CN114561310B - 一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用，在酿酒酵母菌株中表达甜茶苷合成基因并过表达ABC外排泵，ABC外排泵选自YOR1、PDR11和PDR12中的至少一种。本发明通过在酿酒酵母中构建甜茶苷合成途径，使酿酒酵母能够生成甜茶苷，并进一步应用启动子工程和基因工程对重组酿酒酵母进行改造，实现了以葡萄糖为底物从头合成甜茶苷，该重组酿酒酵母在发酵生产甜茶苷中表现良好。

Description

一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用。
背景技术
甜茶苷(Rubusoside，Rubu)是主要从广西甜茶(茶、糖、药三位一体，“天然降血糖植物”)中提取的一种甜菊糖类的甜味剂。甜菊糖，又名甜菊糖苷，具有高甜度(蔗糖的300～450倍)、低热值(蔗糖的1/300)等特点，天然蔗糖替代品，被誉为“世界第三糖原”。甜菊糖是从甜叶菊中萃取甜菊糖苷净化而来的产物。甜茶苷除了作为甜味剂以外，还具有一定的药理作用，例如，降低血糖、激活胰岛素、抗癌活性等。但是植物中甜茶苷的产量较低 (甜茶苷含量低于5％)，且植物生长周期长、人工提取成本高，限制了甜茶苷的大量生产。为了解决这个问题，需要培育富含甜茶苷的新品种，但其所需要的先进技术和设备都仰赖大量资金。即便在甜菊糖的最大出口国中国，大多数生产商也无法负担得起。目前采用基因工程法构建基因工程菌株从头合成天然产物其具有低成本、原料不受限制、提取过程简单、无季节性、生产时间短，对环境污染小等诸多优点，从而受到广大学者的青睐。
微生物发酵法具有可持续性、绿色环保的社会经济效益，采用微生物发酵法生产莱甜茶苷是解决上述问题的有效途径。目前，关于甜茶苷合成途径关键基因的多个研究已指出(倪洪涛等，甜菊糖生物合成相关基因的研究进展；李铭敏等，甜菊糖苷的生物合成途径与生物转化制备策略的研究概述)，植物体内甜菊糖苷(SGs)的生物合成途径与赤霉素具有相关性，它们的共同前体是由焦磷酸异戊二烯(IPP)缩合成的牻牛儿牻牛儿焦磷酸(GGPP)，经过一系列酶的作用，催化形成甜菊醇和赤霉素，而甜菊醇再通过各类UDP- 糖基转移酶(UGTs)合成各类甜菊糖苷(stevioside，SGs)。具体地，牻牛儿焦磷酸合酶(GPPS)催化IPP和二甲基丙烯基二磷酸(DAMPP)形成牻牛儿焦磷酸(GPP)，法呢基焦磷酸合酶(FPPS)催化GPP形成法呢基焦磷酸(FPP)，FPP经牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPPS)催化生成GGPP，GGPP在环化焦磷酸合酶(CPPS)的作用下脱氢形成环化焦磷酸(CPP)， CPP在贝壳杉烯合酶(KS)的催化下环化成贝壳杉烯，重排生成四环的贝壳杉烯，合成的贝壳杉烯转移到内质网中，在依赖细胞色素P450的单加氧酶(KO)的作用下转化成贝壳杉烯酸，贝壳杉烯酸在贝壳杉烯酸羟化酶(KAH) 的作用下，发生C13位脱氢氧化形成甜菊醇。甜菊醇经糖基转移酶UGT85C2、糖基转移酶UGT74G1等进行糖基化反应合成了各类SGs，比如甜茶苷。
中国专利CN201010569609.2公开了一种利用黄杆菌胞内酶提取和快速生产甜茶苷的方法，将黄杆菌活化后破碎，取上清，以甜菊糖为底物进行转化制备甜茶苷；中国专利CN201310460493.2利用微生物生产甜菊糖苷类化合物的方法，在宿主细胞(大肠杆菌、毕赤酵母或酿酒酵母)中重组表达非甜叶菊来源的糖基转移酶UGTB1或IBGT，还表达了(a)牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶GGPPS，(b)古巴焦磷酸合成酶CDPS和贝壳烯合成酶KS，或双功能贝壳烯合酶，(c)贝壳烯氧化酶KO，(d)细胞色素P450氧化还原蛋白 CPR，(e)贝壳烯酸-13α-羟化酶，(f)UGT85C2糖基转移酶，(h)UGT74G1糖基转移酶，和(i)UGT76G1糖基转移酶。但上述方法生产的甜茶苷产量仍有待提高或并未生成甜茶苷，且目前未有关于微生物发酵法以葡萄糖为底物从头合成甜茶苷的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种生产甜茶苷的菌株，以酿酒酵母为出发菌株，构建了甜茶苷合成途径，过表达酿酒酵母中的ABC外排泵 YOR1、PDR11或PDR12，以此实现从头合成甜茶苷和甜茶苷的高效生产。
本发明的第一个目的是提供一种生产甜茶苷的酿酒酵母菌株，该菌株表达甜茶苷合成基因并过表达ABC外排泵，所述ABC外排泵选自YOR1、PDR11和PDR12中的至少一种。
进一步地，YOR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PDR11的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，PDR12的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，甜茶苷合成基因为法呢基焦磷酸合酶基因fpps、贝壳杉烯合酶基因ks、贝壳杉烯酸氧化酶基因ko、甜菊醇合酶基因kah、UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1和UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2。甜茶苷的合成途径见图1。
进一步地，采用Cre-loxP方法将甜叶菊来源的法呢基焦磷酸合酶基因 fpps、贝壳杉烯合酶基因ks、贝壳杉烯酸氧化酶基因ko、甜菊醇合酶基因kah、 UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1和UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2进行全基因合成，整合至酿酒酵母染色体gal80位点、1014a位点、1039a位点、 sap155b位点和1021b位点。
进一步地，法呢基焦磷酸合酶基因fpps的核苷酸序列如SEQ ID NO.4 所示。
进一步地，贝壳杉烯合酶基因ks的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，贝壳杉烯酸氧化酶基因ko的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步地，甜菊醇合酶基因kah的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。酿酒酵母P450酶(KO和KAH)经过增加基因拷贝数、构建底物传输系统系统等策略解除P450酶的限速步骤，从而加速生成甜茶苷。
进一步地，UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步地，通过双向启动子Pgal1/10调控甜茶苷合成基因的表达。双向启动子Pgal1/10由β-半乳糖和葡萄糖共同诱导的启动子Gal1和Gal10组成，启动子Pgal1/10的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。敲除酿酒酵母中的gal80 基因，解除β-半乳糖对Pgal1/10的调控，获得由葡萄糖调控的酿酒酵母菌株。
进一步地，上述生产甜茶苷的酿酒酵母以酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1CMATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2为出发菌株。
进一步地，上述酿酒酵母强化异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的表达。具体地，增加异戊烯基双磷酸盐- 异构酶基因idi的拷贝数；切除羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的N 端内质网定位信号肽获得thmg1(核苷酸序列如SEQ IDNO.13)，增加thmg1 的拷贝数。
进一步地，上述酿酒酵母过表达内质网大小调节因子INO2，INO2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步地，通过Ppgk1启动子调控INO2的表达，Ppgk1启动子的核苷酸序列如SEQID NO.15所示。
酿酒酵母是又称面包酵母或者出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母，作为食品安全菌株已用于制作面包和馒头等食品、酿酒工业。近年来，学者们开始研究利用酿酒酵母生产天然产物，如青蒿酸、三七皂苷等。相比大肠杆菌而言，酿酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也在基因工程领域发挥着重要作用。然而，酿酒酵母中没有甜茶苷合成的代谢通路。因此，本发明中将甜茶苷的合成途径整合至酿酒酵母，由于甜茶苷合成的前体IPP和DMAPP积累对细胞生长有毒，因此选用葡萄糖抑制型启动子Pgal1/10，将细胞生产与生长解耦联，发酵初期培养细胞生长，待葡萄糖耗尽后，Pgal控制的甜茶苷途径基因开始表达促使产物合成以达到高效合成甜茶苷的效果。同时，强化甜茶苷合成前体 IPP和DMAPP合成过程中的关键限速酶的表达以提高IPP和DMAPP的生成，优化羟化酶P450强化中间产物向目标产物甜茶苷的转化，以及过表达INO2最大程度在酿酒酵母中积累甜茶苷。但是，甜茶苷在胞内积累会限制其产量进一步提升，因此本发明还通过鉴定并强化甜茶苷的外排系统进一步提高酿酒酵母中甜茶苷的生产性能。
本发明的第二个目的是提供一种上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：
(1)将基因表达框Pgal10-ks插入酿酒酵母菌株基因组中的gal80位点，将启动子Pgal1/10与cpr1和ko的基因表达框整合至1014a位点，将启动子Pgal1与kah的基因表达框整合至1039a位点，将启动子Pgal1/10与ugt76g1 和ugt85c2的基因表达框整合至sap155b位点，将启动子Pgal1与fpps的基因表达框整合至1021b位点；其中，将基因表达框插入gal80位点，敲除了酿酒酵母中的gal80基因，解除了β-半乳糖对Pgal1/10的调控；
(2)增加甲羟戊酸途径中的关键限速酶基因idi的拷贝数；切除羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的N端内质网定位信号肽获得thmg1，增加thmg1的拷贝数，强化甜茶苷合成前体；过表达INO2以扩大内质网；过表达ABC外排泵以强化其外排系统，ABC外排泵为YOR1、PDR11和PDR12 中的至少一种，得到上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株。
本发明的第三个目的是提供ABC外排泵YOR1、PDR11或PDR12在提高可生产甜茶苷酿酒酵母的甜茶苷产量中的应用，具体地，增强可生产甜茶苷酿酒酵母中YOR1、PDR11或PDR12的表达，可生产甜茶苷酿酒酵母为表达甜茶苷合成基因的酿酒酵母。优选地，过表达PDR11。更优选地，同时过表达YOR1、PDR11和PDR12。
进一步地，鉴定酿酒酵母中甜茶苷外排泵的方法为，预测酿酒酵母质膜上外排泵蛋白结构，通过与甜茶苷进行分子对接初步筛选出甜茶苷的外排泵，再通过ABC外排泵抑制剂进行进一步筛选，分别敲除筛选出的外排泵，对比对应酿酒酵母的甜茶苷产量，筛选出酿酒酵母中对甜茶苷外排起重要作用的外排泵。
本发明通过结构预测、分子对接以及ABC外排泵抑制剂筛选出甜茶苷的外排泵主要包含ABC外排泵家族，再通过敲除ABC外排泵，发现YOR1， PDR11，和PDR12敲除后，甜茶苷的产量降低至1倍以上。通过过表达以上三个外排泵后，发现PDR11是甜茶苷的主要外排泵。PDR11过表达后甜茶苷的产量从67mg/L提升至155mg/L，细胞形态恢复正在，生长OD明显提高。
本发明的第四个目的是提供一种生产甜茶苷的方法，采用上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株发酵生产甜茶苷。
进一步地，以葡萄糖为底物。
进一步地，将上述生产甜茶苷的酿酒酵母菌株接种至以葡萄糖和蔗糖为碳源的无菌培养基，在30-40℃下通气发酵。将30-40℃，180-250rpm条件下培养15-20h的种子，以1-10％的接种率转入发酵培养基，于30-40℃， 180-250rpm条件下培养，优选108小时。
进一步地，种子培养基为含有15-25g/L葡萄糖、2-10mg/L组氨酸、2-10 mg/L色氨酸和2-10mg/L亮氨酸的酵母基础培养基。
进一步地，发酵培养基的成分为5-15g/L酵母粉、15-25g/L蛋白胨和 15-25g/L葡萄糖。
本发明提供的生产甜茶苷的酿酒酵母菌株在生物、制药、食品或化工领域均有巨大的应用潜力，如用于制备甜茶苷或含有甜茶苷的产品等。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明以甜茶苷为最终目标产品进行代谢改造，通过引入甜茶苷合成途径相关基因，选用葡萄糖抑制型启动子调控甜茶苷合成途径相关基因的表达，强化内质网大小调节因子INO2的表达，并考虑到甜茶苷积累的抑制作用，进一步强化外排系统，提供了一种重组酿酒酵母，实现了微生物发酵法以葡萄糖为底物发酵高效生产甜茶苷，并弱化其胞内积累，为代谢工程改造酿酒酵母从头合成甜茶苷奠定了基础。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为甜茶苷的生产路径示意图；
图2为不同外排泵与甜茶苷分子对接图；
图3为外排泵抑制实验结果图；
图4为ABC外排泵敲除实验结果图；
图5为过表达不同ABC外排泵前后甜茶苷的合成情况；
图6为不同时间内过表达不同ABC外排泵前后的细胞生长情况；
图7为发酵产物的质谱分析结果和色谱分析结果；
图8为实施例5中重组菌C6发酵生产时葡萄糖的浓度变化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所涉及的材料与方法如下：
(1)培养基：
种子培养基的成分包括：酵母基础氮源(Yeast nitrogen base，YNB)、葡萄糖20g/L、组氨酸5mg/L、色氨酸5mg/L和亮氨酸5mg/L。
发酵培养基的成分包括：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L和葡萄糖20g/L。
(2)高效液相-质谱联用仪(LC-MS)检测甜茶苷产量：Waters (MICROMASS QUATTROMICRO)，BEH-C18柱子，流动相乙腈和0.1％甲酸水溶液，柱温45℃，进样量1μL。
(3)菌株生长情况检测：使用紫外-可见分光光度计定时测定发酵液的吸光光度值OD600。
实施例1甜茶苷从头合成重组酿酒酵母菌株C1的构建
根据法呢基焦磷酸合酶基因fpps(NCBI ID：P08836.2，核苷酸序列如 SEQ IDNO.4所示)、贝壳杉烯合酶ks(NCBI ID：Q9UVY5，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、贝壳杉烯酸氧化酶ko(NCBI ID:AAQ63464.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)、甜菊醇合酶kah(NCBIID：NP_197872.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)、UDP葡萄糖基转移酶ugt74g1(NCBI ID:Q6VAA6.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)和UDP葡萄糖基转移酶 ugt85c2(NCBI ID:Q6VAB0.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，按照酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化并进行全基因合成。将基因表达框 Pgal10-ks插入基因组中的gal80位点，将启动子Pgal1/10(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)与cpr1和ko的基因表达框整合至1014a位点，将启动子 Pgal1与kah的基因表达框整合至1039a位点，将启动子Pgal1/10与ugt76g1 和ugt85c2的基因表达框整合至sap155b位点，将启动子Pgal1与fpps的基因表达框整合至1021b位点。
将基因整合框中的DNA片段转化至酿酒酵母S.cerevisiae CEN PK2-1C MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2感受态细胞，挑取菌落PCR正确的转化子进行测序验证，最终获得具有甜茶苷合成通路的重组酿酒酵母菌株C1。
实施例2异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的强化
甜茶苷合成属于次级代谢，前体积累较少，为提高前体的合成，增加甲羟戊酸途径中的关键限速酶基因idi(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)的拷贝数；切除羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)的N端内质网定位信号肽获得thmg1(核苷酸序列如SEQ ID NO.13)，增加thmg1的拷贝数。
具体步骤为：
将启动子Pgal1/10与thmg1和idi的基因表达框整合至308a位点，得到重组酿酒酵母菌株C2。
实施例3过表达INO2
使用Ppgk1启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)与INO2基因 (核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)表达框替换C2菌株基因上的INO2基因与启动子序列，得到重组酿酒酵母菌株C3。
实施例4外排泵的鉴定及强化
根据AlphaFold预测酿酒酵母质膜上外排泵蛋白结构，通过与甜茶苷进行分子对接，结果如图2所示，初步筛选出甜茶苷的外排泵主要包含于ABC 外排泵家族。
选择五种不同类型的ABC外排泵抑制剂(利血平、羰基氰化物间氯苯腙、地塞米松、taniqudar和Phe-Arg-β-naphthylamide dihydrochloride)对重组酿酒酵母菌株C3进行抑制，结果如图3所示。结果发现利血平和CCCP 对甜茶苷外排具有明显的抑制作用，说明ABC外排泵在酿酒酵母对甜茶苷的外排中起非常重要的作用。
随后，敲除酿酒酵母质膜上的ABC外排泵pdr11、yor1、pdr12、pdr1、 pdr15、snq2、pdr10和pdr5，结果见图4。发现YOR1，PDR11和PDR12 敲除后，甜茶苷的产量降低至1倍以上，PDR1和PDR15敲除后甜茶苷的产量也有一定程度的下降，而其余外排泵无明显影响。
分别过表达以上三个外排泵YOR1(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，PDR11(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和PDR12(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，分别得到重组酿酒酵母菌株C4、C5和C6，发酵108h后甜茶苷生产情况及生长OD情况见图5和图6。结果显示，PDR11是甜茶苷的主要外排泵，PDR11过表达后甜茶苷的产量从67mg/L提升至155mg/L(图5)，细胞形态恢复正常，生长OD明显提高(图6)。
实施例5重组酿酒酵母发酵生产甜茶苷
具体步骤如下：
将重组酿酒酵母菌株C1、C2、C3、C4、C5和C6划线与SD平板(添加尿嘧啶50mg/L)，30℃下培养直至长出大量菌落。接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养18至20h至细胞生长对数前期。
按起始3％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃220rpm 培养108h。每隔12h取一次菌液，测量OD600与葡萄糖剩余量，结果如图 8所示。108h停止培养，将菌液转至50mL离心管，常温6000rpm离心10 min。弃去培养基，用1mL水重悬菌体，加入0.1mm的玻璃珠进行均质研磨。研磨后的样品，8000rpm离心10min，取上清液经0.22μm的水系滤膜过滤后进行LC-MS分析，质谱定性分析结果(上)和色谱分析结果(下) 如图7。
重组酿酒酵母菌株C1、C2、C3、C4、C5和C6发酵108h后甜茶苷产量结果如表1所示，表达fpps、ks、ko、kah、ugt74g1和ugt85c2基因，敲除gal80基因，增加idi的拷贝数，增加thmg1的拷贝数，优化P450酶，过表达INO2，过表达ABC外排泵，菌株甜茶苷的产量最高达到155mg/L， OD600达到23.7(过表达PDR11前OD600为14.4)。
表1不同重组酿酒酵母的甜茶苷产量及OD600
Figure BDA0003551853530000101
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种生产甜茶苷的酿酒酵母及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4434
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ttaacttctg ttctcgaaat cattttccac aataccagat ctagaacaca tgcttctgaa 60
aatactatct tcttgactaa acaacgtcca tggtgtatcg aattctgcga cttcaccctt 120
ctctaaaaca agaatacgat cataatttac aatggtcttc agtctgtgag caatacacaa 180
aattgtacaa tctccaaatt cctcaacaat acgtgtttgg attttgccat ccgtttcgta 240
gtccactgag gatgtagcct catccaaaat caatattttt gattggcgga ccaatgccct 300
tgttaatgct aatagttgtc tctcacctaa ggagaaattg gagccctctt cttccactgc 360
ttgatctaaa tggaacttat gcattttacc atgagtacca ttttcatcag gtttttgcaa 420
tttcacttcc ggcaagtcat ccttggcgat agcaccacct ctcaccaatg catcccataa 480
ttcgtcatct gtacgctcat taaatggatc taagttcttg cgaatcgtac ccctaaataa 540
tactggatct tgtggaatga tggctaattt tcttcttaaa tcgaaaagtc ccagctgact 600
tatatcaaca ttgtcaatta aaattttacc tgcggtcaat tcattcaacc tgtaaagggc 660
actcataata gtggacttac cagcacctgt acgaccacag ataccaattt tttccccact 720
cttgatattc aagttaagat tttttaaaac tataggtaaa ccaggtctat aggcaaaatc 780
aacattttca aaaattattt cgcccattga gggccatgac tctggaggtg tcatttcggg 840
ctttctatag gatgcctcta gtggtagttc agttgcatat gttaccaatc tttcggcact 900
attcatgtca ttctctgttt gagtcattgc ccttaaaatg gtatttaata gaccaggcaa 960
ttgtaataca taagtcaaca aaacaccaac tgaagccgcg gaaataggaa aggctctcgt 1020
aacacacaat aacgtaataa ttagtgcaaa tgcgatagca accatatcaa ggaaaatacc 1080
tacccatctt tgcaggacaa ctacaaggta tcccgcctca ttcatcttgt tgatcaaaaa 1140
atctgatttc gccaaaaatc gttcctgact tcggtatgct ttgattgtat ccatcccacc 1200
caaaacttca tttaaattat tgtaaacaaa agaccgttgc acagcttcaa gtcttttaat 1260
ttctctacca gaactctgat aatgatcagc aatcagaaca aagatgacca aaagaaacgg 1320
aattgcgata gcaaaccacg gcaagtaaac aatacacatg acgcaaacac ctacaatatt 1380
agcaaattga gatgtcatca accgtaaact ttcggttaac tcattatcta agctatctgt 1440
atcttttgtg aatctgttca gaatacgtcc caaaggtgtg gtatctatgt atgacattgg 1500
agtgtgtaaa attcttttca cagccctcaa atttaaccat ttcgatgcca taatacccat 1560
tgcgcaaagt atggtgaact ggccattcat gaatatgaaa gcagcaaaca caaagaagga 1620
gtaaagaccc atataaaaac tgggtggtct gtttttgaat ttattctcag tccagtaaga 1680
taaccaaacg gaagaaaaaa gtgagcagaa tgtggttcca acgactaaaa ttgcatacaa 1740
cggtagtgcg ataaaacccc acttacctac tgcagcttta atgtattcac ggtatatttt 1800
cagactgata ctattgactg ctctttcttc tttactacta gtatgaccat ccgctacaat 1860
tttaccacta tttgcagttt gtgacatttc tgtagccttt ttcttcagtt cagtcaattc 1920
ctttacctct gattcatatt ttagttgtcc caattcaccg gcaacaaccg cttcctgttc 1980
ttcatcctct ttctccgaat tttgagaaga gaattgtaaa agatttatca aagtttgatt 2040
acgagctttt agctcatcaa cagtaccaat atcgacttgg ccatcagtac ctaaaacgat 2100
gactctagaa gctctctcaa tcagtgacaa ttgatgcgtt gctaaaattc tggttttatt 2160
agcaagcatt ccggttagac attcatccat gatgtgttta ccaacacgag aatcgacagc 2220
acttaggaca tcgtcgaata gataaatatc cttcttctta taaacagacc tggctaaatt 2280
gatacgtgcc ttttgaccac cagataaagt aataccacgt tccccaattt cggtcatatc 2340
gcctgccggt aaaatatcca gatcagcttt caaagagcaa acacgaacta cttcatcata 2400
cttttcttta ttgaatggtg aaccgaatat gatgttatct cttacagatg cattttgaat 2460
ccatggataa ccacacatta ataagtcccc gttgacttca accttaccat cagtttttct 2520
cattgatcct gccatcgcat tcaataatga agatttacca gtaccaatag gtcccgtaat 2580
cataataaat tcgccctttt taatatcgaa gttcaagtcc ttgaaacccc taaacgaagt 2640
tttttctaaa tcttccgggc cgtctctgtc tttcaacata ttgtccaatc ttttcgcctt 2700
attagtactt gcagatggct taccccatgt atccttacgc ttttttttgt tctttttacc 2760
ttcatcttta gcttctcctt ttgcttcttc aatagcgtcg tttaattcat aatcttccca 2820
ctcaaatgag caatgtgtca tttttaaagc caattttgga tcaaagccag gagaaggctt 2880
catttcaatc atctgatttg gatcatcttc tggagcctcc aataagcttt gcaaacggcc 2940
caatccaatg atcatgtcaa ttccagtacc aatagcaata ggtaagaaaa acatttgcaa 3000
actcaagacc tgaaataaag ataaagaggc aaaaatatta ccaggttgcc tgcctccttt 3060
attaactttg tacattgcaa ggaaagtgac caatgaagca atactaggca aagacatggc 3120
catagcaatc aagaaatttc ttgatagttg catttttcta actttagaaa tctctttggt 3180
cctaatatct tgaatatttt tttcatacgc atcctcccac gtataatatt taatcatttt 3240
tatattattc agcacttctc tcatcatggt aactctagca tcagtgaaga tgttcgcagc 3300
aattctaaag cccagaatta acttaaatgc aaataaggat atgaaaaacc caccgaaaaa 3360
aataccaatc ccaactaagg caatgggtcc aaggttaacg atcaataaaa caatgcaaat 3420
agccaaaatt gcagggaacc cagccaaaaa cggctgaaaa gataaggcaa attcaattct 3480
agcgagatct gttgttacaa aagaagtcac tttaccgtta ggaaaacaat gtctcgcata 3540
attagatgca ttaaacattt tcttcatggc agctttagta agaatagact tagcttgcac 3600
accagtcagt tgggatgtat gaaagaaatg gttgaacgtc aacccgttaa cgaacatcat 3660
caaacatgca ccaatagcgt aaccaatacc tttgttaaca tgcatgctat gaaaaatagc 3720
cttttcttcg acaaactcaa ttagcctctt ggtaatcatg gggttaaaac cggatgtaca 3780
attagcgaga attgcaaaca ctatcgacat gaagtactgt ttcttaaaag tgaataataa 3840
agctctcaga actgtatgtt taggtagttt ggcattttcc ataacctctt cttctgtcgc 3900
ttctggatgt cttttacggt attttttcct cgtcttctca aaatagtaaa tcatgttttt 3960
ttcaaagtcg tcataaaggg tctctataga catcctcgga tccattttga agagatcgtt 4020
cggctgtatc gttctcttat aaccaactcg caggatgggt agaacccacc aaaaaaacat 4080
gttagagata atatttgtat ggaacagagg atatatcttc ctctcgtcat cggtttgtgg 4140
tacttctgga attttcttag agtgcaagaa tgaaaacaga cgtttctgag ggaaaatatc 4200
agattctgtc actttttcga tatcatcgct attcaagtag gtttggggct tatttctgtc 4260
cacaatatat tcacctgtag gcagcaaaga tttgtcatcc caagaagacg atgtgtcctt 4320
atcaacatct gtgcttatgt ctgaagaagc agatgccttg ggagatagta ccacgttttg 4380
acttttgttt tccagctccg tctccgaaac tgcatccccc acggtaatcg tcat 4434
<210> 2
<211> 4236
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atgtctcttt ccaaatattt taatccaatt cctgacgctt cagtcacctt tgatggggct 60
accgttcaat tggaagaatc cctcggtgct gttcagaacg atgaagagtc cgcatcggaa 120
ttcaaaaacg taggccattt agaaattagt gatatcactt ttcgtgctaa tgaaggtgaa 180
gtcgtcttag tactgggaaa cccaacatca gcgctcttca aaggtctatt ccatggtcac 240
aagcatctga aatactcgcc tgaagggtct attagattca aagacaatga gtacaaacag 300
tttgcttcca aatgccccca tcagatcatt tataataacg aacaagatat tcacttcccg 360
tatctgacgg tggagcaaac cattgatttt gcgttgagtt gtaagtttca cattcccaag 420
caagagcgta ttgaaatgag agacgagtta ttaaaagagt tcggactgtc gcacgtaaag 480
aagacgtatg tgggtaatga ctacgttcgt ggtgtttctg gaggtgaaag gaaacgtatc 540
tccattatag aaacgtttat tgccaatggg tctgtttact tatgggacaa ctcgacgaag 600
ggtttggact ctgccaccgc cctagaattt ctttccatta cccaaaagat ggcaaaagct 660
acaagatcgg tgaattttgt taaaatttct caagcaagcg acaaaattgt cagcaagttt 720
gacaagattc ttatgttagg tgattccttc caggtgtttt acggaaccat ggaggagtgt 780
ttaacccatt ttcatgacac cttacagata aaaaaaaacc ctaacgattg tattattgaa 840
tatttaacat caatcttaaa ttttaagttc aaggaaacgt ctaattccat tgttggtctt 900
gacactccat ctgttgtttc tgaagaaaat caagctttaa acatcaataa tgaaacagat 960
ttgcatacat tatggattca gtctccatac tataaacact ggaaggccat cacttcaaaa 1020
acagtgcaag aatgcaccag aaaagatgtt aatccggatg atatctcccc catttttagt 1080
attccgctaa agacgcaact gaaaacgtgc actgtaagag ctttcgaaag aatcattggt 1140
gacagaaact acttgatttc tcaatttgtt tctgttgtgg tgcagtcttt ggttattggg 1200
tccctttttt ataacattcc cctgacaaca attggttcgt tttctagagg atctttaact 1260
ttcttttcca tcctattctt tacatttctt tctctcgccg acatgcctgc ttcctttcaa 1320
aggcaacccg tcgttcgtaa acatgtccag ctccattttt attataattg ggtggaaact 1380
ttagcaacaa attttttcga ttgctgctct aaatttatac tggtggttat ttttacaatc 1440
atactttact ttttggccca tttacagtac aatgcagcta ggtttttcat ctttttgctt 1500
ttcctttccg tctataattt ttgcatggtg tcactatttg cattaactgc tttgatcgct 1560
ccaactctat caatggcaaa cctattggcc ggtatcttac tgttagccat tgccatgtac 1620
gcgtcctatg ttatttatat gaaagatatg catccatggt tcatatggat tgcatatttg 1680
aatcctgcta tgtttgccat ggaagccatt ttgagtaacg aattgtttaa cctgaaacta 1740
gactgtcatg aaagtattat tcccagaggt gaatattatg acaatatttc attcagtcat 1800
aaagcttgtg cctggcaagg cgctacccta ggtaacgatt acgtcagagg ccgtgattat 1860
ttaaaaagtg gattgaaata cacttaccat cacgtgtgga gaaatttcgg tattatcatt 1920
gggtttctgt gtttcttcct attttgctct ttactagcag cggaatatat cacgcctctg 1980
tttactagag aaaatttatt gcgctggaat aactatctca aaagatactg tccctttctg 2040
aatagccaaa aaaagaataa taaaagcgct attaccaaca acgatggcgt atgtactccc 2100
aagaccccga tagccaattt ttccacttca tcctcttctg ttccatcagt ctcgcatcaa 2160
tacgatactg attacaatat taaacatcca gatgaaactg ttaacaatca tactaaggaa 2220
tccgtagcta tggaaacgca aaagcacgtc atctcctgga aaaatatcaa ttataccatt 2280
ggagacaaaa aattgatcaa cgacgcttct ggatatataa gttccggatt aactgcccta 2340
atgggtgaat ctggtgctgg taagacaact ttgttgaatg tcttgtctca aaggaccgaa 2400
agcggggttg ttaccggtga attattaatc gatggacagc ccttaacgaa tattgatgca 2460
ttcagaagaa gtatagggtt cgttcaacag caagatgttc atttagagct cttaactgtg 2520
agagagtctt tggaaatttc ctgcgtccta agaggtgatg gggatagaga ctatttagga 2580
gttgttagca acctattaag attgccttcg gaaaaactgg ttgctgattt atctccaact 2640
caaagaaaat tattatctat tggtgttgaa ttggtcacta agccttctct gttgttattc 2700
ctagatgaac ctacttcagg gctagacgcc gaagcagctt taaccatcgt gcaatttctg 2760
aaaaagcttt cgatgcaagg tcaggctatc ttatgtacta ttcatcagcc tagcaaaagt 2820
gtcatcagct attttgataa catctattta ctaaaaagag gtggtgagtg tgtctatttt 2880
ggttcattac ctaatgcctg tgactatttt gtagctcacg atagacgcct aacatttgac 2940
agagaaatgg ataatccggc tgatttcgtt attgacgttg ttggtagcgg aagtacaaat 3000
attccaatgg atgatgcaga gaagccaacc tcaagcaaaa ttgatgagcc agtatcttac 3060
cataagcaat ctgattcaat taactgggca gaactctggc aatcctctcc agaaaaagtg 3120
cgggttgctg atgatttgct tttattagaa gaagaagccc ggaaatctgg tgttgatttc 3180
actacgtccg tatggagtcc gccttcgtat atggaacaaa taaagttaat cacaaagaga 3240
cagtacattt gtaccaagag agacatgacc tatgttttcg ctaaatatgc tttgaatgct 3300
ggcgctggac tattcattgg attttcattt tggaggacaa agcataatat caacggtctg 3360
caagatgcta ttttcttgtg cttcatgatg ctttgtgttt cctccccttt gatcaatcag 3420
gttcaagata aggctttgca atctaaagaa gtatatatcg ccagggaagc gagatctaat 3480
acttatcatt ggaccgttct tttgattgct caaactattg ttgaattacc attagccatt 3540
tccagttcta ccttattttt cctgtgttgc tacttctgtt gcggtttcga aacctctgcc 3600
cgtgtagctg gtgtctttta cttgaattat attttatttt ccatgtatta tttgtcattt 3660
gggttgtggc ttctatattc tgcccccgat ttacaaactg ccgctgtctt tgttgccttc 3720
ctctatagtt tcacagcttc attctgtggc gttatgcaac catactcgtt attcccaaga 3780
ttttggacat tcatgtacag ggtttcacca tacacgtatt tcattgaaac tttcgtaagc 3840
ttacttctcc atgacagaga agtaaactgc tcgacaagtg aaatggtacc aagccaacct 3900
gtaatgggtc aaacctgcgg tcagtttatg aaacccttta ttgatgaatt tggtgggaaa 3960
ctgcacatca ataacacata caccgtctgc gcctactgca tgtacactgt tggggatgac 4020
ttccttgctc aagaaaatat gagttatcat cacagatgga gaaattttgg ttttgaatgg 4080
gttttcgttt gctttaacat tgccgccatg tttgtgggct tctacctaac ctacatcaaa 4140
aaaatttggc cttctgtgat tgatggtata aagaagtgta tcccatcaat gaggcggtcc 4200
aaaacatctc ataatccaaa cgaacaaagc gtataa 4236
<210> 3
<211> 4536
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ttatttcttc gtgattttat tttcgtcacc tggaactgtt tggaaaatgt tggtatcttt 60
ttcatgtctt tcctttcttg gcccattaaa ccatttcttg aaattcaaaa cagacttcaa 120
agaccacacc ttaactctta caacatagta acaaatcaac atagcggcaa tattgaagca 180
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agccacaact tgatcttgaa cagtgtatgg gcaatattga cagttttcgg tggcagttgg 300
atttaccaaa taaccggtat tattgtccat ataggtagat aaaaactcac cacaagtttt 360
tccgcttggt gggtccatga tgttgtattc atgaggatta caaacgacct ttttattgtg 420
aactaatggt gtaaccaaag cttgaaccac gtaggtaaat ggtgatacat tatacatcaa 480
tcttctccag aaggcaggca ttttctctct tggttgtaaa ataccacaga acagtaacat 540
agcagcaaac aaattggaat taatcataga agctgaggga acatcaggag acatgtacag 600
gatccataga ccatatgtga caaaatataa tgggaaaatt aaaacataga agaagaagaa 660
gaaacctgca tgagatgcac gtccactgaa ttgagctggc cagtagtagc aaatgaaaca 720
cataaactga caaagtgtgg accaaaagtt ttcaacagca gcatgacata ataacaagac 780
actccaatgg aaagtgttag aagcggcttc tctaacctca tataattccc tactatcata 840
agcgaagacg tgcagttgat tgatcatagc cagagcaatc aataatagca tgaaaataga 900
cgaaaaggcc tcaatggcac caccaacaga gtgatttaca ccaacatatg ataaaccgac 960
gaacaaagca catgcgacac attcaaagaa tttggccctg atatagacag gcgatctcca 1020
aaattgaaga gctgttctac gtaaaacaca tttgatttga gtcatgtaac tggcagcaaa 1080
tcttgtagct aactcaggat catcattaac tgctctacca ggtaaagtac gatgtaattc 1140
ttcaacttca gcccttgcag cggcacattc tggggaagca agccataagt cgtgccaatc 1200
agagttaaca ctagcagtgg caccggcacc aatacaattc aaaatatatt cagctggatt 1260
ttcagaaaca ccacacttca taccagattg acgttcaaaa tacttcaaca aagtttcaga 1320
atttggacca atgtcaccaa agtaaaccat cttaccacct ttctttaaca acaacaatct 1380
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agaatcagct aaggctctca tgaattgaac aattgaccaa gcagactgag agtccagacc 1500
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agataacttc tttctctgtt caacgttcaa acctctacca gtcttaccaa ctaaggcttc 1620
agcgtaattt tgcataccta gcaatgtgat aattttttca acatattcat atttctcctc 1680
taacggaacg gaactttgct gtcttaactc ggctgcaaat ctcagggatt ccctaacaga 1740
taattcggcc atatgattat cggcttgcgc aacataacca catgatctgt tgaaagaagc 1800
aggcaagggc ttggcattga ctaacatatc accagtgatg acacccatat tgattctttg 1860
tgctaaaaca tttaacaagg tagttttacc agcaccggat tcacccatca aggcggtcat 1920
cttaccaggc ttaacgtaac caaagacatc cgataataat tttcttgtag ctccgtcgta 1980
tggaatggtg tagtccagat ggttccaggt gaaaacgtcc ttttctgcaa tgaccttttc 2040
taaatcgaca tttggaccat tcagagcctc catcatttcc tctctggaag cggttcttgc 2100
atctgcattt tcggtaccta actccggcat atgacctctc ttatataaca gcaagtcacc 2160
tcctccctca acaggtttca aatattctga taagatgaca ttgaacacaa tataaccaaa 2220
agtccacaca atgttcacac cccaatttct ccaagcatgc ttatatgcga aatgatattg 2280
gtgtaagatg taagagtcac cgctaacata caagttaccc ttaaccgcac cagcagcatc 2340
acagacttgg ttagcaatag aaataccttc ataaccagga ccagatggga ctaaggcgct 2400
acacaacatt tccctgtggt gaaattcagt ggaaactaaa ctttcaaaag cataagttaa 2460
aggattaatg aaatgaagcc atctaatcca atgatgcatt tcaccaattg gcaagacaaa 2520
accagcataa acacaaagca tcaggaccca taaaccaccg acggcatggg catccacacc 2580
agatttactc atagtagcaa caaacttgaa aatgaaagaa gtacattgtt gcacagtcag 2640
tagatataaa atatactgga agaaagcacc agcttcatat ttcataaatg gaatccagta 2700
agtaatcaaa catagtatca caatagcgac aaatttagta gggaactcag tgataatctc 2760
ttgtaacgat tccgcagaca aatggtacat ggaatatgat ttgtgtttga caataacagg 2820
tctactagaa aaagagttac caatttcggc caaggaagta acagaagcga acaataaaac 2880
atagaataac ataccaccac gagaataagc acctgccgtg gtggattgac ttttgtcatc 2940
aattttgtgg aacatagaac cgataatcaa agctttgatc aaaaaagaac ttaagtagac 3000
cttagtatac gttgaatcac ccttaaccct ttgaaaacca cgaatcatac aataataaac 3060
ttgtgtccaa taattgacaa catattgaga attttctctt tggccttgtt gcagtctttg 3120
cttcttggcc acatccagtc tatctctcgt ttcattaaca gggtgtctac tttgataatc 3180
atcataagtt cttaaaagtt cctgataatc ctcagagttc aaccagtatt cctcaaactc 3240
tgaactagat tttggaactt tatcttcata gccaggttta atatccaatg tcctattttc 3300
aaaatcgacc gtgacggatg ttaaaaattc cgcagaggtc attctgtttg gtttaaccca 3360
acccattctt tggaaatatc caacagcttt atcagcagga ccgaagtaaa tctgtctacc 3420
gttatataga acagtagttt tatcaaataa ttcataaata ttttcaccag cttggtaaat 3480
agcaacaata gcagagttgt ttaccatatt tgtagccgtt ctaatggctt gggcaaactc 3540
taaagcagta gaggcatcca aacctcttgt ggcgttatcc caagagtaga tggaggcatt 3600
cattgcctga gcttcaacca aggaaacacg cttacgttca ccaccagaaa cacctcttac 3660
gaaatcgtta ccgactttgg tggcatatgt gtgtcttaaa ccaaaaacgg tacaccacat 3720
atctctgatg ttatcaacgt attgctttct cgtcattttg tcaattctaa cacgaggagt 3780
cttacatttt agggcaaaat cgattgtttc cttcacagta atttttggga aatggaaatc 3840
aagctcggga cagtaaataa cgtaaccttt atacttagac atcatttcgc tttggtccag 3900
accatcatag gagaattcac cttgtacatc aactaattct gaagtttcac cagatagaca 3960
ctttaggaaa gtggagcaac ctgcacctgg cctaccgacg acaaataaca tttcaccaga 4020
ttcaacgaca cccgtacaat tttgaataat attccttaat gggacatcag atttcttggt 4080
aaatttactt atgagatgtg ccggtatact agcaatattt ctaaacatct cttcaacact 4140
aggcccatat gcagcagagg catcaacacc gactgctgtt aggtttttaa aggcaatacc 4200
agaatcacca ggttcaattc cctgttccaa ttgacgagac ctcaaataat gtaatagtga 4260
gcgcaaatca aaatctaagt cattaatttc aaaagagtcc atttccttct ttgtcttatg 4320
tgaaatgact ctcgccatag actccaacct ttcaatacct tcttcattgg aaagaatgtt 4380
tgaaaggtga cgggatagct gagaagtggc tgccaaatcc tcattatcaa cttggccttc 4440
ggaggcagcg taggattgta ccgaattagc ataatcatcg tcatggttcg atctcgacga 4500
aatgtctttc tcaatatgtt cgtcagtcga agacat 4536
<210> 4
<211> 1104
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atgcataagt ttactggtgt taacgcaaag ttccaacaac cagctttgag aaatttgtct 60
ccagttgttg ttgaaagaga aagagaagaa ttcgttggtt tctttccaca aatcgttaga 120
gatttgactg aagatggtat tggtcatcca gaagttggtg acgcagttgc tagattgaag 180
gaagttttgc aatacaatgc accaggtggt aaatgtaata gaggtttgac agttgttgct 240
gcatacagag aattatctgg tccaggtcaa aaagatgcag aatcattgag atgtgcatta 300
gctgttggtt ggtgtatcga attgttccaa gctgcatttt tagttgctga tgatatcatg 360
gatcaatctt tgacaagaag aggtcaatta tgttggtata agaaagaagg tgttggtttg 420
gatgctatta atgattcatt tttgttggaa tcttcagttt atagagtttt gaagaaatac 480
tgtagacaaa gaccatacta cgttcatttg ttggaattgt ttttacaaac tgcataccaa 540
acagaattgg gtcaaatgtt ggatttgatt actgctccag tttcaaaggt tgatttgtct 600
catttctcag aagaaagata caaggcaatc gttaagtaca agacagcttt ttattctttt 660
tacttaccag ttgctgcagc tatgtacatg gttggtatcg attcaaagga agaacatgaa 720
aacgcaaagg ctatcttgtt ggaaatgggt gaatacttcc aaatccaaga tgattacttg 780
gattgttttg gtgacccagc tttaactggt aaagttggta cagatatcca agataataag 840
tgttcttggt tggttgttca atgtttacaa agagttactc cagaacaaag acaattgttg 900
gaagataact acggtagaaa ggaaccagaa aaggttgcaa aggttaagga attgtacgaa 960
gctgttggta tgagagcagc tttccaacaa tacgaagaat cttcatacag aagattgcaa 1020
gaattgatcg aaaagcattc aaacagatta ccaaaggaaa ttttcttggg tttggctcaa 1080
aagatatata agagacaaaa ataa 1104
<210> 5
<211> 2859
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atgccaggta aaatcgaaaa cggtactcca aaggatttga agactggtaa cgatttcgtt 60
tcagctgcaa agtctttgtt ggatagagct tttaaatcac atcattctta ctacggtttg 120
tgttcaactt cttgtcaagt ttacgataca gcttgggttg caatgatccc aaagacaaga 180
gataacgtta agcaatggtt gttcccagaa tgtttccatt atttgttgaa gactcaagct 240
gcagatggtt catggggttc tttaccaact acacaaactg ctggtatttt ggatacagct 300
tctgcagttt tagctttgtt atgtcatgca caagaaccat tgcaaatttt agatgtttca 360
ccagatgaaa tgggtttgag aattgaacat ggtgttacat ctttgaagag acaattggca 420
gtttggaacg atgttgaaga tactaaccat atcggtgttg aattcattat cccagctttg 480
ttgtctatgt tggaaaagga attggatgtt ccatcattcg aattcccatg tagatctatc 540
ttggaaagaa tgcatggtga aaagttgggt catttcgatt tggaacaagt ttacggtaaa 600
ccatcttcat tgttgcattc attggaagca tttttgggta aattggattt cgatagattg 660
tctcatcatt tgtatcatgg ttcaatgatg gcttctccat cttcaacagc tgcatacttg 720
attggtgcta ctaaatggga tgatgaagca gaagattatt tgagacatgt tatgagaaat 780
ggtgcaggtc atggtaatgg tggtatttca ggtacatttc caactacaca tttcgaatgt 840
tcttggatca tcgctacttt gttgaaggtt ggttttacat tgaagcaaat cgatggtgac 900
ggtttgagag gtttgtctac tatcttgttg gaagcattga gagatgaaaa cggtgttatt 960
ggttttgctc caagaactgc agatgttgat gatacagcta aggcattgtt ggctttgtca 1020
ttggttaatc aaccagtttc tccagatatc atgatcaagg ttttcgaggg taaagatcat 1080
ttcactacat tcggttcaga aagagatcca tcattgacat ctaatttgca tgttttgttg 1140
tctttgttga agcaatcaaa tttgtctcaa taccatccac aaatcttgaa gacaacattg 1200
tttacttgta gatggtggtg gggttcagat cattgtgtta aggataagtg gaatttgtct 1260
catttgtacc caacaatgtt gttagttgaa gcttttactg aagttttgca tttgattgat 1320
ggtggtgaat tgtcttcatt gttcgatgaa tcttttaaat gcaagattgg tttatctatc 1380
ttccaagcag ttttgagaat catcttaaca caagataatg atggttcttg gagaggttac 1440
agagaacaaa cttgttacgc tatcttggca ttagttcaag ctagacatgt ttgtttcttt 1500
acacatatgg ttgatagatt gcaatcatgt gttgatagag gtttttcttg gttgaagtca 1560
tgttctttcc attcacaaga tttgacttgg acatctaaaa ctgcttatga agttggtttt 1620
gttgctgaag catacaaatt ggctgcatta caatcagcat ctttagaagt tccagctgca 1680
actattggtc attcagttac atctgctgtt ccatcttcag atttggaaaa gtacatgaga 1740
ttagttagaa agacagcatt gttttcacca ttagatgaat ggggtttgat ggcttctatc 1800
atcgaatctt ctttctttgt tccattgtta caagcacaaa gagttgaaat ctatccaaga 1860
gataacatca aggttgatga ggataagtac ttatctatta ttccttttac ttgggttggt 1920
tgtaacaaca gatcaagaac tttcgcttct aacagatggt tgtacgatat gatgtactta 1980
tcattgttgg gttaccaaac tgatgaatac atggaagctg ttgcaggtcc agtttttggt 2040
gacgtttctt tgttacatca aacaatcgat aaagttattg ataacactat gggtaatttg 2100
gctagagcaa atggtacagt tcattctggt aatggtcatc aacatgaatc tccaaatatt 2160
ggtcaagttg aagatacttt gacaagattc actaactctg ttttgaacca taaggatgtt 2220
ttgaactctt catcttcaga tcaagatact ttgagaagag aattcagaac ttttatgcat 2280
gctcatatca ctcaaatcga agataactca agattttcta aacaagcttc ttcagatgca 2340
ttttcttcac cagaacaatc ttacttccaa tgggttaact caactggtgg ttctcatgtt 2400
gcttgtgcat actcattcgc tttttctaac tgtttgatgt cagcaaattt gttgcagggt 2460
aaagatgctt tcccatctgg tacacaaaag tacttaatct cttcagttat gagacatgct 2520
actaacatgt gtagaatgta caacgatttc ggttcaatcg ctagagataa tgcagaaaga 2580
aacgttaact ctatccattt cccagaattc actttgtgta atggtacatc tcaaaatttg 2640
gatgaaagaa aggaaagatt gttgaagatc gctacatatg aacaaggtta cttggataga 2700
gctttggaag cattagaaag acaatcaaga gatgatgctg gtgacagagc aggttctaaa 2760
gatatgagaa aattgaaaat tgttaaatta ttttgtgatg ttactgattt gtatgatcaa 2820
ttatacgtta ttaaagattt gtcttcatct atgaaataa 2859
<210> 6
<211> 1404
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
ttgccaagag ttccagaagt tccaggtgtt ccattgttgg gtaatttgtt gcaattgaag 60
gaaaagaaac catatatgac ttttacaaga tgggctgcaa cttacggtcc aatctattct 120
attaaaactg gtgctacatc aatggttgtt gtttcttcaa acgaaatcgc taaggaagca 180
ttggttacta gattccaatc tatctcaaca agaaatttgt ctaaggcttt gaaggttttg 240
actgcagata agacaatggt tgctatgtca gattacgatg attaccataa gactgttaag 300
agacatatct tgacagcagt tttaggtcca aacgctcaaa agaaacatag aatccataga 360
gatatcatga tggataatat ttctacacaa ttgcatgaat tcgttaaaaa taatccagaa 420
caagaagaag ttgatttgag aaagatcttc caatctgaat tgtttggttt agctatgaga 480
caagcattgg gtaaagatgt tgaatcattg tacgttgaag atttgaagat cactatgaac 540
agagatgaaa tcttccaagt tttggttgtt gatccaatga tgggtgcaat tgatgttgat 600
tggagagatt tctttccata tttgaagtgg gttccaaata agaaattcga aaacacaatc 660
caacaaatgt acattagaag agaagcagtt atgaagtctt tgattaaaga acataagaaa 720
agaattgctt ctggtgaaaa gttgaactca tacatcgatt acttgttgtc tgaagctcaa 780
actttgacag atcaacaatt gttgatgtca ttgtgggaac caatcatcga atcttcagat 840
actacaatgg ttactacaga atgggctatg tacgaattgg ctaaaaatcc aaagttgcaa 900
gatagattgt acagagatat caagtctgtt tgtggttcag aaaagattac tgaagaacat 960
ttgtctcaat tgccatacat cactgctatc ttccatgaaa cattgagaag acattcacca 1020
gttccaatta ttccattgag acatgttcat gaagatactg ttttaggtgg ttatcatgtt 1080
ccagctggta cagaattggc agttaacatc tatggttgta acatggataa gaacgtttgg 1140
gaaaacccag aagaatggaa cccagaaaga ttcatgaagg aaaacgaaac tatcgatttc 1200
caaaagacta tggcatttgg tggtggtaaa agagtttgtg ctggttcttt acaagctttg 1260
ttaactgcat caattggtat tggtagaatg gttcaagaat tcgaatggaa gttgaaggat 1320
atgactcaag aagaagttaa cacaatcggt ttaactacac aaatgttaag accattgaga 1380
gctattatta agccaagaat ttga 1404
<210> 7
<211> 1578
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
atggaatctt tggttgttca tactgttaac gctatctggt gtatcgttat cgttggtatt 60
ttctctgttg gttatcatgt ttacggtaga gcagttgttg aacaatggag aatgagaaga 120
tctttgaagt tgcaaggtgt taagggtcca ccaccatcta ttttcaatgg taacgtttca 180
gaaatgcaaa gaatccaatc agaagctaag cattgttctg gtgacaacat catctcacat 240
gattactctt catctttgtt cccacatttt gatcattgga gaaaacaata cggtagaatc 300
tatacttact caacaggttt gaagcaacat ttgtacatca atcatccaga aatggttaag 360
gaattgtctc aaactaacac attgaatttg ggtagaatca ctcatatcac aaagagattg 420
aatccaattt tgggtaatgg tattattact tcaaatggtc cacattgggc tcatcaaaga 480
agaatcatcg catacgaatt cactcatgat aagattaaag gcatggttgg tttgatggtt 540
gaatctgcta tgccaatgtt gaataagtgg gaagaaatgg ttaagagagg tggtgaaatg 600
ggttgtgata tcagagttga tgaagatttg aaggatgttt ctgcagatgt tattgctaag 660
gcatgtttcg gttcatcttt ttctaagggt aaagctattt tctctatgat cagagatttg 720
ttaactgcaa tcacaaagag atctgttttg tttagattca atggttttac tgatatggtt 780
ttcggttcta agaaacatgg tgacgttgat atcgatgctt tggaaatgga attggaatca 840
tctatctggg aaactgttaa ggaaagagaa atcgagtgta aggatacaca taagaaagat 900
ttgatgcaat tgatcttgga aggtgctatg agatcttgtg atggtaattt gtgggataaa 960
tcagcataca gaagattcgt tgttgataac tgtaaatcta tctattttgc tggtcatgat 1020
tcaacagcag tttcagtttc ttggtgtttg atgttgttag ctttgaaccc atcatggcaa 1080
gttaagatca gagatgaaat cttgtcatct tgtaaaaatg gtattccaga tgcagaatct 1140
atcccaaatt tgaagactgt tacaatggtt attcaagaaa ctatgagatt gtacccacca 1200
gctccaattg ttggtagaga agcatctaaa gatattagat tgggtgactt ggttgttcca 1260
aaaggtgttt gtatttggac attgattcca gctttacata gagatccaga aatttggggt 1320
ccagatgcaa acgatttcaa gccagaaaga ttttcagaag gtatctctaa ggcttgtaag 1380
tacccacaat cttacatccc atttggtttg ggtccaagaa catgtgttgg taaaaatttc 1440
ggtatgatgg aagttaaggt tttggtttct ttgatcgttt caaaattttc ttttacttta 1500
tcaccaacat accaacattc accatctcat aagttgttag ttgaaccaca acatggtgtt 1560
gttattagag ttgtttaa 1578
<210> 8
<211> 1383
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
atggctgaac aacaaaaaat taagaaatct ccacatgttt tgttgattcc atttccatta 60
caaggtcata ttaatccttt tattcaattt ggtaaaagat tgatttctaa aggtgttaaa 120
actactttag ttactacaat tcatacactt aatagtactt taaatcattc taatacaaca 180
actactagta ttgaaattca agctatttct gatggttgtg atgaaggtgg ttttatgtct 240
gcaggtgaat catacttaga aacttttaaa caagtaggtt ctaaatcatt agctgatttg 300
attaagaaat tgcaatctga aggtactaca attgatgcaa ttatatatga ttctatgact 360
gaatgggttt tagatgttgc tattgaattt ggtattgatg gtggttcttt ctttacacaa 420
gcatgtgttg ttaattcttt atattaccat gttcataaag gtttaatttc attgccttta 480
ggtgaaactg tttctgttcc aggttttcca gttttacaaa gatgggaaac tccattaatt 540
ttgcaaaatc atgaacaaat tcaatctcca tggtcacaaa tgttgttcgg tcaatttgct 600
aatattgatc aagctagatg ggtttttact aattcttttt ataaattaga agaagaagtt 660
attgaatgga ctagaaagat ttggaatctt aaagttattg gtccaacttt accttctatg 720
tacttggata aaagattaga tgatgataaa gataatggtt ttaacttata taaggctaat 780
catcatgaat gtatgaattg gttagatgat aaaccaaaag aatctgttgt ttatgttgca 840
tttggttctt tagtcaaaca tggtcctgaa caagttgaag aaataactag agctttgatt 900
gattctgatg ttaacttttt atgggttatt aagcataaag aagaaggtaa attgcctgaa 960
aacttatctg aagttattaa gactggtaaa ggtttgatag tcgcttggtg taaacaatta 1020
gatgttttag ctcatgaatc tgtcggttgt tttgttactc attgtggttt caattctaca 1080
ttagaagcta ttagtttagg tgttccagta gttgctatgc cacaattttc tgatcaaact 1140
actaatgcta aattattaga tgaaatttta ggtgtcggtg ttagagttaa agctgatgaa 1200
aatggtattg ttagaagagg taatttggca agttgtatca aaatgattat ggaagaagaa 1260
agaggtgtta ttattagaaa aaatgctgtt aaatggaaag atttggctaa agttgcagtt 1320
catgaaggtg gtagttcaga taatgatata gttgaatttg tttcagaatt gataaaagct 1380
taa 1383
<210> 9
<211> 1476
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
ttaatttcta gctaaaactg taatttcttt aaccatttta tcaatattta aagaagaaga 60
accattaggt gcaatagcta ttctagcttt ttctttccaa tctttagcct tatttctcat 120
tttatgacca ccttcaccca ttaattcttg aaccaatctt ttaacttcat ctctcttaac 180
tttagtaccc atttctaaac caacttccca ttccttacaa atatatctac aattagtcaa 240
ttgatcccaa gaataaggcc aacaaatcat tggaacacct gcacttaaag attcaattgt 300
agaaccccaa ccacaatgag tcaagaaacc accaactgat ggatgtttca agactttttc 360
ttgtgaacac caagatgcaa taaaaccacg ttttttgata tgttcttcta attcaggagg 420
caaaacagca ttttcaccaa taaccaaatt agatctaata atccataaga aataatgatt 480
agaattagcc aatccccaac caaattcagt catatcttct aaagacataa cagttgtaga 540
accaaaatta acataaacaa ctgagttagg ttctttagat tgcaaccatt ggaaacattc 600
tggttcttct ttaactaatg aataaccatg taatgatgta ataccagttt gtttcttttc 660
ttcaggtatt tgatctaaca acaattgtaa tggaccaata gtatagatat gattatatct 720
caaacttaaa gtttttataa tagaaggttc taattcgtca aaagtatgaa aaatatgatg 780
agaaacttta tgagatcttt gtggagcttc tgtagtaaac attaaaactt tatcattcaa 840
atcagttgac caatctagtg gaaaatcttt caatctaata ccttccatac ctggaaccca 900
atcaattact gtatctaagt aaccattagt caaataacta gcatctttca atggtgcaaa 960
acctttttca attaaactat gaatatgata aaaacccata aaaccacatg cggccaatgt 1020
ccaatacatc ataacaggaa tacctaattt tttagcagca tcaatagtaa aaactgacaa 1080
aaatccatca ctaataatac atgtaggtgg atctggtaat ttagtaacca aatcaataaa 1140
cctatctaag aaattagttt caatagatct taacaaagat tctctaattg gaatagaagc 1200
ttcaggagaa tgagaaacac catcaggaat tgtttcaaat ctaaaacctg gagcaccatc 1260
tagacaatgt ggacctgagg attctaaaaa ttgattatgt ataaaatcag tattaacaaa 1320
agtaatttgt aaacctttat gatgcaataa ttgagccaat ttcaacattg cttttatatg 1380
agattgagct ggaaaaggaa taaaaattac atgtggtttc ttttcagtag ttgccatagc 1440
atccatacgg atccgcgcaa ttaaccctca ctaaag 1476
<210> 10
<211> 668
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ttatattgaa ttttcaaaaa ttcttacttt ttttttggat ggacgcaaag aagtttaata 60
atcatattac atggcattac caccatatac atatccatat ctaatcttac ttatatgttg 120
tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac cttctctttg gaactttcag 180
taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat tagaagccgc cgagcgggcg 240
acagccctcc gacggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt cttcaccggt cgcgttcctg 300
aaacgcagat gtgcctcgcg ccgcactgct ccgaacaata aagattctac aatactagct 360
tttatggtta tgaagaggaa aaattggcag taacctggcc ccacaaacct tcaaattaac 420
gaatcaaatt aacaaccata ggatgataat gcgattagtt ttttagcctt atttctgggg 480
taattaatca gcgaagcgat gatttttgat ctattaacag atatataaat ggaaaagctg 540
cataaccact ttaactaata ctttcaacat tttcagtttg tattacttct tattcaaatg 600
tcataaaagt atcaacaaaa aattgttaat atacctctat actttaacgt caaggagaaa 660
aaactata 668
<210> 11
<211> 942
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
ttatagcatt ctatgaattt gcctgtcatt ttccacttca gaaaggtcat ctaattgctc 60
ccaccagttg aataagtaat tctcgcaaat aatcttaaac caaggcgtaa acttgtaact 120
tgggtcagca aacatagttt tcaaatcatt tggtgaaacc catttgaagt ctctaacttc 180
attgacgttt gggttgacag tcaagttttc tttagcgttg atcttataaa ataggatgta 240
atcaatttca tgttcacccc atggttcatt gcttggtgcc atgtaatgga ttctgtttaa 300
aaagtgaaac ttaccccttg tcttagtttc atcttctgga atacctaatt catgatctag 360
ttttctcacc gccgcagtaa tagcgccctt aatcttatcg tctagcttac ccttcaaacc 420
taattcgtca tcaatacata gtggatgaga gcagcatgtg ttagtccaaa gatcagggaa 480
agttattttt tcagtggctc tttgttgtaa aagtaattca ccttgttcat tgaaaataaa 540
gacggagaat gcacgatgta gtaaaccctt ttcaatattt tccattaaat gacaaacttt 600
cttggtaccg gcaccaatag cattatcgtc ccaatccaaa acaatacaat tttcattcat 660
taacttaatt tgctcctcat catgaccaga aaaacatgtt tctccgcttt cgtcatttga 720
cgtctcacta gatcgggtat taggtctttg ttgtaatgga ataatttcag gaaactcttc 780
caaaatgtct tcaggtgttt ggttttgcac taatttggcg taactagata ctgcaccatg 840
gggcatacta ttgttgtcgg cagtctgaag cagatatcta gagctacaca aagttcttgt 900
ggctggcttg aaaaatctta tagattgacg tagtgaaagc at 942
<210> 12
<211> 3165
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
atgccgccgc tattcaaggg actgaaacag atggcaaagc caattgccta tgtttcaaga 60
ttttcggcga aacgaccaat tcatataata cttttttctc taatcatatc cgcattcgct 120
tatctatccg tcattcagta ttacttcaat ggttggcaac tagattcaaa tagtgttttt 180
gaaactgctc caaataaaga ctccaacact ctatttcaag aatgttccca ttactacaga 240
gattcctctc tagatggttg ggtatcaatc accgcgcatg aagctagtga gttaccagcc 300
ccacaccatt actatctatt aaacctgaac ttcaatagtc ctaatgaaac tgactccatt 360
ccagaactag ctaacacggt ttttgagaaa gataatacaa aatatattct gcaagaagat 420
ctcagtgttt ccaaagaaat ttcttctact gatggaacga aatggaggtt aagaagtgac 480
agaaaaagtc ttttcgacgt aaagacgtta gcatattctc tctacgatgt attttcagaa 540
aatgtaaccc aagcagaccc gtttgacgtc cttattatgg ttactgccta cctaatgatg 600
ttctacacca tattcggcct cttcaatgac atgaggaaga ccgggtcaaa tttttggttg 660
agcgcctcta cagtggtcaa ttctgcatca tcacttttct tagcattgta tgtcacccaa 720
tgtattctag gcaaagaagt ttccgcatta actctttttg aaggtttgcc tttcattgta 780
gttgttgttg gtttcaagca caaaatcaag attgcccagt atgccctgga gaaatttgaa 840
agagtcggtt tatctaaaag gattactacc gatgaaatcg tttttgaatc cgtgagcgaa 900
gagggtggtc gtttgattca agaccatttg ctttgtattt ttgcctttat cggatgctct 960
atgtatgctc accaattgaa gactttgaca aacttctgca tattatcagc atttatccta 1020
atttttgaat tgattttaac tcctacattt tattctgcta tcttagcgct tagactggaa 1080
atgaatgtta tccacagatc tactattatc aagcaaacat tagaagaaga cggtgttgtt 1140
ccatctacag caagaatcat ttctaaagca gaaaagaaat ccgtatcttc tttcttaaat 1200
ctcagtgtgg ttgtcattat catgaaactc tctgtcatac tgttgtttgt cttcatcaac 1260
ttttataact ttggtgcaaa ttgggtcaat gatgccttca attcattgta cttcgataag 1320
gaacgtgttt ctctaccaga ttttattacc tcgaatgcct ctgaaaactt taaagagcaa 1380
gctattgtta gtgtcacccc attattatat tacaaaccca ttaagtccta ccaacgcatt 1440
gaggatatgg ttcttctatt gcttcgtaat gtcagtgttg ccattcgtga taggttcgtc 1500
agtaaattag ttctttccgc cttagtatgc agtgctgtca tcaatgtgta tttattgaat 1560
gctgctagaa ttcataccag ttatactgca gaccaattgg tgaaaactga agtcaccaag 1620
aagtctttta ctgctcctgt acaaaaggct tctacaccag ttttaaccaa taaaacagtc 1680
atttctggat cgaaagtcaa aagtttatca tctgcgcaat cgagctcatc aggaccttca 1740
tcatctagtg aggaagatga ttcccgcgat attgaaagct tggataagaa aatacgtcct 1800
ttagaagaat tagaagcatt attaagtagt ggaaatacaa aacaattgaa gaacaaagag 1860
gtcgctgcct tggttattca cggtaagtta cctttgtacg ctttggagaa aaaattaggt 1920
gatactacga gagcggttgc ggtacgtagg aaggctcttt caattttggc agaagctcct 1980
gtattagcat ctgatcgttt accatataaa aattatgact acgaccgcgt atttggcgct 2040
tgttgtgaaa atgttatagg ttacatgcct ttgcccgttg gtgttatagg ccccttggtt 2100
atcgatggta catcttatca tataccaatg gcaactacag agggttgttt ggtagcttct 2160
gccatgcgtg gctgtaaggc aatcaatgct ggcggtggtg caacaactgt tttaactaag 2220
gatggtatga caagaggccc agtagtccgt ttcccaactt tgaaaagatc tggtgcctgt 2280
aagatatggt tagactcaga agagggacaa aacgcaatta aaaaagcttt taactctaca 2340
tcaagatttg cacgtctgca acatattcaa acttgtctag caggagattt actcttcatg 2400
agatttagaa caactactgg tgacgcaatg ggtatgaata tgatttctaa aggtgtcgaa 2460
tactcattaa agcaaatggt agaagagtat ggctgggaag atatggaggt tgtctccgtt 2520
tctggtaact actgtaccga caaaaaacca gctgccatca actggatcga aggtcgtggt 2580
aagagtgtcg tcgcagaagc tactattcct ggtgatgttg tcagaaaagt gttaaaaagt 2640
gatgtttccg cattggttga gttgaacatt gctaagaatt tggttggatc tgcaatggct 2700
gggtctgttg gtggatttaa cgcacatgca gctaatttag tgacagctgt tttcttggca 2760
ttaggacaag atcctgcaca aaatgttgaa agttccaact gtataacatt gatgaaagaa 2820
gtggacggtg atttgagaat ttccgtatcc atgccatcca tcgaagtagg taccatcggt 2880
ggtggtactg ttctagaacc acaaggtgcc atgttggact tattaggtgt aagaggcccg 2940
catgctaccg ctcctggtac caacgcacgt caattagcaa gaatagttgc ctgtgccgtc 3000
ttggcaggtg aattatcctt atgtgctgcc ctagcagccg gccatttggt tcaaagtcat 3060
atgacccaca acaggaaacc tgctgaacca acaaaaccta acaatttgga cgccactgat 3120
ataaatcgtt tgaaagatgg gtccgtcacc tgcattaaat cctaa 3165
<210> 13
<211> 1575
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
gaccaattgg tgaaaactga agtcaccaag aagtctttta ctgctcctgt acaaaaggct 60
tctacaccag ttttaaccaa taaaacagtc atttctggat cgaaagtcaa aagtttatca 120
tctgcgcaat cgagctcatc aggaccttca tcatctagtg aggaagatga ttcccgcgat 180
attgaaagct tggataagaa aatacgtcct ttagaagaat tagaagcatt attaagtagt 240
ggaaatacaa aacaattgaa gaacaaagag gtcgctgcct tggttattca cggtaagtta 300
cctttgtacg ctttggagaa aaaattaggt gatactacga gagcggttgc ggtacgtagg 360
aaggctcttt caattttggc agaagctcct gtattagcat ctgatcgttt accatataaa 420
aattatgact acgaccgcgt atttggcgct tgttgtgaaa atgttatagg ttacatgcct 480
ttgcccgttg gtgttatagg ccccttggtt atcgatggta catcttatca tataccaatg 540
gcaactacag agggttgttt ggtagcttct gccatgcgtg gctgtaaggc aatcaatgct 600
ggcggtggtg caacaactgt tttaactaag gatggtatga caagaggccc agtagtccgt 660
ttcccaactt tgaaaagatc tggtgcctgt aagatatggt tagactcaga agagggacaa 720
aacgcaatta aaaaagcttt taactctaca tcaagatttg cacgtctgca acatattcaa 780
acttgtctag caggagattt actcttcatg agatttagaa caactactgg tgacgcaatg 840
ggtatgaata tgatttctaa aggtgtcgaa tactcattaa agcaaatggt agaagagtat 900
ggctgggaag atatggaggt tgtctccgtt tctggtaact actgtaccga caaaaaacca 960
gctgccatca actggatcga aggtcgtggt aagagtgtcg tcgcagaagc tactattcct 1020
ggtgatgttg tcagaaaagt gttaaaaagt gatgtttccg cattggttga gttgaacatt 1080
gctaagaatt tggttggatc tgcaatggct gggtctgttg gtggatttaa cgcacatgca 1140
gctaatttag tgacagctgt tttcttggca ttaggacaag atcctgcaca aaatgttgaa 1200
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<210> 14
<211> 915
<212> DNA
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<400> 14
tcaggaatca tccagtatgt gctgtagtgc ttcatttgcg cttctaatgg acttgatatc 60
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gtttgtgggt aactcccctg tgttactgtg tggatgtgtt tcaggatatc tttgatttaa 420
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aaacgtgttt tcatgtatgt gcgcagacat ttggtcgtcg aagttactgc tgagcatttg 840
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<210> 15
<211> 750
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
tgttttatat ttgttgtaaa aagtagataa ttacttcctt gatgatctgt aaaaaagaga 60
aaaagaaagc atctaagaac ttgaaaaact acgaattaga aaagaccaaa tatgtatttc 120
ttgcattgac caatttatgc aagtttatat atatgtaaat gtaagtttca cgaggttcta 180
ctaaactaaa ccaccccctt ggttagaaga aaagagtgtg tgagaacagg ctgttgttgt 240
cacacgattc ggacaattct gtttgaaaga gagagagtaa cagtacgatc gaacgaactt 300
tgctctggag atcacagtgg gcatcatagc atgtggtact aaaccctttc ccgccattcc 360
agaaccttcg attgcttgtt acaaaacctg tgagccgtcg ctaggacctt gttgtgtgac 420
gaaattggaa gctgcaatca ataggaagac aggaagtcga gcgtgtctgg gttttttcag 480
ttttgttctt tttgcaaaca aatcacgagc gacggtaatt tctttctcga taagaggcca 540
cgtgctttat gagggtaaca tcaattcaag aaggagggaa acacttcctt tttctggccc 600
tgataatagt atgagggtga agccaaaata aaggattcgc gcccaaatcg gcatctttaa 660
atgcaggtat gcgatagttc ctcactcttt ccttactcac gagtaattct tgcaaatgcc 720
tattatgcag atgttataat atctgtgcgt 750

Claims (9)

1.一种生产甜茶苷的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母表达甜茶苷合成基因，强化异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi和羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的表达，并过表达内质网大小调节因子相关基因INO2；
所述甜茶苷合成基因为法呢基焦磷酸合酶基因fpps、贝壳杉烯合酶基因ks、贝壳杉烯酸氧化酶基因ko、甜菊醇合酶基因kah、UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1和UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2；
所述法呢基焦磷酸合酶基因fpps的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，贝壳杉烯合酶基因ks的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，贝壳杉烯酸氧化酶基因ko的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，甜菊醇合酶基因kah的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，UDP葡萄糖基转移酶基因ugt74g1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，UDP葡萄糖基转移酶基因ugt85c2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，内质网大小调节因子相关基因INO2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母过表达ABC外排泵，所述ABC外排泵选自YOR1、PDR11和PDR12中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母，其特征在于：YOR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，PDR11的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，PDR12的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：所述酿酒酵母通过双向启动子Pgal1/10调控甜茶苷合成基因的表达。
5.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：以酿酒酵母S. cerevisiae CEN PK2-1C为出发菌株。
6.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于：强化异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi表达的方法为增加异戊烯基双磷酸盐-异构酶基因idi的拷贝数；强化羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1表达的方法为切除羟基甲基戊二酰-CoA还原酶基因hmg1的N端内质网定位信号肽获得thmg1，增加thmg1的拷贝数。
7.根据权利要求6所述的酿酒酵母，其特征在于：所述thmg1的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。
8.一种生产甜茶苷的方法，其特征在于：以葡萄糖为底物，采用权利要求1-7任一项所述的酿酒酵母发酵生产甜茶苷。
9.权利要求1-7任一项所述的酿酒酵母在制备甜茶苷或含有甜茶苷的产品中的应用。
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