CN105247064A - 细胞外的二萜生产 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：a.使重组微生物在合适的发酵培养基中发酵，其中所述微生物包含编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力，其中在所述发酵培养基中在细胞外生产二萜或糖基化二萜；以及b.从所述发酵培养基回收二萜或糖基化二萜。

Description

细胞外的二萜生产

发明领域

本发明涉及使用重组微生物生产二萜和/或糖基化二萜的方法。本发明还涉及一种发酵液，其中所述发酵液包括通过这种方法可获得的二萜和/或糖基化二萜。

发明背景

世界各地对高效甜味剂的需求不断增长，而且混合不同的人工甜味剂正在逐渐变成一种常规做法。然而，对甜味剂替代品的需求预计将会增加。多年生草本植物—甜叶菊(SteviarebaudianaBert.)—的叶子中积聚了大量极甜的化合物，它们被称为甜菊糖苷。虽然这些化合物的生物学功能还不明确，但由于甜叶菊甜味剂是天然植物产品这一附加优势，它们作为备选的高效甜味剂具有商业意义。

这些甜的甜菊糖苷显示出优于许多高强度甜味剂的功能特性和感官性状。此外，研究表明甜菊苷(stevioside)能降低Ⅱ型糖尿病人的血糖水平和中度高血压患者的血压。

甜菊糖苷积聚于甜菊叶中，它们可以占甜菊叶干重的5-20％。甜菊苷和莱苞迪苷(rebaudioside)A都具有热稳定性和pH稳定性，因此适合用于饮料和许多其它食物中。甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱苞迪苷A比蔗糖甜150-320倍。此外，具有更好味道的莱苞迪苷D也是积聚于甜菊叶的高效二萜糖苷甜味剂，它可能比蔗糖甜约200倍。

目前，甜菊糖苷是从甜菊植物中提取的。在甜菊中，(-)-贝壳杉烯酸(kaurenoicacid,赤霉素(GA)生物合成的中间物)被转换为四环的二萜—甜菊醇，然后甜菊醇继续通过多步骤的葡糖基化途径形成各种甜菊糖苷。然而，产率是可变的并受农业和环境条件的影响。而且，种植甜菊需要大量陆地面积、收获前的长久时间、密集的劳动力以及提取和纯化糖苷的额外费用。

为了满足对高效、天然甜味剂日益增长的商业需求，需要新的、更标准的、完全单一成分的、没有后味的糖苷来源。

发明概述

在甜菊中，通过脱氧木酮糖磷酸酯途径(deoxyxylulose5-phosphatepathway)形成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，甜菊醇就是从GGPP合成的。(-)-柯巴基二磷酸合酶(copalyldiphosphatesynthase,CPS)和(-)-贝壳杉烯合酶(kaurenesynthase,KS)这两个二萜环化酶的活性导致(-)-贝壳杉烯的形成，然后在一个三步骤的反应中，(-)-贝壳杉烯被(-)-贝壳杉烯氧化酶(kaureneoxidase,KO)氧化形成(-)-贝壳杉烯酸。

在甜菊叶中，(-)-贝壳杉烯酸接着被内根-贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)羟基化以形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基转移酶(UGTs)葡糖基化。

本发明涉及使用微生物在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方法，所述微生物能够产生二萜(例如甜菊醇)或糖基化二萜(即二萜糖苷，例如甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷或杜克苷A)。

因此，根据本发明，提供了生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：

a.在合适的发酵培养基中发酵重组微生物，

其中所述微生物包含编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力，

其中二萜或糖基化二萜被排出/分泌/转运到所述细胞之外并且在发酵培养基中在细胞外生产；及

b.从所述发酵培养基回收所述二萜或糖基化二萜。

换言之，本发明的方法是细胞外的二萜或糖基化二萜生产方法。二萜或糖基化二萜由生产宿主微生物排出到发酵培养基中，然后从发酵培养基中物理和/或化学回收。因此，二萜或糖基化二萜的回收被简化，并且其与需要从部分或完全在细胞内生成并积累甜菊醇糖苷的重组微生物本身回收这些化合物的方法相比在经济上可行。

在本发明的方法中，重组微生物可包含编码具有UDP-葡糖基转移酶活性(UGT)的一个或多个多肽的一个或多个核苷酸序列，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷或杜克苷A中的至少一种的能力。

根据本发明，还提供了：

-包含通过本发明的方法能够获得的二萜或糖基化二萜的发酵液；

-通过本发明的方法获得的或从本发明的发酵液能够获得的二萜或糖基化二萜；

-包含本发明的二萜或糖基化二萜的食品、饲料或饮料；和

-以上所定义的重组微生物在细胞外生产二萜或糖基化二萜的用途。

附图简述

图1展示了质粒pUG7-EcoRV的示意图。

图2展示了设计ERG20、tHMG1和BTS1过表达盒(A)，并将其整合至酵母基因组(B)的方法的示意图。(C)显示了利用Cre重组酶移除KANMX标记后的最终状态。

图3展示了ERG9敲低构建体的示意图。所述构建体由500bpERG9的3’部分、98bpTRP1的启动子、TRP1的开放阅读框和终止子以及之后的400bp长的ERG9的下游序列组成。由于在ERG9的开放阅读框的终点引入了XbaI位点，因此最后的氨基酸变成了丝氨酸，终止密码子变成了精氨酸。新的终止密码子位于TRP1的启动子中，这导致延长了18个氨基酸。

图4展示了将UGT2整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态；C.Cre重组酶表达后的状态。

图5展示了将GGPP到RebA的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态。

图6展示了质粒MB6754的示意图。

图7展示了质粒MB6761的示意图。

图8展示了质粒MB6762的示意图。

图9展示了质粒MB6775的示意图。

图10展示了生物合成甜菊糖苷的潜在途径的示意图。

图11展示了从STV040去除UGT2基因的示意图。

序列表说明

表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号(同样展示于表1)来定义。

发明详述

在本说明书和附属的权利要求书的各个部分，词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为包含性的。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的元素或整体。

本文中不使用数量词修饰时指的是一个或多于一个(即一个或至少一个)对象。例如，“要素”可能意味着一个要素或多于一个要素。

我们已经证实本文所述的重组微生物能够生产二萜或糖基化二萜，优先在细胞外生产所述二萜或糖基化二萜。因此，本发明涉及一种在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括使用重组微生物。本发明的方法通常为发酵方法，其中重组微生物在细胞外生产二萜或糖基化二萜，即二萜或糖基化二萜被生产并被排出并且存在于发酵液中。可直接从发酵液回收这种二萜或糖基化二萜，从而没有从重组微生物(细胞内)本身回收此类化合物的昂贵必要性。所述方法中使用的重组微生物是能够生产二萜或糖基化二萜，通常分别为甜菊醇或甜菊醇糖苷的重组微生物。

产生和/或选择在细胞外生产甜菊醇糖苷的重组微生物相对于现有技术有特别优势，例如i)产生经济上可行的产品，ii)产生更简单并且可调整规模的制备方法，iii)不从细胞内材料(包括DNA和可影响产品感官性质的蛋白质)中纯化产品。需要强调的是，相比于已知的生产方法，本发明的教导使得发酵性二萜如甜菊醇糖苷的生产成为商业现实。特别地，重组微生物可为Yarrowia或Candida属的微生物。

为了本发明的目的，二萜通常意味着由4个异戊二烯单元组成的有机物。这种化合物可来源于香叶基香叶基焦磷酸。糖基化二萜或二萜糖苷是一种结合有糖的二萜，其中糖通常与非碳水化合物部分相结合。通常，在二萜糖苷中，糖基通过其异头碳(anomriccarbon)经由糖苷键与另外一个基团结合。优选的二萜和二萜糖苷分别是甜菊醇和甜菊糖苷。因此，特别地，本发明涉及能够产生甜菊醇和甜菊糖苷的重组微生物。

根据本发明，提供了一种在细胞外生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：

a.在合适的发酵培养基中发酵重组微生物，

其中所述微生物包含编码：

具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和

具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力，

其中在所述发酵培养基中在细胞外生产二萜或糖基化二萜；以及

b.从所述发酵培养基回收所述二萜或糖基化二萜。

用于本发明的重组微生物可为Yarrowia属之一，例如Yarrowialipolytica，或Candida属之一，例如Candialipolytica。当重组微生物为Yarrowia例如Yarrowialipolytica时，糖基化二萜可优先为莱苞迪苷A或莱苞迪苷D。用于本发明的重组微生物可为Saccharomyces属之一，例如Saccharomycescerevisiae。当重组微生物为Saccharomyces例如Saccharomycescerevisiae时，糖基化二萜可优先为甜叶悬钩子苷或莱苞迪苷D。

用于本发明的重组微生物包含编码：

具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和

具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的一个或多个核苷酸序列，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力。

为了本发明的目的，具有内根-柯巴基焦磷酸合酶(EC5.5.1.13)活性的多肽能够催化如下化学反应：

该酶有一种底物(香叶基香叶基焦磷酸)和一种产物(内根-柯巴基焦磷酸)。该酶参与赤霉素的生物合成。该酶属于异构酶家族，具体是分子内的裂解酶类。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸裂解酶(去环化)。其它的常用名包括内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶A和内根-贝壳杉烯合成酶A。

为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯合酶(EC4.2.3.19)活性的多肽能够催化下述化学反应：

因此，该酶有一种底物(内根-柯巴基二磷酸)和两种产物(内根-贝壳杉烯和二磷酸盐)。

该酶属于裂解酶家族，具体是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶(环化，形成内根-贝壳杉烯)。其它的常用名包括内根-贝壳杉烯合酶B、内根-贝壳杉烯合成酶B、内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶和(环化)。该酶参与二萜类化合物的生物合成。

内根-柯巴基二磷酸合酶还可以有与同一蛋白质分子关联的不同的内根-贝壳杉烯合酶的活性。内根-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径中的下一个步骤。这两种类型的酶活性是不同的，抑制蛋白质的内根-贝壳杉烯合酶活性的定点突变导致内根-柯巴基焦磷酸的积累。

因此，本发明使用的单个核苷酸序列可编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性和内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者，可以用两段不同的、分开的核苷酸序列编码这两种活性。

为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯氧化酶(EC1.14.13.78)活性的多肽能够催化内根-贝壳杉烯的4-甲基的连续三次氧化以产生贝壳杉烯酸。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。

为了本发明的目的，具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性(EC1.14.13)活性的多肽能够催化利用NADPH和O₂形成甜菊醇(对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-羧酸)的反应。这种活性也可被称为内根-贝壳杉烯13-羟化酶活性。

在本发明方法中使用的重组微生物可包括一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物能够生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷、杜克苷A中的至少一种。

为了本发明的目的，具有UGT活性的多肽具有糖基转移酶(EC2.4)活性，即作为催化剂能够催化单糖基团从有活性的的核苷酸糖(又称“糖基供体”)转移至糖基受体分子(通常是醇)。UGT的糖基供体通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖)。

可以选择所使用的UGTs以产生期望的二萜糖苷，例如甜菊糖苷。Humphrey等人，PlantMolecularBiology(2006)61:47-62和Mohamed等人，J.PlantPhysiology168(2011)1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意图。此外，图10展示了甜菊糖苷形成的示意图。

莱苞迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体而言，莱苞迪苷A可通过以下步骤形成：首先葡糖基化甜菊醇的13-OH形成13-O-甜菊单糖苷，然后葡糖基化甜菊单糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'形成甜菊醇-1,2二糖苷，接着葡糖基化甜菊醇-1,2二糖苷的C-19羟基形成甜菊糖苷，以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'形成莱苞迪苷A。各个葡糖基化反应发生的顺序可以变化—参见图10。如该示意图中所示，一种UGT可以能够催化不止一种转换。

通过在重组宿主中表达编码功能UGTs(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2)的基因，可以实现从甜菊醇到莱苞迪苷A或莱苞迪苷D的转换。因此，当表达这四种UGTs的用于本发明方法中的重组微生物产生甜菊醇或向培养基中补加甜菊醇时，该微生物能够制造莱苞迪苷A。通常，这些基因中的一个或多个是重组基因，它们被转化到天生不具有这些基因的微生物中。所有这些酶的实例都展示在表1中。本发明的微生物可能包括UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2的任意组合。在表1中，序列UGT64G1被表示为序列UGT1，序列UGT74G1被表示为序列UGT3，序列UGT76G1被表示为序列UGT4，序列UGT2被表示为序列UGT2。

适合用于本发明的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说，适合用于本发明方法中的微生物可包括能够催化将甜菊醇转换为甜菊单糖苷的UGT。因此，这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊单糖苷。

这种微生物可包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT85C2所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊醇转换为甜菊单糖苷。

UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-OH转移一个葡萄糖单元。因此，合适的UGT85C2可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-OH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶的作用。功能UGT85C2多肽还可以催化葡糖基转移酶反应，该反应利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡糖苷作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT1。

用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说，合适的微生物可包括能够催化将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊双糖苷。

适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。

适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT2所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。

合适的UGT2多肽起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶(也被称为甜菊醇-13-单葡糖苷1,2-转葡糖基酶)的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。通常，合适的UGT2多肽还起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜叶悬钩子苷转移酶的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜叶悬钩子苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。

功能性UGT2多肽还可以催化利用甜菊糖苷，而非甜菊醇-13-O-葡糖苷和甜叶悬钩子苷作为底物的反应，例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作为底物，将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱苞迪苷E。功能UGT2多肽还可以利用莱苞迪苷A作为底物，将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱苞迪苷D。但是功能UGT2多肽通常不能将葡萄糖部分转移至C-13位有1,3-键葡萄糖的甜菊醇化合物，即不能将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-二苷和1,3-甜菊苷。功能UGT2多肽还可以从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的其他供体转移糖部分。例如，功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸D-木糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用，将木糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。又例如，功能UGT2多肽能够起尿嘧啶5'-二磷酸L-鼠李糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用，将鼠李糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。这种序列在表1中被表示为序列UGT2。

适合用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将甜菊双糖苷转换为甜菊苷的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊苷。

适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。

合适的UGT74G1多肽可以将葡萄糖单元分别转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH。合适的UGT74G1多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇19-COOH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-O-葡糖苷19-COOH转移酶的作用。功能UGT74G1多肽还可以催化糖基转移酶反应，该反应利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡糖苷作为底物，或者该反应从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的供体转移糖部分。这种序列在表1中被表示为序列UGT1。

适合在本发明方法中使用的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的糖基化的多肽。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱苞迪苷A的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷转换为莱苞迪苷A。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱苞迪苷A。

适合用于本发明方法的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT76G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊苷转换为莱苞迪苷A。

合适的UGT76G1将葡萄糖部分添加到受体分子(甜菊醇1,2-糖苷)的C-13-O-葡萄糖的C-3’。因此，UGT76G1起着例如，尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-O-1,2葡糖苷C-3’葡糖基转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇19-O-葡萄糖，13-O-1,2二苷C-3’葡糖基转移酶的作用。功能UGT76G1多肽还可以催化葡糖基转移酶反应，该反应利用含糖(除葡萄糖外)的甜菊糖苷(例如甜菊鼠李糖苷和甜菊木糖苷)作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT4。

适合用于本发明方法的微生物可以包括编码具有上述四种UGT活性中的一种或多种的多肽的核苷酸序列。优选地，本发明所述的微生物可以包括编码具有全部上述四种UGT活性的多肽的核苷酸序列。给出的核酸可以编码具有一种或多种上述活性的多肽。例如，编码具有2种、3种或4种上述活性的多肽的核酸。优选地，这种的重组微生物包括UGT1活性、UGT2活性和UGT3活性。更优选地，这种重组微生物还包括UGT4活性。

适合用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱苞迪苷A的葡糖基化。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将甜菊苷或莱苞迪苷A转换为莱苞迪苷D的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷或莱苞迪苷A转换为莱苞迪苷D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱苞迪苷D。我们已经证明：表达UGT85C2、UGT2、UGT74G1和UGT76G1多肽组合物的微生物可以产生莱苞迪苷D。

适合用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的糖基化的多肽。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱苞迪苷E的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷转换为莱苞迪苷E。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱苞迪苷E。

适合用于本发明方法的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化莱苞迪苷E的糖基化的多肽。也就是说，这样的微生物可包括能够催化将莱苞迪苷E转换为莱苞迪苷D的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷或莱苞迪苷A转换为莱苞迪苷D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱苞迪苷D。

适合用于本发明方法的重组微生物可表达编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。也就是说，这种的重组微生物可包括编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的序列。

为了本发明的目的，具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性(EC1.6.2.4；又名NADPH:高铁血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450氧化还原酶、POR、CPR、CYPOR)的多肽通常是膜结合型的酶，它使电子从含有FAD和FMN的酶—NADPH:细胞色素P450还原酶(POR；EC1.6.2.4)转移至真核细胞微粒体中的细胞色素P450。

优选地，适合用于根据在前的权利要求中的任意一项所述方法中的重组微生物能够表达下述序列中的一种或多种：

a.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO(SEQIDNO)：54、56、58或78的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：53、55、57或77的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，

优选地，适合用于本发明方法的重组微生物能够表达以下核苷酸序列中的一种或多种：

a.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：1、3、5、7、17、19、59或61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，

b.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，

c.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；或者

d.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在适合用于本发明方法的能够表达编码可催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：35、37、71、147、168、169或189的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在适合用于本发明方法的能够表达编码可催化在甜菊单糖苷C-13位添加葡萄糖(这通常表示甜菊单糖苷的C-13-葡萄糖/13-O-葡萄糖的C-2’的糖基化)的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：88、100、102、104、106、108、110或112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在适合用于本发明方法的能够表达编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：39、41、43、45、47、73、148、170、171、172、173、174或190的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在适合用于本发明方法的表达编码可催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列，所述多肽包括与SEQID.NO：50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：49、51、75、149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在适合用于本发明方法的表达编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述反应为：将甜菊苷或莱苞迪苷A葡糖基化为莱苞迪苷D、将甜菊苷葡糖基化为莱苞迪苷E或者将莱苞迪苷E葡糖基化为莱苞迪苷D，所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列，其中所述反应为：将甜菊苷或莱苞迪苷A糖基化为莱苞迪苷D、将甜菊苷糖基化为莱苞迪苷E或者将莱苞迪苷E糖基化为莱苞迪苷D，其中所述多肽包括与SEQID.NO：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

适合用于根据本发明所述方法的微生物产生香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的能力可被上调。在本发明的语境中，上调意味着：较同等但未被转化的菌株，本发明的微生物产生更多GGPP。

因此，适合用于本发明方法的微生物可包括编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列中的一种或多种，通过将所述核苷酸序列转化至微生物使其生产GGPP的水平提高。

优选地，适合用于本发明方法的微生物能够表达以下序列中的一种或多种：

a.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：80的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：79的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，

b.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：82的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：81的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；或者

c.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与SEQID.NO：84的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：83的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

本发明的方法包括使用重组微生物。为了本发明的目的，微生物通常指人类肉眼不可见的(即显微的)生物体。所述微生物可以来自细菌、真菌、古生菌或原生生物。所述微生物通常是单细胞生物。

本文中使用的重组微生物被定义为：被遗传修饰或者被一种或多种核苷酸序列(如在本文中所定义的)转化/转染的微生物。一种或多种这类核苷酸序列的存在改变了微生物产生二萜或二萜糖苷(特别是甜菊醇或甜菊糖苷)的能力。未被转化/转染或遗传修饰的微生物不是重组微生物，其通常不包括能使细胞产生二萜或二萜糖苷的一种或多种核苷酸序列。因此，未被转化/转染的微生物在自然条件下通常不能产生二萜，然而天生能够产生二萜或二萜糖苷并且根据本发明所述经修饰的微生物(以及产生二萜/二萜糖苷的能力改变的微生物)被认为是根据本发明所述的重组微生物。

序列同一性在本文中被定义为：两种或多种氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两种或多种核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，序列同一性或相似性是对被比较序列的全长进行比较。在本领域，“同一性”还意味着氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，其由这些序列串之间的匹配程度所决定(视情况而定)。利用本领域的技术人员已知的各种方法易于计算出“同一性”和“相似性”。判断同一性的优选方法被设计成可以给出被检验的序列之间最大程度的匹配。然后，通常在被比较序列的全长范围计算同一性和相似性。判断同一性和相似性的方法被编码成了一些可通过公开途径获得的计算机程序。优选的判断两段序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括，例如BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，在NCBI和其它来源(BLASTManual，Altschul，S.等人，NCBINLMNIHBethesda，MD20894)中公开可用)。使用BLASTP对比氨基酸序列时，优选的参数是：空位开放10.0、空位扩展0.5、Blosum62矩阵。使用BLASTP对比核酸序列时，优选的参数是：空位开放10.0、空位扩展0.5、DNA全矩阵(DNA身份矩阵)。

还可以用下述方法定义编码表达于本发明所述细胞中的酶的核苷酸序列：在温和杂交条件下，或者优选地在严格杂交条件下，将所述核苷酸序列与SEQID.NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或84的核苷酸序列或者本文中提到的任何其它序列分别杂交，然后根据它们的杂交性能定义。“严格杂交条件”在本文中被定义为下述条件：在约65℃下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中，允许包括至少约25个核苷酸，优选的约50、75或100个核苷酸，最优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交，然后在65℃下，在含有约0.1M盐(优选的是0.2×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地，杂交持续过夜，即至少10小时；优选地，洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列特异性杂交。

温和条件在本文中被定义为：在约45℃下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中，允许包括至少约50个核苷酸，优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交，然后在室温下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地，杂交持续过夜，即至少10小时；优选地，洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许序列同一性最高为50％的序列特异性杂交。本领域的技术人员可以调整这些杂交条件以确切鉴定同一性在50％-90％之间变化的序列。

编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以是原核来源或真核来源。

编码内根-柯巴基焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184中展示的序列。

编码内根-贝壳杉烯合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184中展示的序列。

编码内根-贝壳杉烯氧化酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186中展示的序列。优选的KO是由在SEQID.NO:85中展示的核酸编码的多肽。

编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185中展示的序列。优选的KAH是由在SEQID.NO:33中展示的核酸编码的多肽。

本发明一个更优选的重组微生物可以表达由SEQID.NO:85和SEQID.NO:33或上述二者之一的变体(如本文所述)编码的多肽的组合物。本发明优选的重组微生物可以表达表8中展示的序列组合(与任意UGT2组合，但尤其是与由SEQID.NO:87编码的UGT2组合)。

编码UGT的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中展示的序列。

编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:79中展示的序列。

编码法尼基-焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:81中展示的序列。

编码香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:83中展示的序列。

编码NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以包括，例如在SEQID.NO:53、55、57或77中展示的序列。

对于UGT序列，选自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的，其中所述组是：(i)SEQID.NO:35、37、168、169、71、147或189；(ii)SEQID.NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192；(iii)SEQID.NO:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190；和(iv)SEQID.NO:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT，那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT，那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。

本发明可使用与上述序列的序列同一性至少约10％、约15％、约20％，优选地至少约25％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列。

为了增加被引入的酶在细胞中以活性形式表达的可能性，可修改相应的编码核苷酸序列以将其密码子使用(codonusage)优化为所选真核宿主细胞的密码子使用。编码酶的核苷酸序列相对于所选宿主细胞的密码子使用的适应性可被表示为密码子适应指数(CAI)。“密码子适应指数”在本文中被定义为：一个基因的密码子使用相对高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量值。每种密码子的相对适应度(w)指的是对于同一个氨基酸，该密码子相对于最高丰度密码子的使用率。CAI被定义为这些相对适应性数值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0-1之间，较高的值表示最高丰度的密码子的比例较高(参见Sharp和Li，1987，NucleicAcidsResearch15:1281-1295；亦可参见:Jansen等人，2003，NucleicAcidsRes.31(8):2242-51)。优选地，经修改的核苷酸序列的CAI值至少为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。

在一个优选的实施方式中，用核苷酸序列遗传修饰根据本发明所述的真核细胞，其中使用密码对优化技术(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)修改所述核苷酸序列的密码子使用为真核细胞的密码子使用。密码对优化技术是用于在宿主细胞中产生多肽的方法，其中就编码多肽的核苷酸序列的密码子使用(尤其是被使用的密码对)对核苷酸序列进行修饰，以改善编码多肽的核苷酸序列的表达和/或提高多肽的产量。密码对被定义为：编码序列中的一组2个连续的三联体(密码子)。

可利用公知的方法(例如易错PCR或定向进化)进一步提高本发明所述的真核宿主细胞体内酶的活性。WO03010183和WO03010311中描述了定向进化的优选方法。

根据本发明的微生物可以是微生物来源的任何合适的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是酵母或丝状真菌。更优选地，所述宿主细胞属于下述属之一：Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen或Yamadazyma或Zygosaccharomyces。

更优选的微生物属于下述物种：Aspergillusniger,Penicilliumchrysogenum,Pichiastipidis,Kluyveromycesmarxianus,K.lactis,K.thermotolerans,Yarrowialipolytica,Candidasonorensis,C.glabrata,Hansenulapolymorpha,Torulasporadelbrueckii,Brettanomycesbruxellensis,Zygosaccharomycesbailii,Saccharomycesuvarum,Saccharomycesbayanus或Saccharomycescerevisiae物种。优选地，所述微生物是Yarrowia，特别是Yarrowialipolyptica。

可修饰适合用于根据本发明的方法的重组微生物以使ERG9基因被下调和/或ERG5/ERG6基因被缺失。在其它微生物中，可用相同的方法修饰相应的基因。

可以用本文所述的方法转化这种微生物，通过将核苷酸序列转化至所述微生物使细胞能够产生二萜或其糖苷。

用于本发明的一个优选微生物是Yarrowialipolytica细胞。重组Yarrowialipolytica细胞可包括以下每组中的一种或多种核苷酸序列：

(i)SEQID.NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、152、153、154、159、160、182或184。

(ii)SEQID.NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184。

(iii)SEQID.NO:21、23、25、6785、145、161、162、163、180或186。

(iv)SEQID.NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185。

这种微生物通常还包括一种或多种如SEQID.NO:53、55、57或77中所示的核苷酸序列。

这种微生物还可以包括一种或多种如SEQID.NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中所示的核苷酸序列。对于这些序列，来自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的，其中所述组是：(i)SEQID.NO:35、37、168、169、71、147或189；(ii)SEQID.NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192；(iii)SEQID.NO:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190；和(iv)SEQID.NO:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT，那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT，那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。

这种微生物还可以包括下述核苷酸序列：SEQID.NO:79、81和83。

对于上述每种序列(或本文提及的任何序列)，可以使用与所述序列的序列同一性至少约15％，优选地至少约20％、25％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的变体。

可将编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列连接至一个或多个核酸构建体以促进根据本发明所述的微生物的转化。

核酸构建体可以是质粒，其中所述质粒带有编码上述二萜(例如甜菊醇/甜菊糖苷)途径中的酶的基因；或者核酸构建体可包括两个或三个质粒，其中每个质粒分别带有3个或2个基因，这些基因以任意恰当的方式分布并编码二萜途径中的酶。

可以使用任何合适的质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。

选自内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的酶可以源于宿主微生物，这样就可以不需要用一种或多种编码这些酶的核苷酸序列转化而使宿主细胞产生二萜或二萜糖苷酶。可以通过经典的菌株改良方法，进一步提高利用宿主微生物生产二萜/二萜糖苷酶的产量。

核酸构建体可以维持附加体状态，因此其包括自主复制的序列，例如常染色体复制序列。如果宿主细胞是真菌来源，那么合适的游离核酸构建体可以，例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等人，1991，Biotechnology9:968-975)或者AMA质粒(Fierro等人，1995，CurrGenet.29:482-489)。

或者，可以将每种核酸构建体以单拷贝或多拷贝整合至宿主细胞的基因组。可以通过非同源重组将核酸构建体随机整合至宿主细胞的基因组，但优选地通过本领域公知的同源重组(参见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US6,265,186)实现。

任选地，核酸构建体中可存在选择标记。本文中使用的术语“标记”涉及编码允许选择或筛选含有此标记的微生物的性状或表型的基因。标记基因可以是抗生素抗性基因，能够通过使用恰当的抗生素从未被转化的细胞中选出被转化的细胞。或者还可以使用非抗生素抗性标记，例如营养缺陷型标记(URA3、TRP1、LEU2)，被这种核酸构建体转化过的宿主细胞可以不含有标记基因。EP-A-0635574中公开了构建不含重组标记基因的微生物宿主细胞的方法，该方法基于双向标记的使用。或者，可以使可筛选的标记(例如绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶)成为本发明所述的核酸构建体的一部分以筛选被转化的细胞。WO0540186中描述了引入异源多聚核苷酸的优选的无标记方法。

在一个优选的实施方式中，编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列各自与启动子操作性连接，所述启动子能够使根据本发明所述的真核细胞中相应核苷酸序列充分表达，从而使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。

本文中使用的术语“操作性连接”指的是多聚核苷酸元件(或编码序列，或核酸序列)以功能关系连接。当一种核酸序列与另一种核酸序列存在功能关系时，则该核酸序列被与另一种核酸序列“操作性连接”。例如，如果一个启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它与编码序列操作性连接。

本文中使用的术语“启动子”涉及控制一个或多个基因转录的核酸片段，其位于基因转录起始位点的上游(相对于转录方向)，在结构上可以根据依赖DNA的RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它的DNA序列(包括但不局限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地从启动子调控转录量的任何其它核苷酸序列)的存在来鉴定。“组成型”启动子指的是在大部分环境和发育条件下活跃的启动子。“诱导型”启动子指的是在环境或发育调控下活跃的启动子。

能够被用来表达编码上文所定义的酶的核苷酸序列的启动子可以不源于编码要表达的酶的核苷酸序列，即启动子和与其操作性连接的核苷酸序列(编码序列)是异源的。优选地，启动子是同源的，即相对于宿主细胞是內源的。

在本发明所述的微生物中，合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其它合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。实施例中陈述了其它合适的启动子。

本发明可以使用任何在细胞中有功能的终止子。优选的终止子是从宿主细胞的天然基因中获得的。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，在本发明的宿主细胞中，这种终止子与阻止无义介导的mRNA降解的突变体结合(参见实施例：Shirley等人，2002，Genetics161:1465-1482)。

本发明中使用的核苷酸序列可以包括将其锚定至微生物的期望隔室的序列。例如，在本发明所述的一种优选的微生物中，除内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的编码序列外的所有核苷酸序列都可被锚定至细胞溶质。可以在酵母细胞中使用这种方法。

当使用术语“同源的”表示给出的(重组)核酸或多肽分子与给出的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，可以理解为：本质上，核酸或多肽分子由一种宿主细胞或相同物种(优选的是相同变体或菌株)的生物体产生。

当使用术语“异源的”表示核酸(DNA或RNA)或蛋白质时，其中所涉及的核酸或蛋白质在自然条件下并不作为其存在的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的一部分出现，或者是与在自然界发现的不同的细胞、位置、基因组或者DNA或RNA序列中发现的核酸或蛋白质。异源的核酸或蛋白质相对于其被引入的细胞不是內源的，但它是从另外一种细胞或者合成或重组生产获得的。

适合用于本发明方法的重组微生物通常包括异源的核苷酸序列。或者适合用于本发明方法的重组微生物可包括被修饰(如本文所述)的完全同源的序列，以便所述微生物比同种但未被修饰的微生物产生更大量的二萜和/或二萜糖苷。

可过表达一种或多种本文所述的二萜途径中的酶以利用细胞产生充足的二萜。

本领域存在多种用以在本发明的宿主细胞中过表达酶的有效方法。特别地，可以通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数以过表达该酶，例如通过将基因的额外拷贝整合至宿主细胞的基因组中。

根据本发明所述的优选的宿主细胞可以是天然能够产生GGPP的重组细胞。

适合用于根据本发明方法的重组微生物可以在本领域已知的任意合适的碳源上生长并将其转换为二萜或二萜糖苷。所述重组微生物可直接转换植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的宿主生物体表达酶，例如将纤维素转换为葡萄糖单体所需的纤维素酶(内纤维素酶和外纤维素酶)、将半纤维素转换为木糖和阿拉伯糖单体所需的半纤维素酶(例如内木聚糖酶、外木聚糖酶、阿拉伯糖酶)、能够将果胶转换为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶或者能够将淀粉转换为葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，所述宿主细胞能够转换的碳源选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。所述宿主细胞可以是，例如如在WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO2006096130或WO04/099381中描述的真核宿主细胞。

本发明涉及一种生产二萜或二萜糖苷的方法，其包括在合适的发酵培养基中发酵本文所述的重组微生物；以及从所述发酵培养基回收二萜和/或二萜糖苷。

在生产二萜或二萜糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是任何能使所述重组细胞生长的适合的培养基。合适发酵培养基的基本元素是本领域的技术人员已知的，并可针对所使用的特定细胞进行修改。

优选地，发酵培养基包括选自植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油的碳源。优选地，发酵培养基还包括氮源，例如尿素或者铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵)。

可以以分批、补料分批或连续的模式实施根据本发明的发酵方法。也可采用分步水解发酵(SHF)法或同时糖化发酵(SSF)法。为了达到最佳生产力，还可以将这些发酵方法的模式结合。在发酵方法中，如果使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源，那么SSF方法可能特别有吸引力，该方法中可能需要加入水解酶，例如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶以水解底物。

在制备二萜或二萜糖苷的方法中使用的重组微生物可以是任何如上文所定义的适合的微生物。细胞可以在低pH条件下生长以避免细菌污染。

根据本发明所述的生产二萜的发酵方法可以是有氧的或厌氧的发酵方法。

厌氧发酵方法在本文中可被定义为：在没有氧气或实质上没有氧气可用(优选的少于5、2.5或1mmol/L/h)的条件下运行的发酵方法，其中有机分子起着电子供体和电子受体的作用。根据本发明的发酵方法还可以首先在有氧条件下运行，然后在无氧条件下运行。

还可以在氧限制(oxygen-limited)或微有氧(micro-aerobical)条件下运行所述发酵方法。或者，可以先在有氧条件下、然后在氧限制条件下运行所述发酵方法。氧限制发酵方法指的是耗氧量受到从气体输送至液体的氧气的限制。氧限制的程度取决于进入气流的量和组分以及所使用的发酵设备的实际混合/传质性能。

根据本发明所述的方法中，可以在宿主细胞的生长期或静止(稳态)期生产二萜，或者在这两个阶段均生产二萜。可以在不同的温度下运行所述发酵方法。

可以在最适合真核细胞的温度下生产二萜或二萜糖苷。最适宜的生长温度可因各种被转化的真核细胞而异，这是本领域的技术人员已知的。所述最适宜的温度可以比最适合野生型生物体的温度高，以便生物体在非无菌条件下，在感染敏感性最小和冷却成本最低时高效生长。或者，可以在并非最适合重组微生物生长的温度下实施该方法。事实上，我们已经证明在重组微生物生长亚适宜(sub-optimal)温度下实施制备二萜或二萜糖苷的方法可以是有益的。

根据本发明所述的生产二萜或二萜糖苷的方法中，可以获得超过5mg/l发酵液，优选地超过10mg/l，优选地超过20mg/l，优选地超过30mg/l，优选地超过40mg/l，更优选地超过50mg/l，优选地超过60mg/l，优选地超过70mg/l，优选地超过80mg/l，优选地超过100mg/l，优选地超过1g/l，优选地超过5g/l，优选地超过10g/l，但通常低于70g/l的浓度。

关键的是，在本发明的方法中，在细胞外生产一种或多种二萜或糖基化二萜。换言之，所述方法使得在所述发酵培养基中存在一种或多种二萜或糖基化二萜。为了本发明的目的，一种或多种二萜或糖基化二萜的至少约30％在细胞外生产(即，存在于所述发酵培养基中)时，通常表示细胞外生产。给出的百分比表示与留在重组微生物内的相比，多少所述一种或多种二萜或糖基化二萜存在于所述发酵培养基中。换言之，重组微生物生成的所述一种或多种二萜或糖基化二萜的全部的至少约30％在细胞外生产。

在细胞外生产的一种或多种二萜或糖基化二萜的量

在本发明的方法中，一种或多种二萜或糖基化二萜的至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或更多在细胞外生产。

在生产二萜或二萜糖苷的方法中，重组微生物的生长温度可以高于20℃、22℃、25℃、28℃或高于30℃、35℃或高于37℃、40℃、42℃，优选地低于45℃。然而在二萜或二萜糖苷的产生阶段，最适宜的温度可能低于平均温度以优化生物质的稳定性。这个阶段的温度可以低于45℃，例如低于42℃、40℃、37℃，例如低于35℃、30℃或者低于28℃、25℃、22℃或者低于20℃，优选地高于15℃。

因此，本发明提供一种制备二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括在约29℃或更低的温度下，在适合的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化二萜的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化二萜。所述微生物可以是根据本发明的微生物。

这种方法中的发酵温度可以是约29℃或更低、约28℃或更低、约27℃或更低、约26℃或更低，或者更低的温度。

可以在任意合适的pH值下实施根据本发明的生产二萜或二萜糖苷的方法。如果重组微生物是酵母，那么发酵培养基优选的pH值低于6，优选地低于5.5，优选地低于5，优选地低于4.5，优选地低于4，优选地低于3.5或低于3.0或低于2.5，优选地高于2。在这些低pH值下实施发酵过程的一个优势在于，可以防止发酵培养基中污染细菌的生长。

可以以工业规模实施这种方法。

这种方法的产物可以是甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷、杜克苷A中的一种或多种。优选地，产生莱苞迪苷A或莱苞迪苷D。

可以使用本领域已知的方法，例如通过蒸馏、真空抽提、溶剂抽提或蒸发从发酵培养基中回收二萜或二萜糖苷。

本发明还涉及发酵液，所述发酵液包括利用根据本发明的方法能够得到的二萜和/或二萜糖苷。其中所述二萜或二萜糖苷可以是甜菊糖苷，尤其是莱苞迪苷A或莱苞迪苷D。

如果二萜或二萜糖苷表达于微生物中，那么可能需要处理这种细胞以释放二萜/二萜糖苷。

利用根据本发明的发酵方法产生的二萜或二萜糖苷(例如莱苞迪苷A或莱苞迪苷D)可用于这些化合物已知的任何应用中。特别地，例如它们可以在，例如食品或饮料中被用作甜味剂。例如，甜菊糖苷可以被调配在软饮料中、浆汁(juices)中，可以用于桌用型甜味剂(tabletopsweetener)、口香糖、乳制品(例如酸奶(例如原味酸奶))、蛋糕、谷物或基于谷物的食品、营养食品、药物、食用胶、糖果食品、化妆品、牙膏或者其它口腔组合物等。此外，二萜或二萜糖苷作为甜味剂不仅能够用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品，而且还能够用于具有改良特性的动物饲料。

因此，本发明此外还提供包括根据本发明的方法制备的二萜或二萜糖苷的食品、饲料或饮料。

在生产食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖时，可使用常规方法，例如混合、揉捏、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。

对于在本发明中得到的二萜或二萜糖苷，可以以干燥形式或液体形式使用。可以在食品热处理之前或之后加入。甜味剂的量取决于使用目的。可以单独加入或者与其它化合物组合加入。

根据本发明的方法生产的化合物可以与一种或多种其它无热量或有热量的甜味剂混合。这种混合物可被用于改善风味或时间变化形廓或稳定性。大范围无热量和有热量的甜味剂可适合与甜菊糖苷混合。例如，无热量的甜味剂，例如罗汉果苷、莫那甜、阿斯巴甜、乙酰舒泛盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、邻磺苯甲酰亚胺盐或赤藓糖醇。适合与甜菊糖苷混合的有热量的甜味剂包括糖醇和碳水化合物(例如蔗糖、葡萄糖、果糖、转化糖和HFCS)。也可以使用有甜味的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。

二萜或二萜糖苷能够与甜味抑制剂(例如天然甜味抑制剂)组合使用。它可以与鲜味增强剂(例如氨基酸或其盐)组合。

二萜或二萜糖苷能够与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂素、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或植物固醇、多元醇类、益生质、益生素、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或被归为有益健康类的例如有益心血管的、降低胆固醇的或抗炎的物质)组合。

含有二萜或二萜糖苷的组合物可包括增味剂、芳香剂、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味剂、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或脂肪酸盐。

本发明的二萜或二萜糖苷可作为高强度甜味剂被使用以产生具有改良味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病人的饮料和食品。它也能用于不能使用糖的食品、药品和其它产品中。

此外，本发明的二萜或二萜糖苷作为甜味剂，不仅可以用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品，而且可以用于具有改良特征的动物饲料。

使用本发明的二萜或二萜糖苷组合物作为甜味剂的产品实例有：含酒精的饮料(例如伏特加酒、红酒、啤酒、烈酒、日本清酒等)、天然果汁、清凉饮料、碳酸软饮料、低糖饮料、零卡路里饮料、中度和低卡路里饮料和食物、酸奶饮料、速溶果汁、速溶咖啡、粉末型速溶饮料、罐装食品、糖浆剂、发酵豆酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱粉、汤、速食汤、酱油粉、醋粉、饼干类、米饼、咸饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、果脯、榨菜、鲜奶油、果酱、橘子酱、花酱、奶粉、冰激凌、果汁冰糕、瓶装蔬菜、瓶装水果、罐装煮豆、糖酱煮肉和食物、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干海鲜制品、冷冻食品、腌海藻、腊肉、烟草、药品和许多其它产品。原则上，其应用可以不受限制。

甜味组合物包括饮料，其中非限制性的实例包括：非碳酸和碳酸饮料(例如可乐、姜汁汽水、沙士、汤力水、苹果酒、果味软饮料(例如柑橘类(例如柠檬-酸橙或橘子)风味软饮料)、软饮料粉等)；源于水果或蔬菜的果汁、含有压榨汁或其类似物的果汁、含有水果颗粒的果汁、水果饮料、水果汁饮料、含有水果汁的饮料、果味饮料、蔬菜汁、含有蔬菜的果汁以及含有水果和蔬菜的混合果汁；运动饮料、能量饮料、近似水及其类似物的饮料(例如含有天然或合成调味剂的水)；茶类或最受欢迎类饮料(例如咖啡、可可饮料、红茶、绿茶、乌龙茶等)；含有牛奶成分的饮料(例如牛奶饮料、含有牛奶成分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果乳饮料、饮用酸奶、乳酸菌饮料等)和乳制品。

通常，甜味组合物中的甜味剂的量变化很大，这取决于甜味组合物的具体类型和期望甜味。本领域的普通技术人员能够易于分辨出待放入甜味组合物中的甜味剂的合适量。

在本发明中得到的本发明所述的二萜或二萜糖苷可以干燥形式或液体形式被使用。它可以在热处理食品之前或之后被加入。甜味剂的量取决于使用目的。它能够被单独加入或者与其它化合物组合加入。

在制造食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖的过程中可以使用常规方法，例如混合、捏合、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。

因此，可以利用本领域的技术人员已知的任何方法制造本发明的组合物，其中所述方法能够提供组成成分的同质均一的或同质的混合物。这些方法包括干混合、喷雾干燥、凝聚、湿制颗粒、压缩、共结晶等。

可以以任何适合配送至待加糖食品的形式向消费者提供固体的本发明的二萜或二萜糖苷，其中所述形式包括小袋、小包、散装袋或盒、立方块、片、喷雾或者可溶性的条。可以以单位剂量或大批量配送所述组合物。

对于液体甜味剂系列和方便的液体、半液体、膏状和乳状形式的组合物，应该发明一种便于携带或分配或贮存或运输含有任何上述甜味剂产品或上述产品的组合物的合适的包装，其中所述包装使用合适的任意形状或形式的包装材料。

所述组合物可包括各种填充剂、功能成分、色素和香料。

不能认为本文参考的专利文件或者作为现有技术给出的其它材料承认：截止任意权利要求的优先权日，所述文件或材料是已知的或者其所包含的信息是公众常识的一部分。

本文提及的每个参考文献的公开内容均通过引用的方式被全部并入本文。

通过以下实施例进一步阐释本发明。

实施例

总则

标准的遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶以及宿主细胞的额外遗传修饰)是本领域已知的方法，例如在Sambrook和Russel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress或者F.Ausubel等人，eds.，"Currentprotocolsinmolecularbiology"，GreenPublishingandWileyInterscience，NewYork(1987)中所描述的。真菌宿主细胞的转化和遗传修饰的方法可以从，例如EP-A-0635574、WO98/46772、WO99/60102和WO00/37671中了解。

表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号(同样展示于表1)来定义。

实施例1：在S.cerevisiae中过表达ERG20、BTS1和tHMG

使用如共同待决专利申请no.PCT/EP2013/056623中描述的技术将表达盒整合至一个位点以过表达ERG20、BTS1和tHMG1。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株(vanDijken等人EnzymeandMicrobialTechnology26(2000)706-714)的基因组DNA扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0，不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。这些盒子中的基因的侧翼是组成型启动子和终止子。参见表2。溶解来源于DNA2.0的含有ERG20、tHMG1和BTS1盒子的质粒DNA至浓度为100ng/μl。在50μlPCR混合物中，使用20ng模板和20pmol引物。材料被溶解至浓度为0.5μg/μl。

表2：过表达构建体的组分

启动子	开放阅读框	终止子
			Eno2(SEQ ID.NO:201)	Erg20(SEQ ID.NO:81)	Adh1(SEQ ID.NO:212)
Fba1(SEQ ID.NO:202)	tHMG1(SEQ ID.NO:79)	Adh2(SEQ ID.NO:213)
			Tef1(SEQ ID.NO:203)	Bts1(SEQ ID.NO:83)	Gmp1(SEQ ID.NO:214)

使用pUG7-EcoRV构建体(图1)和合适的引物来扩增选择标记。使用ZymocleanGelDNARecovery试剂盒(ZymoResearch)从凝胶中纯化KanMX片段。使用在表3中列出的片段转化酵母菌株Cen.PK113-3C。

表3：用于ERG20、tHMG1和BTS1的转化的DNA片段

片段
	5’YPRcTau3
ERG20盒
	tHMG1盒
KanMX盒
	BTS1盒
3’YPRcTau3

转化后，在30℃下于YEPhD(酵母膏植物蛋白胨葡萄糖；BBL植物蛋白胨来源于BD)中复苏2.5小时，然后将细胞涂布在含200μg/mlG418(Sigma)的YEPhD琼脂上。在30℃下培养平板4天。利用诊断PCR和测序技术确定正确的整合。通过对蛋白质进行LC/MS证实过表达。图2阐释了组装ERG20、tHMG1和BTS1的原理图。该菌株被命名为STV002。

该菌株中CRE重组酶的表达导致KanMX标记的向外重组。利用诊断PCR确定正确的向外重组以及ERG20、tHMG1和BTS1的存在。

实施例2：敲低Erg9

为了降低Erg9的表达，设计并使用含有修饰的3’末端的Erg9敲低构建体，其中所述3’末端延续至驱动TRP1表达的TRP1启动子。

转化含有Erg9-KD片段的构建体至E.coliTOP10细胞。转化株生长于2PY(2倍的植物蛋白胨和酵母膏)-sAMP培养基中。使用QIAprepSpinMiniprepkit(Qiagen)分离质粒DNA，然后用SalI-HF(NewEnglandBiolabs)消化。用乙醇沉淀DNA以浓缩。转化所述片段至S.cerevisiae，然后将菌落涂布到不含色氨酸的矿质培养基(Verduyn等人，1992.Yeast8:501-517)琼脂板上。利用诊断PCR和测序技术确定正确整合的Erg9-KD构建体。图2阐释了执行Erg9-KD构建体的转化的原理图。该菌株被命名为STV003。

实施例3：过表达UGT2_1a

使用共同待决专利申请PCT/EP2013/056623和PCT/EP2013/055047中描述的技术过表达UGT2_1a。在DNA2.0，UGT2_1a被整理为一个盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。细节请参见表4。使用如共同待决专利申请no.PCT/EP2013/055047中描述的技术以获得含有标记和Cre重组酶的片段。用具有诺尔丝菌素抗性的NAT标记进行筛选。

表4：过表达构建体的组分

使用合适的引物进行扩增。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。

使用表5中列出的片段转化S.cerevisiae酵母菌株STV003，然后将转化混合物涂布在含有50μg/ml诺尔丝菌素(LexyNTC来源于JenaBioscience)的YEPhD琼脂板上。

表5：用于UGT2_1a的转化的DNA片段

片段
	5’Chr09.01
UGT2_1a盒
	NAT‐CR
RE
	3’Chr09.01

半乳糖能够激活CRE重组酶的表达。为了诱导CRE重组酶的表达，将转化株再次划线至YEPh半乳糖培养基上。这导致了位于lox位置之间的标记的向外重组。利用诊断PCR证实UGT2a的正确整合和NAT标记的向外重组。由此产生的菌株被命名为STV004。图4阐释了执行UGT2_1a构建体的转化的原理图。

实施例4.RebA生产途径的过表达：CPS、KS、KO、KAH、CPR、 UGT1、UGT3和UGT4

使用共同待决专利申请号PCT/EP2013/056623中描述的技术设计导致RebA生成的所有途径基因以整合在一个位点中。为扩增整合位点的5’和3’整合侧翼，使用来自于CEN.PK酵母菌株的合适引物和基因组DNA。不同的基因在DNA2.0中排列为盒(含有同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(参见表6的概述)。来自于DNA2.0的DNA溶解至100ng/μl。这种原液进一步稀释至5ng/μl，其中1μl用于50μl-PCR混合物中。反应含25pmol的各引物。扩增后，用NucleoSpin96PCRClean-up试剂盒(Macherey-Nagel)纯化DNA或者使用乙醇沉淀进行浓缩。

表6.用于RebA生成途径的序列

用于RebA途径的所有片段、标记和侧翼(参见表7中的概述)转化到S.cerevisiae酵母菌株STV004中。在20℃下在YEPhD中过夜恢复后，将转化混合物铺板在含有200μg/mlG418的YEPhD琼脂上。这些在25℃下培育3天并且在室温下培育一夜。

表7.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4转化的DNA片段

片段
	5’INT1
CPS盒
	KS盒
KO盒
	KanMX盒
KAH盒
	CPR盒
UGT1盒
	UGT3盒
UGT4盒
	3’INT1

经诊断PCR和序列分析(3500基因分析仪，AppliedBiosystems)确认正确整合。用BigDye终止子v3.1循环测序试剂盒(LifeTechnologies)进行序列反应。每种反应物(10μl)含有50ng模板和3.2pmol引物。通过乙醇/EDTA沉淀纯化产物，溶于10μlHiDi甲酰胺中并施加到装置上。该菌株命名为STV006。图5中说明了从GGPP到RebA的途径如何整合到所述基因组中的示意图。

实施例5.KO和CPR酶变体

如实施例6中所述，使用相同CPS、KS、KAH、UGT1、UGT3和UGT4盒，但使用KO和CPR基因的不同变体产生另一菌株STV016。KO基因受到如实施例4中所述的相同ScENO2.pro启动子和ScTPI1.ter终止子的控制。CPR基因受到如实施例4中所述的相同Klprom6.pro启动子和ScPDC1.ter终止子的控制。表8中描述了KO和CPR基因变体。表9总结了构建的S.cerevisiae酵母菌株。

表8.具有KO和CPR酶不同组合的菌株

菌株	KO	CPR
			STV006	KO_Gibfu(SEQ ID NO:85)	CPR_3(SEQ ID NO:57)
STV016	KO_2(SEQ ID NO:23)	CPR_SR(SEQ ID NO:59)

表9.S.cerevisiae菌株

实施例6.产甜菊醇的重组Yarrowialipolytica菌株的构建

如下构建用于合成甜菊醇的质粒pMB6754、pMB6761和pMB6762(参见表10和图6、7和8)编码基因。使用如PCT/EP2007/05594中公开的密码子对优化技术密码子对优化tCPS(SEQIDNO:182)、tKS(SEQIDNO:183)、CPSKS(SEQIDNO:184)、KOGib(SEQIDNO:186)、KAH4(SEQIDNO:185)、CPR1(SEQIDNO:187)和CPR3(SEQIDNO:188)的开放阅读框，以在Yarrowialipolytica中表达。

用GenScript合成两侧为60bp所需启动子和终止子的优化序列(SEQIDNOS:182-188)，并且使用适当引物通过PCR扩增。通过PCR由现有构建体(SEQID193-197和199)扩增编码终止子-启动子序列，TPI启动子或Yarrowialipolytica标记的DNA片段。使用标准技术由E.coli制备由基于S.cerevisiae着丝粒的URA3质粒YCp50(Rose等人，Gene1987；60(2-3):237-43)和来自于Yarrowia的置换tet基因的ENOp组成的载体DNA(SEQID198)并用XbaI和SnaBI酶切。使用QiaQuick试剂盒(Qiagen)通过凝胶电泳纯化所有片段。S.cerevisiae菌株10556-23C(W303背景；G.R.Fink)经250ng的各DNA片段转化(Gietz和Schiestl，Nat.Protoc.2007；2(1):31-4)并且在最低葡萄糖天冬氨酸培养基上选择原养型。从原养型转化株中营救质粒(NucleicAcidsResearch，第20卷，第14期，第3790页(1992))并且用于在LB琼脂板上将E.coliDH5α转化为氨苄青霉素抗性(100mg/L)。

通过用pMB4591(tef1-GGSURA2)转化MF350获得香叶基香叶基二磷酸合酶表达增加的Yarrowia菌株ML2597(US7851199)。质粒pMB6754、pMB6761和pMB6762经SfiI消化并用于在含有腺嘌呤(0.2mM)的最低葡萄糖天冬氨酸培养基上将ML2597转化为亮氨酸原养型。将转化株重新划线到选择培养基上并且随后接种于24孔微量滴定板(MTP)中的0.8mlYPD。板经BugStopper垫(Whatman)密封并且在30℃下，以800rpm振荡使菌株在Multitron培育箱(Infors)内生长6天以生成甜菊醇-参见表11。

表10.甜菊醇和RebA途径质粒

质粒	SEQIDs	基因型(部分)
			pMB6754	184,185,186,187,194,195,196,197,198,199	CPSKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_1,LEU2
pMB6761	184,185,186,188,194,195,196,197,198,199	tCPS,tKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_1,LEU2
			pMB6762	182,183,185,186,188,193,194,195,196,197,198,199	tCPS,tKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_3,LEU2
pMB6775	189,190,191,192,194,195,196,198,199,200	UGT1,UGT3,UGT4,UGT2,HPH

表11.产甜菊醇菌株

菌株	质粒
		ML12925	pMB6754
ML12927	pMB6754
		ML12929	pMB6162
ML12930	pMB6162
		ML12931	pMB6761
ML12932	pMB6761

实施例7：产RebA的重组Yarrowialipolytica菌株的构建

如下构建用于合成RebA的质粒pMB6775(参见表10和图9)编码基因。使用如PCT/EP2007/05594中公开的密码子对优化技术密码子对优化UGT1、UGT3、UGT4和UGT2的开放阅读框，以在Yarrowialipolytica中表达。用GenScript(SEQIDNOS:189-192)合成两侧为60bp所需启动子和终止子的优化序列，并且使用适当引物通过PCR扩增。通过PCR由现有构建体(SEQIDNO:194-196、199和200)扩增编码终止子-启动子序列或Yarrowialipolytica标记的DNA片段。使用标准技术由E.coli制备由基于S.cerevisiae着丝粒的URA3质粒YCp50(Rose等人，同上)和来自于Yarrowia的置换tet基因的ENOp组成的载体(SEQID198)并用XbaI和SnaBI消化。使用QiaQuick试剂盒(Qiagen)通过凝胶电泳纯化所有片段。S.cerevisiae菌株10556-23C(W303背景；G.R.Fink)经250ng的各DNA片段转化(Gietz和Schiestl，同上)并且在最低葡萄糖天冬氨酸培养基上选择原养型。从原养型转化株中营救质粒(NucleicAcidsResearch，第20卷，第14期，第3790页(1992))并且用于在LB琼脂板上将E.coliDH5α转化为氨苄青霉素抗性(100mg/L)。

质粒MB6775经SfiI消化并用于在YPD琼脂板上将产甜菊醇的Yarrowia菌株ML12925、ML12929和ML12931转化为潮霉素抗性(100mg/L)。将转化株重新划线到选择培养基上并且随后接种于24孔微量滴定板(MTP)中的0.8mlYPD。板经BugStopper垫(Whatman)密封并且在30℃下，以800rpm振荡使菌株在Multitron培育箱(Infors)内生长6天以生成甜菊醇。

ML12929的产RebA转化株命名为ML12986。以两种方式之一由ML12986产生原养型菌株。在YNB板上用经HaeIII消化的pMP4637(WO2006/102342)将ML12986转化为原养型，产生菌株ML12987。可替代地，使ML12986与ML5929配种。通过引入受内源性TEF1启动子控制的异源基因，加上几代杂交育种构建ML5929{MATAura2ADE1-tHMGLEU2-CarRP}。针对RebA生产筛选原养型孢子，导致分离出ML13113。

实施例8：由Saccharomyces和Yarrowia生成RebA

如上所述构建的S.cerevisiae菌株STV016和Y.lipolytica菌株ML13113在30℃和200rpm下在摇瓶中(2l，含200ml培养基)培养1天。如表12和13所述，培养基根据Verduyn等人(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992年7月；8(7):501-517)，在碳源和氮源上有修改。

表12.S.cerevisiae菌株STV016预培养基组成

原材料	式	浓度(g/kg)
			半乳糖	C6H12O6	20.0
尿素	(NH2)2CO	2.3
			磷酸二氢钾	KH2PO4	3.0

硫酸镁	MgSO4.7H2O	0.5
			微量元素溶液		1
维生素溶液		1

表13.Y.lipolytica菌株ML13113预培养基组成

原材料	式	浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	22.0
尿素	(NH2)2CO	2.3
			磷酸二氢钾	KH2PO4	3.0
硫酸镁	MgSO4.7H2O	0.5
			微量元素溶液		1
维生素溶液		1

^a微量元素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			EDTA	C10H14N2Na2O8.2H2O	15.00
硫酸锌.7H2O	ZnSO4.7H2O	4.50
			氯化锰.2H2O	MnCl2.2H2O	0.84
氯化钴(II).6H2O	CoCl2.6H2O	0.30
			硫酸铜(II).5H2O	CuSO4.5H2O	0.30
钼酸钠.2H2O	Na2MoO4.2H2O	0.40
			氯化钙.2H2O	CaCl2.2H2O	4.50
硫酸铁.7H2O	FeSO4.7H2O	3.00
			硼酸	H3BO3	1.00
碘化钾	KI	0.10

^b维生素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			生物素(D-)	C10H16N2O3S	0.05
泛酸钙D(+)	C18H32CaN2O10	1.00
			烟酸	C6H5NO2	1.00
肌醇	C6H12O6	25.00

氯化硫胺盐酸盐	C12H18Cl2N4OS.xH2O	1.00
			吡哆醇盐酸盐	C8H12ClNO3	1.00
对氨基苯甲酸	C7H7NO2	0.20

随后，将200ml摇瓶内容物转移到S.cerevisiae菌株STV016的发酵罐中(起始体积5L)并且将12ml摇瓶内容物转移到解Y.lipolytica菌株ML13113的发酵罐中(起始体积0.3L)，发酵罐装有如表14中展示的培养基。

表14.发酵培养基组成

原材料		最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	4.4
硫酸铵	(NH4)2SO4	1
			磷酸二氢钾	KH2PO4	10
硫酸镁	MgSO4.7H2O	5
			微量元素溶液	-	8
维生素溶液	-	8

通过添加氨水(25重量％)将pH控制在5.0。温度控制在27℃下。通过调节搅拌器速度将pO₂控制在40％。如表15所展示，保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制。

表15.发酵进料培养基的组成

原材料	式	最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	550
磷酸二氢钾	KH2PO4	15.1
			七水硫酸镁	MgSO4.7H2O	7.5
Verduyn微量元素溶液		12
			Verduyn维生素溶液		12

用含有8.5g/lNaCl的生理盐溶液洗涤全培养液样品两次。在全培养液和经洗涤培养液中的RebA浓度显示，对于Y.lipolytica菌株而言可通过洗涤去除93％的RebA并且对于S.cerevisiae而言可通过两个洗涤步骤去除19％的RebA(参见表16)。

表16.全培养液和经洗涤培养液中的RebA

实施例9.ERG20、BTS1和tHMG在S.cerevisiae中的过表达

为了ERG20、BTS1和tHMG1过表达，使用共同待决专利申请第PCT/EP2013/056623号中描述的技术设计表达盒以整合在一个位点中。为扩增整合位点的5’和3’整合侧翼，使用来自于CEN.PK酵母菌株的合适引物和基因组DNA(vanDijken等人EnzymeandMicrobialTechnology26(2000)706-714)。不同的基因在DNA2.0中排列为盒(含有同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。这些盒中的基因两侧为组成型启动子和终止子。参见表17。来自于DNA2.0的含ERG20、tHMG1和BTS1盒的质粒DNA溶解至100ng/μl的浓度。在50μlPCR混合物中20ng模板与20pmol引物一起使用。将所述材料溶解至0.5μg/μl的浓度。

表17：过表达构建体的组成

启动子	ORF	终止子
			Eno2(SEQ ID NO:201)	Erg20(SEQ ID NO:81)	Adh1(SEQ ID NO:212)
Fba1(SEQ ID NO:202)	tHMG1(SEQ ID NO:79)	Adh2(SEQ ID NO:213)
			Tef1(SEQ ID NO:203)	Bts1(SEQ ID NO:83)	Gmp1(SEQ ID NO:214)

为了扩增选择标记，使用pUG7-EcoRV构建体(图1)和合适的引物。使用Zymoclean凝胶DNA回收试剂盒(ZymoResearch)从凝胶中纯化KanMX片段。用表18所列的片段转化酵母菌株Cen.PK113-3C。

表18：用于ERG20、tHMG1和BTS1转化的DNA片段

片段

5’YPRcTau3
	ERG20盒
tHMG1盒
	KanMX盒
BTS1盒
	3’YPRcTau3

在30℃下在YEPhD(酵母提取物植物蛋白胨葡萄糖；来自于BD的BBL植物蛋白胨)中转化和回收2.5小时后，将细胞铺板在含200μg/mlG418(Sigma)的YEPhD琼脂上。板在30℃下培育4天。经诊断PCR和测序确定正确整合。经过对所述蛋白的LC/MS确认过表达。图2中说明了ERG20、tHMG1和BTS1组装的示意图。这种菌株命名为STV002。

CRE-重组酶在这种菌株中的表达导致KanMX标记的外重组。经诊断PCR确定正确的外重组和ERG20、tHMG和BTS1的存在。

实施例10.Erg9敲低

为减少Erg9的表达，设计并使用含有经修饰3’末端的Erg9敲低构建体，持续到TRP1启动子驱动TRP1表达。

含有Erg9-KD片段的构建体转化到E.coliTOP10细胞中。使转化株在2PY(2倍植物蛋白胨酵母提取物)、sAMP培养基中生长。用QIAprepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA并用Sall-HF(NewEnglandBiolabs)消化。为了浓缩，用乙醇使DNA沉淀。将所述片段转化到S.cerevisiae中，并且将菌落铺板在无色氨酸的矿质培养基(Verduyn等人，1992.Yeast8:501-517)琼脂板上。经诊断PCR和测序确认Erg9-KD构建体的正确整合。图3中说明了Erg9-KD构建体进行转化的示意图。该菌株命名为STV003。

实施例11.UGT2_1a过表达

为了UGT2_1a过表达，使用如共同待决专利申请第PCT/EP2013/056623和PCT/EP2013/055047号中描述的技术。UGT2_1a在DNA2.0中排列为盒(含有同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。详情参见表19。为获得含有标记和Cre-重组酶的片段，使用如共同待决专利申请第PCT/EP2013/055047号中描述的技术。使用赋予对诺尔丝菌素抗性的NAT标记进行选择。

表19：过表达构建体的组成

使用合适的引物扩增。为扩增整合位点的5’和3’整合侧翼，使用来自于CEN.PK酵母菌株的合适引物和基因组DNA。

用表20所列的片段转化S.cerevisiae菌株STV003，并且将转化混合物铺板在含有50μg/ml诺尔丝菌素(来自于JenaBioscience的LexyNTC)的YEPhD琼脂板上。

表20：用于UGT2_1a转化的DNA片段

片段
	5’Chr09.01
UGT2_1a盒
	NAT-CR
RE
	3’Chr09.01

CRE重组酶的表达受半乳糖的存在而激活。为诱导CRE重组酶的表达，将转化株重新划线于YEPh半乳糖培养基上。这导致位于lox位点之间的标记外重组。经诊断PCR确认UGT2a的正确整合和NAT标记的外重组。所得菌株命名为STV004。图4中说明了UGT2_1a构建体进行转化的示意图。

实施例12.RebA生成途径的过表达：CPS、KS、KO、KAH、CPR、 UGT1、UGT3和UGT4

使用共同待决专利申请第PCT/EP2013/056623号中描述的技术设计导致RebA生成的所有途径基因以整合在一个位点中。为扩增整合位点的5’和3’整合侧翼，使用来自于CEN.PK酵母菌株的合适引物和基因组DNA。不同的基因在DNA2.0中排列为盒(含有同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(参见表21的概述)。来自于DNA2.0的DNA溶解至100ng/μl。这种原液进一步稀释至5ng/μl，其中1μl用于50μl-PCR混合物中。反应物含25pmol的各引物。扩增后，用NucleoSpin96PCR清洁试剂盒(Macherey-Nagel)纯化DNA或可替代地使用乙醇沉淀进行浓缩。

表21.用于RebA生成途径的序列

用于RebA途径的所有片段、标记和侧翼(参见表22中的概述)转化到S.cerevisiae酵母菌株STV004中。在20℃下在YEPhD中过夜恢复后，将转化混合物铺板在含有200μg/mlG418的YEPhD琼脂上。这些在25℃下培育3天并且在室温下培育一夜。

表22.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3和 UGT4转化的DNA片段

片段

5’INT1
	CPS盒
KS盒
	KO盒
KanMX盒
	KAH盒
CPR盒
	UGT1盒
UGT3盒
	UGT4盒
3’INT1

经诊断PCR和序列分析(3500基因分析仪，AppliedBiosystems)确认正确整合。用BigDye终止子v3.1循环测序试剂盒(LifeTechnologies)进行序列反应。每种反应物(10μl)含有50ng模板和3.2pmol引物。通过乙醇/EDTA沉淀纯化产物，溶于10μlHiDi甲酰胺中并涂到装置上。该菌株命名为STV040。图5中说明了从GGPP到RebA的途径如何整合到所述基因组中的示意图。

实施例13.从产RebA菌株缺失UGT2

为了缺失菌株STV040中的UGT2_1a，用NAT标记和编码Cre-重组酶的基因置换UGT2_1a。图11中说明了这种构建体。该构建体两侧是与UGT2_1a整合位点同源的序列。为获得含所述标记和Cre-重组酶的片段，使用如共同待决专利申请第PCT/EP2013/055047号中描述的技术。使用赋予对诺尔丝菌素的抗性的NAT标记进行选择。使用合适的引物扩增。

用NAT和CRE构建体转化STV040，并且将转化混合物铺板在含有50μg/ml诺尔丝菌素(来自于JenaBioscience的LexyNTC)的YEPhD琼脂板上。将NAT抗性转化株重新划线以得到单分离株，然后划线到含有半乳糖的板上以诱导Cre-重组酶表达。一种正确的无UGT2_1a的转化株命名为STV055。

实施例14：由Saccharomyces生成RebA和甜叶悬钩子苷

如上所述构建的S.cerevisiae菌株STV040和STV055在30℃和280rpm下在摇瓶中(0.5l，含50ml培养基)培养1天。如表23所述，培养基根据Verduyn等人(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992年7月；8(7):501-517)，在碳源和氮源上有修改。

表23.预培养基组成

原材料	式	浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	22.0
尿素	(NH2)2CO	2.3
			磷酸二氢钾	KH2PO4	3.0
硫酸镁	MgSO4.7H2O	0.5
			微量元素溶液		1
维生素溶液		1

^a微量元素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			EDTA	C10H14N2Na2O8.2H2O	15.00
硫酸锌.7H2O	ZnSO4.7H2O	4.50
			氯化锰.2H2O	MnCl2.2H2O	0.84
氯化钴(II).6H2O	CoCl2.6H2O	0.30
			硫酸铜(II).5H2O	CuSO4.5H2O	0.30
钼酸钠.2H2O	Na2MoO4.2H2O	0.40
			氯化钙.2H2O	CaCl2.2H2O	4.50
硫酸铁.7H2O	FeSO4.7H2O	3.00
			硼酸	H3BO3	1.00
碘化钾	KI	0.10

^b维生素溶液

组分

式

浓度(g/kg)

生物素(D-)	C10H16N2O3S	0.05
			泛酸钙D(+)	C18H32CaN2O10	1.00
烟酸	C6H5NO2	1.00
			肌醇	C6H12O6	25.00
氯化硫胺盐酸盐	C12H18Cl2N4OS.xH2O	1.00
			吡哆醇盐酸盐	C8H12ClNO3	1.00
对氨基苯甲酸	C7H7NO2	0.20

随后，将200ml摇瓶内容物转移到S.cerevisiae菌株STV016的发酵罐中(起始体积5L)并且将12ml摇瓶S.cerevisiae菌株STV040和STV055的内容物转移到发酵罐中(起始体积0.3L)，发酵罐装有如表24中展示的培养基。

表24.发酵培养基组成

原材料		最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	4.4
硫酸铵	(NH4)2SO4	1
			磷酸二氢钾	KH2PO4	10
硫酸镁	MgSO4.7H2O	5
			微量元素溶液	-	8
维生素溶液	-	8

通过添加氨水(25重量％)将pH控制在5.0。温度控制在27℃下。通过调节搅拌器速度将pO2控制在40％。如表25所展示，保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制。

表25.发酵进料培养基的组成

原材料	式	最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	550
磷酸二氢钾	KH2PO4	15.1
			七水硫酸镁	MgSO4.7H2O	7.5
Verduyn微量元素溶液		12
			Verduyn维生素溶液		12

表26中示出了全培养液和上清液中的RebA和甜叶悬钩子苷。

表26.全培养液和上清液中的RebA和甜叶悬钩子苷

实施例15：由酵母生成RebA、RebD和甜叶悬钩子苷

如上所述构建的S.cerevisiae菌株STV016、STV040和STV055在30℃和280rpm下在摇瓶中(0.5l，含50ml培养基)培养1天。如表27所述，培养基根据Verduyn等人(VerduynC,PostmaE,ScheffersWA,VanDijkenJP.Yeast,1992年7月；8(7):501-517)，在碳源和氮源上有修改。

表27.预培养基组成

原材料	式	浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	22.0
尿素	(NH2)2CO	2.3
			磷酸二氢钾	KH2PO4	3.0
硫酸镁	MgSO4.7H2O	0.5
			微量元素溶液		1
维生素溶液		1

^a微量元素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			EDTA	C10H14N2Na2O8.2H2O	15.00
硫酸锌.7H2O	ZnSO4.7H2O	4.50
			氯化锰.2H2O	MnCl2.2H2O	0.84
氯化钴(II).6H2O	CoCl2.6H2O	0.30
			硫酸铜(II).5H2O	CuSO4.5H2O	0.30
钼酸钠.2H2O	Na2MoO4.2H2O	0.40

氯化钙.2H2O	CaCl2.2H2O	4.50
			硫酸铁.7H2O	FeSO4.7H2O	3.00
硼酸	H3BO3	1.00
			碘化钾	KI	0.10

^b维生素溶液

组分	式	浓度(g/kg)
			生物素(D-)	C10H16N2O3S	0.05
泛酸钙D(+)	C18H32CaN2O10	1.00
			烟酸	C6H5NO2	1.00
肌醇	C6H12O6	25.00
			氯化硫胺盐酸盐	C12H18Cl2N4OS.xH2O	1.00
吡哆醇盐酸盐	C8H12ClNO3	1.00
			对氨基苯甲酸	C7H7NO2	0.20

随后，将12ml摇瓶内容物转移到发酵罐中(起始体积0.3L)，发酵罐装有如表28中展示的培养基。

表28.发酵培养基组成

原材料		最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	4.4
硫酸铵	(NH4)2SO4	1
			磷酸二氢钾	KH2PO4	10
硫酸镁	MgSO4.7H2O	5
			微量元素溶液	-	8
维生素溶液	-	8

通过添加氨水(25重量％)将pH控制在5.0。温度控制在27℃下。通过调节搅拌器速度将pO₂控制在40％。如表29所展示，保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制。

表29.发酵进料培养基的组成

原材料	式	最终浓度(g/kg)
			一水葡萄糖	C6H12O6.1H2O	550

磷酸二氢钾	KH2PO4	15.1
			七水硫酸镁	MgSO4.7H2O	7.5
Verduyn微量元素溶液		12
			Verduyn维生素溶液		12

表30中示出了全培养液和上清液中的RebA和甜叶悬钩子苷。

表30.全培养液和上清液中的RebA、RebD和甜叶悬钩子苷

表1：序列表描述

灰色id被截短并且因此是提到的UniProtid的片段。

Claims (32)

1.一种生产二萜或糖基化二萜的方法，所述方法包括：

a.在合适的发酵培养基中发酵重组微生物，

其中所述微生物包含编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，以及其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊醇的能力，

其中在所述发酵培养基中在细胞外生产二萜或糖基化二萜；以及

b.从所述发酵培养基回收所述二萜或糖基化二萜。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组微生物包含一种或多种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶活性的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、甜叶悬钩子苷、杜克苷A中的至少一种的能力。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊单糖苷的能力。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊醇或甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊双糖苷的能力。

5.根据权利要求2-4中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少甜菊苷的能力。

6.根据权利要求2-5中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少莱苞迪苷A的能力。

7.根据权利要求2-6中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱苞迪苷A的葡糖基化的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少莱苞迪苷D的能力。

8.根据权利要求2-7中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的葡糖基化的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少莱苞迪苷E的能力。

9.根据权利要求2-8中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化莱苞迪苷E的葡糖基化的多肽，

其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产至少莱苞迪苷D的能力。

10.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述重组微生物能够表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽。

11.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述重组微生物能够表达以下中的一种或更多种：

a.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：141、142、151、152、153、154、159、160、182或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列，

b.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO:143、144、155、156、157、158、159、160、183或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列，

c.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO:145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列，或

d.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO:28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO:146、164、165、166、167或185的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

12.根据权利要求2-11中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物能够表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸包括：

i.编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO：147、168、169或189的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

13.根据权利要求2-12中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物能够表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸包括：

i.编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO：181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

14.根据权利要求2-13中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物能够表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

v.编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

vi.与SEQIDNO：148、170、171、172、173、174或190的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

vii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

viii.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

15.根据权利要求2-14中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQIDNO：50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO：149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

16.根据权利要求2-15中的任意一项所述的方法，其中所述重组微生物表达核苷酸序列，所述核苷酸序列编码能够催化以下的一种或多种的多肽：将甜菊苷或莱苞迪苷A葡糖基化为莱苞迪苷D、将甜菊苷葡糖基化为莱苞迪苷E，或者将莱苞迪苷E葡糖基化为莱苞迪苷D，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化以下的一种或多种的多肽的核苷酸序列：将甜菊苷或莱苞迪苷A葡糖基化为莱苞迪苷D、将甜菊苷葡糖基化为莱苞迪苷E，或者将莱苞迪苷E葡糖基化为莱苞迪苷D，所述多肽包含与SEQIDNO：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQIDNO：181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

17.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法，其中所述重组微生物产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力被上调。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述重组微生物包含编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的表达赋予所述微生物生产水平提高的GGPP的能力。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述重组微生物能够表达以下的一种或多种：

a.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID.NO：80的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：79的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列，

b.编码具有法尼基-焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有法尼基-焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID.NO：82的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：81的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列，或者

c.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与SEQID.NO：84的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与SEQID.NO：83的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

iii.其互补链与(i)或(ii)的序列的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子的序列的核苷酸序列。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物属于Saccharomyces、Aspergillus、Pichia、Kluyveromyces、Candida、Hansenula、Humicola、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen、Yarrowia、Yamadazyma或Escherichia属之一。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述微生物为Saccharomycescerevisiae细胞，任选地其中所述糖基化二萜为甜叶悬钩子苷；为Yarrowialipolitica细胞，任选地其中所述糖基化二萜为莱苞迪苷A；或者Escherichiacoli细胞。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种二萜或糖基化二萜的至少约30％在细胞外生产。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种二萜或糖基化二萜的至少约50％在细胞外生产。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种二萜或糖基化二萜的至少约70％在细胞外生产。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组微生物在约29℃或更低的温度下发酵。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法以工业规模进行。

27.发酵液，其包含通过根据权利要求1-26中任一项所述的方法能够获得的二萜或糖基化二萜。

28.根据权利要求27所述的发酵液，其包含莱苞迪苷A或莱苞迪苷D。

29.通过根据权利要求1-26中任一项所述的方法获得的或从根据权利要求27或28所述的发酵液能够获得的二萜或糖基化二萜。

30.根据权利要求29所述的二萜或糖基化二萜，其为莱苞迪苷A或莱苞迪苷D。

31.食品、饲料或饮料，其包含根据权利要求29或30所述的二萜或糖基化二萜。

32.权利要求1-19中任一项所定义的重组微生物在二萜或糖基化二萜的细胞外生产中的用途。