得自簇1和2的同源物在该测定中显示出最高的功效，因为在这两个簇中的大多数同源物均比对照显示出明显更好的农学参数。
对于源自每个T0植物(含有据发现对转基因事件1∶1分离的每个硝酸盐吸收相关构建体的单个拷贝)的自体受精的T1子代，分析了在次优KNO3中改善的生长速率。对生长监测至花期，此时在事件水平上针对转基因阳性事件和转基因无效事件测定累积植物生长、生长速率和穗重量。将个体事件的表型的分布与作为无效事件的对照组的分布进行了比较。计算了每组的平均值，并使用两两比较双尾T检验(p≤0.1)进行了比较，从而将转基因阳性事件平均值与实验中的非转基因对照组平均值进行比较。将阳性结果与事件内的转基因的分布进行比较，以确保响应与转基因分离。
使用玉米UBI启动子转基因表达ZmSTPP3在温室NUE繁殖测定中增强了穗生长和发育，在该测定中从栽培到收获期间使植物经受次优氮处理。如图4中所示，据发现，相对于非转基因对照，两个事件分别使穗轴周长显著增加了9.0％和8.0％并使穗长度显著增加了9.8％和8.6％(p＜0.1)。此外，事件A的穗轴体积、穗面积和穗宽度与对照相比全部显著增大，分别增大了21.2％、14.3％和5.5％(p＜0.1)。
表4
表5
实例18：由田间地块进行玉蜀黍转基因分析
通过PCR针对转基因拷贝数和表达在分子水平上表征了转基因事件。接着以包含具有可检测的转基因表达的转基因的单个拷贝的事件进行田间测试。产生了测试杂交/杂种种子，并在正常和低氮田间中于多年/位置/重复样实验中进行了田间测试。在因减少施肥达30％或更多而造成产量受限的田间地块中评价转基因事件。使用在这些氮肥减少或正常的地块中转基因植物与非转基因植物之间产量、产量构成或其他农学性状的统计上显著的改善来评估转基因表达的功效。接着以具有多个在多个位置中的产量或其构成方面显示出明显改善(当与无效对照比较时)的事件的构建体进行进一步测试。
除了At3g05580外，还在田间地块中评价了三个玉蜀黍同源物。根据表1，At3g05580是丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)簇3.1的成员，并且所述三个玉蜀黍同源物代表三个不同的STPP簇。STPP1(SEQ ID NO：44)是簇3.2的成员而STPP2(SEQ ID NO：29)是簇2.2的成员，STPP3(SEQ IDNO：1)则是簇1.1的成员。使用组成型启动子过表达玉蜀黍同源物STPP1的多个转基因事件导致了在两种氮条件下产量均显著降低。在氮限制条件下，过表达玉蜀黍同源物STPP2的多个事件显示出产量显著降低，而多个事件显示出在正常氮条件下产量显著提高。使用组成型启动子过表达玉蜀黍同源物STPP3的多个转基因事件在多测试者/年/位置中在正常和低氮条件下均显示出产量显著提高(图3)。前3个事件在低氮和正常氮条件下分别显示出2-3蒲式耳/英亩和4-5蒲式耳/英亩的提高(图3)。对得自低氮和正常氮的产量数据的组合分析显示出前3个事件中3-4蒲式耳/英亩的提高(图3)。转基因事件可具有不同的转基因表达水平或不同的蛋白质水平。STPP3包含N端基序L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)和C端基序GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，而STPP1不包含这些基序。
实例19：大豆胚转化
如下用包含可操作地连接到泛素启动子的反义硝酸盐吸收相关序列的质粒轰击大豆胚。为诱导体细胞胚，将从大豆栽培种A2872的经表面灭菌的不成熟种子切取的3-5mm长的子叶在适当的琼脂培养基中，在26℃下在光照或黑暗中培养六到十周。然后切取产生次级胚的体细胞胚并置于合适的液体培养基中。在反复选择作为早期球状阶段的胚繁殖的体细胞胚的簇之后，如下所述维持悬浮物。
大豆胚发生悬浮培养物可在旋转振荡器上在150rpm、26℃下维持在35ml液体培养基中，以荧光灯按16∶8小时白日/黑夜时间表进行维持。每隔两周，通过将大约35mg的组织接种到35ml的液体培养基中，将培养物进行传代培养。
然后可通过粒子枪轰击方法(Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》(伦敦)，第327卷，第70-73页)，美国专利No.4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。可使用DuPont Biolistic PDS1000/HE仪器(氦改型)进行这些转化。
实例20：向日葵分生组织转化
转化了向日葵分生组织。用单小麦头脱粒机(single wheat-head thresher)将成熟的向日葵种子(Helianthus annuus L.)脱壳。将种子在20％Clorox漂白溶液(每50mL溶液加入两滴Tween 20)中进行表面灭菌30分钟。将种子在无菌蒸馏水中清洗两次。基于向日葵分生组织的转化在本领域中是已知的。
实例21：水稻组织转化
硝酸盐吸收相关基因的遗传确认
一种本领域技术人员可用的将DNA转化到高等植物细胞中的方法，是使用包被有所关注核酸构建体的金属粒子进行的高速弹道轰击(参见Klein，et al.，(1987)Nature(London)327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》(伦敦)，第327卷，第70-73页)并参见美国专利No.4,945,050)。将Biolistic PDS-1000/He(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRADLaboratories，Hercules，CA))用于这些互补实验。使用粒子轰击技术，用DNA片段转化硝酸盐吸收相关突变体和野生型水稻。
使用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的能赋予对抗生素的抗性的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因，作为水稻转化的选择性标记。在载体pML18中，Hpt II基因被工程连接上来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根瘤农杆菌的章鱼氨酸合酶基因的终止信号和多腺苷酸化信号。pML18在1997年12月18日公布的WO 1997/47731中有所描述，该专利的公开内容据此以引用方式并入。
衍自萌发的水稻种子的盾片的胚发生愈伤组织培养物用作转化实验的原始材料。该材料是通过使无菌水稻种子在愈伤组织引发培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1.0mg/l 2，4-D和10μM AgNO3)中于暗处27-28℃下萌发来产生的。将从胚的盾片增殖的胚性愈伤组织转移到CM培养基(N6盐、Nitsch和Nitsch维生素、1mg/l 2，4-D，Chu，et al.，1985，Sci.Sinica18：659-668(Chu等人，1985年，《中国科学》，第18卷，第659-668页))。将愈伤组织培养物通过以两个星期时间间隔进行常规分培维持在CM上，并在引发的10个星期内用于转化。
将0.5-1.0mm块体相隔大约1mm排列在放置于CM培养基上的Whatman#541纸的圆圈中央约4cm直径的圆形区域中进行分培，以制备愈伤组织供进行转化。将具有愈伤组织的板在暗处于27-28℃下温育3-5天。在轰击之前，将具有愈伤组织的过滤器转移到补加有0.25M甘露醇和0.25M山梨醇的CM，置于暗处3小时。然后在无菌罩中将平皿盖保持微开20-45分钟，以让组织上的水分散发。
将每个基因组DNA片段与含有用于水稻转化的选择性标记的pML18一起共沉淀到金粒子的表面上。为实现这一点，将总共10μg的DNA以性状DNA：选择性标记DNA为2∶1的比例加到以60mg ml-1的浓度重悬的50μl金粒子等分试样。然后将氯化钙(50μl 2.5M溶液)和亚精胺(20μl 0.1M溶液)加至该金-DNA悬浮液，同时将管漩涡混合3分钟。将金粒子在微量离心机中离心1秒钟，除去上清液。然后将金粒子用1ml无水乙醇洗涤两次，接着重悬于50μl无水乙醇中，超声处理(浴超声器)1秒钟以使金粒子分散。将金分散液在-70℃下温育五分钟，如果需要的话进行超声处理(浴超声器)以使粒子分散。然后将6μl的包被DNA的金粒子装载到聚酯薄膜巨载体碟(mylar macrocarrier disk)上，让乙醇蒸发。
在干燥时间结束时，将含有组织的平皿放在PDS-1000/He的腔室中。然后将腔室中的空气抽真空成28-29英寸Hg。使用防爆膜以氦冲击波将该巨载体进行加速，该膜在冲击管中的氦压力达到1080-1100psi时破裂。将组织放置在离停止网大约8cm处，将愈伤组织轰击两次。用包被DNA的金粒子以此方式轰击两个至四个板的组织。在轰击之后，将愈伤组织转移到没有补加山梨醇或甘露醇的CM培养基。
在轰击后3-5天内，将愈伤组织转移到SM培养基(含有50mg/l潮霉素的CM培养基)。为实现这一点，将愈伤组织从各板转移到无菌的50ml圆锥形管并称重。加入40℃熔化的顶层琼脂，采用2.5ml顶层琼脂/100mg愈伤组织。将愈伤组织团块通过反复分配穿过10ml移液管来破碎成小于2mM直径的碎块。将3ml的愈伤组织悬浮液等分试样接种到新鲜SM培养基上，将各板在暗处于27-28℃下温育4个星期。4个星期后，鉴定转基因愈伤组织事件，转移到新鲜的SM板，在暗处于27-28℃下再生长2个星期。
将生长的愈伤组织转移到RM1培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、2％蔗糖、3％山梨糖醇、0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)在25℃下暗处保持2个星期。2个星期后，将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、3％蔗糖、0.4％脱乙酰吉兰糖胶+50ppm潮霉素B)并在冷白光(约40μEm-2s-1)下放置，光照周期为12小时，温度25℃，湿度30-40％。在光中2-4个星期后，愈伤组织开始器官化并形成苗。将苗从周围的愈伤组织/培养基移取，小心转移到phytatray(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)中的RM3培养基(1/2×MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，用之前的步骤中所描述的相同条件继续进行温育。
在2-3个星期后当出现充分的根和苗生长时，将植物从RM3转移到含有Metro mix 350的4英寸盘。对获自转基因植物的种子检查硝酸盐吸收相关突变与含有硝酸盐吸收相关基因的野生型基因组DNA的遗传互补情况。
实例22：用于确定玉蜀黍的根构型的改变的测定法
测定转基因玉蜀黍植物在籽苗阶段、花期或成熟期时根构型的变化。用于测量玉蜀黍植物的根构型的改变的测定法包括但不限于下面列出的方法。为了便于对根构型改变的人工或自动测定，可将玉米植物栽培于透明盆中。
1)根质量(干重)将植物栽培于中，为一种便于使根容易分开的生长培养基。将烘箱干燥的苗和根组织称重并计算根/苗比率。
2)侧根分支的水平侧根分支的程度(例如，侧根数目、侧根长度)通过对完整根系进行二次采样并用平台式扫描仪或数码相机成像并用WinRHIZOTM软件(丽晶仪器有限公司(Regent InstrumentsInc.))分析来测定。
3)根带宽度测量根带为随植物成熟而在温室盆的底部形成的根的带或群体。在成熟期测量根带的毫米厚度作为对根质量的粗略估计值。
4)节根计数在将根从支持培养基(例如盆栽混合物(potting mix))分离后，可测定脱离较高节位的冠根的数目。另外，可测量冠根和/或支柱根的角度。对节根和节根分支量进行的数字分析，构成对上述人工方法的另一个扩充。
将所取得的关于根表型的所有数据进行统计分析，通常是t检验，以将转基因根与非转基因姊妹植物的根进行比较。在多个事件和/或构建体参与该分析的情形中，还可使用单因素方差分析。
实例23：所公开序列的变体
另外的序列可通过已知的方法产生，包括但不限于截短和点突变。可通过使用标准转化、再生和评估方案来评估这些变体对雄性育性的影响。
A.不改变所编码的氨基酸序列的变体核苷酸序列
用所公开的核苷酸序列产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列所具有的开放阅读框核苷酸序列与相应的SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性。这些功能变体是用标准密码子表产生的。虽然变体的核苷酸序列被改变，但开放阅读框所编码的氨基酸序列没有改变。这些变体与确定生物量生产和质量的构成性状相关。然后显示相关性的变体用作标记来选择每个构成性状。
B.非编码区中的变体核苷酸序列
本文所公开的核苷酸序列用于产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列具有5’-非翻译区、3’-非翻译区或启动子区的核苷酸序列，其与相应的SEQ ID NO的起始核苷酸序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％和95％同一性。这些变体然后与种质中与生物量生产和质量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标志单倍型来选择所期望的性状。
C.所公开的多肽的变体氨基酸序列
产生了所公开的多肽的变体氨基酸序列。在这个实例中，变更一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸变更。通过考虑蛋白比对(与其他直系同源物或来自各种物种的其他基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择出这样的氨基酸，其被认为不处在高选择压力下(不高度保守)，且相当容易地被具有相似的化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸置换。利用蛋白比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴别出目标氨基酸，就随后进行如下C部分中所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。这些变体然后与种质中与生物量生产和质量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标志单倍型来选择所期望的性状。
D.所公开的多肽的另外的变体氨基酸序列
在该实例中，产生出相对于参比蛋白序列而言具有80％、85％、90％和95％同一性的人工蛋白序列。这后一种尝试需要从比对鉴定保守区域和可变区域并然后审慎应用氨基酸置换表。这些部分将在下文中作更详细的讨论。
主要地，基于所公开的蛋白之间或其他所公开的多肽之间的保守区作出哪些氨基酸序列要进行改变的决定。基于序列比对，将所公开的多肽的很可能要进行改变的不同区域以小写字母表示，而保守区域用大写字母表示。应认识到，可在以下保守区域中作出保守置换而又不改变功能。另外，技术人员会理解，本发明所公开的序列的功能变体可在保守结构域中具有微小的非保守氨基酸变更。
然后产生出与原始蛋白序列相差在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性范围内的人工蛋白序列。目标定在这些范围的中点，正负偏差近似幅度例如为1％。氨基酸置换将通过定制的Perl脚本来实现。置换表在下表2中提供。
表2：置换表
氨基酸 强相似的和最佳的置换 改变顺序排列 注释
I L，V 1 50∶50置换
L I，V 2 50∶50置换
V I，L 3 50∶50置换
A G 4
G A 5
D E 6
E D 7
W Y 8
Y W 9
S T 10
T S 11
K R 12
R K 13
N Q 14
Q N 15
F Y 16
M L 17 第一个甲硫氨酸不能改变
H Na 无好的置换物
C Na 无好的置换物
P Na 无好的置换物
首先，鉴定出蛋白中不应改变的任何保守氨基酸并“作上记号”以隔离开来不作置换。起始甲硫氨酸当然将自动被加到这个名单。接着，作出改变。
H、C和P在任何情况下都不改变。该改变将首先以异亮氨酸开始，从N端扫描至C端。然后是亮氨酸，如此按列表往下直至达到所需的目标。可作出中数置换(interim number substitution)，以便不造成改变的逆转。列表的顺序是1-17，因此按需以尽可能多的异亮氨酸变化开始，然后是亮氨酸，一直到甲硫氨酸。显然，按此方式，许多氨基酸将不需要改变。L、I和V将涉及两个交替的最佳置换的50∶50置换。
将变体氨基酸序列作为输出写出。用Perl脚本计算同一性百分数。使用这个程序，产生出与起始未改变的ORF核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的所公开的多肽的变体。
本说明书中的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的普通技能水平。所有出版物和专利申请均以引用方式并入本文，所引用的程度就如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和独立地指出以引用方式并入本文一样。
已结合各个具体的和优选的实施例和技术描述了本发明。然而，应当理解，在保持在本发明的实质和范围内的情况下可以作出许多变化和修改。

Claims (50)

1.一种提高产量或提高有助于产量的农学参数的方法，所述方法包括：
a.增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性；以及
b.使所述植物在植物生长环境中生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶为1型。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述STPP为玉蜀黍STPP3。
4.一种改善植物的农学特性的方法，所述方法包括：
a.增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149.22)；以及
b.通过使所述植物在植物生长环境中生长而改善所述植物的所述农学特性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述STPP多肽包含N端附近的基序和C端附近的基序，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述STPP多肽包含VRTARPGKQV(SEQ ID NO：123)的氨基酸序列。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述STPP多肽包含选自SEQ IDNO：1-47、104-111、113、115或117的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：1-47、104-111、113、115或117至少90％相似的变体。
8.一种在其基因组中包含重组丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的转基因植物，其中所述蛋白磷酸酶包含N端附近的基序和C端附近的基序、RVxF结合位点、催化亚基以及调节亚基，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)；
并且其中所述植物表现出改善的农学特性。
9.根据权利要求8所述的植物，其中所述植物与在其基因组中不含重组STPP的对照植物相比表现出氮使用效率的增加。
10.一种在其基因组中包含可操作地连接到丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的异源调控元件的植物，其中所述异源调控元件增加所述蛋白磷酸酶的表达，所述蛋白磷酸酶包含N端附近的基序和C端附近的基序、RVxF结合位点、催化亚基以及调节亚基，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)；
并且其中所述植物表现出改善的农学特性。
11.根据权利要求10所述的植物，其中所述异源调控元件为增强子。
12.根据权利要求10所述的植物，其中所述异源调控元件为启动子。
13.一种鉴定并选择ZmSTPP3的等位基因的方法，所述等位基因导致所述ZmSTPP3多肽的表达增加和/或酶活性的增加，所述方法包括以下步骤：
a.对突变型玉蜀黍植物群体进行遗传筛选；
b.鉴定表现出所述ZmSTPP3多肽的表达增加和/或酶活性增加的一株或多株突变型玉蜀黍植物；以及
c.鉴定所述突变型玉蜀黍植物中的所述ZmSTPP3等位基因。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在包含ZmSTPP3的基因座处对所述突变型玉蜀黍植物测序。
15.一种增加植物中的氮吸收的方法，所述方法包括：
a.增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)；以及
b.通过使所述植物在植物生长环境中生长而改善所述植物的所述氮吸收。
16.根据权利要求4所述的方法，其中所述STPP多肽包含N端附近的基序和C端附近的基序，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)。
17.根据权利要求4所述的方法，其中所述STPP多肽包含VRTARPGKQV(SEQ ID NO：123)的氨基酸序列。
18.一种能够在植物细胞中表达的重组DNA构建体，所述构建体包含：
a.在植物中表达丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的多核苷酸，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)；
b.可操作地连接到所述蛋白磷酸酶并在植物细胞中具有功能性的异源启动子；以及
c.在植物细胞中具有功能性的转录终止子。
19.一种玉蜀黍植物，其包含根据权利要求18所述的DNA构建体。
20.根据权利要求18所述的DNA构建体，其中所述STPP包含编码所述蛋白磷酸酶的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含与选自以下的一者至少80％相似的序列：SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118。
21.一种改善单子叶植物的氮利用效率的方法，所述方法包括：
a.增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
i.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
ii L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ IDNO：119)，和
iii.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
iV.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
V.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
Vi.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)，以及
b.使所述植物在植物生长条件下生长，其中氮肥的施用率低于约140至160磅/英亩。
22.一种通过改善在田间生长的单子叶植物的氮利用效率而提高所述单子叶植物的产量的方法，所述方法包括：
a.增加丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)在植物中的表达或活性，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
i.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
ii L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ IDNO：119)，和
iii.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
iV.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
V.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
Vi.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)，以及
b.使所述植物在植物生长条件下生长，其中氮肥的施用率为约140至160磅/英亩。
23.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接到在植物中具有功能性的启动子的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
a.选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的核苷酸序列；
b.基于Clustal V比对方法，在与选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118中的一者相比时，具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列；
c.可在严格条件下与(a)的所述核苷酸序列杂交的核苷酸序列；并且
其中所述植物当与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比时，表现出至少一种选自以下的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植株高度、生物量和产量。
24.根据权利要求23所述的植物，其中所述植物选自：拟南芥属(Arabidopsis)、番茄、玉蜀黍、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
25.权利要求23或24所述的植物的种子，其中由所述种子长成的植物当与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比时，表现出至少一种选自以下的农学特性的改变：增大的穗分生组织、籽粒行数、种子数、植株高度、生物量和产量。
26.一种在植物中编码丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的重组多核苷酸，其中所述STPP多肽包含金属磷结构域(PFAM PF00149.22)并且还包含N端附近的基序和C端附近的基序，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)；并且
其中所述多核苷酸包含异源调控元件。
27.根据权利要求26所述的多核苷酸，其编码包含选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的氨基酸序列的多肽，或与选自SEQID NO：1-47、104-111、113、115或117的多肽90％相似的多肽。
28.一种种子，其包含根据权利要求26所述的重组多核苷酸。
29.一种植物，其由根据权利要求28所述的种子产生。
30.一种表达盒，其包含根据权利要求26所述的多核苷酸。
31.一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，所述方法包括：提供在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽；以及通过使所述玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高所述玉蜀黍植物的谷粒产量。
32.一种在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少90％相同的多肽。
33.一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，所述方法包括：提供在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽；以及通过使所述玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高所述玉蜀黍植物的谷粒产量。
34.一种在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽。
35.一种在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因单子叶作物植物，所述重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少90％相同的多肽。
36.一种提高玉蜀黍植物的产量的方法，所述方法包括：提供在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少85％相同的多肽；以及通过使所述玉蜀黍植物在植物生长环境中生长而提高所述玉蜀黍植物的谷粒产量。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID NO：1约87％相同。
38.一种在其基因组中包含重组多核苷酸的转基因玉蜀黍植物，所述重组多核苷酸编码与SEQ ID NO：1至少85％相同的多肽。
39.根据权利要求38所述的玉蜀黍植物，其中所述多肽与SEQ ID NO：1约87％相同。
40.根据权利要求38所述的转基因植物，其中所述玉蜀黍植物与不含所述重组多核苷酸的对照植物相比产量高至少约3-5蒲式耳/英亩。
41.一种在其基因组中包含可操作地连接到丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶(STPP)的异源调控元件的转基因玉蜀黍植物，其中所述异源调控元件增加所述蛋白磷酸酶的表达，所述蛋白磷酸酶包含N端附近的基序和C端附近的基序、RVxF结合位点、催化亚基以及调节亚基，所述N端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
a.L[L/T]EVR[T/L]ARPGKQVQL(SEQ ID NO：95)，
b.L[L/T]EV[R/K][T/L/N][A/L][R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：119)，和
c.LLEV[R/K][T/N]L[R/K]PGK[Q/N][V/A]QL(SEQ ID NO：120)
以及所述C端附近的基序包含选自以下的氨基酸序列：
d.GAMMSVDE[T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：96)，
e.GAMMSVD[D/E][T/N]LMCSFQ(SEQ ID NO：121)，和
f.GAMMSVD[D/E]TLMCSFQ(SEQ ID NO：122)，
并且其中所述玉蜀黍植物表现出提高的谷粒产量。
42.一种改善植物的根构型的方法，所述方法包括：表达重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码与选自SEQ ID NO：1-8的序列至少80％相同的多肽；以及通过使所述植物在植物生长环境中生长而改善所述植物的所述根构型。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述根构型是在正常或低氮环境下改善的根生长或根数量。
44.一种鉴定表现出改善的农学参数的植物的方法，所述方法包括针对提高的氮利用效率筛选玉蜀黍植物群体并分析编码包含选自SEQ IDNO：1-47、104-111、113、115或117的多肽的蛋白质的多核苷酸序列或其调控序列，以及鉴定具有提高的氮利用效率的所述植物。
45.一种鉴定与增加的氮使用效率相关的玉蜀黍植物或种质中的等位基因的方法，包括：
a.获得玉蜀黍植物的群体，其中一株或多株植物表现出不同水平的增强的耐旱性和/或增加的氮使用效率；
b.相对于编码蛋白质的包含选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的多核苷酸的多核苷酸序列或在调节编码所述蛋白质的所述多核苷酸的表达的基因组区中评估等位变异；
c.获得针对所述群体中多株玉蜀黍植物的增加的氮使用效率的表型值；
d.将与选自SEQ ID NO：48-94、97-103、112、114、116和118的多核苷酸相关的所述基因组中的所述等位变异与所述效率相关联；以及
e.鉴定与增强的效率相关的所述等位基因。
46.一种在其基因组中包含重组构建体的转基因植物，所述重组构建体含有调节内源基因表达的遗传元件，其中所述内源基因编码包含选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的多肽90％相同的序列的多肽。
47.一种在其基因组中包含遗传修饰的植物，所述遗传修饰导致基因的表达增加，所述基因编码包含选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的多肽95％相同的序列的多肽，或导致所述多肽的活性增加，其中所述植物显示出有助于耐旱性或产量的一个或多个改善的农学参数。
48.一种对表现出改善的农学参数的植物进行标记辅助选择的方法，所述方法包括：对在编码包含选自SEQ ID NO：1-47、104-111、113、115或117的多肽的蛋白质的基因组区或其调控序列中具有一个或多个变异的植物进行标记辅助选择，并鉴定具有提高的氮利用效率的所述植物。
49.根据权利要求1所述的方法，其中所述STPP包含与SEQ ID NO：1至少94％相同的氨基酸序列。
50.根据权利要求1所述的方法，其中所述STPP包含与SEQ ID NO：2至少95％相同的氨基酸序列。
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