CN107109358B - 在重组宿主中生产甜菊醇糖苷 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中生产甜菊醇糖苷
技术领域
本公开内容涉及在重组宿主中重组生产甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。特别地，本公开内容涉及在重组宿主中生产包含甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A，或其异构体的甜菊醇糖苷。
相关技术描述
甜味剂作为最常用于食品、饮料或糖果业的成分是公知的。甜味剂既可以在生产过程中加入最终食品，也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂(tabletop sweeter)或者作为烘培中糖的家用替代品单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(例如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(例如阿斯巴甜、糖精和三氯半乳蔗糖(sucralose))。甜菊提取物(stevia extract)是可从多年生灌木甜菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜菊在南美洲和亚洲被普遍种植用于商业生产甜菊提取物。各种程度纯化的甜菊提取物在商业中用作食品中的高甜度甜味剂，以及在共混物中或单独地作为佐餐甜味剂。
图1中显示了几种甜菊醇糖苷的化学结构，包括二萜甜菊醇和多种甜菊醇糖苷。甜菊植物的提取物通常包含有助于甜味的甜菊醇糖苷，尽管每种甜菊醇糖苷的量通常在不同的生产批次之间不同。
由于从甜菊植物中回收和纯化甜菊醇糖苷已被证明是劳动密集型的和低效的，因此仍然需要可以高产率积累所需甜菊醇糖苷(如RebD和RebM)的重组生产系统。还需要在重组宿主中改进甜菊醇糖苷的生产以用于商业用途。
发明内容
在上述背景下，本发明提供了相对于现有技术的某些优点和进步。
尽管本文公开的发明不限于特定的优点或功能，但是本发明提供了这样的重组宿主，其包含以下的一种或更多种：
(a)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；
(b)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和/或
(c)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。
本发明还提供了这样的重组宿主，其包含：
(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；
(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；
(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；
(d)编码对映贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽的基因；
(e)编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的基因；和
(f)编码对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主能够产生甜菊醇。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，
(a)所述KO多肽包含这样的KO多肽：其与SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性；与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有65％的同一性；与SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列具有至少40％的同一性；或与SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；
(b)所述CPR多肽包含这样的CPR多肽：其与SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：74、SEQ IDNO：76或SEQ ID NO：87所示氨基酸序列具有至少70％的同一性；与SEQ ID NO：73所示的氨基酸序列具有至少80％的同一性；与SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列具有至少85％的同一性；与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列具有至少65％的同一性；或与SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；和/或
(c)所述KAH多肽包含这样的KAH多肽：其与SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列具有至少40％同一性；与SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性；或与SEQ IDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％的同一性。
本发明还提供了一种重组宿主，其包含以下的一种或更多种：
(a)编码与SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KO多肽的基因；
(b)编码与SEQ ID NO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或
(c)编码与SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。
本发明还提供了一种重组宿主，其包含以下的一种或更多种：
(a)编码与SEQ ID NO：70所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因；
(b)编码与SEQ ID NO：82所示氨基酸序列具有至少40％同一性的KAH多肽的基因；和/或
(c)编码与SEQ ID NO：98所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的CPR多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述宿主还包含编码与SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的KO多肽的基因。
在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述重组宿主还包含编码与SEQ IDNO：68所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的KAH多肽的基因。
在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述重组宿主还包含编码与SEQ IDNO：79所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的KO多肽的基因。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述宿主还包含以下的一种或更多种：
(a)编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)多肽的基因；
(b)编码对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)多肽的基因；和/或
(c)编码对映贝壳杉烯合酶(KS)多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主能够产生甜菊醇糖苷前体。
在本文所公开的重组宿主的一些方面中，
(a)所述GGPPS多肽包含与SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；
(b)所述CDPS多肽包含与SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列具有至少70％同一性的多肽；和/或
(c)所述KS多肽包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少40％同一性的多肽。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述重组宿主还包含编码内质网膜多肽的基因。
在本文所公开的重组宿主的另一个方面中，所述内质网膜多肽包含与SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的皮层ER蛋白2(ICE2)多肽的遗传物(Inheritance)。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述KO多肽是融合构建体。
在另一个方面中，所述融合构建体包含与SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列具有至少60％同一性的多肽。
在另一个方面中，所述融合构建体与SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：112所示的氨基酸序列具有至少50％的同一性。
在本文所公开的重组宿主的一个方面中，所述宿主还包含以下的一种或更多种：
(a)编码UGT85C多肽的基因；
(b)编码UGT76G多肽的基因；
(c)编码UGT74G1多肽的基因；
(d)编码UGT91D2功能同源物多肽的基因；和/或
(e)编码EUGT11多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述宿主能够产生甜菊醇糖苷。
在本文所公开的重组宿主的一些方面中，
(a)所述UGT85C2多肽包含与SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；
(b)所述UGT76G1多肽包含与SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽；
(c)所述UGT74G1多肽包含与SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列具有至少55％同一性的多肽；
(d)所述UGT91D2功能同源物多肽包含与SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列具有90％或更高同一性的UGT91D2多肽，或与SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列具有90％或更高同一性的UGT91D2e-b多肽；和/或
(e)所述EUGT11多肽包含与SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列具有至少65％同一性的多肽。
在一些方面中，本文所公开的重组宿主包括植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌细胞。
在一个方面中，所述细菌细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞)、乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞、乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞、棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞、醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞、不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。
在一个方面中，所述真菌细胞包括酵母细胞。
在一个方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种的细胞。
在一个方面中，所述酵母细胞是酵母菌(Saccharomycete)。
在一个方面中，所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。
本发明还提供了生产甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体的方法，其包括：
(a)在表达本文所公开的任何基因的条件下，在培养基中培养本文所公开的重组宿主；
其中所述甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷前体由所述宿主合成；和/或
(b)任选地定量所述甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷前体；和/或
(c)任选地分离所述甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷前体。
在一些方面，所述甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷B(RebB)、莱鲍迪苷C(RebC)、莱鲍迪苷D(RebD)、莱鲍迪苷E(RebE)、莱鲍迪苷F(RebF)、莱鲍迪苷M(RebM)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、莱鲍迪苷I(RebI)、杜尔可苷A、二糖基化的甜菊醇、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇，或其异构体。
在一些方面中，当在所述条件下培养时，由本文公开的重组宿主或方法所产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体积累至可检测的浓度。
在一些方面中，由本文公开的重组宿主或方法所产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体具有不可检测浓度的甜菊植物来源的污染物。
在一些方面中，由本文公开的重组宿主或方法所产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体具有相对于野生型甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含RebD或RebM的甜菊醇糖苷组合物。
从下文的详细描述结合所附权利要求将更充分地理解本发明的这些和其他一些特点和优点。应当注意，所述权利要求的范围由其中的记载限定，而不是由对在本描述中所阐述的特点和优点的具体讨论所限定。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可以最好地理解本发明实施方案的以下详细描述，其中类似的结构用相同的参考数字表示，其中：
图1显示了使用牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶(GGPPS)、对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、对映贝壳杉烯合酶(KS)、对映贝壳杉烯氧化酶(KO)和对映贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽在酵母中由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸酯生产甜菊醇的工程化生物合成途径的示意图。
图2显示了由合适的尿苷5′-二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)酶促催化的代表性甜菊醇糖苷糖基化反应和几种甜菊醇糖苷化合物的化学结构。
图3显示了在单独表达由SEQ ID NO：59所示核苷酸序列编码的甜菊(S.rebaudiana)KO1(SrKO1)、由SEQ ID NO：55所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KO或由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的莱鲍迪苷B(RebB)的生产。通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析各个培养物的μM/OD600来测量RebB的产生。参见实施例3。
图4显示了在单独表达由SEQ ID NO：59所示核苷酸序列编码的SrKO1、由SEQ IDNO：55所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KO或由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO之甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的对映贝壳杉烯酸的生产，其通过培养物样品的LC-MS分析测量。根据对应于对映贝壳杉烯酸的LC-MS峰的曲线下面积(AUC)计算出对映贝壳杉烯酸的水平。参见实施例3。
图5显示了与未过表达SrKAHe1且未表达由SEQ ID NO：55-60中任一个所示的核苷酸序列编码的KO的对照菌株相比，在过表达甜菊KAHe1(SrKAHe1；由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中，或在共表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)和由SEQ ID NO：55-60中任一个所示的核苷酸序列编码的KO的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的总(胞外加胞内)甜菊醇糖苷的产生。通过与标准曲线比较来量化总甜菊醇糖苷的产量。在y轴上绘制的值是三个生物学重复的平均值(以μM计)。参见实施例4。
图6显示了在过表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)，并且还表达由SEQ ID NO：56所示核苷酸序列编码的KO或由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的莱鲍迪苷A(RebA)、莱鲍迪苷D(RebD)和莱鲍迪苷M(RebM)产生。测量RebA+RebD+RebM的产生(以μM计)。参见实施例4。
图7显示了在过表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株或共表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)和由SEQ ID NO：55-60中任一个所示的核苷酸序列编码的KO的甜菊醇糖苷生产菌株中的糖基化对映贝壳杉烯酸的产生。根据对应于糖基化对映贝壳杉烯酸的LC-MS峰的AUC计算三个生物学重复的平均值。参见实施例4。
图8显示在过表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中，或在共表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)和由SEQ ID NO：55-60所示的核苷酸序列编码的KO的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的糖基化对映贝壳杉烯醇(glycosylated ent-kaurenol)的产生。根据对应于糖基化对映贝壳杉烯醇的LC-MS峰的AUC计算y轴上所绘制的值。参见实施例4。
图9显示了在表达CPR1(由SEQ ID NO：61所示的密码子优化的核苷酸序列编码)或CPR7(由SEQ ID NO：23所示的核苷酸序列编码)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的莱鲍迪苷M(RebM)的产生。测量绘制在y轴上的值(以μM计)。参见实施例5。
图10显示了在过表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的密码子优化的核苷酸序列编码)并且还表达由SEQ ID NO：62所示核苷酸序列编码的CPR4497的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的莱鲍迪苷M(RebM)的产生。绘制在y轴上的值表示RebM的μM浓度。参见实施例5。
图11A显示了甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)标准品的LC-MS色谱图。图11B显示了在表达由SEQ ID NO：80所示核苷酸序列编码的KAH(SEQ ID NO：82所示氨基酸序列)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的13-SMG产生。参见实施例7。
图12显示了在共表达KO和CPR的甜菊醇糖苷产生酿酒酵母菌株中的甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)和莱鲍迪苷B(RebB)的产生。KO选自SrKO1(由SEQ ID NO：59所示的密码子优化的核苷酸序列编码)、由SEQ ID NO：63所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KO或由SEQ ID NO：64所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KO。细胞色素P450还原酶(CPR)多肽选自由SEQ ID NO：66所示的密码子优化的核苷酸序列编码的CPR，或由SEQ ID NO：67所示的密码子优化的核苷酸序列编码的CPR。在y轴上显示的值是所指示的甜菊醇糖苷的μM浓度。参见实施例6。
图13显示了在表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)、由SEQ IDNO：80所示核苷酸序列编码的KAH，或由SEQ ID NO：81所示密码子优化的核苷酸序列编码的KAH的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中的甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)和甜茶苷的产生。在y轴上显示的值是13-SMG和甜茶苷的μM浓度，其对8个生物学重复进行平均，并且相对使用平板读数器测量的OD600进行归一化。误差条是±相应的标准偏差。参见实施例7。
图14显示了当与从仅表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)，或其与CPR1(由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)或CPR12(由SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列编码)组合表达的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白(microsomal protein)一起孵育时，细胞色素P450还原酶(CPR)多肽对细胞色素c的活性。结果显示为两个生物学重复的平均值(以U/mg计)。参见实施例9。
图15A显示了当对映贝壳杉烯酸与从仅表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)，或其与CPR1(由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)或CPR12(由SEQ IDNO：97所示的核苷酸序列编码)组合表达的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白一起孵育30分钟后的甜菊醇积累。结果以AUC显示为三个生物学重复的平均值。对照反应包含上述微粒体蛋白，但是其未在测量甜菊醇积累之前孵育30分钟。图15B显示了当对映贝壳杉烯酸与从仅表达SrKAHe1(由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码)，或其与CPR1(由SEQ ID NO：61所示的核苷酸序列编码)或CPR12(由SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列编码)组合表达的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白一起孵育30分钟后的对映贝壳杉烯酸的水平。结果以μM显示为三个生物学重复的平均值。对照反应包含上述微粒体蛋白，但在测量对映贝壳杉烯酸水平之前未孵育30分钟。参见实施例9。
图16显示了由表达SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)、SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO，或者表达SrKO1或由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的KO与CYP102A1的NADPH依赖性P450氧化还原酶结构域(本文称为“BMR结构域”)之融合构建体的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累的甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、1，2-二糖苷，莱鲍迪苷B(RebB)、对映贝壳杉烯酸和对映贝壳杉烯水平。图16A显示了通过LC-MS测量的表达SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)、SrKO1和BMR的融合构建体(SEQ ID NO：99、SEQ IDNO：100)、SrKO1和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102)、截短的SrKO1和BMR的融合构建体(SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104)、截短的SrKO1和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106)或对照质粒的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的13-SMG、1，2-二糖苷和RebB的水平。图16B显示了通过LC-UV测量的表达SrKO1(SEQ IDNO：59、SEQ ID NO：79)、SrKO1和BMR的融合构建体(SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100)、SrKO1和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102)、截短的SrKO1和BMR的融合构建体(SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104)、截短的SrKO1和BMR W1046A的融合构建体(SEQID NO：105、SEQ ID NO：106)或对照质粒的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的对映贝壳杉烯酸和对映贝壳杉烯的水平。图16C显示了通过LC-MS测量的表达由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO、由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR的融合构建体(SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108)、由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110)、截短的由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112)或质粒对照的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的13-SMG、1，2-二糖苷和RebB的水平。图16D显示了表达由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO、由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR的融合构建体(SEQID NO：107、SEQ ID NO：108)、由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110)、截短的由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和BMR W1046A的融合构建体(SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112)或质粒对照的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累的对映贝壳杉烯酸或对映贝壳杉烯的水平。参见实施例10。
发明详述
在详细描述本发明之前，将定义多个术语。如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，否则未指定具体数量的形式和“该/所述”包括复数指示物。例如，提及“核酸”是指一种或更多种核酸。
应注意，术语如“优选”、“一般”和“通常”在本文中并不是用于限制要求保护的发明的范围，或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至是重要的。相反，这些术语仅旨在突出可被用在或不被用在本发明的特定实施方案中的替选的或额外的特征。
为了描述和限定本发明的目的，应注意术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表述的固有的不确定程度。术语“基本上”在本文中也用于表示在不导致所讨论主题的基本功能改变的情况下，定量表达可不同于所述参照的程度。
可使用本领域技术人员公知的方法来构建根据本发明的遗传表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链式反应(PCR)技术。参见，例如描述于如下文献中的技术：Green & Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates andWiley Interscience，New York，和PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)。
本文中使用的术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸。
如本文所用，术语“微生物”、“微生物宿主”、“微生物宿主细胞”、“重组宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。如本文所用，术语“重组宿主”意指这样的宿主，其基因组已经增强(augment)至少一个DNA序列。这样的DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、通常不转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达的”)的DNA序列和期望引入宿主中的其他基因或DNA序列。应当理解，通常通过稳定引入一个或更多个重组基因来增强本文所述的重组宿主的基因组。一般而言，引入的DNA最初不是作为DNA接受者的宿主中所固有的，而是在本公开内容的范围内从给定宿主中分离DNA片段，并随后将该DNA的一个或更多个另外的拷贝引入同一宿主中，例如用来提高基因产物的产量或改变基因的表达模式。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物。
如本文所使用的，术语“重组基因”是指引入接受者宿主的基因或DNA序列，不管相同或相似的基因或DNA序列是否可能已经存在于这样的宿主中。在本上下文中，“引入”或“增加”在本领域中已知是指人工(by the hand of man)引入或增加。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是源自或存在于相同物种但已通过重组方法并入宿主以形成重组宿主的DNA序列。应当理解，引入宿主的重组基因可以与正常存在于被转化宿主中的DNA序列相同，并且被引入以提供所述DNA的一个或更多个另外的拷贝，从而允许该DNA基因产物的过表达或经修饰表达。在一些方面，所述重组基因由cDNA编码。在其他一些实施方案中，将重组基因针对在酿酒酵母中的表达进行合成和/或密码子优化。
如本文所用，术语“改造的生物合成途径”是指如本文所述在重组宿主中发生的生物合成途径。在一些方面中，生物合成途径的一个或更多个步骤并不天然存在于未经修饰的宿主中。在一些实施方案中，将异源形式的基因引入到包含内源形式之基因的宿主中。
如本文所用，术语“内源”基因是指源自特定生物体、组织或细胞并在其中产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，所述基因对于酿酒酵母(包括但不限于酿酒酵母菌株S288C)是内源的。在一些实施方案中，内源酵母基因被过表达。如本文所用，术语“过表达”用于指生物体中基因以高于野生型生物体中基因表达水平的水平表达。参见例如Prelich，2012，Genetics 190：841-54。在一些实施方案中，使内源酵母基因缺失。参见例如，Giaever & Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。如本文所用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可互换使用，指已被操作变得不再在生物体中表达的内源基因，所述生物体包括但不限于酿酒酵母。
如本文所用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来自除重组宿主之外的物种的序列。在一些实施方案中，重组宿主是酿酒酵母细胞，异源序列来自酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或不同于表达异源序列的重组宿主的真菌。在一些实施方案中，编码序列对宿主是天然的序列。
“可选择标志物”可以是补充宿主细胞营养缺陷型、提供抗生素抗性或导致颜色改变的任何数量的基因之一。然后使用本领域公知的方法(参见下文)将基因置换载体的线性化DNA片段引入细胞。可以基于选择标志物来确定线性片段整合到基因组中和基因的破坏，并且可以通过例如PCR或Southern印迹分析来验证。在将其用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞的基因组中除去可选择性标志物(参见例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics 36：153-173和U.S.2006/0014264)。或者，可以以包括待破坏的基因之一部分的方式构建基因置换载体，其中所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且不编码所述基因的编码序列，或编码所述基因的无活性片段。
如本文所用的术语“变体”和“突变体”用于描述与特定蛋白质的野生型序列相比在一个或更多个氨基酸处已经被修饰的蛋白质序列。
如本文所用的术语“无活性片段”是编码活性小于例如从基因的全长编码序列所产生之蛋白质的约10％(例如小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％，或0％)的蛋白质的基因片段。这样的基因部分以这样的方式插入载体中，使得没有已知的启动子序列有效地连接到基因序列，但是终止密码子和转录终止序列有效地连接至基因序列的所述部分。该载体随后可以在基因序列的所述部分中线性化并转化到细胞中。然后通过单一同源重组，将该线性化载体整合到基因的内源对应物中，使其失活。
如本文所用的术语“甜菊醇糖苷”指莱鲍迪苷A(RebA)(CAS#58543-16-1)、莱鲍迪苷B(RebB)(CAS#58543-17-2)、莱鲍迪苷C(RebC)(CAS#63550-99-2)、莱鲍迪苷D(RebD)(CAS#63279-13-0)、莱鲍迪苷E(RebE)(CAS#63279-14-1)、莱鲍迪苷F(RebF)(CAS#438045-89-7)、莱鲍迪苷M(RebM)(CAS#1220616-44-3)、甜茶苷(Rubusoside)(CAS#63849-39-4)、杜尔可苷(Dulcoside)A(CAS#64432-06-0)、莱鲍迪苷I(RebI)(MassBank记录号：FU000332)、莱鲍迪苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(Stevioside)(CAS#57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、1，2-二糖苷(MassBank记录号：FU000299)、1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-葡糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-葡糖苷(19-SMG)、三葡糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五葡糖基化甜菊醇糖苷、六葡糖基化甜菊醇糖苷、七葡糖基化甜菊醇糖苷，及其异构体。参见图2；还参见由Harriet Wallin，Food Agric.Org筹备的Steviol Glycosides Chemical and TechnicalAssessment 69th JECFA，2007。
如本文所使用的术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于表示甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间体化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于牻牛儿基牻牛儿基二磷酸/酯/盐(geranylgeranyl diphosphate、GGPP)、对映柯巴基二磷酸/酯/盐、对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图1。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身是甜菊醇糖苷化合物。例如，19-SMG、甜茶苷、甜菊苷和RebE是RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图2。可以在体内(即，在重组宿主中)、体外(即，酶促地)或通过全细胞生物转化来生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。如本文所使用的术语“生产”和“积累”可以互换使用以描述体内、体外或全细胞生物转化中甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的合成。
如本文所使用的术语“二糖基化的甜菊醇”可用于指包含两个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。二糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜茶苷、包含两个葡萄糖部分的甜菊醇分子、包含一个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所使用的术语“三糖基化的甜菊醇”可用于指包含三个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。三糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括RebB、RebG、甜菊苷、包含两个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所使用的术语“四糖基化的甜菊醇”可用于指包含四个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。四糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括RebA、RebE、RebQ、包含四个葡萄糖部分的甜菊醇分子、包含三个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所使用的术语“五糖基化的甜菊醇”可用于指包含五个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。五糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括RebD、包含五个葡萄糖部分的甜菊醇分子、包含四个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所使用的术语“六糖基化的甜菊醇”可用于指包含六个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。六糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括RebM、包含六个葡萄糖部分的甜菊醇分子、包含五个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所使用的术语“七糖基化的甜菊醇”可用于指包含七个糖部分的甜菊醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。七糖基化的甜菊醇分子的非限制性实例包括包含七个葡萄糖部分的甜菊醇分子，及其异构体。
如本文所用，术语“糖基化的对映贝壳杉烯酸”可用于指包含糖部分的对映贝壳杉烯酸分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。糖基化的对映贝壳杉烯酸分子的非限制性实例包括包含两个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的对映贝壳杉烯酸分子、包含三个葡萄糖部分的对映贝壳杉烯酸分子、包含一个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的对映贝壳杉烯酸分子、包含两个葡萄糖部分的对映贝壳杉烯酸分子，及其异构体。
如本文所用，术语“糖基化的对映贝壳杉烯醇”可用于指包含糖部分的对映贝壳杉烯醇分子，所述部分例如葡萄糖或GlcNAc。糖基化的对映贝壳杉烯醇分子的非限制性实例包括包含三个葡萄糖部分的对映贝壳杉烯醇分子、包含一个葡萄糖部分和一个GlcNAc部分的对映贝壳杉烯醇分子、包含两个葡萄糖部分的对映贝壳杉烯醇分子，及其异构体。
重组甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株描述于WO 2011/153378，WO 2013/022989，WO2014/122227和WO 2014/122328。在重组宿主中，通过全细胞生物转化并且体外生产甜菊醇糖苷的方法也描述于WO 2011/153378，WO 2013/022989，WO 2014/122227和WO 2014/122328中。
在一些实施方案中，通过在重组宿主中参与甜菊醇糖苷生物合成途径的一种或更多种酶的表达，在体内生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，表达一种或更多种以下基因的甜菊醇生产重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因、编码CPR多肽的基因和编码UGT多肽的基因。参见例如图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因和编码CPR多肽的基因的重组宿主可以在体内产生甜菊醇。参见例如图1。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。
在另一个实例中，表达编码GGPPS多肽的基因、编码CDPS多肽的基因、编码KS多肽的基因、编码KO多肽的基因、编码KAH多肽的基因、编码CPR多肽的基因和编码UGT多肽的一种或更多种基因的甜菊醇生产重组宿主可以在体内生产甜菊醇糖苷。参见例如图1和图2。技术人员将理解，这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入重组宿主中的重组基因。
KS多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：1-4和SEQ ID NO：6所示。KO多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：7-10、54、70-72、75和77-79所示。KAH多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：13-17、68、82和91所示。CPR多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：20-22、28、69、73、74、76、87和98所示。CDPS多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：33-39所示。CDPS-KS多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：40-42所示。GGPPS多肽的非限制性实例如SEQ ID NO：43-50所示。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码UGT85C2多肽的核酸(SEQ ID NO：32)、编码UGT76G1多肽的核酸(SEQ ID NO：83)、编码UGT74G1多肽的核酸(SEQ ID NO：29)、编码UGT91D2多肽的核酸和/或编码EUGT11多肽的核酸(SEQ ID NO：86)。在一些方面中，UGT91D2多肽可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：84)或UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：88)。技术人员将理解，这些基因的表达可能是产生特定甜菊醇糖苷所必需的，但是这些基因中的一个或更多个对于宿主可以是内源的，条件是这些基因中的至少一个(在一些实施方案中，全部)是引入所述重组宿主中的重组基因。在一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1或UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和EUGT11多肽的外源核酸。在另一个具体实施方案中，生产甜菊醇的重组微生物包含编码UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1、UGT91D2(尤其包括91D2e、91D2m、91D2e-b及其功能同源物)和EUGT11多肽的外源核酸。
在某些实施方案中，甜菊醇糖苷是RebA、RebB、RebD和/或RebM。RebA可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1和UGT91D2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebB可以在表达UGT85C2、UGT76G1和UGT91D2的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebD可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的生产甜菊醇的重组微生物中合成。RebM可以在表达UGT85C2、UGT76G1、UGT74G1以及UGT91D2和/或EUGT11的生产甜菊醇的重组微生物中合成(参见图2)。
在一些实施方案中，通过使甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶在体外接触而生产甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体。例如，使甜菊醇与UGT多肽接触可以导致体外生产甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，通过使上游甜菊醇糖苷前体与参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶体外接触生产甜菊醇糖苷前体。例如，使对映贝壳杉烯酸与KAH酶接触可以导致体外生产甜菊醇。
在一些实施方案中，通过全细胞生物转化生产甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。为了发生全细胞生物转化，使表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷保留在细胞中和/或分泌到培养基中。例如，表达编码UGT多肽之基因的宿主细胞可以摄取甜菊醇并在细胞中糖基化甜菊醇；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可以分泌到培养基中。在一些实施方案中，使细胞透化以摄取待修饰的底物或分泌经修饰的产物。
在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主产生甜菊醇、一种或更多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，一种或更多种宿主(其各自表达参与甜菊醇糖苷途径的一种或更多种酶)产生甜菊醇、一种或更多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。例如，包含GGPPS、CDPS、KO、KS、KAH和/或CPR的宿主和包含一种或更多种UGT的宿主产生一种或更多种甜菊醇糖苷。
在一些实施方案中，在体内、体外或通过全细胞生物转化生产的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物包含比特别是来自甜菊植物的甜菊提取物更少的污染物。污染物包括有助于异味的植物来源的化合物。潜在污染物包括颜料、脂质、蛋白质、酚类、糖类、脂肪醇和其他倍半萜、劳丹烷二萜(labdane diterpene)、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆固醇、β谷固醇、α-香树素(amyrin)和β-香树素、羽扇豆醇、β香树素乙酸酯、五环三萜类、centauredin、槲皮素(quercitin)、表-α-杜松醇(epi-alpha-cadinol)、丁香烯(carophyllene)和衍生物、β-蒎烯、β-谷固醇和赤霉素。
如本文所用，术语“可检测的量”、“可检测浓度”、“可测量的量”和“可测量的浓度”是指以AUC、μM/OD600、mg/L、μM或mM测量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员通常可获得的技术检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即总的、上清液和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)，例如但不限于：液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high-performanceliquid chromatography，HPLC)、紫外-可见光谱/分光光度法(ultraviolet-visiblespectroscopy/spectrophotometry，UV-Vis)、质谱法(mass spectrometry，MS)和核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)。
如本文所用，术语“不可检测的浓度”是指太低而无法通过例如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR的技术测量和/或分析的化合物水平。在一些实施方案中，“不可检测的浓度”的化合物不存在于甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中。
如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述多种成分的组合或彼此排除。例如，“x、y和/或z”可以单独指“x”，单独指“y”，单独指“z”，“x、y和z”，“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一组的一种或更多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的生产。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中生产一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的生产，其中通过以下步骤中的一个或更多个生产一种或更多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或更多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或更多种甜菊醇糖苷。
在一些实施方案中，编码KO多肽的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、或SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：63、SEQID NO：64或SEQ ID NO：65所示。在一些方面中，编码KO多肽的核酸与SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性，与SEQ IDNO：56或SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列具有至少80％的同一性，与SEQ ID NO：63所示的核苷酸序列具有至少95％的同一性，或与SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性。在一些实施方案中，KO酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：54、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78或SEQID NO：79所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码KO多肽的一种或更多种核酸的一个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，与在RebB生产酿酒酵母菌株中表达SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQID NO：79)相比，在RebB生产酿酒酵母菌株中，SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：56所示的KO基因的表达导致更高的RebB产量。参见实施例3。
在一些实施方案中，在能够产生RebB且具有功能性KO的酿酒酵母菌株中表达如SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57所示的KO基因导致生产对映贝壳杉烯酸。参见实施例3。
如本文所使用的术语“对映贝壳杉烯酸羟化酶”和“甜菊醇合酶”可互换使用并缩写为“KAH”。在一些实施方案中，编码KAH酶的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：18、SEQ IDNO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：96所示。在一些方面中，编码所述KAH多肽的核酸与SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性；或与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：96所示核苷酸序列具有至少70％的同一性。在一些实施方案中，KAH酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：91所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码KAH酶的一种或更多种核酸的一个或更多个拷贝。
在一些实施方案中，在酿酒酵母菌株中表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)的一个或更多个拷贝。例如，在一些实施方案中，在酿酒酵母菌株中表达SrKAHe1(SEQID NO：18、SEQ ID NO：68)的两个拷贝。
在一些实施方案中，编码KAH酶的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：80所示。SEQ IDNO：80的核酸编码具有SEQ ID NO：82所示氨基酸序列的KAH。用于在酿酒酵母中表达的密码子优化形式的SEQ ID NO：80如SEQ ID NO：81所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码KAH酶的一种或更多种核酸的一个或更多个拷贝。参见实施例7。
在一些实施方案中，在甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中共表达SrKAHe1(SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：68)和由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH或由SEQ ID NO：81所示的经密码子优化的核苷酸序列编码的KAH。在一些实施方案中，与对照甜菊醇糖苷生产菌株或过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产菌株相比，在甜菊醇糖苷生产菌株中共表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)和由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH或由SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KAH，导致更高的甜菊醇糖苷产量。参见实施例7和表6。在一些方面中，过表达SrKAHe1导致产生85.5μM13-SMG，表达SrKAHe1和由SEQ ID NO：80所示核苷酸编码的KAH导致产生153.8μM 13-SMG，并且表达SrKAHe1和由SEQ ID NO：81所示的核苷酸编码的KAH导致产生130.5μM 13-SMG。
在一些实施方案中，在另外过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达KO基因。在一些实施方案中，与对照甜菊醇糖苷生产菌株或过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产菌株相比，在过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：65的KO基因导致更高的甜菊醇糖苷表达。参见实施例4。
在一些实施方案中，在过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：60的KO基因导致与对照酿酒酵母菌株相比更高的糖基化对映贝壳杉烯酸水平。参见实施例4。
在一些实施方案中，相对于对照酿酒酵母菌株或过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株，在过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60的KO基因导致糖基化对映贝壳杉烯醇中间体化合物的代谢转化改善。参见实施例4。
在一些实施方案中，KAH是李属(Prunus)KAH，例如甜樱桃(Prunus avium)、梅(Prunus mume)，或桃(Prunus persica)KAH。在一些实施方案中，KAH是CYP72A219或CYP71A219样家族的KAH。在一些实施方案中，编码KAH酶的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：90或SEQ ID NO：96所示。SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：96的核酸编码具有SEQ ID NO：91所示氨基酸序列的来自甜樱桃的KAH。在一些实施方案中，KAH多肽是具有SEQ ID NO：92、SEQ IDNO：93、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95所示氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，KAH多肽是与SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的KAH多肽。在一些实施方案中，在重组宿主中表达编码与SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：95所示氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽的基因导致产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体，如13-SMG和/或甜茶苷。参见实施例8。
在一些实施方案中，编码CPR酶的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：97所示。在一些方面中，编码CPR多肽的核酸与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62所示的核苷酸序列具有至少75％的同一性，或与SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：51或SEQ ID NO：97所示的核苷酸序列具有至少70％的同一性。在一些实施方案中，CPR酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ IDNO：74或SEQ ID NO 76、SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：98所示。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码CPR酶的一种或更多种核酸的一个或更多个拷贝。
在非限制性实例中，SrKAHe1被由基因NCP1(YHR042W)编码的酿酒酵母CPR活化。当在重组细胞中共表达由基因ATR2(SEQ ID NO：51)编码的拟南芥(Arabidopsis thaliana)CPR或由基因CPR7(SEQ ID NO：23)或CPR8(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)编码的甜菊CPR时，观察到SrKAHe1编码的KAH的增强活化。拟南芥多肽ATR1和ATR2的氨基酸序列分别如SEQID NO：25和SEQ ID NO：26所示。甜菊多肽CPR7和CPR8分别如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示。
在一些实施方案中，与表达甜菊CPR8(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)和拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51)的对照甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株相比，在共表达甜菊CPR8(SEQID NO：24、SEQ ID NO：28)和拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达CPR1(SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：76)或CPR7导致更高的RebM水平。在一些实施方案中，与不表达SEQ ID NO：62所示的核酸且不过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株相比，在过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达SEQ ID NO：62所示的CPR导致更高的RebM水平。参见实施例5。
在一些实施方案中，与共表达SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64的KO基因和SEQ IDNO：66或SEQ ID NO：77的CPR基因相比，在RebB生产菌株中共表达SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQID NO：79)和SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：77的CPR基因导致更高的13-SMG和RebB产量。参见实施例6。
在一些实施方案中，CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)激活细胞色素c。在一些实施方案中，在SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)存在下的CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)激活细胞色素c。在一些实施方案中，CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ IDNO：97，SEQ ID NO：98)调节对映贝壳杉烯酸向甜菊醇的转化。在一些实施方案中，与SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)组合的CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)将对映贝壳杉烯酸转化为甜菊醇。在一些实施方案中，在将对映贝壳杉烯酸与由表达CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ IDNO：97，SEQ ID NO：98)与SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)之组合的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白孵育后，检测到甜菊醇的产生。在一些实施方案中，重组宿主中CPR1(SEQID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)的表达导致产生甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体。参见实施例9。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷生产菌株表达包含KO和CYP102A1的NADPH依赖性P450氧化还原酶结构域的融合构建体，本文称其为“BMR”。编码BMR多肽的密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：117所示；BMR氨基酸序列如SEQ ID NO：118所示。在一些实施方案中，BMR是突变体BMR，包括但不限于BMR W1046A突变体(SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120)。BMR突变体可以是NADH特异性的。在一些实施方案中，KO-BMR融合构建体包含接头(SEQ IDNO：121、SEQ ID NO：122)。在一些实施方案中，融合构建体的KO是SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQID NO：79)或由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO(对应于SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列)。在一些实施方案中，融合构建体的KO是截短的KO。示例性的KO-BMR融合构建体如SEQ ID NO：99-112所示。参见实施例10。
在一些实施方案中，与在甜菊醇糖苷生产菌株中表达SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQID NO：79)相比，在甜菊醇糖苷生产菌株中表达SrKO1-BMR融合构建体(SEQ ID NO：99-106)导致对映贝壳杉烯酸、13-SMG和RebB水平的提高。在一些实施方案中，与在甜菊醇糖苷生产菌株中表达如SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO相比，在甜菊醇糖苷生产菌株中表达融合构建体(SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：108)导致对映贝壳杉烯向对映贝壳杉烯酸的更多转化且对映贝壳杉烯酸向13-SMG的更多转化。在一些实施方案中，表达包含由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和W1046A突变体BMR(SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110)的融合构建体导致对映贝壳杉烯酸水平的提高。参见图16(B和D)和实施例10。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷生产菌株包含皮层ER蛋白2的遗传物(ICE2；SEQID NO：113，SEQ ID NO：114)。ICE2也称为YIL090W。在一些方面中，使ICE2过表达。ICE2可以在包含CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)和/或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)的菌株中表达。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷生产菌株包含两个拷贝的ICE2。在一些实施方案中，ICE2的表达增加了对映贝壳杉烯代谢(导致对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛和对映贝壳杉烯醇糖苷的积累减少)，导致与对照菌株相比，甜菊醇糖苷的积累增加。参见表10和实施例11。
在一些实施方案中，在通过发酵培养的甜菊醇糖苷生产菌株中表达由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO导致与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比对映贝壳杉烯化合物的积累降低。在一些方面中，与对照菌株相比，产生更高水平的对映贝壳杉烯酸和甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，在通过发酵培养的甜菊醇糖苷生产菌株中表达由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH、由SEQ ID NO：56所示核苷酸序列编码的KO，和由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO，导致与对照菌株相比，对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯醇糖苷、对映贝壳杉烯酸和对映贝壳杉烯酸糖苷的积累减少，而甜菊醇糖苷的产量增加。在一些实施方案中，通过发酵培养表达CPR12(SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：98)、由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH和由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO导致与对照菌株相比，对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯醇糖苷、对映贝壳杉烯酸和对映贝壳杉烯酸糖苷的积累减少，而甜菊醇糖苷的水平提高。参见表12和实施例12。
功能同源物
上述多肽的功能同源物也适用于在重组宿主中生产甜菊醇糖苷。功能同源物是与参照多肽具有序列相似性并且执行参照多肽的一种或更多种生化或生理功能的多肽。功能同源物和参照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于收敛或发散的演化事件。因此，功能同源物有时在文献中指定为同源物、或直系同源物或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体(例如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)本身可以是功能同源物。还可以通过对多肽编码序列的定点诱变，或通过组合来自不同天然存在多肽的编码序列的结构域(“域交换”)来产生功能同源物。用于修饰编码本文所述功能性多肽之基因的技术是已知的，并且尤其包括定向演化技术，定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于增加多肽的比活性、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或以期望的方式修饰多肽-多肽相互作用。这种经修饰的多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能同源多肽的核酸。
功能同源物可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定。例如，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可以鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及使用KO、KAH或CPR氨基酸序列作为参照序列的非冗余数据库的BLAST、交互BLAST或PSI-BLAST分析。在某些情况下，氨基酸序列是从核苷酸序列推导的。数据库中那些具有大于40％序列同一性的多肽是进一步评估其作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适用性的候选物。氨基酸序列相似性允许进行保守氨基酸替换，例如以一个疏水性残基替换另一个疏水性残基，或以一个极性残基替换另一个极性残基。如果需要，可以对这些候选物进行手动检查，以缩小待进一步评估的候选物数目。可以通过选择那些似乎具有存在于甜菊醇糖苷生物合成多肽中的结构域(例如保守功能结构域)的候选物来进行手动检查。在一些实施方案中，从转录组数据中基于表达水平而不是通过使用BLAST分析来鉴定核酸和多肽。
可以通过在甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内定位这样的区域来鉴定保守区，所述区域为重复序列、形成一些二级结构(例如螺旋和β片层)、建立带正电或带负电的结构域、或代表蛋白质基序或结构域。参见例如在万维网上描述多种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网站，sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/。包括在Pfam数据库中的信息在Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；和Bateman等，Nucl.Acids Res.，27：260-262(1999)中描述。保守区也可以通过对来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列进行比对来确定。密切相关的物种优选来自同一科。在一些实施方案中，对来自两种不同物种的序列比对足以鉴定此类同源物。
通常，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区。相关多肽的保守区表现出至少45％的氨基酸序列同一性(例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或至少90％的氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区表现出至少92％、94％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
例如，适用于在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括KO、KAH和CPR的功能同源物。
对例如KO、KAH或CPR的底物特异性进行修饰的方法是本领域技术人员已知的，其包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向演化方法和其中在酶的活性位点附近进行随机诱变/饱和技术的组合。例如参见Osmani等，2009，Phytochemistry 70：325-347。
候选序列通常具有参照序列长度的80％至200％的长度，例如82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190或200％的参照序列长度。功能同源物多肽通常具有参照序列长度的95％至105％的长度，例如90、93、95、97、99、100、105、110、115或120％的参照序列长度，或其间的任何范围。任何候选核酸或多肽相对于参照核酸或多肽的％同一性可以如下确定。使用计算机程序ClustalW(版本1.83，默认参数)将参照序列(例如，本文所述的核酸序列或氨基酸序列)与一个或更多个候选序列比对，所述程序允许对核酸或多肽序列的全长进行比对(全局比对)。Chenna等，2003，NucleicAcids Res.31(13)：3497-500。
ClustalW计算参照序列与一个或更多个候选序列之间的最佳匹配，并对其进行比对，以使得可以确定同一性、相似性和差异度。可以将一个或更多个残基的空位插入参照序列、候选序列或两者中，以使序列比对最大化。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字体大小：2；窗口大小：4；评分方法：％年龄；顶对角线数：4；空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；权重转换：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字体大小：1；窗口大小：5；评分方法：％年龄；顶对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly，Pro，Ser，Asn，Asp，Gln，Glu，Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开。ClustalW输出的是反映序列之间关系的序列比对。可以例如在万维网上的Baylor College of Medicine SearchLauncher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和在万维网上的欧洲生物信息学研究所网站(ebi.ac.uk/clustalw)上运行ClustalW。
为了确定候选核酸或氨基酸序列与参照序列的％同一性，使用ClustalW比对序列，将比对中的相同匹配数除以参照序列的长度，并将结果乘以100。应当注意的是，％同一性值可以四舍五入到最接近的十分位。例如，78.11、78.12、78.13和78.14被四舍五入到78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19被四舍五入到78.2。
将理解，功能性KO、KAH或CPR蛋白质可以包括不参与由酶进行的酶促活性的其他氨基酸。在一些实施方案中，KO、KAH或CPR蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”在本文中可互换使用，指通过连接编码不同蛋白质的两个或更多个基因而工程化改造的蛋白质。在一些实施方案中，编码KO、KAH或CPR多肽的核酸序列可以包含标签序列，其编码设计成用于辅助所编码的多肽的后续操作(例如，辅助纯化或检测)、分泌或定位的“标签”。标签序列可插入编码多肽的核酸序列中，以使得所编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。所编码标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人流感血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、多组氨酸标签(HIS标签)和FlagTM标签(Kodak，New Haven，CT)。标签的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、淀粉体肽、信号肽或分泌标签。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过域交换改变的蛋白质。如本文所使用的术语“域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域替换第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域在功能上是相同的或功能上相似的。在一些实施方案中，第二蛋白质结构域的结构和/或序列与第一蛋白质结构域的结构和/或序列不同。在一些实施方案中，通过域交换改变KO多肽。参见实施例10。
甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸
编码本文所述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列，该序列与适合表达所述多肽之一个或更多个调控区按照有义方向有效连接。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达多种基因产物，因此如果期望的话，可以在这些微生物的单一调控区的控制下表达多个多肽。当调控区和编码序列被定位成使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时，认为该编码序列和调控区有效连接。通常来说，对于单顺反子基因，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸之间。
在许多情况下，本文所述的多肽之编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的，即编码序列是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况下，编码序列是宿主先天具有的且被重新引入该生物体的序列。天然序列(native sequence)与天然存在的序列(naturally occurringsequence)的区别通常在于存在与外源核酸连接的非天然序列，例如例如位于重组核酸构建体中天然序列侧翼的非天然调节序列。此外，稳定转化的外源核酸通常整合到发现天然序列的位置之外的位置。“调控区”是指含有影响转录或翻译的起始和速率、以及转录或翻译产物的稳定性和/或移动性之核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于，启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5’和3’非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子、及其组合。调控区通常包含至少一个核心(基本)启动子。调控区还可以包含至少一个控制元件，例如增强子序列、上游元件或者上游激活区(upstream activation region，UAR)。通过将调控区与编码序列定位成使得调控区有效地调节序列的转录或翻译来使得调控区与编码序列有效连接。例如，为了有效连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点通常定位于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。但调控区也可能被定位在翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。
对要包含的调控区的选择取决于几个因素，包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、期望的表达水平，以及在某些培养阶段期间优先表达。对于本领域技术人员而言，通过相对编码序列适当选择和定位调控区来调整编码序列的表达是常规问题。应理解可能存在多于一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
可以将一个或更多个基因以“模块(modules)”组合在重组核酸构建体中，可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的一个独立方面。以模块组合多个基因，特别是多顺反子模块，便于在多种物种中使用所述模块。例如，可以以多顺反子模块组合甜菊醇生物合成基因簇或者UGT基因簇，从而使得在插入合适的调控区后，可以将模块引入众多的物种中。作为另一个实例，可以将UGT基因簇组合，以使得每个UGT编码序列有效连接独立的调控区从而形成UGT模块。这样的模块可以用在那些必须或者期望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊醇糖苷生产有用的基因以外，重组构建体通常还含有复制起点和使构建体保持在合适的物种中的一个或更多个可选择标志物。
应理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定多肽，即对于许多氨基酸，有多于一个核苷酸三联体充当该氨基酸的密码子。因此，使用针对宿主(例如，微生物)的合适密码子偏向性表格，可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰，从而获得在所述特定宿主中的最佳表达。作为经分离的核酸，这些经修饰的序列可以作为经纯化分子存在，也可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。
在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或更多种功能，以将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。例如，可能期望下调酵母菌株中固醇的合成，以例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷的产量。作为另一个实例，可能需更抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物中除去葡萄糖部分的糖基水解酶或如本文所讨论的磷酸酶)的降解功能。在这种情况下，可以在转化入菌株的重组构建体中包括过表达所述多肽或基因产物的核酸。或者，可使用诱变来生成期望增加或增强其功能的基因的突变体。
宿主微生物
重组宿主可用于表达生产甜菊醇糖苷的多肽，其包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和藻类细胞。许多原核生物和真核生物也适合用于构建本文所述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、酵母和真菌。首先分析选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对于菌株是内源的，哪些基因不存在。对于其内源对应物不存在于菌株中的基因，其有利地装配在一个或更多个重组构建体中，然后将其转化入菌株以提供丧失的功能。
通常，使重组微生物在发酵罐中在限定的温度下生长期望的一段时间。本发明提供的经构建和经遗传改造的微生物可以使用常规发酵方法培养，尤其包括恒化器、分批、补料分批培养、半连续发酵如吸取和填充、连续灌注发酵和连续灌注细胞培养。根据该方法中使用的特定微生物，也可以存在和表达其他重组基因，例如异戊烯基生物合成基因和萜合酶和环化酶基因。可以通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来确定底物和中间体(例如，异戊烯基二磷酸、二磷酸二甲基烯丙酯、GGPP、对映贝壳杉烯和对映贝壳杉烯酸)的水平。
本方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进生长和/或甜菊醇糖苷生产的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。例如在使用酵母作为宿主的实施方案中，碳源如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖是合适的。碳源可以在整个培养期间提供给宿主生物体，或者替选地，生物体可以在另一种能量源(例如蛋白质)的存在下生长一段时间，然后仅在补料分批阶段期间提供碳源。
在重组微生物在培养物中已经生长期望的时间后，然后可以使用本领域已知的多种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一种或更多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，可以加入透化剂以帮助原料进入宿主和产物离开。例如，可以将培养的微生物的粗裂解物离心以获得上清液。然后可将所得上清液施加到色谱柱例如C-18柱上，并用水洗涤以除去亲水性化合物，随后用溶剂如甲醇洗脱目标化合物。然后可以通过制备型HPLC进一步纯化化合物。也参见，WO 2009/140394。
应当理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两个或更多个重组宿主中，而不是单个宿主中。当使用多种重组宿主时，它们可以在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
或者，两种或更多种宿主各自可在单独的培养基中生长，并且可以将第一培养基的产物例如甜菊醇引入第二培养基中以转化为随后的中间体或最终产物例如RebA。然后回收由第二或最终宿主生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组宿主。
示例性的原核和真核物种在下文更详细地描述。然而，应当理解，其他物种也是合适的。例如，合适的物种可以是这样的属，例如伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢菌(Fusarium)/赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。来自这些属的示例性物种包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、粘红酵母(Rhodoturula glutinis)、胶红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)/腾仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌和解脂耶氏酵母。
在一些实施方案中，微生物可以是原核生物如埃希氏菌属(Escherichia)细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；乳杆菌属(Lactobacillus)细菌细胞；乳球菌属(Lactococcus)细菌细胞；棒状杆菌属(Cornebacterium)细菌细胞；醋杆菌属(Acetobacter)细菌细胞；不动杆菌属(Acinetobacter)细菌细胞或假单胞菌属(Pseudomonas)细菌细胞。
在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)，例如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉或酿酒酵母。
在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞、例如三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)、杜氏盐藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、almeriensis栅藻(Scenedesmus almeriensis)物种。
在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌细胞，例如三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、雨生红球藻、小球藻、裙带菜、马尾藻、海带、almeriensis栅藻。
酵母属
酵母是合成生物学中广泛使用的经典生物体，并且可以用作重组微生物平台。例如，存在可用于酿酒酵母的突变体、质粒、代谢的详细计算机模型和其他信息的文库，允许各种模块的合理设计以提高产物产量。用于制备重组微生物的方法是已知的。
曲霉属
曲霉属物种(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)和酱油曲霉(A.sojae))是食品生产中广泛使用的微生物，并且还可用作重组微生物平台。构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组核苷酸序列是均是可获得的，从而允许合理设计和修饰内源途径以提高通量和提高产物产率。已经开发了用于曲霉属的代谢模型，以及转录组学研究和蛋白组学研究。黑曲霉被培养用于工业化生产多种食品成分，例如柠檬酸和葡糖酸，并且因此例如黑曲霉的物种通常适用于生产甜菊醇糖苷。
大肠杆菌
大肠杆菌，合成生物学中另一种广泛使用的平台生物体，也可以用作重组微生物平台。与酵母相似，大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型以及其他信息，从而允许合理设计多种模块以提高产物的产率。可使用与上文针对酵母属所述的那些类似的方法来制备重组大肠杆菌微生物。
伞菌属、赤霉属和平革菌属
伞菌属、赤霉属和平革菌属是可用的，因为已知它们在培养物中生产大量类异戊二烯。因此用于大量生产甜菊醇糖苷的萜前体已由内源基因产生。因此，可将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入来自这些属的物种中，而无需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。
Arxula adeninivorans(Blastobotrys adeninivorans)
Arxula adeninivorans是具有独特生化特征的二态酵母(其在高至42℃的温度下生长为类似于面包酵母的出芽酵母，高于该阈值时，其以丝状形式生长)。其可在多种底物上生长，并且可同化硝酸盐。其已成功地应用于产生可以生产天然塑料的菌株或者应用于开发用于环境样品中之雌激素的生物传感器。
解脂耶氏酵母
解脂耶氏酵母是二态酵母(参见Arxula adeninivorans)并且属于半子囊菌科(family Hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组是已知的。耶氏酵母属物种是需氧的并且被认为是非致病性的。耶氏酵母在使用疏水性底物(例如烷烃、脂肪酸、油)方面是高效的，并且可以在糖上生长。它具有很高的工业应用潜力，是一种产油微生物。解脂耶氏酵母可以将脂质含量积累到其干细胞重量的约40％，并且是用于脂质积累和再活化的模式生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie 91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。
红酵母属(Rhodotorula sp.)
红酵母是单细胞的、含色素的酵母。产油的红酵母，粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)已经显示从粗甘油生产脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，ProcessBiochemistry 46(1)：210-8)。圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)菌株已经显示为用于改善生物质和脂质生产力的高效补料分批发酵系统(Li等，2007，Enzyme andMicrobial Technology 41：312-7)
圆红冬孢酵母
圆红冬孢酵母是产油酵母，并且可用于工程化脂质生产途径(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。
博伊丁假丝酵母
博伊丁假丝酵母是甲基营养型酵母(其可在甲醇上生长)。与其他的甲基营养型物种(例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母)类似，博伊丁假丝酵母为生产异源蛋白质提供优异的平台。已报道了分泌型外来蛋白的多克级范围的产率。最近，计算方法IPRO预测了在实验上将博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转化至NADH的突变。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。
多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母，Pichia angusta)
多形汉逊酵母是甲基营养型酵母(参见，博伊丁假丝酵母)。其还可在多种其他底物上生长；其耐热并且可以同化硝酸盐(另参见乳酸克鲁维酵母)。多形汉逊酵母已被应用于生产乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，还用于一系列技术酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。
乳酸克鲁维酵母
乳酸克鲁维酵母是常规地应用于生产克非尔(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要的是可在存在于乳和乳清中的乳糖上生长。乳酸克鲁维酵母已被成功地应用于生产凝乳酶(通常存在于牛的胃中的一种酶)等以生产奶酪。生产以40,000L的规模在发酵罐中进行。参见例如van Ooyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。巴斯德毕赤酵母为外来蛋白质的生产提供有效的平台。平台元件可作为试剂盒获得并且在世界范围内在学术界中被用于生产蛋白质。已将菌株改造成可生产复杂的人N-多糖(酵母多糖与在人中发现的那些类似但不相同)。参见例如Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。
小立碗藓属(Physcomitrella spp.)
小立碗藓苔藓(Physcomitrella mosse)在悬浮培养物中生长时具有与酵母或其他真菌培养物相似的特征。该属可用于生产可能难以在其他类型的细胞中生产的植物次级代谢物。
甜菊醇糖苷组合物
甜菊醇糖苷在不同的食品系统中不一定具有等同的性能。因此，期望其具有将合成引导至所选择的甜菊醇糖苷组合物的能力。本文描述的重组宿主可以生产选择性富集特定甜菊醇糖苷(例如RebD或RebM)并具有一致的味道特性的组合物。如本文所使用的术语“富集”用于描述与来自甜菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比，具有增加的特定甜菊醇糖苷比例的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文所述的重组宿主可以促进这样的组合物的生产，所述组合物被调整以满足给定食品所需的甜味特性，并且每批次之间具有一致比例的各甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，本文所述的宿主不产生或仅产生减少量的在甜菊提取物中发现的不期望的植物副产物。因此，由本文所述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物与源自甜菊植物的组合物是可区分的。
积累的单一甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以为约1至约7,000mg/L，例如，约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L、或约200至约1,000mg/L、至少约1,000mg/L、至少约1,200mg/L、至少约至少1,400mg/L、至少约1,600mg/L、至少约1,800mg/L、至少约2,800mg/L、或至少约7,000mg/L。在一些方面中，单一甜菊醇糖苷的量可以超过7,000mg/L。所积累的甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以为约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少约2,000mg/L、至少约3,000mg/L、至少约4,000mg/L、至少约5,000mg/L、至少约6,000mg/L，或至少约7,000mg/L。在一些方面中，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。一般来说，更长的培养时间将导致更大量的产物。因此，重组微生物可以培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
应当理解，本文所讨论的多种基因和模块可以存在于两种或更多种重组微生物中，而不是单一微生物中。当使用多种重组微生物时，它们可以在混合培养物中生长以生产甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。例如，第一微生物可以包含用于生产甜菊醇糖苷前体的一种或更多种生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。
或者，两种或更多种微生物可各自在单独的培养基中生长，并且第一培养基的产物例如甜菊醇可以被引入第二培养基中以转化为随后的中间体，或转化为最终产品例如RebA。然后回收由第二或最终微生物生产的产物。还将理解，在一些实施方案中，使用除培养基之外的营养源并利用除发酵罐之外的系统来培养重组微生物。
通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可用于制备食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328。
例如，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷例如RebM或RebD可以包含在食品中，例如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖和调味汁(sauce)。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在非食品产品例如药品、医药产品、膳食补充剂和营养补充剂中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷也可以包含在用于农业工业和伴侣动物工业的动物饲料产品中。或者，可以通过分别培养重组微生物来制备甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物，每种重组微生物生产特定的甜菊醇或甜菊醇糖苷，从每种微生物中回收基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后合并这些化合物以获得包含所需比例的每种化合物的混合物。与目前的甜菊产品相比，本文所述的重组微生物允许获得更精确和一致的混合物。
在另一替代方案中，可将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷与其他甜味剂一起并入食品中，所述其他甜味剂例如糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫纳甜(monatin)或乙酰磺胺酸钾。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要改变以在最终食品中达到令人满意的味道。参见例如，U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以与风味剂(例如柑橘)一起提供，以作为风味调节剂。
由本文所述的重组微生物所生产的组合物可以并入食品中。例如，取决于甜菊醇糖苷和食品的类型，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以基于干重以约20mg甜菊醇糖苷/kg食品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食品的量并入食品中。例如，由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜点、冷的糖食(例如冰淇淋)、乳制品(例如酸奶)或饮料(例如碳酸饮料)中，以使得食品基于干重具有最多500mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如饼干)中，以使得食品基于干重具有最多300mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入到调味汁(例如巧克力糖浆)或蔬菜产品(例如腌菜)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物生产的甜菊醇糖苷组合物可以掺入面包中以使得食品基于干重具有最多160mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖或软糖中，以使得食品基于干重具有最多1600mg甜菊醇糖苷/kg食品。由重组微生物、植物或植物细胞生产的甜菊醇糖苷组合物可以并入加工的水果产品(例如果汁、水果馅、果酱和果冻)中，以使得食品基于干重具有最多1000mg甜菊醇糖苷/kg食品。在一些实施方案中，本文生产的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见例如由HarrietWallin，Food Agric.Org.筹备的Steviol Glycosides Chemical and TechnicalAssessment 69th JECFA，2007；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sourcesadded to Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety of steviol glycosidesfor the proposed uses as a food additive，”2010，EFSA Journal 8(4)：1537；美国食品和药物管理局GRAS通知323；美国食品和药物管理局GRAS通知329；WO 2011/037959；WO2010/146463；WO 2011/046423；和WO 2011/056834。
例如，这样的甜菊醇糖苷组合物可具有90-99％的RebA和不可检测量的甜菊植物衍生的污染物，并基于干重以25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食品中。
这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebB的组合物，其具有大于3重量％的RebB并被并入食品中，以使得产物中RebB的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebB的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。
这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebD的组合物，其具有大于3重量％的RebD并被并入食品中，以使得产物中RebD的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebD的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。
这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebE的组合物，其具有大于3重量％的RebE并被并入食品中，以使得产物中RebE的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebE的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。
这样的甜菊醇糖苷组合物可以是富含RebM的组合物，其具有大于3重量％的RebM并被并入食品中，以使得产物中RebM的量基于干重为25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。通常，富含RebM的组合物具有不可检测量的源自甜菊植物的污染物。
在一些实施方案中，将基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入到佐餐甜味剂或“杯对杯(“cup-for-cup”)”产品中。这样的产品通常用本领域技术人员已知的一种或更多种填充剂例如麦芽糖糊精稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可包装在小袋中，例如，以基于干重的10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品用于佐餐使用。在一些实施方案中，在体外、体内或通过全细胞生物转化产生甜菊醇糖苷。
将在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
以下实施例说明本发明的具体实施方案及其多种用途。它们仅出于说明的目的而列出，并且不被认为是限制本发明。
实施例1.LC-MS分析过程
本文使用三个LC-MS过程。在实施例2-6中使用的第一种方法中，使用配有WatersAcquity
Figure BPA0000240137070000382
BEH shield RP18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，
Figure BPA0000240137070000383
孔径)的UltiMate3000 UPLC系统(Dionex)进行LC-MS分析，所述柱连接到具有加热电喷雾离子(HESI)源的TSQ Quantum Access(ThermoFisher Scientific)三重四极杆质谱仪。使用洗脱液B(含0.1％甲酸的MeCN)和洗脱液A(含0.1％甲酸的水)的流动相，通过增加梯度来进行洗脱，所述梯度为：0.0至4.0分钟从25％增加至47％B；4.0至5.0分钟从47％增加至100％B；5.0至6.5分钟保持100％B。流量为0.4mL/分钟，柱温度为35℃。采用SIM(单离子监测，Single IonMonitoring)用下述m/z迹线来检测甜菊醇糖苷。
表1A.甜菊醇糖苷的LC-MS分析信息。
Figure BPA0000240137070000381
Figure BPA0000240137070000391
在用于实施例7、8和10的第二种方法中，在Waters ACQUITY UPLC(WatersCorporation，Milford，MA)上进行LC-MS分析，其与Waters ACQUITY ESI(电喷雾离子化，electrospray ionization)-TQD三重四极杆质谱仪联用。在配备有ACQUITY UPLC BEH C18VanGuard预装柱(
Figure BPA0000240137070000392
1.7μm，2.1mm×5mm)的Waters ACQUITY
Figure BPA0000240137070000393
BEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，
Figure BPA0000240137070000394
孔径)上，通过使用两个流动相的梯度：A(含0.1％甲酸的水)和B(含0.1％甲酸的乙腈)，在0.3-2.0分钟内将B从20％增加到50％，在2.01分钟达到100％，保持在100％持续0.6分钟，并重新平衡0.6分钟，以实现化合物分离。流量为0.6mL/分钟，柱温为55℃。MS采集处于使用SIM模式(单离子监测)的阴离子模式。通过与确定标准进行比较，来进行甜菊醇糖苷定量。
表1B：甜菊醇糖苷的MS分析信息。
Figure BPA0000240137070000395
在用于实施例9的第三种方法中，使用配有ESI并以负模式操作，并与Waters单四极杆质谱仪(SQD)联用的Waters Acquity
Figure BPA0000240137070000396
BEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm颗粒，
Figure BPA0000240137070000397
)，在Waters ACQUITY UPLC(Waters Corporation，Milford，MA)上进行LC-MS分析。通过两个流动相的梯度来实现化合物分离：A(具有0.1％甲酸的水)和B(具有0.1％甲酸的乙腈)，并通过在0.3至2.5分钟内从60％增加到100％B，保持100％B 0.1分钟，并重新平衡0.2分钟。流量为0.6mL/分钟，柱温设为55℃。使用SIM(单离子监测)监测甜菊醇或对映贝壳杉烯酸，并通过与确定标准进行比较来进行定量。
表1C：甜菊醇和对映贝壳杉烯酸的MS分析信息。
Figure BPA0000240137070000401
实施例2.构建甜菊醇糖苷生产酵母菌株和RebB生产酵母菌株
如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中所述构建甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株。例如，包含以下基因的酵母菌株积累甜菊醇糖苷：编码聚球藻属(Synechococcus sp.)GGPPS(SEQ ID NO：49)多肽的重组基因；编码截短的玉蜀黍(Zea mays)的CDPS(SEQ ID NO：37)多肽的重组基因；编码拟南芥(A.thaliana)KS(SEQ IDNO：6)多肽的重组基因；编码甜菊(S.rebaudiana)KO(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)多肽的重组基因；编码拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：87)多肽的重组基因；编码稻(O.sativa)EUGT11(SEQ ID NO：86)多肽的重组基因；编码SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ IDNO：68)多肽的重组基因；编码甜菊CPR8(SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：28)多肽的重组基因；编码甜菊UGT85C2(SEQ ID NO：30)多肽的重组基因；编码甜菊UGT74G1(SEQ ID NO：29)多肽的重组基因；编码甜菊UGT76G1(SEQ ID NO：2)多肽的重组基因；和编码甜菊UGT91D2变体UGT91D2e-b(SEQ ID NO：88)多肽的重组基因。
UGT91D2的UGT91D2e-b变体(来自PCT/US2012/050021的SEQ ID NO：5)包括在211位将甲硫氨酸替换为亮氨酸并在286位将丙氨酸替换为缬氨酸。另外的变体可以包括在PCT/US2012/050021的表14和实施例11中描述的变体(T144S、M152L、L213F、S364P和G384C变体除外)。GeneArt密码子优化的编码甜菊UGT91D2e-b并具有氨基酸修饰L211M和V286A的序列(氨基酸序列为SEQ ID NO：88；密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：89所示)，其从天然酵母TDH3启动子表达，其后是天然酵母CYC1终止子。
在收获之前，将细胞在30℃下在合成完全(Synthetic Complete，SC)培养基中在振荡下(对于深孔为400rpm，对于15mL Falcon生长管为200rpm)培养5天。将培养物样品(未去除细胞)在DMSO存在下加热，用LC-MS检测总糖苷水平。菌株积累的RebD总量超过2500mg/L，RebM总量超过2500mg/L，RebA总量超过700mg/L。参见WO 2014/122227。
构建了单独的酿酒酵母菌株来积累RebB。该菌株包含以下基因来积累甜菊醇糖苷：编码聚球藻属GGPPS(SEQ ID NO：49)多肽的重组基因；编码截短的玉蜀黍CDPS(SEQ IDNO：37)多肽的重组基因；编码拟南芥KS(SEQ ID NO：6)多肽的重组基因；编码甜菊KO(SEQID NO：59，SEQ ID NO：79)多肽的重组基因；编码拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：87)多肽的重组基因；编码稻EUGT11(SEQ ID NO：86)多肽的重组基因；编码SrKAHe1(SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：68)多肽的重组基因；编码甜菊CPR8(SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：28)多肽的重组基因；编码甜菊UGT85C2(SEQ ID NO：30)多肽的重组基因；编码甜菊UGT76G1(SEQ IDNO：2)多肽的重组基因；和编码甜菊UGT91D2变体UGT91D2e-b(SEQ ID NO：88)多肽的重组基因。
实施例3.表达KO基因的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
为了确定对映贝壳杉烯酸水平的增加是否提高甜菊醇糖苷生产，分析了来自多种物种的KO基因的活性。使用NCBI基本局部比对序列搜索工具(Basic Local AlignmentSequence Search Tool，BLAST)鉴定推定的KO基因。编码KO多肽的基因被克隆并表达在实施例2中所描述的RebB生产酿酒酵母菌株中，其被修饰成缺少KO基因。因此，RebB仅在表达功能性KO时积累。
通过SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示)和SEQID NO：75所示的氨基酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示)鉴定的两个KO多肽被发现在RebB生产菌株中比SrKO1(核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：79所示)积累更高水平的RebB。RebB水平(μM/OD600)如图3所示。
在酿酒酵母甜菊醇糖苷生产菌株中编码KO多肽的基因(SEQ ID NO：55或SEQ IDNO：56)的表达也导致对映贝壳杉烯酸的积累(图4)。编码密码子优化的KO多肽(SEQ ID NO：57)的基因和编码SEQ ID NO：70所示的KO多肽的基因的表达也导致对映贝壳杉烯酸的积累。然而，SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)的表达没有导致产生可测量水平的对映贝壳杉烯酸。因此，与由SEQ ID NO：59所示的核苷酸序列编码的SrKO1多肽相比，由SEQ IDNO：55-57所示的核苷酸序列编码的KO多肽更有效地将酿酒酵母中的对映贝壳杉烯，对映贝壳杉烯醇和/或对映贝壳杉烯醛转化成对映贝壳杉烯酸。
实施例4.表达KO基因并且另外过表达SrKAHe1的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
将克隆的KO基因在甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中单独表达。将表达SrKO1(SEQID NO：59，SEQ ID NO：79)的实施例2中描述的酿酒酵母菌株修饰为包含过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)。所测试的KO基因的编码序列及其相应的氨基酸序列如表2所示。SEQ ID NO：55、57、58、59和60所示的序列经密码子优化以用于在酿酒酵母中表达。
表2：在另外过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中所表达的KO基因。
KO核苷酸序列 对应的KO氨基酸序列
SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：54
SEQ ID NO：56 SEQ ID NO：75
SEQ ID NO：57 SEQ ID NO：70
SEQ ID NO：58 SEQ ID NO：71
SEQ ID NO：59 SEQ ID NO：79
SEQ ID NO：60 SEQ ID NO：72
共表达编码表2的KO酶的任何异源核酸，并且还过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)的酿酒酵母菌株比对照酿酒酵母菌株(不表达表2的KO)或仅过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累更高水平的甜菊醇糖苷，如图5所示。表达SEQ ID NO：56的密码子优化形式(本文鉴定为SEQ ID NO：65)并且过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株比共表达SEQ ID NO：56所示的核酸和SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累更高水平的甜菊醇糖苷(RebA、RebD和RebM)(图6)。
另外，共表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：60所示的核酸，并且还过表达SrKAHe1的酿酒酵母菌株比不表达表2的KO的对照酿酒酵母菌株积累更高水平的糖基化对映贝壳杉烯酸(图7)。
并且，如图8所示，证明了共表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQID NO：59或SEQ ID NO：60所示的核酸，并且还过表达SrKAHe1的酿酒酵母菌株改善了中间体化合物对映贝壳杉烯醇的代谢转化，这继而导致相对于不表达表2的KO的对照酿酒酵母菌株或仅过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株的糖基化对映贝壳杉烯醇的积累减少。对照酿酒酵母菌株和仅过表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株各自积累的糖基化对映贝壳杉烯醇的水平高于表达SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQID NO：59或SEQ ID NO：60所示的核酸并且还过表达SrKAHe1的酿酒酵母菌株。
实施例5.表达CPR基因的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
将克隆的CPR基因在甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中单独表达。将实施例2中描述的表达甜菊CPR8(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)和拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株修饰成共表达编码表3的CPR的核酸。所测试的CPR基因的编码序列及其相应的氨基酸序列如表3所示。
表3：与CPR8和ATR2组合测试的CPR基因。
Figure BPA0000240137070000431
如图9所示，在已经表达甜菊CPR8(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)和拟南芥ATR2(SEQ ID NO：51)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达CPR1(SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：76)或CPR7(SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：69)导致比不表达CPR1和CPR7的对照甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株积累更高水平的RebM。同样，表达SEQ ID NO：62所示的核酸并过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株所累积的RebM水平高于由仅过表达SrKAHe1的对照甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株所积累的RebM水平(图10)。
实施例6.共表达KO和CPR基因的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
在实施例2中所描述的RebB生产酿酒酵母菌株中测试了甜菊醇糖苷产生，其被修饰成共表达表4的KO基因和表5的CPR。
表4：与CPR基因组合测试的KO基因。
基因 核苷酸序列 氨基酸序列
SrKO1 SEQ ID NO：59 SEQ ID NO：79
密码子优化的KO SEQ ID NO：63 SEQ ID NO：77
密码子优化的KO SEQ ID NO：64 SEQ ID NO：78
表5：与KO基因组合测试的CPR基因。
核苷酸序列 氨基酸序列
SEQ ID NO：66 SEQ ID NO：73
SEQ ID NO：67 SEQ D NO：22
如图12所示，在RebB生产菌株中共表达SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)和表5中的任一种CPR基因导致产生比共表达SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64所示的核酸和表5中的任一种细胞色素P450基因更高的13-SMG和RebB。
实施例7.在表达KAH基因的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
将候选KAH酶克隆并在工程化酿酒酵母菌株中表达以积累13-SMG。13-SMG产生酿酒酵母菌株包含以染色体方式整合在单独的表达盒中的编码聚球藻属GGPPS7多肽(SEQ IDNO：49)的重组基因、编码截短的玉蜀黍CDPS多肽(SEQ ID NO：37)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO：6)的重组基因、SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)、CPR8(SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：28)、由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO(氨基酸序列如SEQ IDNO：75所示)，和UGT85C2(SEQ ID NO：30)(图11B)。该菌株缺乏SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQID NO：68)，因此，13-SMG仅在具有功能性KAH的酿酒酵母菌株转化时才积累(图11B)。
将转化体在SC-URA培养基中培养4天，并用1∶1的DMSO在80℃下提取10分钟。通过LC-MS分析提取物(实施例1的方法2)。用SEQ ID NO：80所示的核酸转化的酿酒酵母积累了13-SMG(图11B)。因此，SEQ ID NO：80编码的蛋白质(如SEQ ID NO：82所示)是KAH。
由SEQ ID NO：80所示核苷酸序列编码的KAH经密码子优化以用于在酵母中表达(SEQ ID NO：81)，并在上述13-SMG生产酿酒酵母菌株中表达。与SrKAHe1(SEQ ID NO：18)或由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH的表达相似，SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列的表达导致13-SMG加甜茶苷的产生(图13)。
由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KAH也如实施例2所述各自在表达SrKAHe1的甜菊醇糖苷生产菌株中表达。与没有表达由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH、由SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KAH或过表达SrKAHe1的对照菌株相比，通过SrKAHe1(SEQ ID NO：18)、SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH，或由SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KAH的过表达，13-SMG的产量得到增加。参见表6。由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH或由SEQ ID NO：81所示的密码子优化的核苷酸序列编码的KAH的表达导致产生比对照菌株或过表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18)的酿酒酵母菌株更高的甜菊醇糖苷(13-SMG+1，2-二糖苷+甜茶苷+RebB+RebA+RebD+RebM)。参见表6。
表6：表达KAH基因的酵母所积累的甜菊醇糖苷的定量。
Figure BPA0000240137070000451
实施例8.在表达CYP72A219家族的KAH基因的酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
将SEQ ID NO：90的核酸(其经密码子优化以用于在酿酒酵母中表达并编码SEQ IDNO：91的多肽)克隆并表达在实施例7中所述的酿酒酵母菌株中，所述菌株改造成积累13-SMG。13-SMG产生酿酒酵母菌株包含以染色体方式整合在单独的表达盒中的编码聚球藻属GGPPS7多肽(SEQ ID NO：49)的重组基因、编码截短的玉蜀黍CDPS多肽(SEQ ID NO：37)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO：6)的重组基因、SrKO1(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)、CPR8(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)、由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO(氨基酸序列如SEQ ID NO：75所示)，和UGT85C2(SEQ ID NO：30)。
将转化体在SC-URA培养基中培养4天，并在80℃下用1∶1的DMSO提取10分钟。通过LC-MS分析提取物(实施例1的方法2)。用SEQ ID NO：90所示的核酸转化的酿酒酵母积累13-SMG和甜茶苷(表7)。因此，由SEQ ID NO：90的核酸序列编码的蛋白质(如SEQ ID NO：91所示)是KAH。
表7：由表达SEQ ID NO：90所示的核苷酸序列编码的KAH(氨基酸序列如SEQ IDNO：91所示)的酵母所积累的甜菊醇糖苷的定量。
Figure BPA0000240137070000461
实施例9.CPR1和CPR12活性的测定
使用体外微粒体测定法测量CPR1和CPR12的活性。通过Pompon等，“Yeastexpression of animal and plant P450s in optimized redox environments，”MethodsEnzymol.272：51-64(1996)教导的方法的修改形式来制备微粒体。将酿酒酵母细胞在4℃下沉淀10分钟。将沉淀用10mL TEK缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，100mM KCl)洗涤。将细胞在4℃再次沉淀10分钟，并将沉淀重悬于1-3mL TES2缓冲液(50mM Tri-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，600mM山梨糖醇)中。将玻璃珠(425-600微米)加入到样品中，通过在4℃下振荡和涡旋5分钟来剧烈破碎细胞。收集上清液，将珠用TES2缓冲液洗涤数次。将洗涤液与上清液组合，并将样品在4℃下离心15分钟以除去未破裂的细胞和玻璃珠。然后将样品在4℃下超速离心1小时。用TES缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA，600mM山梨糖醇，1％(w/V)BSA，5mM DTT)洗涤沉淀两次，并用TEG缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，1mMEDTA，30％(V/V)甘油)洗涤一次。将样品重新悬浮在1-3mL TEG中，并将颗粒均化。
如上所述从不包含异源KAH或CPR的野生型酿酒酵母细胞中制备野生型对照微粒体蛋白。还从表达以下物质的酿酒酵母细胞的染色体水平整合的遗传构建体制备微粒体蛋白：i)SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)，ii)SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)和CPR1(SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：76)，或iii)SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)和CPR12(SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98)。从表达实施例2中所述基因并且还包含来自甜菊的密码子优化的CPR1(对应于氨基酸序列SEQ ID NO：76的SEQ ID NO：61)以及由SEQ ID NO：75编码的KO的酿酒酵母细胞制备来自甜菊醇糖苷生产菌株的微粒体蛋白。
首先使用细胞色素C还原酶测定试剂盒(Sigma-Aldrich；CY0100-1KT)测定CPR1和CPR12活性，以测量在NADPH存在下CPR1或CPR12体外减少细胞色素C的能力。细胞色素C的减少导致550nm处的吸光度增加，这可以通过分光光度法定量。通过将9mg细胞色素C加入到20mL测定缓冲液中制备工作溶液，并将溶液在25℃下储存直到使用。将NADPH在H2O中稀释至0.85mg/mL的浓度。最终反应体积为1.1mL(950μL工作溶液(0.43mg细胞色素C)，28μL酶稀释缓冲液，100μL NADPH溶液(0.085mg NADPH)，20μL细胞色素C氧化酶抑制剂，2μL微粒体蛋白)。空白样品不含微粒体蛋白，并用950μL工作溶液(0.43mg细胞色素C)、30μL酶稀释缓冲液、100μL NADPH溶液(0.085mg NADPH)和20μL细胞色素C氧化酶抑制剂制备。除了NADPH之外，将所有组分加入到反应中以将分光光度计空白化。通过添加NADPH引发酶促反应，通过吹打将样品充分混合，并且以10秒为读数间隔在550nm处测量吸光度70秒。对每个微粒体制备物进行两次独立的速率测量，并对速率计算平均值以计算比活性。反应完成后，将结果根据蛋白质浓度归一化，其使用标准BCA测定(Thermo Scientific)测量。
使用以下等式计算单位/mL，其中ΔA550/分钟表示吸光度读数期间550nm处吸光度的变化，1.1表示反应体积(以mL计)，21.1表示减少的细胞色素c的消光系数：
单位/mL＝(ΔA550/分钟×稀释倍数×1.1)/(21.1×酶体积)
将每个样品的单位/mL值除以其相应的微粒体蛋白浓度，计算以计算CPR活性(以单位/mg计)。图14显示了i)SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)，ii)SrKAHe1(SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：68)和CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)，和iii)SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)和CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)微粒体样品的活性测量。
来自野生型对照的微粒体制备物仅显示出最小的CPR活性，反映出天然NCP1(YHR042W)的低活性。同样，来自过表达KAHe1的酵母菌株的微粒体制备物没有表现出CPR活性的增加。相比之下，来自表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)和CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)和CPR12(SEQ ID NO：97，SEQID NO：98)的菌株的微粒体制备物显示高CPR活性，其与阴性对照相比，分别具有高7和高14倍的活性(图14)。
在单独的实验中，测量了如上制备的微粒体中甜菊醇的形成和对映贝壳杉烯酸的消耗。在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)中将33μM的对映贝壳杉烯酸、10mM NADPH和10μL微粒体蛋白在30℃下在100μL的总反应体积中孵育30分钟。在加入所有反应组分后立即提取对照反应物，将它们在冰上混合并在孵育之前等分。使用实施例1中所述的第二种LC-MS方法对甜菊醇和对映贝壳杉烯酸水平进行定量。对于甜菊醇定量，在80℃下用DMSO(1∶1)萃取微粒体反应物10分钟，离心后进行LC-MS分析。对于对映贝壳杉烯酸定量，在80℃下用乙腈1∶4(20％微粒体反应物和80％乙腈)萃取微粒体反应物10分钟，离心后进行LC-MS分析。使用标准曲线将对映贝壳杉烯酸测定得到的AUC值转化为浓度。
如图15A所示，从表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)和CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白在30分钟的孵育时间内将对映贝壳杉烯酸转化成甜菊醇。图15A中所示的甜菊醇糖苷生产菌株对照(在无30分钟孵育期间立即提取)的甜菊醇水平对应于在微粒体制备之前由菌株积聚并与微粒体共同纯化的甜菊醇。如图15B所示，当与仅表达SrKAHe1(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：68)或其与CPR1(SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：76)或CPR12(SEQ ID NO：97，SEQID NO：98)组合表达的酿酒酵母菌株制备的微粒体蛋白一起孵育后，对映贝壳杉烯酸水平降低。图15B中对于孵育30分钟的甜菊醇糖苷生产菌株微粒体样品的水平增加的对映贝壳杉烯酸对应于在微粒体制备之前由菌株积累的对映贝壳杉烯酸，并且对应于由与微粒体共纯化的对映贝壳杉烯积累的对映贝壳杉烯酸。针对所使用的稀释倍数校正图15B所示的对映贝壳杉烯酸的水平。
实施例10.包含KO和P450还原酶结构域之间的融合构建体的酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷生产
CYP102A1(也称为P450BM3；SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116)是来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megatarium)的催化性自给自足性可溶性酶。参见例如Whitehouse等，2012，Chem Soc Rev.41(3)：1218-60。CYP102A1多肽链中存在两个结构域：P450血红素结构域(BMP)和NADPH依赖性P450氧化还原酶结构域(BMR)。CYP102A1利用NADPH的近100％的还原能力来生产单氧化产物。参见例如Yuan等，2009，Biochemistry 48(38)：9140-6。
将CYP102A1的BMR结构域(“BMR”；SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118所示的密码子优化的核苷酸序列)与SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)或由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的KO(氨基酸序列如SEQ ID NO：75所示)以及接头(SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122)融合，如Dodhia等，2006，J Biol Inorg Chem.11(7)：903-16中所述。使用了野生型形式的CYP102A1的BMR结构域，以及BMR结构域的W1046A突变体(SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：120)，已经发现该突变体将CYP102A1的辅因子专一性从NADPH转换到NADH。参见Girvan等，2011，Arch Biochem Biophys.507(1)：75-85。在与CYP102A1的BMR结构域融合之前，SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)和由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的KO也被截短；通过生物信息学预测这些截短导致丧失KO基因的膜锚点并产生胞质形式的KO-BMR融合构建体。所分析的KO-BMR融合构建体如表8所示。
表8：KO-BMR融合构建体和序列。
Figure BPA0000240137070000501
将KO-BMR融合构建体克隆并转化到实施例2中所述的RebB生产菌株中，其被修饰成不包含任何另外的KO基因。因此，包括13-SMG、1，2-二糖苷和RebB在内的甜菊醇糖苷仅在表达功能性KO时积累。将来自每个转化板的三个刮板(1μL环的细胞)重悬于200μl超纯水中。然后将70μL转移到96孔深板中的1mL SC-URA中，并在30℃下以400rpm孵育5天。通过LC-MS(实施例1的方法2)进行生物学一式三份重复分析以测量13-SMG、1，2-二糖苷和RebB水平，并且通过LC-UV分析单个样品以测量对映贝壳杉烯和对映贝壳杉烯酸水平。
对于LC-MS，将50μL样品与50μL 100％DMSO混合并加热至80℃持续10分钟。随后，将样品在4000RCF下旋转沉降10分钟，将85μL所得上清液转移至LC-MS板。根据各培养物的OD600将LC-MS结果归一化，其通过Wallac，2104 EnVision(Perkin Elmer)平板读数器测量。
以包含可变波长检测器(variable wavelength detector，VWD)、恒温柱室(thermostatted column compartment，TCC)、自动进样器、自动进样器冷却单元和二元泵的Agilent 1290仪器，并使用SB-C18快速分辨高清晰度(rapid resolution highdefinition，RRHD)2.1mmx300mm，1.8μm分析柱(两个150mm柱串联；柱温65℃)进行LC-UV。通过反相C18柱分离甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体，然后通过210mm处的UV吸光度检测。通过将每个分析物的峰面积与RebA的标准进行比较，并将校正因子应用于不同摩尔吸光度的物质来进行甜菊醇糖苷的定量。通过将每种分析物的峰面积与贝壳杉烯酸标准物进行比较，并将校正因子应用于不同摩尔吸光度的物质来进行对甜菊醇糖苷前体(如贝壳杉烯酸、贝壳杉烯醛、贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯和牻牛儿基牻牛儿醇)的定量。对于LC-UV，将0.5mL培养物旋转沉降，除去上清液，并计算沉淀的湿重。将LC-UV结果根据沉淀湿重归一化。
如图16B和16D所示，用空质粒转化的酿酒酵母菌株积累了对映贝壳杉烯。用包含SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)的质粒转化或用包含具有SEQ ID NO：65所示核苷酸序列之KO基因的质粒转化导致13-SMG、1，2-二糖苷和RebB的积累(图16A和186C)。
全长SrKO1-BMR融合构建体(野生型或W1046A突变体BMR；SEQ ID NO：99-102)的表达导致与表达SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)相比，对映贝壳杉烯酸、13-SMG和RebB增加。参见图16A和16B。截短的SrKO1-BMR融合构建体(野生型或W1046A突变体BMR；SEQ IDNO：103-106)的表达导致与表达SrKO1(SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：79)相比，对映贝壳杉烯酸增加(图16B)。尽管截短的SrKO1-BMR融合构建体也增加了甜菊醇糖苷产量，但全长SrKO1-BMR融合构建体的糖基化活性高于截短的SrKO1-BMR融合构建体(图16A)。
与由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的KO相比，表达包含由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和野生型BMR的融合构建体(SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：108)导致对映贝壳杉烯酸向13-SMG的转化更多(图16C)。相比于由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO，表达包含由SEQ ID NO：65所示核苷酸序列编码的KO和W1046A突变体BMR的融合构建体(SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110)导致降低的对映贝壳杉烯酸水平，但其糖基化活性类似(图16C)。
实施例11.评估包含ICE2的酿酒酵母菌株中的甜菊醇糖苷途径
ICE2是参与例如ER锌内稳态和细胞色素P450稳定性和/或活性机制的内质网(ER)膜蛋白。参见例如Estrada de Martin等，2005，J Cell Sci.118(Pt 1)：65-77和Emmerstorfer等，2015，Biotechnol J.10(4)：623-35。将ICE2(SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114)克隆并过表达在甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中，所述菌株包含编码聚球藻属GGPPS多肽(SEQ ID NO：49)的重组基因、编码截短的玉蜀黍CDPS多肽(SEQ ID NO：37)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO：6)的重组基因、编码重组甜菊KO多肽(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：87)的重组基因、编码SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)多肽的重组基因、编码甜菊CPR8多肽(SEQID NO：24、SEQ ID NO：28)的重组基因、由SEQ ID NO：81所示的核苷酸序列编码的重组KAH基因(对应于SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列)、由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的重组KO基因(对应于SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列)、由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的重组KO基因(对应于SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列)、编码UGT76G1(SEQ ID NO：83)多肽的重组基因、编码甜菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO：30)的重组基因、编码甜菊UGT74G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：29)、编码EUGT11(SEQ ID NO：86)多肽的重组基因、编码UGT91D2e(SEQ ID NO：84)多肽的重组基因，和编码CPR1(SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：76)多肽的重组基因。使用USER克隆系统进行整合来进行过表达；参见例如Nour-Eldin等，2010，Methods Mol Biol.643：185-200。表9显示了在上述菌株中表达的其他重组基因(ICE2和/或CPR12)。对照菌株不包含编码ICE2(SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114)或CPR12(SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：98)多肽的重组基因。
表9：ICE2甜菊醇糖苷生产菌株。
Figure BPA0000240137070000521
在30℃下的2L发酵罐中需氧地进行补料分批发酵，在包含葡萄糖、硫酸铵、痕量金属、维生素、盐和缓冲液的基本培养基中进行约16小时的生长阶段，随后用包含葡萄糖的限定补料培养基进行约110小时的补料阶段。维持pH值接近6.0和葡萄糖限制条件。通过实施例10的LC-UV方法分析全培养物样品(未去除细胞)，以测定甜菊醇糖苷和甜菊醇途径中间体的水平。
基于甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的测量水平计算以下值。“总通量”计算为所测量的RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、二糖基化甜菊醇、三糖基化甜菊醇、四糖基化甜菊醇、五糖基化甜菊醇、六糖基化甜菊醇、七糖基化甜菊醇、柯巴醇(copalol)、对映贝壳杉烯酸、糖基化对映贝壳杉烯酸、糖基化对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、牻牛儿基牻牛儿醇、对映贝壳杉烯醛和对映贝壳杉烯水平的总和(以g/L RebD当量计)。“前甜菊醇糖苷/通量”计算为((“总通量”-(牻牛儿基牻牛儿醇+柯巴醇+对映贝壳杉烯+糖基化对映贝壳杉烯醇+对映贝壳杉烯醇+对映贝壳杉烯醛+对映贝壳杉烯酸+糖基化对映贝壳杉烯酸)/“总通量”)。“(KAH步骤/通量”)计算为((对映贝壳杉烯酸+糖基化对映贝壳杉烯酸)/“总通量”)。“(KO步骤/通量”)计算为((对映贝壳杉烯+糖基化对映贝壳杉烯醇+对映贝壳杉烯醇+对映贝壳杉烯醛)/“总通量”)。
前甜菊醇糖苷/通量，KO步骤/通量和KAH步骤/通量值示于下表10中。在包含ICE2的菌株中观察到与对照甜菊醇糖苷生产菌株相比，对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、糖基化对映贝壳杉烯醇的量减少而对映贝壳杉烯酸和糖基化对映贝壳杉烯酸的量增加。在CPR1和/或CPR12存在下，这些作用更加强烈(表10)。ICE2的两个拷贝的过表达(ICE2菌株B)导致与对照菌株、ICE2菌株A或ICE2菌株C相比，对映贝壳杉烯，对映贝壳杉烯醇，对映贝壳杉烯醛和对映贝壳杉烯醇糖苷水平降低，而甜菊醇糖苷水平增加(表10)。在含有两个拷贝的ICE2的甜菊醇糖苷生产菌株中，甜菊醇糖苷水平提高最多。因此，发现ICE2可以改善细胞色素P450的功能。
表10：包含ICE2的甜菊醇糖苷生产菌株的前甜菊醇糖苷/通量、KO步骤/通量和KAH步骤/通量值。
菌株 前甜菊醇糖苷/通量 KO步骤/通量 KAH步骤/通量
ICE2“菌株A” 0.38 0.36 0.22
ICE2“菌株B” 0.43 0.42 0.10
ICE2“菌株C” 0.39 0.38 0.19
对照 0.41 0.48 0.08
实施例12.通过包含CPR1和CPR12的酿酒酵母菌株的发酵生产甜菊醇糖苷
通过发酵培养包含通过基因组方式整合入菌株的以下基因的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株：编码聚球藻属GGPPS多肽(SEQ ID NO：49)的重组基因、编码截短的玉蜀黍CDPS多肽(SEQ ID NO：37)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO：6)的重组基因、编码重组甜菊KO多肽(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：79)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：87)的重组基因、编码SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)多肽的重组基因、编码甜菊CPR8多肽(SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：28)的重组基因、编码CPR1(SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：76)多肽的重组基因、编码SrKAHe1(SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：68)多肽的重组基因、由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的重组KO基因(对应于SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列)、编码UGT76G1(SEQ ID NO：83)多肽的重组基因、编码甜菊UGT85C2(SEQ IDNO：30)多肽的重组基因、编码甜菊UGT74G1(SEQ ID NO：29)多肽的重组基因、编码UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：88)的重组基因和编码EUGT11(SEQ ID NO：86)多肽的重组基因，以及表11所示的重组基因。如实施例11所述，通过LC-UV测量甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的水平。如实施例11所述计算前KO/通量、前KAH/通量、前甜菊醇糖苷/通量值。
表11：还在实施例12中的甜菊醇糖苷生产酿酒酵母菌株中表达的重组基因。
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前甜菊醇糖苷/通量、KO步骤/通量和KAH步骤/通量值示于下表12中。在包含由SEQID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO的菌株(菌株A)中，得到较低的对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇，对映贝壳杉烯醛和对映贝壳杉烯醇糖苷的积累。与对照菌株相比，还测量到了更高水平的对映贝壳杉烯酸和甜菊醇糖苷。在包含由SEQ ID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH、由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO(对应于SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列)，和由SEQ ID NO：65所示的核苷酸序列编码的KO的菌株(菌株B)中，与对照菌株相比，其对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯醇糖苷和对映贝壳杉烯酸积累减少，而甜菊醇糖苷的积累增加。在包含CPR12(SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98)、由SEQID NO：80所示的核苷酸序列编码的KAH，和由SEQ ID NO：56所示的核苷酸序列编码的KO的菌株(菌株C)中，与对照相比，其对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛、对映贝壳杉烯醇糖苷和对映贝壳杉烯酸积累减少，而甜菊醇糖苷的积累增加。参见表12。因此，发现CPR12是一种可以改进KAH和/或KO活性的还原酶蛋白。
表12.实施例12的甜菊醇糖苷生产菌株的前甜菊醇糖苷/通量、KO步骤/通量，和KAH步骤/通量值。
菌株 前甜菊醇糖苷/通量 KO步骤/通量 KAH步骤/通量
实施例12，菌株A 0.48 0.28 0.22
实施例12，菌株B 0.64 0.18 0.12
实施例12，菌株C 0.55 0.24 0.12
对照 0.40 0.43 0.17
已经详细地并通过参考其具体实施方案描述了本发明，显而易见的是，在不偏离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下，可以对其进行修改和改变。更具体而言，尽管本发明的一些方面在本文中被认为是特别有利的，但是预期本发明并不必然限于本发明的这些特定方面。
表13.本文所公开的序列。
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Claims (30)

1.在细胞培养物中产生甜菊醇糖苷前体或甜菊醇的重组宿主，其包含：
（a）编码能够从法呢基二磷酸（FPP）和异戊烯基二磷酸（IPP）合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的多肽的基因；
（b）编码能够从GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽的基因；
（c）编码能够从对映柯巴基二磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因；
（d）编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因，所述多肽由SEQ ID NO: 22、28、69、73、74、76、87或98中任一个所示的氨基酸序列组成；
并且其还包含
（e）编码从对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸的多肽的基因；
其中所述从对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸的多肽为由SEQ ID NO: 54、70、71、72、75；77、78或79中任一个所示的氨基酸序列组成的多肽；
或者
（f）编码从对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
其中所述从对映贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽为由SEQ ID NO: 68、82或91中任一个所示的氨基酸序列组成的多肽；
其中所述基因中的至少一个是重组基因；并且
其中所述重组宿主是酵母细胞。
2.权利要求1所述的重组宿主，其还包含：
（d）编码从法呢基二磷酸（FPP）和异戊烯基二磷酸（IPP）合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的多肽的基因；
（e）编码从GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽的基因；和/或
（f）编码从对映柯巴基二磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因。
3.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主，其中：
（a）所述编码从法呢基二磷酸（FPP）和异戊烯基二磷酸（IPP）合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的多肽的基因中，所述多肽由SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列组成；
（b）所述编码从GGPP合成对映柯巴基二磷酸的多肽的基因中，所述多肽由SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列组成；和/或
（c）所述编码从对映柯巴基二磷酸合成对映贝壳杉烯的多肽的基因中，所述多肽由SEQID NO：6所示氨基酸序列组成。
4.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主，其中相对于缺乏所述重组基因的相应宿主，由所述宿主产生的对映贝壳杉烯、对映贝壳杉烯醇、对映贝壳杉烯醛和/或对映贝壳杉烯醇糖苷的量降低至少10%。
5.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主，其中所述宿主还包含编码内质网膜多肽的基因，所述内质网膜多肽具有SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列；其中所基因具有2个或更多个拷贝数。
6.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主，其中所述能够从对映贝壳杉烯合成对映贝壳杉烯酸的多肽是融合构建体。
7.权利要求6所述的重组宿主，其中所述融合构建体由SEQ ID NO：118或SEQ ID NO：120所示的氨基酸序列组成。
8.权利要求1至2中任一项所述的重组宿主，其还包含：
（a）编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13位羟基处进行糖基化的多肽的基因；
（b）编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β 1,3糖基化的多肽的基因；
（c）编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处进行糖基化的多肽的基因；和/或
（d）编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β 1,2糖基化的多肽的基因；
其中所述基因中的至少一个是重组基因; 以及
其中所述宿主产生一种或更多种甜菊醇糖苷。
9.权利要求8所述的重组宿主，其中：
（a）所述能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13位羟基处进行糖基化的多肽为由SEQ IDNO：30所示的氨基酸序列组成的多肽；
（b）所述能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β 1,3糖基化的多肽为由SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列组成的多肽；
（c）所述能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处进行糖基化的多肽为由SEQ IDNO：29所示的氨基酸序列组成的多肽；以及
（d）所述能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β 1,2糖基化的多肽为由SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列组成的多肽。
10.权利要求8所述的重组宿主，其中所述一种或更多种甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷（13-SMG）、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜菊醇-1,3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷（19-SMG）、甜菊苷、1,3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A（RebA）、莱鲍迪苷B（RebB）、莱鲍迪苷C（RebC）、莱鲍迪苷D（RebD）、莱鲍迪苷E（RebE）、莱鲍迪苷F（RebF）、莱鲍迪苷M（RebM）、莱鲍迪苷Q（RebQ）、莱鲍迪苷I（RebI）、杜尔可苷A、二糖基化的甜菊醇、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇，或其异构体。
11.权利要求8所述的重组宿主，其中相对于缺乏一种或更多种所述重组基因的相应宿主，由所述宿主产生的13-SMG的量提高至少2倍。
12.权利要求8所述的重组宿主，其中相对于缺乏一种或更多种所述重组基因的相应宿主，由所述宿主产生的13-SMG、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebD和RebM的总量提高至少10％。
13.权利要求1所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、光滑念珠菌（Candida glabrata）、棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）、产朊假丝酵母（Cyberlindnera jadinii）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）、博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）、Arxula adeninivorans、红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）或白色念珠菌（Candida albicans）物种的细胞。
14.权利要求13所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是酵母菌（Saccharomycete）。
15.权利要求14所述的重组宿主，其中所述酵母细胞是来自酿酒酵母物种的细胞。
16.权利要求1所述的重组宿主，其中所述重组宿主是解脂耶氏酵母细胞。
17.细胞培养物，其包含权利要求1至12中任一项所述的重组宿主，所述细胞培养物还包含：
（a）由所述重组宿主产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷；
（b）葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰葡糖胺；以及
（c）包含微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸的补充营养物；
其中所述甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷以至少1 mg/升所述细胞培养物的浓度存在；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集所述甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷，并且相对于来源自植物的甜叶菊提取物具有降低水平的来源自甜叶菊植物的组分。
18.生长于细胞培养物中的来自权利要求1至12中任一项所述的重组宿主的细胞裂解物，其包含：
（a）由所述重组宿主细胞产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷；
（b）葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰葡糖胺；和/或
（c）包含微量金属、维生素、盐、酵母氮源、YNB和/或氨基酸的补充营养物；
其中由所述重组宿主细胞产生甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷以至少1 mg/升所述细胞培养物的浓度存在。
19.生产甜菊醇糖苷前体的方法，其包括在基因被表达的条件下，在细胞培养物中培养权利要求1所述的重组宿主，并且其中所述甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷由所述重组宿主产生。
20.在细胞培养物中生产一种或更多种甜菊醇糖苷的方法，其包括在基因被表达的条件下，培养权利要求8所述的重组宿主，并且其中所述一种或更多种甜菊醇糖苷由所述重组宿主产生。
21.权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述基因是组成型表达的和/或所述基因的表达是被诱导的。
22.权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述重组宿主在发酵罐中在一定温度下生长一段时间，其中所述温度和一段时间促进所述甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷的产生。
23.权利要求20所述的方法，其中所述一种或更多种甜菊醇糖苷包含甜菊醇-13-O-葡糖苷（13-SMG）、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜菊醇-1,3-二糖苷、甜菊醇-19-O-葡糖苷（19-SMG）、甜菊苷、1,3-甜菊苷、甜茶苷、莱鲍迪苷A（RebA）、莱鲍迪苷B（RebB）、莱鲍迪苷C（RebC）、莱鲍迪苷D（RebD）、莱鲍迪苷E（RebE）、莱鲍迪苷F（RebF）、莱鲍迪苷M（RebM）、莱鲍迪苷Q（RebQ）、莱鲍迪苷I（RebI）、杜尔可苷A、二糖基化的甜菊醇、三糖基化的甜菊醇、四糖基化的甜菊醇、五糖基化的甜菊醇、六糖基化的甜菊醇、七糖基化的甜菊醇，或其异构体。
24.权利要求20所述的方法，其中相对于缺乏一种或更多种所述重组基因的相应宿主，由所述细胞产生的13-SMG的量提高至少2倍。
25.权利要求20所述的方法，其中相对于缺乏一种或更多种所述重组基因的相应宿主，由所述细胞产生的13-SMG、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜茶苷、RebB、RebA、RebD和RebM的总量提高至少10％。
26.权利要求19或权利要求20所述的方法，其还包括从所述细胞培养物中分离所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷。
27.权利要求26所述的方法，其中所述分离步骤包括将所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相分离以获得包含所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷的上清液，和：
（a）使所述上清液与一种或更多种吸附树脂接触，以获得至少一部分所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷；或者
（b）使所述上清液与一种或更多种离子交换或反相色谱柱接触，以获得至少一部分所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷；或者
（c）结晶或提取所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷；
从而分离所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷。
28.权利要求19或权利要求20所述的方法，其还包括从所述细胞培养物中回收所产生的甜菊醇糖苷前体、甜菊醇或一种或更多种甜菊醇糖苷。
29.权利要求28所述的方法，其中包含所回收的一种或更多种甜菊醇糖苷的组合物相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富集莱鲍迪苷M，并且相对于由来源自植物的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物，具有降低水平的来源自甜叶菊植物的组分。
30.用于产生一种或更多种甜菊醇糖苷的方法，其包括在权利要求8的重组宿主的细胞培养物中对来源自植物的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化；
其中所述多肽中的至少一种是在所述重组宿主中表达的重组多肽。
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