CN107614677A - 用于使用多阶段进料生产甜菊醇糖苷的发酵方法 - Google Patents

Abstract

公开了用于使用工程化酵母生产甜菊醇糖苷诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的方法。所述方法包括至少两个阶段：第一阶段和第二阶段，其中含有葡萄糖的进料组合物在每个阶段中以不同的进料模式，诸如可变进料和随后恒定进料，提供到所述培养基。所述两阶段进料可使得生长速率在所述第二阶段中比在所述第一阶段中慢，并且因此增加甜菊醇糖苷的生产速率、减少发酵时间并降低生物质浓度。

Description

用于使用多阶段进料生产甜菊醇糖苷的发酵方法

对序列表的引用：

本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，所述序列以2016年5月27日创建并且大小为92千字节的标题为“CAR0212WO_Sequence_Listing.txt”的ASCII文本文件的形式与本文同时提交。根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，序列表据此以引用的方式整体并入。

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年5月29日提交的美国临时申请号62/168,372的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及用于生产甜菊醇糖苷的发酵方法、发酵组合物和通过发酵产生的甜菊醇糖苷组合物。

发明背景

利用糖(诸如蔗糖、果糖和葡萄糖)为饮料、食物、药物和口腔卫生/美容产品提供令人愉悦的味道。特别是蔗糖，它赋予了消费者偏爱的味道。虽然蔗糖提供优异的甜味特征，但它有热量。已引入了无热量或较低热量的甜味剂来满足消费者需求，并且期望这些类型的甜味剂具有良好的味道特征。

甜叶菊是向日葵家族(菊科)中约240种草本和灌木的属，原产于北美洲西部到南美洲的亚热带和热带地区。物种甜叶菊(Stevia rebaudiana)通常称为甜叶、甜味叶、糖叶或简称甜菊，被广泛种植以获得其甜味的叶子。基于甜叶菊的甜味剂可通过从所述叶子中提取一种或多种甜味化合物来获得。这些化合物中有许多是甜菊醇糖苷，它们是二萜化合物甜菊醇的糖苷。这些二萜糖苷比糖甜约150至450倍。甜菊醇糖苷彼此之间的不同之处在于甜味能力以及促成诸如苦味、残留余味等味道品质的其他感官特点。参见Kinghorn，A.D.，Stevia：The genus Stevia，Taylor&Francis，London(2002)。

甜菊醇糖苷的实例在WO 2013/096420(参见例如图1中的列表)；以及Ohta等人，“Characterization of Novel Steviol Glycosides from Leaves of Steviarebaudiana Morita,”J.Appl.Glycosi.，57，199-209(2010)(参见例如第204页的表4)中有所描述。在结构上，二萜糖苷特征在于单一核心结构甜菊醇，并且不同之处在于在位置C13和C19处存在碳水化合物残基，如图2a-2k所示。还可参见PCT专利公布WO20013/096420。

通常，以干重计，甜叶菊叶中存在的四种主要甜菊醇糖苷是杜尔可苷A(0.3％)、莱苞迪苷C(0.6-1.0％)、莱苞迪苷A(3.8％)和甜菊苷(9.1％)。甜叶菊提取物中鉴定的其他糖苷包括莱苞迪苷B、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、甜菊双糖苷以及甜茶苷中的一种或多种。

虽然主要的甜菊醇糖苷Reb A通常用作饮料应用中的甜味剂，但它具有异味问题。最近，人们一直关注具有更好味道特性的某些次要的甜菊醇糖苷。例如，莱苞迪苷M具有较高的甜味强度，并且比其他甜菊醇糖苷更强效(例如，参见Prakash，I.等人(2013)Nat.Prod.Commun.，8：1523–1526和WO 2013/096420)。莱苞迪苷D尝起来比蔗糖甜约200-220倍，并且在感官评价中，其具有缓慢的甜味起效并且非常干净，即总体上比蔗糖甜，与蔗糖相比，残留的甜味余味少(例如，参见Prakash，I.等人(2012)Int.J.Mol.Sci.，13:15126-15136)。

分子技术已用于制备能够通过发酵合成甜菊醇糖苷的重组生物体。例如，具有编码参与甜菊醇糖苷合成的酶的多种转基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)重组菌株已用于生产莱苞迪苷M和莱苞迪苷D(参见例如WO2014/122227)。然而，使用重组生物体的当前发酵方法无法充分提供所需的甜菊醇糖苷生产速率，并且还与实现所需甜菊醇糖苷滴度的大量生物质生成和较长发酵时间相关联。

发明概述

本发明大体上涉及用于使用工程化酵母生产甜菊醇糖苷的方法，以及发酵组合物和包含一种或多种甜菊醇糖苷的发酵产物。本公开的发酵条件可促进以下各项中的一种或多种：来自工程化酵母的甜菊醇糖苷滴度增加；细胞活性增加，包括甜菊醇糖苷生产速率增加；产率增加；发酵时间减少；以及生物质浓度降低。在示例性实施方案中，所述方法可用于生产甜菊醇糖苷，诸如莱苞迪苷M、莱苞迪苷D、莱苞迪苷A、莱苞迪苷B及其组合。

本发明的一个实施方案提供一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：

(a)在培养基中生长能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母，其中所述工程化酵母以第一范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长；并且其中包含葡萄糖的组合物根据第一模式添加到培养基；以及

(b)用工程化酵母发酵培养基以产生一种或多种甜菊醇糖苷，其中在发酵期间，包含葡萄糖的组合物根据不同于第一模式的第二模式添加到培养基，并且在发酵期间，酵母以第二范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长，其中第二范围小于第一范围。

本发明的另一个实施方案提供一种用于生产甜菊醇糖苷的方法，其包括：

至少步骤(a)和(b)，其涉及工程化酵母的生长和发酵。在步骤(a)(即第一阶段)中，在培养基中以第一范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母。此外，在步骤(a)中，根据使酵母在第一范围内生长的第一模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基。在步骤(b)(即第二阶段)中，对工程化酵母进行发酵以产生一种或多种甜菊醇糖苷，其中包含葡萄糖的组合物根据不同于第一模式的第二模式添加到培养基。在步骤(b)期间，根据第二模式添加使得酵母以小于第一范围的第二范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长。

在示例性方法中，步骤(a)中酵母的生长速率范围是约0.06h^-1至约0.15h^-1，并且步骤(b)中的生长速率范围是约0.015h^-1至约0.09h^-1。步骤(a)到步骤(b)的生长速率的改变可由添加“模式”的改变所引起，诸如通过改变将含有葡萄糖的组合物添加到培养基中的速率，或者改变含有葡萄糖的组合物添加到培养基中的方式，诸如在步骤(a)中提供非恒定的进料速率，并且然后在步骤(b)中提供恒定的进料速率。

在另一个示例性方法中，工程化酵母在步骤(a)中生长至5g dcw/L至60g dcw/L范围内的生物质量，并且然后在步骤(b)中生长至不超过150g dcw/L的生物质量。

在又其他示例性方法中，通过基于呼吸商(RQ)、氧摄取速率(OUR)、二氧化碳释放速率(CER)或其组合控制葡萄糖进料速率来生长工程化酵母。在一些示例性方法中，在发酵阶段期间将葡萄糖调节至在约0.5至约2.0范围内的RQ。

本发明还提供一种发酵培养基，其包含根据本公开的方法获得的甜菊醇糖苷以及从发酵培养基中获得的甜菊醇糖苷组合物。

附图说明

图1示出代表性甲羟戊酸途径。

图2示出代表性非甲羟戊酸途径。

图3示出用于甜菊醇生产的代表性途径。

图4示出用于由甜菊醇生物合成甜菊醇糖苷的代表性途径。

发明详述

本文所描述的本公开的实施方案并不意图是详尽的或将本发明限制于以下详述中所公开的精确形式。相反，所选择和描述的实施方案的目的是使得可以促进本领域技术人员对本发明的原理和实践的认识和理解。

本公开的发酵方法使用能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母。能够产生甜菊醇糖苷的工程化酵母可包含编码细胞中促进一种或多种甜菊醇糖苷形成的酶的一种或多种外源性核酸。

如本文所用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷。示例性甜菊醇糖苷包括但不限于莱苞迪苷A、莱苞迪苷B、莱苞迪苷C、莱苞迪苷D、莱苞迪苷E、莱苞迪苷F、莱苞迪苷G、莱苞迪苷H、莱苞迪苷I、莱苞迪苷J、莱苞迪苷K、莱苞迪苷L、莱苞迪苷M、莱苞迪苷N、莱苞迪苷O、甜菊苷、甜菊双糖苷、杜尔可苷A、甜茶苷。工程化酵母可产生与自然界中存在(“天然存在”)的甜菊醇糖苷相同的甜菊醇糖苷以及自然界中不存在的甜菊醇糖苷。甜菊醇糖苷可通过酶促过程而在工程化酵母中形成。

在结构上，根据以下所示骨架上的原子编号，甜菊醇糖苷具有中心分子部分(即单一甜菊醇骨架)以及连接到甜菊醇骨架的C13和/或C19原子的吡喃葡萄糖基残基。即，吡喃葡萄糖基表示以下式中的基团R₂和R₁：

以下表A示出各种甜菊醇糖苷和对应的R₁和R₂基团：表A

Glu：葡萄糖

Rha：鼠李糖

根据本公开，甜菊醇糖苷是在具有至少以下两个阶段的过程中产生：第一阶段和第二阶段，其中含有葡萄糖的进料组合物在每个阶段中以不同的进料模式(诸如可变进料和随后恒定进料)提供到培养基。如本文所述的两阶段进料过程可使得生长速率在第二阶段中比在第一阶段中慢，因此增加甜菊醇糖苷的生产速率、减少发酵时间并降低生物质浓度。工程化酵母可具有提供用于合成甜菊醇糖苷的途径的一组酶。例如，所述过程可产生甜菊醇糖苷，诸如RebM和RebD。

本公开的方法可使用工程化以提供一种或多种甜菊醇糖苷的途径的各种酵母宿主细胞。此类细胞可使用编码用于甜菊醇糖苷合成的酶的一种或多种DNA构建体进行转化。可用于编码甜菊醇糖苷途径酶的外源性DNA构建体的宿主的示例性酵母包括但不限于假丝酵母属、克氏酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属以及接合酵母属的物种。示例性物种是白假丝酵母(Candida albicans)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。此外，宿主细胞除了包含甜菊醇糖苷途径的遗传修饰，还可包含在发酵期间提供改善的性能的遗传修饰。

“工程化酵母”是指具有引入到细胞中的至少一个外源性DNA序列的酵母细胞，所述序列被整合到细胞的基因组中或存在于染色体外的构建体(诸如质粒或附加体)上。术语“外源性”是指引入到宿主酵母中的分子(诸如核酸)或活性(诸如酶活性)。外源性核酸可通过熟知的技术引入到酵母宿主中，并且可保持在宿主染色体材料的外部(例如，保持在非整合载体上)，或者可整合到酵母的染色体中，诸如通过重组事件。一般而言，工程化酵母的基因组通过稳定引入一种或多种重组基因来增强。外源性核酸可编码与酵母同源或异源的酶或其部分。外源性核酸可呈“重组基因或DNA构建体”的形式，是指通过分子技术以一种或多种方式调控而呈非天然存在的形式的核酸。

术语“异源的”(例如“非天然”)是指来自不同于参考分子或生物体的来源的分子或活性。因此，与参考生物体异源的基因或蛋白质是所述生物体中不存在的基因或蛋白质。在本公开的上下文中，“异源性糖基转移酶”是指不同于对宿主生物体而言可能是天然的任何糖基转移酶多肽的糖基转移酶多肽。例如，存在于第一物种中并且外源性地引入到不同于第一物种的宿主酵母生物体中的特定糖基转移酶基因对于宿主酵母是“异源的”。

工程化酵母可使用适用于选择具有编码甜菊醇糖苷途径酶的核酸的转化体的营养缺陷型标记。宿主酵母可包含控制营养缺陷型的一种或多种基因(诸如LYS2、LEU2、HIS3、URA3、URA5和TRP1)中的修饰(缺失等)。使用具有所需遗传背景的宿主细胞来引入一种或多种外源性基因，将一种或多种基因构建体引入到细胞中，以整合到基因组中或稳定地保持并允许表达。用于将基因构建体引入到宿主细胞中的方法包括转化、转导、转染、共转染以及电穿孔。具体地，可使用乙酸锂方法、原生质体方法等来进行酵母转化。待引入的基因构建体可以质粒形式、或通过插入到宿主基因中、或通过与宿主基因同源重组而结合到染色体中。可使用选择性标记(例如，如上所述的营养缺陷型标记)选择已引入基因构建体的转化酵母。可通过测量所表达蛋白质的活性或生物产物(诸如甜菊醇糖苷)的生产进行进一步确认。

包含甜菊醇途径基因的外源性核酸序列的转化可使用本领域熟知的方法来确认。此类方法包括例如：核酸分析，诸如RNA印迹或mRNA的聚合酶链反应(PCR)扩增；或用于基因产物表达的免疫印迹法；或测试所引入核酸序列或其对应基因产物的表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，外源性核酸以足以产生所需产物的量表达，并且应进一步理解，表达水平可被优化以使用本领域熟知且本文所公开的方法来获得足够的表达。

萜类化合物异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)可用作工程化酵母中的甜菊醇糖苷的化学前体。一些生物体(包括植物、昆虫和一些微生物物种)具有甲羟戊酸(MVA)途径，其通过一系列化学中间体将乙酰-CoA转化成IPP和DMAPP。一些生物体通过非甲羟戊酸途径(也称为甲基D-赤藓醇4-磷酸或MEP途径)以甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)开始产生IPP和DMAPP。

酵母酿酒酵母天然表达甲羟戊酸途径的基因。甲羟戊酸途径基因包括：(a1)乙酰乙酰CoA硫解酶(EC 2.3.1.9)；(b1)3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)合酶(EC4.1.3.5)；(c1)HMG-CoA还原酶(EC1.1.1.34)；(d1)甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)；(e1)磷酸甲羟戊酸激酶(EC2.7.4.2)；以及(f1)甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)。甲羟戊酸途径的酶如下将乙酰-CoA转化成IPP：乙酰-CoA→乙酰乙酰-CoA→3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA→甲羟戊酸→甲羟戊酸-5-磷酸→甲羟戊酸-5-焦磷酸→IPP。还参见图1。

在一些实施方案中，工程化酵母可包含一种或多种修饰以增加由乙酰-CoA到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供用于甜菊醇途径中的增加的IPP和/或DMAPP库。修饰可包括例如增加一种或多种甲羟戊酸途径酶(a1)-(f1)的表达或活性，诸如通过使编码与酵母细胞同源或异源的酶的核酸处于提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或与天然酶相比提供更高水平的酶活性的变体异源酶。

可替代地，非甲羟戊酸(MEP)途径可用于提供IPP和DMAPP作为甜菊醇糖苷生产的前体。酵母酿酒酵母并不天然地表达MEP途径的基因，但可任选地工程化以提供MEP途径基因。在理论上，MEP途径通常在能量上更有效，因为与MVA途径相比，其作为CO2而失去的碳更少(MEP途径：1CO2/IPP；MVA途径：4CO2/IPP；糖作为碳源)。

具体地，在非甲羟戊酸(MEP)途径中，化合物异戊烯基二磷酸(IPP)、二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)通过一系列由甘油醛-3-磷酸(G3P)和丙酮酸(PYR)引起的中间体而生成，并且多种酶负责这种转化。参与G3P和PYR到IPP和DMAPP的生物合成途径的酶包括(a2)l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b2)l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(ispC)-、(c2)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(IspD)、(d2)4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(IspE)、(e2)2C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、(f2)l-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、(g2)4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)以及(h2)异戊烯基-二磷酸异构酶(IDI)。参见图2

本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用具有一种或多种遗传修饰的工程化酵母，以增加由G3P和PYR到IPP和/或DMAPP的通量，从而提供用于甜菊醇途径中的增加的IPP和/或DMAPP库。修饰可包括例如增加一种或多种酶(a2)-(h2)的表达或活性，诸如通过使编码与酵母细胞异源的酶的核酸处于提供增加的表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用异源酶、变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或提供高水平的酶活性的变体异源酶。

本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用工程化酵母，其也可包含将IPP和/或DMAPP转化成甜菊醇的途径。例如，在一些方面，工程化酵母可包含表达以下酶的外源性核酸：(a3)香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、(b3)柯巴基二磷酸合酶(CPS)、(c3)贝壳杉烯合酶(KS)、(d3)贝壳杉烯氧化酶(KO)以及(e3)异贝壳杉烯酸13-羟基化酶(KAH)。参见图3甲羟戊酸途径的酶如下将IPP和/或DMAPP转化成甜菊醇：IPP/DMAPP→香叶基香叶基二磷酸→柯巴基二磷酸→贝壳杉烯→异贝壳杉烯酸→甜菊醇。参见图3编码与酵母细胞异源的酶(a3)-(e3)的外源性核酸可处于提供增加表达的启动子的控制下、使用核酸的多个拷贝和/或使用变体酶(例如，包含一个或多个氨基酸取代的变体酶)或提供高水平的酶促活性的变体异源酶。

本公开的用于通过发酵生产甜菊醇糖苷的方法可使用具有将甜菊醇转化成甜菊醇糖苷的任何途径的工程化酵母。如果工程化酵母中存在多于一种甜菊醇糖苷途径酶，则酵母可能够产生不同的甜菊醇糖苷。例如，酵母可能够产生两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种不同的甜菊醇糖苷物质。

甜菊醇糖苷途径可包括介导糖基残基从活化的核苷酸糖转移至受体分子的一种或多种尿苷二磷酸(UDP)糖基转移酶(UGT)。在甜菊醇糖苷途径的情况下，单糖单元可转移到甜菊醇或甜菊醇糖苷分子上的羟基或羧基部分，或者转移到连接至甜菊醇骨架的葡萄糖基团上的羟基。参见图4。基于序列同源性已将UGT分类为家族和亚族。参见Li等人，2001，J.Biol.Chem.276:4338-4343。在模型植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已鉴定了编码UGT(各自含有42个氨基酸共有序列)的超过100个基因的超家族，并且还在若干种其他高等植物物种中鉴定了编码UGT的基因。

示例性UDP-葡糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物以提供目标甜菊醇糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。在一个实施方案中，工程化酵母可包括一种或多种UDP-葡糖基转移酶，其选自组UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)以及与这些多肽具有实质同一性(例如，>85％、>75％、>65％、>55％、>45％以及>35％)的UGT。工程化酵母可包含编码这些UGT的一个或多个外源性核酸分子。

工程化酵母还可包含一种或多种UGT和UDP-葡萄糖循环酶。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜茶苷以形成甜菊苷的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2。能够将至少一个葡萄糖单元添加到甜菊苷以形成莱苞迪苷A的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷A以形成莱苞迪苷D的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT91D2。能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱苞迪苷D以形成莱苞迪苷M的示例性UDP-葡糖基转移酶是UGT76G1。

描述用于甜菊醇糖苷生产的工程化微生物以及甜菊醇糖苷途径酶的示例性公布包括例如US2014/0357588、WO2014/193934、WO2014/193888和WO2014/122227，其各自据此以引用的方式整体并入。

在一个实施方案中，适用于生产甜菊醇糖苷的工程化酵母表达以下酶：香叶基香叶基二磷酸合酶(GGPPS)、对映柯巴基二磷酸合酶(CDPS)、贝壳杉烯氧化酶(KO)、贝壳杉烯合酶(KS)、甜菊醇合酶(KAH)、细胞色素P450还原酶(CPR)、UGT74G1、UGT76G1、UGT91D2、UGT85C2以及EUGT11。WO2014/122227描述了表达这些酶的工程化酵母菌株。UDP-葡糖基转移酶可以是编码多肽的基因，所述多肽例如UGT74G1(SEQ ID NO：1)、UGT85C2(SEQ ID NO：2)、UGT76G1(SEQ ID NO：3)、UGT91D2(SEQ ID NO：4)以及EUGT11(SEQ ID NO：13)；这些基因编码能够进行多种反应的多肽，诸如：a)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的多肽的基因；(b)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C2’进行β1,2糖基化的多肽的基因；(c)编码能够对甜菊醇糖苷的19-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化的多肽的基因；(d)编码能够对甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖的C3’进行β1,3糖基化的多肽的基因；(i)编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷的13-OH进行糖基化的多肽的基因；(j)编码能够对甜菊醇或甜菊醇糖苷的C-19羧基进行糖基化的多肽的基因。例如，UGT85C2进行反应(i)；UGT74G1进行反应(j)；UGT91D2进行反应(a；弱)、(b)；UGT76G1进行反应(c)和(d)；EUGT11进行反应(a)、(b；不太好)。

术语“培养基”是指液体组合物，其中工程化酵母或真菌可保持、可生长、可发酵或其组合。“培养基”也可称为“发酵液”或“细胞培养物”，并且诸如“生长”、“分裂”、“呼吸”和“发酵”的术语可用于更具体地定义培养基中发生的细胞活动。

培养基可相对于培养基中存在的组分及其量进行定义，诸如：(a)碳源，包括碳水化合物，诸如葡萄糖和淀粉产物(诸如麦芽糖糊精)；(b)氮源，诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合；(c)盐，诸如磷酸钾(一盐基、二盐基)、硫酸镁、氯化钠和氯化钙；(d)维生素，诸如生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素和柠檬酸；和/或(e)痕量金属，诸如硼酸、硫酸铜、氯化钴、氯化钙、碘化钾、氯化铁、硫酸镁、氯化锰、钼酸钠和硫酸锌。培养基中的组分可基于干重进行定义。此外，培养基是水基或“水性”组合物。培养基也可相对于其pH以及用于控制培养基中的pH的生物相容性酸、碱和缓冲液进行定义。

在示例性实施方案中，在步骤(a)和(b)中培养基中的葡萄糖浓度保持在约0g/L至约5g/L或0g/L至约2g/L的范围内。在示例性实施方案中，培养基中氮源(诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物)的浓度(总量)的范围是约5g/L至约40g/L。在示例性实施方案中，培养基中盐的浓度(总量)，诸如包含硫酸镁的盐的范围为约0g/L至约12g/L并且包含磷酸钾的盐的范围为约0g/L至约22g/L。在示例性实施方案中，培养基中痕量金属的浓度(总量)保持在约0g/L至约0.4g/L或0g/L至约0.2g/L的范围内。

可将组合物(“进料组合物”)添加到包含工程化酵母的培养基以增加培养基的体积，并且随着工程化酵母在培养基中生长，生物质的量增加。进料组合物可包括用于酵母生长和发酵以形成所需培养基的组分。进料组合物可包含碳水化合物、氮源(诸如氢氧化铵、尿素、硫酸铵、酵母提取物或其任何组合)、盐、维生素和痕量金属。进料组合物中组分的浓度可大于培养基中组分的浓度，使得当添加进料组合物时，其在适用于工程化酵母发酵的培养基中提供所需量的组分。

工程化酵母的发酵可使用源自任何植物和植物部分(诸如块茎、根、茎、叶和种子)的含有淀粉和/或糖的植物材料进行。含有淀粉和/或糖的植物材料可从谷物(诸如大麦、小麦、玉米、黑麦、高粱、小米、大麦、马铃薯、木薯或稻及其任何组合)中获得。含有淀粉和/或糖的植物材料可诸如通过诸如碾磨、麦芽处理或部分麦芽处理的方法进行加工。在一些实施方案中，用于步骤(a)和(b)的培养基包含处理的淀粉。例如，用于生长和/或发酵的培养基可包含部分水解的淀粉。部分水解的淀粉可包括高分子量糊精和高分子量麦芽糖糊精。可使用部分水解的淀粉产物，其淀粉和淀粉降解产物的量处于有利于甜菊醇糖苷生产的所需范围内。

任选地，可将淀粉降解酶添加到包含淀粉材料的培养基，以便增加可在发酵时期期间被工程化酵母利用的单体糖(诸如葡萄糖)的浓度。示例性淀粉降解酶包括淀粉分解酶，诸如糖淀粉酶和淀粉酶。在一些实施方案中，代替葡萄糖或除葡萄糖之外，在培养基中可包含可发酵糖诸如果糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖等。

在一些任选的实践模式中，可在包含含有甜菊醇的化合物的培养基中进行发酵。此类化合物可由工程化酵母中的葡糖基转移酶直接使用。例如，任选地，可在含有甜菊醇-13-O-葡糖苷或甜菊醇-19-O-葡糖苷的培养基中进行发酵。使用这种培养基，微生物可含有并表达编码功能性EUGT11、功能性UGT74G1、功能性UGT85C2、功能性UGT76G1和功能性UGT91D2的基因。化合物诸如莱苞迪苷A、莱苞迪苷D和莱苞迪苷M可从发酵培养基中获得。作为另一种选项，可在含有甜茶苷的培养基中进行发酵。使用这种培养基，微生物可含有并表达编码功能性EUGT11、功能性UGT76G1和功能性UGT91D2的基因。化合物诸如莱苞迪苷A、D和M可从发酵后的培养基中获得。

在一些情况下，在工业容量的发酵罐中进行发酵，以便实现商业规模的经济益处和控制。在一个实施方案中，在容量为约10,000升或更多的发酵罐中进行发酵。

术语“第一阶段”和“第二阶段”(以及如果必要的话，任选地“前阶段”、“第三阶段”、“第四阶段”、“第五阶段”等)可用于描述生产甜菊醇糖苷的方法相对于培养基的各个方面。术语“时期”也可用于“阶段”。所述过程包括两个或更多个阶段，其中培养基在每个阶段中进行不同处理，诸如通过在所述过程的第二阶段后期阶段中以不同于第一阶段早期阶段中添加进料组合物模式的模式将进料组合物添加到培养基。添加模式的差异影响工程化酵母的生长和所述过程期间甜菊醇糖苷的生产。

在第一阶段(其中通过第一添加模式来控制细胞生长)之前，细胞可根据“前阶段”进行培养。前阶段可以是“接种/初始生长阶段”，其中细胞在培养基中生长以适应培养基组分(碳水化合物、氮源、盐、维生素、痕量金属)。在前阶段中，对细胞的碳水化合物供应未如第一阶段和第二阶段期间那样受到调整，因此细胞可以其最大生物学速率生长。例如，前阶段中的细胞可分批进料。随着细胞变得适应培养基，细胞将进入生长阶段并增加细胞数。在前阶段期间，工程化酵母可通过出芽生殖(称为酵母分裂)来繁殖。

例如，在前阶段期间，在分批过程中可将生长组合物添加到包含工程化酵母的培养基，所述生长组合物包含碳水化合物、氮源(诸如酵母氮源基础、氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其任何组合)、盐、维生素和痕量金属。在一些实践模式中，添加组合物以提供具有氢氧化铵、尿素、硫酸铵或其组合作为唯一氮源的培养基。在随后的第一阶段中，相同的组合物可用作进料组合物，其中细胞生长由进料组合物添加到培养基的模式来控制。

在特征在于细胞生长快速和生物质增加的前阶段后，可通过根据第一添加模式调节含有葡萄糖的组合物的添加来开始第一阶段(例如，步骤a)。第一阶段可以各种方式进行描述，诸如通过进料溶液添加到培养基的方式和细胞响应于所述类型的添加而生长的方式。

添加模式可影响工程化酵母的倍增时间。第一阶段中的倍增时间可比前阶段中的倍增时间长(增长较慢)。在第一阶段期间，培养基的生物质可增加，但其可以比前阶段中所见的增加更低的速率增加。与第二阶段相比，第一阶段还可根据细胞生长的方式进行描述，在所述第二阶段中进料溶液以不同于第一模式的第二模式添加到培养基。

例如，在第一阶段中，酵母可在实现一种或多种生长速率的条件下在培养基中生长。生长速率可通过控制进料培养基到发酵罐的进料速率来控制，以达到大于第二阶段中的生长的第一范围内的某一(某些)稀释速率。例如，在接种/生长阶段中，生长速率(μ)可以是约0.06h^-1或更大，诸如约0.06h^-1至约0.17h^-1或约0.09h^-1至约0.15h^-1范围内的速率。生长可通过例如600nm处的光密度来测量。生长速率可通过基于生长速率测量值调节进料培养基的进料速率来控制，例如通过增加进料速率来增加生长速率或通过降低进料速率来降低生长速率。

任选地，第一阶段可根据培养基中的葡萄糖浓度来描述。例如，在一些实践模式中，第一阶段在培养基中的葡萄糖少于3g/L(葡萄糖可通过使用YS12700Select ChemicalAnalyzer，Yellow Springs，OH来测定)时开始。例如，可监测前阶段期间培养基中葡萄糖的量，并且当浓度降至3g/L以下时，可开始第一阶段进料。

通过根据第一模式将包含葡萄糖的组合物添加到培养基可实现第一阶段中的所需生长速率。“进料模式”是指将包含葡萄糖的进料组合物添加到具有工程化酵母的培养基中的方式。进料模式包括恒定的进料速率、非恒定的进料速率、连续添加进料组合物、批量添加进料组合物等。在一些进料模式中，在第一阶段期间将进料组合物以非恒定的进料速率添加到培养基。例如，非恒定的进料速率可以是可变的进料速率。

可变的进料速率是指在将进料溶液添加到培养基的时间段内以两种或更多种不同的速率将进料溶液添加到培养基。在一些实践模式中，在可变速率进料期间，速率在一段时间内降低。例如，在所述过程的生长阶段中，进料可从生长阶段中早期的较高进料速率改变成生长阶段后期的较低进料速率。这可通过不断降低进料速率来进行，或者可通过一系列小的递减步骤来进行。在任选的实践模式中，可变的进料速率可包括增加进料速率并且然后降低进料速率。

可变的进料速率可使用可变速率添加系统来实现。此类系统的实例包括变速泵或可操作地连接到泵的计量阀(诸如节流阀)，所述泵或阀可用于随时间改变引入到发酵培养基中的进料组合物的量。

第一阶段还可参考与培养基相关的一个或多个参数来解释，所述参数诸如第一阶段的时间段、培养基的温度、生长的生物质的量和培养基的pH。在一些实践模式中，具有可变进料速率的第一阶段可进行约两小时或更长以及多至约40小时的时间段。例如，第一阶段可以是约10小时或更长时间，诸如约10小时至约30小时或约10小时至约24小时的范围内的时间段。第一阶段可涵盖工程化酵母的生长停滞阶段的全部或部分以及生长对数(指数)阶段的全部或部分。在这段时间之后，然后可改变将包含葡萄糖的进料组合物添加到培养基中的模式(例如，改变成第二阶段中的恒定进料速率)。

在示例性实践模式中，在第一阶段中，将培养基保持在约25℃-35℃或28℃-32℃范围内的温度下，并且最优选地保持在约30℃下。此外，工程化酵母的生长可在曝气和/或搅拌下进行。曝气条件可对溶解在培养基中的氧气量产生影响，因此对工程化酵母可用的氧气产生影响。工程化酵母的氧摄取量可通过在培养基中形成小氧气泡的氧气供应的速率来控制，所述气泡形成可通过搅拌和/或鼓泡来实现。

在培养基中和在第一阶段期间，可进行曝气。曝气可根据以mg min^-1升^-1为单位的溶解氧转移到培养基的速率来描述。曝气也可根据溶解氧(％)来描述。(例如，参见Anderlei，T.和Büchs，J.(2000)Biochem.Engin.J.3478:1-6)。可进行促进细小气泡形成的鼓泡技术以提供所需的曝气。在一些实践模式中，在第一阶段期间，诸如以逐步的方式增加搅拌和曝气。本公开的使用两阶段进料过程的方法还可减少培养基中的曝气需求，同时仍提供所需的甜菊醇糖苷生产。在一些实践模式中，溶解氧保持大于15％。

如本文所用，“生物质”是指工程化酵母的重量，其可以每升培养基的干细胞重量的克数(克/升)进行测量。作为另一个示例性参数，在一些实践模式中，具有可变进料速率的第一阶段产生至少约5dcw/L的量的生物质。优选地，所产生的生物质的量的范围是约5gdcw/L至约60g dcw/L、约20g dcw/L至约60g dcw/L或约20g dcw/L至约40g dcw/L。

作为另一个实例，在一些实践模式中，具有可变进料速率的第一阶段在6.0或更小、小于约5.5以及优选地小于5.2(诸如在约4.0至约5.2范围内)的pH下进行。在第一阶段期间，可监测pH以使其保持在所需的较低pH范围内，诸如在约4.0至5.2的范围内。在进料期间可将酸或碱添加到培养基以将pH保持在所需范围内。

在第一阶段之后，工程化酵母可进入第二阶段，诸如“发酵阶段”，其中提供进料组合物的模式不同于在第一阶段中的。在第二阶段中，工程化酵母的生长至少减慢，并且积极地同化碳水化合物并产生甜菊醇糖苷。如本文所用，“发酵”用于描述大量产生甜菊醇糖苷的阶段，其可在完全有氧、部分有氧或厌氧的条件下发生。在部分有氧的条件下，发酵途径和呼吸途径均可以是有效的，并且可发生一些细胞生长。在部分有氧的条件下，消耗的氧气量可少于在接种/生长阶段期间的。

在第二阶段中，可以不同于第一阶段中的模式将具有葡萄糖的进料组合物添加到培养基。在一些实践模式中，第一阶段和第二阶段在同一容器中进行，其中在第一阶段期间，将包含葡萄糖的进料溶液以可变速率添加到容器中的培养基，并且然后在第二阶段中，将进料溶液以恒定速率添加到同一容器中的培养基。

在一些实践模式中，在第二阶段中，将进料组合物以恒定的进料速率添加到培养基。例如，恒定的进料速率不大于10g葡萄糖/L培养基/h，并且优选地恒定进料速率的范围为2g葡萄糖/L培养基/h至10g葡萄糖/L培养基/h。

例如，在包括发酵和甜菊醇糖苷产生的第二阶段中，酵母可在实现某一范围内的一种或多种生长速率的条件下在培养基中生长。例如，在第二阶段中，生长速率可以是约0.09h^-1或更小，诸如速率的范围为约0.015h^-1至约0.09h^-1或约0.015h^-1至约0.06h^-1。

在一些实践模式中，具有恒定速率的第二阶段可进行一段时间以提供所需的甜菊醇糖苷生产。例如，第二阶段可在自步骤(a)开始的约30小时或更迟的时候开始，并且然后可进行多至从步骤(a)开始的130小时。第二阶段可涵盖产生大部分甜菊醇糖苷的发酵阶段的全部或部分。优选地，大部分甜菊醇糖苷(即大于50％)在第二阶段期间由工程化酵母产生。本公开的包括两阶段进料的方法提供关于发酵的益处，使得与对照过程(例如，单阶段发酵)相比发酵时间减少多至约25％，或甚至减少多至40％。

此外，在一些实践模式中，可以控制具有恒定进料速率的第二阶段，因此工程化酵母并不生长至大于180g dcw/L的生物质量。本公开的包括两阶段进料的方法提供关于生物质生产的益处，使得与具有单阶段发酵的对照过程相比所产生的生物质的量减少多至约25％。

此外，在一些实践模式中，在第二阶段期间，培养基具有的pH可高于第一阶段培期间养基中的pH。例如，在第二阶段开始时或在第二阶段期间，可将碱添加到培养基以将pH从较低pH增加至较高pH。碱可存在于进料组合物中，或者可与用于第二阶段的进料组合物分开添加。例如，在第二阶段中，可将pH调节至约pH 5.8或更高、或约pH 6.0或更高，诸如在约pH 5.8至约pH 7.5或更高、或约pH 6.0至约pH 7.0的范围内。在第二阶段期间，可监测(例如，定期地或连续地)pH，并且如果pH落在所需范围之外，则可对培养基进行调节。例如，如果pH降至6.0或5.8以下，则可将氢氧化铵添加到第二培养基，以便将pH调节至约6.0或更高。

在示例性实践模式中，第二阶段中的发酵和任选的生长在约25℃-35℃或28℃-32℃范围内的温度下进行，并且最优选地在约30℃下进行。此外，第二阶段中工程化酵母的发酵和任选的生长可在曝气和搅拌下进行。本公开的使用两阶段进料过程的方法还可减少培养基中的曝气需求，同时仍提供所需的甜菊醇糖苷生产。

在发酵期间，可监测培养基的甜菊醇糖苷产生。可在存在所需的甜菊醇糖苷总量和分布时停止发酵。

在一些实践模式中，可基于变量诸如呼吸商(RQ)、氧摄取速率(OUR)、二氧化碳释放速率(CER)或其组合来控制发酵生产甜菊醇糖苷的葡萄糖进料速率。这些变量可在发酵液或废气中测量。通过这些变量(例如，呼吸商(RQ))控制葡萄糖进料速率可增加生产，可增加产率、降低生物质生产并降低所需甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M)的乙醇产生。控制葡萄糖进料速率还可增加发酵操作的一致性，即降低批次的失败率并降低由于葡萄糖进料速率或培养生理学引起的总体系统变异性。

RQ可用于控制葡萄糖进料速率，以防止有毒的乙醇积累，即发酵代谢的副产物。

RQ定义为培养物中所产生的二氧化碳的摩尔比率除以所消耗的氧气的摩尔比率。RQ可通过分析来自发酵罐的废气中的二氧化碳和氧气的含量来测量。可在整个所需的生产阶段中连续或间歇地测量这个代谢参数。在一些实践模式中，适当的测量间隔为每四小时、每两小时、每小时、每半小时、每一刻钟、每十分钟、每五分钟、每四分钟、每三分钟、每两分钟或每一分钟。测量期间的时间段可随从开始培养到产生甜菊糖苷的生长条件而改变。测量和控制的示例性时间段在发酵罐中开始培养之后是20与40小时之间、10与60小时之间、5与70小时之间以及20与110小时之间。

在氧气存在下，酵母细胞使用更有效的有氧代谢，例如，在有氧代谢下由一摩尔葡萄糖中获得比在发酵代谢下多的能量。

由葡萄糖仅产生乙醇的培养基的RQ接近无穷大(因为消耗很少的氧气或不消耗氧气，所以RQ的分母接近零)，而对于葡萄糖的纯有氧代谢，RQ接近值1.0(消耗三摩尔氧气来产生3摩尔二氧化碳)。因此，高于1的值指示混合的代谢条件，其中有氧代谢和发酵代谢同时发生。通常，可使用RQ作为反馈控制变量来调节氧气转移速率和/或葡萄糖进料速率(或者其他碳水化合物的进料速率)，以实现这种混合代谢。

RQ可在来自发酵罐的废气流中测量。可使用任何已知和合适的用于确定所消耗的氧气和所生成的二氧化碳的摩尔浓度的方法。可使用的示例性技术是质谱法、红外光谱法和顺磁性分析。例如可与质谱仪一起使用的示例性软件包括来自Thermo Scientific^TM的GasWorks。

在一些实施方案中，RQ保持在约0.5至约2.0下。在一些实践模式中，RQ保持在约0.9至约1.5或约1.0至约1.3下。将RQ保持在所公开的范围内可使得甜菊醇糖苷生产得到改善。例如，一些实践模式使得Reb D和Reb M生产得到改善。

当RQ保持在大约1.1至大约2的狭窄范围内时，乙醇积累稳定在无毒的水平下。在一些实施方案中，乙醇的浓度保持在约5g/L与17g/L之间。可能希望的RQ范围包括约1.08-2.0；约1.08-1.85；约1.08-1.65；约1.08-1.45；约1.08-1.35；约1.08-1.25；约1.08-1.2；以及约1.08-1.15。其他合适的RQ范围包括1.08至1.35和1.15至1.25。在一些实施方案中，调节葡萄糖添加速率以将RQ保持在约0.5至约2.0、0.9至约1.5或1.0至约1.3中。

在发酵的任何所需部分(例如0至110小时、20-40小时、20-70小时，20-90小时、20-110小时或任何其他所需的时间段)期间，可监测并控制RQ。在一些实施方案中，在阶段II进料或发酵阶段期间监测RQ。

因此，可通过添加各种碳源、通过添加各种量的碳源以及通过调控氧气水平来随时间调控和改变RQ。在一个实施方案中，通过增加或减少搅拌来调控氧气水平。在另一个实施方案中，控制气体进料中氧气与氮气的比率。可以调节氧气转移速率的方式包括改变空气流速、氧气浓度、细胞密度、温度和/或搅拌。在一些实施方案中，调整葡萄糖或其他可发酵糖进料来影响RQ。可用于进料中的其他可发酵糖包括但不限于果糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖。可以调整进料速率或组成来影响RQ。对RQ的控制可以是手动的或自动的。

“总甜菊醇糖苷”是指在发酵一段时间后存在于培养基中的所有甜菊醇糖苷，其包括液体培养基中以及可从工程化酵母中获得的甜菊醇糖苷的量。甜菊醇糖苷含量可相对于培养基中的甜菊醇糖苷总量，或者培养基中一种或多种(而非所有)甜菊醇糖苷的量表示。组合物中甜菊醇糖苷的量可相对于彼此表示，或者相对于甜菊醇糖苷的总量表示，诸如通过甜菊醇糖苷总量的重量百分比或者比率或比率的范围，表示为重量百分比或摩尔百分比。甜菊醇糖苷的量也可相对于对照样品(诸如通过不包括第一进料阶段和第二进料阶段的过程制备的对照样品)表示。

在一些实践模式中，本公开的方法提供某些甜菊醇糖苷(诸如莱苞迪苷D和莱苞迪苷M)的生产的改进。在一些实施方案中，莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的组合生产速率为至少0.02g/L/h、0.03g/L/h、0.04g/L/h、0.05、0.06、0.07或0.075g L^-1h^-1。

本公开的方法可提供发酵期间甜菊醇糖苷生产速率的改进。例如，相对于通过在对照过程中生长和发酵的工程化酵母菌株产生甜菊醇糖苷的速率(第1阶段μ＝0.12h^-1；第2阶段7.71g葡萄糖L^-1h^-1)，使用如本文所述的第一阶段和第二阶段方法生长和发酵的工程化酵母可表现出的甜菊醇糖苷生产速率增加为约1％或更大、约2％或更大、约3％或更大、约5％或更多、约7％或更大、约10％或更大、约12％或更大或约15％或更大。

根据本公开的分阶段进料可引起Reb D和Reb M产生和生产速率增加、产率增加、发酵时间减少以及生物质浓度降低。

在发酵产生甜菊醇糖苷的第二阶段后，可使用各种技术从培养基中获得含有一种或多种甜菊醇糖苷的组合物。在一些实施方案中，可将诸如渗透剂的化合物添加到培养基以增强甜菊醇糖苷从细胞中去除并进入培养基中。

然后可将培养基离心或过滤以去除工程化细胞。可任选地处理培养基以去除低分子量组分(葡萄糖、基本营养物质和盐)，诸如通过膜透析。根椐所需用途，可使用包含一种或多种甜菊醇糖苷化合物的组合物。

在发酵之后，可任选地使用热处理方法处理工程化酵母以提高甜菊醇糖苷的回收率。在发酵之后但在任何热处理之前，培养基可含有次最佳量的甜菊醇糖苷，其中大部分的所需甜菊醇糖苷处于工程化酵母内。为了增加甜菊醇糖苷的回收率，在一些实践模式中，将组合物(诸如工程化酵母已发酵的较高pH的培养基)加热到50℃至95℃或70℃至95℃范围内的温度，持续5分钟至48小时范围内的时间段。

如果需要提供具有富集或纯化形式的甜菊醇糖苷的组合物，或者在某些甜菊醇糖苷彼此分离的情况下，可进行进一步纯化。甜菊醇糖苷组分的这种富集或纯化可在发酵所发生的培养基上进行，或者然后可在纯化之前干燥培养基。例如，可使用冻干法干燥培养基以形成包含甜菊醇糖苷的干组合物(例如，粉末或薄片)，随后可对其进行加工。

如本文所用，术语“总甜菊醇糖苷”(TSG)被计算为组合物中基于干(无水)物质的所有甜菊醇糖苷含量的总和。

在一些实践模式中，将富含甜菊醇糖苷的干燥发酵液用作纯化的起始物质。例如，可将溶剂或溶剂组合添加到干燥发酵液中以溶解或悬浮包含甜菊醇糖苷的物质。用于溶解甜菊醇糖苷的示例性组合是水与醇(例如，50:50的乙醇:水)的混合物。为了促进溶解或悬浮，干燥的发酵液物质可在高于室温(诸如在40℃-60℃的范围内)的温度下加热。还可对干燥的发酵液物质进行机械破碎，诸如通过超声处理。在进一步纯化之前，可使用微米或亚微米过滤溶解或悬浮的发酵液物质，诸如通过制备型色谱法。

富含甜菊醇糖苷化合物的干燥发酵液可经受纯化，诸如通过反相液相色谱法。合适的树脂可用于将甜菊醇糖苷化合物保留在柱中、去除亲水性化合物(用液体诸如水将其从整个柱中洗涤下来)。从柱中洗脱甜菊醇糖苷可用合适的溶剂或溶剂组合(诸如乙腈或甲醇)来实现。

从反相柱洗脱甜菊醇糖苷可产生可适用于多种目的中的任何一种的组合物。例如，纯化的甜菊醇糖苷组合物可用作用于经口摄取或经口使用的甜味剂组合物。组合物可相对于组合物中的甜菊醇糖苷进行定义。

产生甜菊醇糖苷的酿酒酵母菌株使用WO 2011/153378、WO2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中所描述的方法进行构建，所述专利各自以引用的方式整体并入。以下序列用于构建亲本菌株(菌株A)：编码聚球藻属某种GGPPS多肽(SEQ ID NO:6)的重组基因、编码截短的玉米(Zea mays)CDPS多肽(SEQ ID NO:7)的重组基因、编码拟南芥KS多肽(SEQ ID NO:8)的重组基因、编码重组甜叶菊KO多肽(SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10)的重组基因、编码拟南芥ATR2多肽(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12)的重组基因、编码稻(Oryzasativa)EUGT 11多肽(SEQ ID NO:13)的重组基因、编码SrKAHel多肽(SEQ ID NO：14、SEQID NO：15)的重组基因、编码甜叶菊CPR8多肽(SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17)的重组基因、编码甜叶菊UGT85C2多肽(SEQ ID NO：2)的重组基因、编码甜叶菊UGT74G1多肽(SEQ ID NO：1)的重组基因、编码甜叶菊UGT76G1多肽(SEQ ID NO：3)的重组基因、以及编码产生甜菊醇糖苷的甜叶菊UGT91D2变体(或功能同源物)UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：4)的重组基因。

UGT91D2的UGT91D2e-b变体(来自PCT/US2012/050021的SEQ ID NO：5)包含位置211处甲硫氨酸对亮氨酸的取代以及位置286处丙氨酸对缬氨酸的取代。(除了据此以引用的方式整体并入的PCT/US2012/050021的表12和实施例11中描述的T144S、M152L、L213F、S364P和G384C变体之外，可使用另外的变体。)GeneArt密码子优化的序列编码具有氨基酸修饰L211M和V286A的甜叶菊UGT91D2e-b(氨基酸序列SEQ ID NO：4；密码子优化的核苷酸序列列出在SEQ ID NO：5中)。

菌株B来源于上述亲本菌株，并且另外包含来自甜叶菊的密码子优化的CPR1(SEQID NO：18，对应于氨基酸SEQ ID NO：19)。

实施例1

在两阶段进料过程中Reb D和Reb M的产生

对于接种物制备，将酵母菌株B在1升摇瓶中的150mL接种烧瓶培养基中在250rpm和30℃下培养20-24小时。

表1接种烧瓶培养基

组分	式	浓度	单位
				Biospringer 0251酵母提取物		7.5	g/L
一水葡萄糖	C6H12O6*H2O	22.0	g/L

对于发酵，将75mL的接种培养物转移到初始发酵培养基中，如表2所示，其中初始体积为0.75升(38.5％的罐内液面)。在2L New Brunswick BioFlo310发酵罐中进行分批进料发酵。用12％NH₄OH将发酵控制在pH 5.0，并且在整个过程中将温度保持在30℃下。在整个发酵过程中，空气流速为1.75SLPM，并且搅拌速率为1200rpm。

通过控制发酵进料培养基的流速来限制葡萄糖浓度。2阶段进料策略包括在12小时(在接种到发酵罐之后)以u＝0.12h^-1或更高的生长速率开始的初始指数阶段(进料阶段I)，而进料阶段II在35-39小时的范围内以恒定流速开始。阶段II进料包括在14.4至22.96g葡萄糖/L发酵液/h的范围内的恒定进料。继续进料直到输送1.0升发酵进料培养基。将消泡剂Ivanhoe 1163B以1.3g/L添加到进料培养基中，并且根据需要添加5重量％消泡剂溶液的另外的推注添加物。

培养基是基于Verduyn等人(Verduyn C、Postma E、Scheffers WA和Van DijkenJP.Yeast.1992Jul；8(7)：501-17)，其具有如表2和3中所述的修改。

表2初始发酵培养基

组分	式	浓度	单位
				一水葡萄糖	C6H12O6*H2O	22.0	g/L
硫酸铵	(NH4)2SO4	5.0	g/L
				磷酸二氢钾	KH2PO4	3.0	g/L
七水硫酸镁	MgSO4*7H2O	0.5	g/L
				痕量金属原液		10.0	ml/L
维生素原液		12.0	ml/L

痕量金属储备溶液

组分	式	浓度	单位
				依地酸二钠	C10H14N2Na2O8*2H2O	15	g/L
七水硫酸锌	ZnSO4*7H2O	4.5	g/L
				四水氯化锰(II)	MnCl2*4H2O	1.026	g/L
六水合氯化钴(II)	CoCl2*6H2O	0.32	g/L
				七水硫酸铜(II)	CuSO4*5H2O	0.3	g/L
二水钼酸钠	Na2MoO4*2H2O	0.4	g/L
				二水氯化钙	CaCl2*2H2O	3	g/L
七水硫酸铁(II)	FeSO4*7H2O	3	g/L
				硼酸	H3BO3	1	g/L
碘化钾	KI	0.1	g/L

维生素储备溶液

组分	式	浓度	单位
				d-生物素	C10H16N2O3S	50	mg/L
泛酸钙	C18H32CaN2O10	1000	mg/L
				烟酸	C6H5NO2	1000	mg/L
盐酸硫胺素	C12H17CIN4OS·HCl	1000	mg/L
				盐酸吡哆醇	C8H11NO3·HCl	1000	mg/L
对氨基苯甲酸	C7H7NO2	200	mg/L
				肌醇	C6H12O6	25000	mg/L

表3发酵进料培养基

组分	式	浓度	单位
				一水葡萄糖	C6H12O6*H2O	660	g/L
消泡剂		1.3	g/L
				硫酸钾	K2SO4	4.2	g/L
硫酸钠	Na2SO4	0.336	g/L
				七水硫酸镁	MgSO4*7H2O	6.12	g/L
磷酸二氢钾	KH2PO4	10.8	g/L
				痕量金属原液		14.4	mL/L
维生素原液		14.4	mL/L

甜菊醇糖苷的定量可通过如下所述的高效液相色谱(HPLC)分析进行，并且与使用购自Chromadex的真实标准物而获得的校准曲线进行比较。

将100μL发酵培养基移取到2mL微量离心管中。将900μL的61％甲醇(提取溶剂)添加到2ml微量离心管中，并且通过置于样品旋转器上搅拌10分钟以提取甜菊醇糖苷。然后将样品在微型离心机中以10K rpm离心3min，并且将澄清的上清液移取到自动进样器小瓶中以用于进行分析。

用于糖苷分离的UHPLC方法

使用串联的两个Agilent SB-C18RRHD柱(2.1mm x 150mm，1.8um)、使用来自Optimize Technologies的安装为前置柱过滤器的杆过滤器组件来分离甜菊醇糖苷。所使用的流动相是通道A：0.01％三氟乙酸(TFA)的水溶液以及通道B乙腈。流速为0.38mL/min，柱温为65℃，并且

在210nm的紫外吸收下进行检测。梯度洗脱概况示出如下：

使用来自Cargill，Inc批1008-005的Reb A(98.85％纯度)的55％MeOH溶液以以下浓度进行校准：0.35、0.175、0.07、0.035、0.014、0.007mg/mL。所有糖苷均在Reb A曲线上进行定量。相对于Reb A测定Reb D、Reb M和Reb B的实验校正因子，而所有其他分析物通过分子量校正。

通过将发酵液过滤通过0.45微米过滤器并用3个体积的水洗涤并在105烘箱中干燥18小时来测量细胞干重(生物质)。

表4在2阶段进料方案的阶段I和阶段II进料中增加的葡萄糖培养基进料速率

实施例2

对于接种物制备，使用实施例1的表1的接种烧瓶培养基如实施例1中所述地培养酵母菌株B。发酵、初始发酵培养基和发酵进料培养基如实施例1中所述。

表5

阶段I进料速率保持恒定，并且进料阶段II速率是可变的但比实施例1中所使用的速率低。以上数据示出在阶段II进料速率较低的情况下，产率提高。

实施例3

对于接种物制备，使用实施例1的表1的接种烧瓶培养基如实施例1中所述地培养酵母菌株C。不同于实施例1的初始发酵培养基并不包含钴、钼酸盐和硼酸盐，在初始发酵培养基中仅添加维生素和痕量矿物质，而在发酵进料培养基中并未添加。

表6

与进料越快(对照)速率越高相比，观察到在进料速率较低的情况下产率提高。

实施例4

基于实时呼吸商反馈控制葡萄糖进料的分批进料发酵中的Reb D和Reb M的产生

对于接种物制备，使用实施例1的表1的接种烧瓶培养基如实施例1中所述地培养酵母菌株B。

对于发酵，如实施例1的表2中所述，将75mL接种培养物转移到初始发酵培养基中，其中起始体积为0.75升。在整个过程中温度保持在30℃。空气流速为1.75SLPM，并且在发酵期间自动控制搅拌速率以从400rpm以逐步方式增加至900rpm。用12％NH4OH将pH控制在pH5.0。

培养基是基于Verduyn等人(Verduyn C、Postma E、Scheffers WA、Van DijkenJP.Yeast.1992Jul；8(7):501-17)，其具有如实施例1的表2和3中所述的修改。对于尿素处理，在初始发酵培养基中将硫酸铵增加至15g/L，并且在发酵进料培养基中将尿素添加至39g/L。

由于酿酒酵母是Crabtree阳性生物体，所以它在非常低水平的葡萄糖存在下形成乙醇，因此通过控制发酵进料培养基的流速(如实施例1的表3中所述)来限制葡萄糖的浓度，以允许生长同时使乙醇产生最小化。

对于两阶段进料方案，初始指数阶段(进料阶段I)在10小时开始，其中生长速率为μ＝0.12 1/h，而第二进料阶段(或进料阶段II)在33小时开始，其中恒定流速为0.180ml/分钟。继续进料直到通过120小时获得1.95升的最终体积。

用基于呼吸商(RQ)的进料反馈控制进行的处理包括进料阶段I的典型指数进料。然后，在进料的进料阶段II中，在39小时，测量葡萄糖培养基添加的反馈控制，并且然后通过用Thermo Scientific Prima Pro Process MS仪器对发酵罐的废气相对于参考气体(空气)中的氧气和二氧化碳浓度进行废气质谱分析来实时测量RQ，从而控制进料。控制进料的算法被设计来将RQ保持在1.05与1.25之间。通过使用以下计算将二氧化碳释放速率(CER)除以氧摄取速率(OUR)来计算(通过Thermo Scientific^TMGasWorks的质谱仪软件进行)RQ：

OUR(mmol/L/h)＝(F(L/min)X(％O_2进-％O_2出)X 60min/h X 1000mmol/mol)/(100X24.45L/mol X发酵罐体积(L))

CER计算：

CER(mmol/L/h)＝(F(L/min)X(％CO_2进-％CO_2出)X 60min/h X1000mmol/mol)/(100X24.45L/mol X发酵罐体积(L))

RQ＝OUR/CER(无单位比率)

基于所使用的总葡萄糖，计算Reb D和Reb M相对于葡萄糖的产率。Reb D和Reb M相对于生物质的产率是基于细胞干重。细胞干重的生物质测定是基于本领域中通常已知的过滤/烘箱方法。

表7基于呼吸商的反馈控制的结果总结

“正常的2阶段进料”是第1阶段：μ＝0.12h^-1；第2阶段＝7.71g L^-1h^-1。

实施例5

对于接种物制备，使用实施例1的表1的接种烧瓶培养基如实施例1中所述地培养酵母菌株C。不同于实施例1的初始发酵培养基并不包含钴、钼酸盐和硼酸盐，在初始发酵培养基中仅添加维生素和痕量矿物质，而在发酵进料培养基中并未添加。

表8

呼吸商(RQ，无单位比率)等于二氧化碳释放速率(CER，mmol/L/h)除以氧摄取速率(OUR，mmol/L/h)。通过BioCommand软件中的算法来实现呼吸商(RQ)目标，所述算法基于通过对发酵的出口气体中的二氧化碳和氧气进行实时废气监测的RQ值来增加或降低葡萄糖进料速率。RQ反馈控制仅用于两阶段进料的阶段II中。

序列表

<110> 嘉吉公司

<120> 用于使用多阶段进料生产甜菊醇糖苷的发酵方法

<130> CAR0212/WO

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 460

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 1

Met Ala Glu Gln Gln Lys Ile Lys Lys Ser Pro His Val Leu Leu Ile

1 5 10 15

Pro Phe Pro Leu Gln Gly His Ile Asn Pro Phe Ile Gln Phe Gly Lys

20 25 30

Arg Leu Ile Ser Lys Gly Val Lys Thr Thr Leu Val Thr Thr Ile His

35 40 45

Thr Leu Asn Ser Thr Leu Asn His Ser Asn Thr Thr Thr Thr Ser Ile

50 55 60

Glu Ile Gln Ala Ile Ser Asp Gly Cys Asp Glu Gly Gly Phe Met Ser

65 70 75 80

Ala Gly Glu Ser Tyr Leu Glu Thr Phe Lys Gln Val Gly Ser Lys Ser

85 90 95

Leu Ala Asp Leu Ile Lys Lys Leu Gln Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp

100 105 110

Ala Ile Ile Tyr Asp Ser Met Thr Glu Trp Val Leu Asp Val Ala Ile

115 120 125

Glu Phe Gly Ile Asp Gly Gly Ser Phe Phe Thr Gln Ala Cys Val Val

130 135 140

Asn Ser Leu Tyr Tyr His Val His Lys Gly Leu Ile Ser Leu Pro Leu

145 150 155 160

Gly Glu Thr Val Ser Val Pro Gly Phe Pro Val Leu Gln Arg Trp Glu

165 170 175

Thr Pro Leu Ile Leu Gln Asn His Glu Gln Ile Gln Ser Pro Trp Ser

180 185 190

Gln Met Leu Phe Gly Gln Phe Ala Asn Ile Asp Gln Ala Arg Trp Val

195 200 205

Phe Thr Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Glu Glu Glu Val Ile Glu Trp Thr

210 215 220

Arg Lys Ile Trp Asn Leu Lys Val Ile Gly Pro Thr Leu Pro Ser Met

225 230 235 240

Tyr Leu Asp Lys Arg Leu Asp Asp Asp Lys Asp Asn Gly Phe Asn Leu

245 250 255

Tyr Lys Ala Asn His His Glu Cys Met Asn Trp Leu Asp Asp Lys Pro

260 265 270

Lys Glu Ser Val Val Tyr Val Ala Phe Gly Ser Leu Val Lys His Gly

275 280 285

Pro Glu Gln Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Leu Ile Asp Ser Asp Val

290 295 300

Asn Phe Leu Trp Val Ile Lys His Lys Glu Glu Gly Lys Leu Pro Glu

305 310 315 320

Asn Leu Ser Glu Val Ile Lys Thr Gly Lys Gly Leu Ile Val Ala Trp

325 330 335

Cys Lys Gln Leu Asp Val Leu Ala His Glu Ser Val Gly Cys Phe Val

340 345 350

Thr His Cys Gly Phe Asn Ser Thr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Gly Val

355 360 365

Pro Val Val Ala Met Pro Gln Phe Ser Asp Gln Thr Thr Asn Ala Lys

370 375 380

Leu Leu Asp Glu Ile Leu Gly Val Gly Val Arg Val Lys Ala Asp Glu

385 390 395 400

Asn Gly Ile Val Arg Arg Gly Asn Leu Ala Ser Cys Ile Lys Met Ile

405 410 415

Met Glu Glu Glu Arg Gly Val Ile Ile Arg Lys Asn Ala Val Lys Trp

420 425 430

Lys Asp Leu Ala Lys Val Ala Val His Glu Gly Gly Ser Ser Asp Asn

435 440 445

Asp Ile Val Glu Phe Val Ser Glu Leu Ile Lys Ala

450 455 460

<210> 2

<211> 481

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 2

Met Asp Ala Met Ala Thr Thr Glu Lys Lys Pro His Val Ile Phe Ile

1 5 10 15

Pro Phe Pro Ala Gln Ser His Ile Lys Ala Met Leu Lys Leu Ala Gln

20 25 30

Leu Leu His His Lys Gly Leu Gln Ile Thr Phe Val Asn Thr Asp Phe

35 40 45

Ile His Asn Gln Phe Leu Glu Ser Ser Gly Pro His Cys Leu Asp Gly

50 55 60

Ala Pro Gly Phe Arg Phe Glu Thr Ile Pro Asp Gly Val Ser His Ser

65 70 75 80

Pro Glu Ala Ser Ile Pro Ile Arg Glu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Glu

85 90 95

Thr Asn Phe Leu Asp Arg Phe Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Pro Asp

100 105 110

Pro Pro Thr Cys Ile Ile Ser Asp Gly Phe Leu Ser Val Phe Thr Ile

115 120 125

Asp Ala Ala Lys Lys Leu Gly Ile Pro Val Met Met Tyr Trp Thr Leu

130 135 140

Ala Ala Cys Gly Phe Met Gly Phe Tyr His Ile His Ser Leu Ile Glu

145 150 155 160

Lys Gly Phe Ala Pro Leu Lys Asp Ala Ser Tyr Leu Thr Asn Gly Tyr

165 170 175

Leu Asp Thr Val Ile Asp Trp Val Pro Gly Met Glu Gly Ile Arg Leu

180 185 190

Lys Asp Phe Pro Leu Asp Trp Ser Thr Asp Leu Asn Asp Lys Val Leu

195 200 205

Met Phe Thr Thr Glu Ala Pro Gln Arg Ser His Lys Val Ser His His

210 215 220

Ile Phe His Thr Phe Asp Glu Leu Glu Pro Ser Ile Ile Lys Thr Leu

225 230 235 240

Ser Leu Arg Tyr Asn His Ile Tyr Thr Ile Gly Pro Leu Gln Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Gln Ile Pro Glu Glu Lys Lys Gln Thr Gly Ile Thr Ser Leu

260 265 270

His Gly Tyr Ser Leu Val Lys Glu Glu Pro Glu Cys Phe Gln Trp Leu

275 280 285

Gln Ser Lys Glu Pro Asn Ser Val Val Tyr Val Asn Phe Gly Ser Thr

290 295 300

Thr Val Met Ser Leu Glu Asp Met Thr Glu Phe Gly Trp Gly Leu Ala

305 310 315 320

Asn Ser Asn His Tyr Phe Leu Trp Ile Ile Arg Ser Asn Leu Val Ile

325 330 335

Gly Glu Asn Ala Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu His Ile Lys Lys

340 345 350

Arg Gly Phe Ile Ala Ser Trp Cys Ser Gln Glu Lys Val Leu Lys His

355 360 365

Pro Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Thr Ile

370 375 380

Glu Ser Leu Ser Ala Gly Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Tyr Ser Trp

385 390 395 400

Asp Gln Leu Thr Asn Cys Arg Tyr Ile Cys Lys Glu Trp Glu Val Gly

405 410 415

Leu Glu Met Gly Thr Lys Val Lys Arg Asp Glu Val Lys Arg Leu Val

420 425 430

Gln Glu Leu Met Gly Glu Gly Gly His Lys Met Arg Asn Lys Ala Lys

435 440 445

Asp Trp Lys Glu Lys Ala Arg Ile Ala Ile Ala Pro Asn Gly Ser Ser

450 455 460

Ser Leu Asn Ile Asp Lys Met Val Lys Glu Ile Thr Val Leu Ala Arg

465 470 475 480

Asn

<210> 3

<211> 458

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 3

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 4

<211> 473

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 4

Met Ala Thr Ser Asp Ser Ile Val Asp Asp Arg Lys Gln Leu His Val

1 5 10 15

Ala Thr Phe Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro Tyr Leu Gln

20 25 30

Leu Ser Lys Leu Ile Ala Glu Lys Gly His Lys Val Ser Phe Leu Ser

35 40 45

Thr Thr Arg Asn Ile Gln Arg Leu Ser Ser His Ile Ser Pro Leu Ile

50 55 60

Asn Val Val Gln Leu Thr Leu Pro Arg Val Gln Glu Leu Pro Glu Asp

65 70 75 80

Ala Glu Ala Thr Thr Asp Val His Pro Glu Asp Ile Pro Tyr Leu Lys

85 90 95

Lys Ala Ser Asp Gly Leu Gln Pro Glu Val Thr Arg Phe Leu Glu Gln

100 105 110

His Ser Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Trp Leu Pro

115 120 125

Ser Ile Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Arg Ala His Phe Ser Val Thr

130 135 140

Thr Pro Trp Ala Ile Ala Tyr Met Gly Pro Ser Ala Asp Ala Met Ile

145 150 155 160

Asn Gly Ser Asp Gly Arg Thr Thr Val Glu Asp Leu Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Lys Trp Phe Pro Phe Pro Thr Lys Val Cys Trp Arg Lys His Asp Leu

180 185 190

Ala Arg Leu Val Pro Tyr Lys Ala Pro Gly Ile Ser Asp Gly Tyr Arg

195 200 205

Met Gly Met Val Leu Lys Gly Ser Asp Cys Leu Leu Ser Lys Cys Tyr

210 215 220

His Glu Phe Gly Thr Gln Trp Leu Pro Leu Leu Glu Thr Leu His Gln

225 230 235 240

Val Pro Val Val Pro Val Gly Leu Leu Pro Pro Glu Ile Pro Gly Asp

245 250 255

Glu Lys Asp Glu Thr Trp Val Ser Ile Lys Lys Trp Leu Asp Gly Lys

260 265 270

Gln Lys Gly Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Leu Val

275 280 285

Ser Gln Thr Glu Val Val Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ser Gly

290 295 300

Leu Pro Phe Val Trp Ala Tyr Arg Lys Pro Lys Gly Pro Ala Lys Ser

305 310 315 320

Asp Ser Val Glu Leu Pro Asp Gly Phe Val Glu Arg Thr Arg Asp Arg

325 330 335

Gly Leu Val Trp Thr Ser Trp Ala Pro Gln Leu Arg Ile Leu Ser His

340 345 350

Glu Ser Val Cys Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Ser Gly Ser Ile Val

355 360 365

Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly

370 375 380

Asp Gln Pro Leu Asn Ala Arg Leu Leu Glu Asp Lys Gln Val Gly Ile

385 390 395 400

Glu Ile Pro Arg Asn Glu Glu Asp Gly Cys Leu Thr Lys Glu Ser Val

405 410 415

Ala Arg Ser Leu Arg Ser Val Val Val Glu Lys Glu Gly Glu Ile Tyr

420 425 430

Lys Ala Asn Ala Arg Glu Leu Ser Lys Ile Tyr Asn Asp Thr Lys Val

435 440 445

Glu Lys Glu Tyr Val Ser Gln Phe Val Asp Tyr Leu Glu Lys Asn Ala

450 455 460

Arg Ala Val Ala Ile Asp His Glu Ser

465 470

<210> 5

<211> 1422

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 5

atggctactt ctgattccat cgttgacgat agaaagcaat tgcatgttgc tacttttcca 60

tggttggctt tcggtcatat tttgccatac ttgcaattgt ccaagttgat tgctgaaaag 120

ggtcacaagg tttcattctt gtctaccacc agaaacatcc aaagattgtc ctctcatatc 180

tccccattga tcaacgttgt tcaattgact ttgccaagag tccaagaatt gccagaagat 240

gctgaagcta ctactgatgt tcatccagaa gatatccctt acttgaaaaa ggcttccgat 300

ggtttacaac cagaagttac tagattcttg gaacaacatt ccccagattg gatcatctac 360

gattatactc attactggtt gccatccatt gctgcttcat tgggtatttc tagagcccat 420

ttctctgtta ctactccatg ggctattgct tatatgggtc catctgctga tgctatgatt 480

aacggttctg atggtagaac taccgttgaa gatttgacta ctccaccaaa gtggtttcca 540

tttccaacaa aagtctgttg gagaaaacac gatttggcta gattggttcc atacaaagct 600

ccaggtattt ctgatggtta cagaatgggt atggttttga aaggttccga ttgcttgttg 660

tctaagtgct atcatgaatt cggtactcaa tggttgcctt tgttggaaac attgcatcaa 720

gttccagttg ttccagtagg tttgttgcca ccagaaattc caggtgacga aaaagacgaa 780

acttgggttt ccatcaaaaa gtggttggat ggtaagcaaa agggttctgt tgtttatgtt 840

gctttgggtt ccgaagcttt ggtttctcaa accgaagttg ttgaattggc tttgggtttg 900

gaattgtctg gtttgccatt tgtttgggct tacagaaaac ctaaaggtcc agctaagtct 960

gattctgttg aattgccaga tggtttcgtt gaaagaacta gagatagagg tttggtttgg 1020

acttcttggg ctccacaatt gagaattttg tctcatgaat ccgtctgtgg tttcttgact 1080

cattgtggtt ctggttctat cgttgaaggt ttgatgtttg gtcacccatt gattatgttg 1140

ccaatctttg gtgaccaacc attgaacgct agattattgg aagataagca agtcggtatc 1200

gaaatcccaa gaaatgaaga agatggttgc ttgaccaaag aatctgttgc tagatctttg 1260

agatccgttg tcgttgaaaa agaaggtgaa atctacaagg ctaacgctag agaattgtcc 1320

aagatctaca acgataccaa ggtcgaaaaa gaatacgttt cccaattcgt tgactacttg 1380

gaaaagaatg ctagagctgt tgccattgat catgaatctt ga 1422

<210> 6

<211> 297

<212> PRT

<213> Synechococcus sp.

<400> 6

Met Val Ala Gln Thr Phe Asn Leu Asp Thr Tyr Leu Ser Gln Arg Gln

1 5 10 15

Gln Gln Val Glu Glu Ala Leu Ser Ala Ala Leu Val Pro Ala Tyr Pro

20 25 30

Glu Arg Ile Tyr Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ala Gly Gly Lys

35 40 45

Arg Leu Arg Pro Ile Leu Cys Leu Ala Ala Cys Glu Leu Ala Gly Gly

50 55 60

Ser Val Glu Gln Ala Met Pro Thr Ala Cys Ala Leu Glu Met Ile His

65 70 75 80

Thr Met Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asn Asp Asp

85 90 95

Phe Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Asp Ile

100 105 110

Ala Ile Leu Ala Gly Asp Ala Leu Leu Ala Tyr Ala Phe Glu His Ile

115 120 125

Ala Ser Gln Thr Arg Gly Val Pro Pro Gln Leu Val Leu Gln Val Ile

130 135 140

Ala Arg Ile Gly His Ala Val Ala Ala Thr Gly Leu Val Gly Gly Gln

145 150 155 160

Val Val Asp Leu Glu Ser Glu Gly Lys Ala Ile Ser Leu Glu Thr Leu

165 170 175

Glu Tyr Ile His Ser His Lys Thr Gly Ala Leu Leu Glu Ala Ser Val

180 185 190

Val Ser Gly Gly Ile Leu Ala Gly Ala Asp Glu Glu Leu Leu Ala Arg

195 200 205

Leu Ser His Tyr Ala Arg Asp Ile Gly Leu Ala Phe Gln Ile Val Asp

210 215 220

Asp Ile Leu Asp Val Thr Ala Thr Ser Glu Gln Leu Gly Lys Thr Ala

225 230 235 240

Gly Lys Asp Gln Ala Ala Ala Lys Ala Thr Tyr Pro Ser Leu Leu Gly

245 250 255

Leu Glu Ala Ser Arg Gln Lys Ala Glu Glu Leu Ile Gln Ser Ala Lys

260 265 270

Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Pro Leu Leu Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Phe Ile Thr Arg Arg Gln His

290 295

<210> 7

<211> 827

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 7

Met Val Leu Ser Ser Ser Cys Thr Thr Val Pro His Leu Ser Ser Leu

1 5 10 15

Ala Val Val Gln Leu Gly Pro Trp Ser Ser Arg Ile Lys Lys Lys Thr

20 25 30

Asp Thr Val Ala Val Pro Ala Ala Ala Gly Arg Trp Arg Arg Ala Leu

35 40 45

Ala Arg Ala Gln His Thr Ser Glu Ser Ala Ala Val Ala Lys Gly Ser

50 55 60

Ser Leu Thr Pro Ile Val Arg Thr Asp Ala Glu Ser Arg Arg Thr Arg

65 70 75 80

Trp Pro Thr Asp Asp Asp Asp Ala Glu Pro Leu Val Asp Glu Ile Arg

85 90 95

Ala Met Leu Thr Ser Met Ser Asp Gly Asp Ile Ser Val Ser Ala Tyr

100 105 110

Asp Thr Ala Trp Val Gly Leu Val Pro Arg Leu Asp Gly Gly Glu Gly

115 120 125

Pro Gln Phe Pro Ala Ala Val Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gln Leu Pro

130 135 140

Asp Gly Ser Trp Gly Asp Ala Ala Leu Phe Ser Ala Tyr Asp Arg Leu

145 150 155 160

Ile Asn Thr Leu Ala Cys Val Val Thr Leu Thr Arg Trp Ser Leu Glu

165 170 175

Pro Glu Met Arg Gly Arg Gly Leu Ser Phe Leu Gly Arg Asn Met Trp

180 185 190

Lys Leu Ala Thr Glu Asp Glu Glu Ser Met Pro Ile Gly Phe Glu Leu

195 200 205

Ala Phe Pro Ser Leu Ile Glu Leu Ala Lys Ser Leu Gly Val His Asp

210 215 220

Phe Pro Tyr Asp His Gln Ala Leu Gln Gly Ile Tyr Ser Ser Arg Glu

225 230 235 240

Ile Lys Met Lys Arg Ile Pro Lys Glu Val Met His Thr Val Pro Thr

245 250 255

Ser Ile Leu His Ser Leu Glu Gly Met Pro Gly Leu Asp Trp Ala Lys

260 265 270

Leu Leu Lys Leu Gln Ser Ser Asp Gly Ser Phe Leu Phe Ser Pro Ala

275 280 285

Ala Thr Ala Tyr Ala Leu Met Asn Thr Gly Asp Asp Arg Cys Phe Ser

290 295 300

Tyr Ile Asp Arg Thr Val Lys Lys Phe Asn Gly Gly Val Pro Asn Val

305 310 315 320

Tyr Pro Val Asp Leu Phe Glu His Ile Trp Ala Val Asp Arg Leu Glu

325 330 335

Arg Leu Gly Ile Ser Arg Tyr Phe Gln Lys Glu Ile Glu Gln Cys Met

340 345 350

Asp Tyr Val Asn Arg His Trp Thr Glu Asp Gly Ile Cys Trp Ala Arg

355 360 365

Asn Ser Asp Val Lys Glu Val Asp Asp Thr Ala Met Ala Phe Arg Leu

370 375 380

Leu Arg Leu His Gly Tyr Ser Val Ser Pro Asp Val Phe Lys Asn Phe

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515 520 525

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Tyr Gly Cys Asn Met Asp Lys Asn Val Trp Glu Asn Pro Glu Glu Trp

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Ile

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<213> Arabidopsis thaliana

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<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

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Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Thr Glu Gly Asn Asp Arg Gly Glu

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Trp Leu Lys Asn Leu Lys Tyr Gly Val Phe Gly Leu Gly Asn Arg Gln

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Leu Leu Asp Met Ser Pro Asp Thr Tyr Phe Ser Leu His Ala Glu Lys

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Glu Asp Gly Thr Pro Ile Ser Ser Ser Leu Pro Pro Pro Phe Pro Pro

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Cys Asn Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr Ala Cys Leu Leu Ser Ser

405 410 415

Pro Lys Lys Ser Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala His Ala Ser Asp Pro

420 425 430

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435 440 445

Glu Tyr Ser Lys Trp Val Val Glu Ser Gln Arg Ser Leu Leu Glu Val

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Pro Lys Ile Ala Glu Thr Arg Ile His Val Thr Cys Ala Leu Val Tyr

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515 520 525

Met Lys Asn Ala Val Pro Tyr Glu Lys Ser Glu Lys Leu Phe Leu Gly

530 535 540

Arg Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Ser

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Lys Val Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe

565 570 575

Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Val Glu Ser Gly Val Glu

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Leu Gly Pro Ser Val Leu Phe Phe Gly Cys Arg Asn Arg Arg Met Asp

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Val Gln His Lys Met Met Asp Lys Ala Ser Asp Ile Trp Asn Met Ile

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Ser Gln Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Gly Met Ala

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Arg Asp Val His Arg Ser Leu His Thr Ile Ala Gln Glu Gln Gly Ser

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<213> Oryza sativa

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Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

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Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

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Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

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245 250 255

Thr Arg Met Glu Thr Lys Ile Gln Arg Leu Tyr Phe Arg Arg Lys Ala

260 265 270

Val Met Thr Ala Leu Ile Asn Glu Gln Lys Lys Arg Ile Ala Ser Gly

275 280 285

Glu Glu Ile Asn Cys Tyr Ile Asp Phe Leu Leu Lys Glu Gly Lys Thr

290 295 300

Leu Thr Met Asp Gln Ile Ser Met Leu Leu Trp Glu Thr Val Ile Glu

305 310 315 320

Thr Ala Asp Thr Thr Met Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Tyr Glu Val

325 330 335

Ala Lys Asp Ser Lys Arg Gln Asp Arg Leu Tyr Gln Glu Ile Gln Lys

340 345 350

Val Cys Gly Ser Glu Met Val Thr Glu Glu Tyr Leu Ser Gln Leu Pro

355 360 365

Tyr Leu Asn Ala Val Phe His Glu Thr Leu Arg Lys His Ser Pro Ala

370 375 380

Ala Leu Val Pro Leu Arg Tyr Ala His Glu Asp Thr Gln Leu Gly Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Ile Pro Ala Gly Thr Glu Ile Ala Ile Asn Ile Tyr Gly Cys

405 410 415

Asn Met Asp Lys His Gln Trp Glu Ser Pro Glu Glu Trp Lys Pro Glu

420 425 430

Arg Phe Leu Asp Pro Lys Phe Asp Pro Met Asp Leu Tyr Lys Thr Met

435 440 445

Ala Phe Gly Ala Gly Lys Arg Val Cys Ala Gly Ser Leu Gln Ala Met

450 455 460

Leu Ile Ala Cys Pro Thr Ile Gly Arg Leu Val Gln Glu Phe Glu Trp

465 470 475 480

Lys Leu Arg Asp Gly Glu Glu Glu Asn Val Asp Thr Val Gly Leu Thr

485 490 495

Thr His Lys Arg Tyr Pro Met His Ala Ile Leu Lys Pro Arg Ser

500 505 510

<210> 21

<211> 523

<212> PRT

<213> Rubus suavissimus

<400> 21

Met Glu Val Thr Val Ala Ser Ser Val Ala Leu Ser Leu Val Phe Ile

1 5 10 15

Ser Ile Val Val Arg Trp Ala Trp Ser Val Val Asn Trp Val Trp Phe

20 25 30

Lys Pro Lys Lys Leu Glu Arg Phe Leu Arg Glu Gln Gly Leu Lys Gly

35 40 45

Asn Ser Tyr Arg Phe Leu Tyr Gly Asp Met Lys Glu Asn Ser Ile Leu

50 55 60

Leu Lys Gln Ala Arg Ser Lys Pro Met Asn Leu Ser Thr Ser His Asp

65 70 75 80

Ile Ala Pro Gln Val Thr Pro Phe Val Asp Gln Thr Val Lys Ala Tyr

85 90 95

Gly Lys Asn Ser Phe Asn Trp Val Gly Pro Ile Pro Arg Val Asn Ile

100 105 110

Met Asn Pro Glu Asp Leu Lys Asp Val Leu Thr Lys Asn Val Asp Phe

115 120 125

Val Lys Pro Ile Ser Asn Pro Leu Ile Lys Leu Leu Ala Thr Gly Ile

130 135 140

Ala Ile Tyr Glu Gly Glu Lys Trp Thr Lys His Arg Arg Ile Ile Asn

145 150 155 160

Pro Thr Phe His Ser Glu Arg Leu Lys Arg Met Leu Pro Ser Phe His

165 170 175

Gln Ser Cys Asn Glu Met Val Lys Glu Trp Glu Ser Leu Val Ser Lys

180 185 190

Glu Gly Ser Ser Cys Glu Leu Asp Val Trp Pro Phe Leu Glu Asn Met

195 200 205

Ser Ala Asp Val Ile Ser Arg Thr Ala Phe Gly Thr Ser Tyr Lys Lys

210 215 220

Gly Gln Lys Ile Phe Glu Leu Leu Arg Glu Gln Val Ile Tyr Val Thr

225 230 235 240

Lys Gly Phe Gln Ser Phe Tyr Ile Pro Gly Trp Arg Phe Leu Pro Thr

245 250 255

Lys Met Asn Lys Arg Met Asn Glu Ile Asn Glu Glu Ile Lys Gly Leu

260 265 270

Ile Arg Gly Ile Ile Ile Asp Arg Glu Gln Ile Ile Lys Ala Gly Glu

275 280 285

Glu Thr Asn Asp Asp Leu Leu Gly Ala Leu Met Glu Ser Asn Leu Lys

290 295 300

Asp Ile Arg Glu His Gly Lys Asn Asn Lys Asn Val Gly Met Ser Ile

305 310 315 320

Glu Asp Val Ile Gln Glu Cys Lys Leu Phe Tyr Phe Ala Gly Gln Glu

325 330 335

Thr Thr Ser Val Leu Leu Ala Trp Thr Met Val Leu Leu Gly Gln Asn

340 345 350

Gln Asn Trp Gln Asp Arg Ala Arg Gln Glu Val Leu Gln Val Phe Gly

355 360 365

Ser Ser Lys Pro Asp Phe Asp Gly Leu Ala His Leu Lys Val Val Thr

370 375 380

Met Ile Leu Leu Glu Val Leu Arg Leu Tyr Pro Pro Val Ile Glu Leu

385 390 395 400

Ile Arg Thr Ile His Lys Lys Thr Gln Leu Gly Lys Leu Ser Leu Pro

405 410 415

Glu Gly Val Glu Val Arg Leu Pro Thr Leu Leu Ile His His Asp Lys

420 425 430

Glu Leu Trp Gly Asp Asp Ala Asn Gln Phe Asn Pro Glu Arg Phe Ser

435 440 445

Glu Gly Val Ser Lys Ala Thr Lys Asn Arg Leu Ser Phe Phe Pro Phe

450 455 460

Gly Ala Gly Pro Arg Ile Cys Ile Gly Gln Asn Phe Ser Met Met Glu

465 470 475 480

Ala Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ile Leu Gln His Phe Thr Phe Glu Leu

485 490 495

Ser Pro Ser His Ala His Ala Pro Ser His Arg Ile Thr Leu Gln Pro

500 505 510

Gln Tyr Gly Val Arg Ile Ile Leu His Arg Arg

515 520

<210> 22

<211> 701

<212> PRT

<213> Siraitia grosvenorii

<400> 22

Met Lys Val Ser Pro Phe Glu Phe Met Ser Ala Ile Ile Lys Gly Arg

1 5 10 15

Met Asp Pro Ser Asn Ser Ser Phe Glu Ser Thr Gly Glu Val Ala Ser

20 25 30

Val Ile Phe Glu Asn Arg Glu Leu Val Ala Ile Leu Thr Thr Ser Ile

35 40 45

Ala Val Met Ile Gly Cys Phe Val Val Leu Met Trp Arg Arg Ala Gly

50 55 60

Ser Arg Lys Val Lys Asn Val Glu Leu Pro Lys Pro Leu Ile Val His

65 70 75 80

Glu Pro Glu Pro Glu Val Glu Asp Gly Lys Lys Lys Val Ser Ile Phe

85 90 95

Phe Gly Thr Gln Thr Gly Thr Ala Glu Gly Phe Ala Lys Ala Leu Ala

100 105 110

Asp Glu Ala Lys Ala Arg Tyr Glu Lys Ala Thr Phe Arg Val Val Asp

115 120 125

Leu Asp Asp Tyr Ala Ala Asp Asp Asp Gln Tyr Glu Glu Lys Leu Lys

130 135 140

Asn Glu Ser Phe Ala Val Phe Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Asp Gly Glu

145 150 155 160

Pro Thr Asp Asn Ala Ala Arg Phe Tyr Lys Trp Phe Ala Glu Gly Lys

165 170 175

Glu Arg Gly Glu Trp Leu Gln Asn Leu His Tyr Ala Val Phe Gly Leu

180 185 190

Gly Asn Arg Gln Tyr Glu His Phe Asn Lys Ile Ala Lys Val Ala Asp

195 200 205

Glu Leu Leu Glu Ala Gln Gly Gly Asn Arg Leu Val Lys Val Gly Leu

210 215 220

Gly Asp Asp Asp Gln Cys Ile Glu Asp Asp Phe Ser Ala Trp Arg Glu

225 230 235 240

Ser Leu Trp Pro Glu Leu Asp Met Leu Leu Arg Asp Glu Asp Asp Ala

245 250 255

Thr Thr Val Thr Thr Pro Tyr Thr Ala Ala Val Leu Glu Tyr Arg Val

260 265 270

Val Phe His Asp Ser Ala Asp Val Ala Ala Glu Asp Lys Ser Trp Ile

275 280 285

Asn Ala Asn Gly His Ala Val His Asp Ala Gln His Pro Phe Arg Ser

290 295 300

Asn Val Val Val Arg Lys Glu Leu His Thr Ser Ala Ser Asp Arg Ser

305 310 315 320

Cys Ser His Leu Glu Phe Asn Ile Ser Gly Ser Ala Leu Asn Tyr Glu

325 330 335

Thr Gly Asp His Val Gly Val Tyr Cys Glu Asn Leu Thr Glu Thr Val

340 345 350

Asp Glu Ala Leu Asn Leu Leu Gly Leu Ser Pro Glu Thr Tyr Phe Ser

355 360 365

Ile Tyr Thr Asp Asn Glu Asp Gly Thr Pro Leu Gly Gly Ser Ser Leu

370 375 380

Pro Pro Pro Phe Pro Ser Cys Thr Leu Arg Thr Ala Leu Thr Arg Tyr

385 390 395 400

Ala Asp Leu Leu Asn Ser Pro Lys Lys Ser Ala Leu Leu Ala Leu Ala

405 410 415

Ala His Ala Ser Asn Pro Val Glu Ala Asp Arg Leu Arg Tyr Leu Ala

420 425 430

Ser Pro Ala Gly Lys Asp Glu Tyr Ala Gln Ser Val Ile Gly Ser Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Leu Glu Val Met Ala Glu Phe Pro Ser Ala Lys Pro Pro

450 455 460

Leu Gly Val Phe Phe Ala Ala Val Ala Pro Arg Leu Gln Pro Arg Phe

465 470 475 480

Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Met Ala Pro Ser Arg Ile His Val

485 490 495

Thr Cys Ala Leu Val Tyr Asp Lys Met Pro Thr Gly Arg Ile His Lys

500 505 510

Gly Val Cys Ser Thr Trp Met Lys Asn Ser Val Pro Met Glu Lys Ser

515 520 525

His Glu Cys Ser Trp Ala Pro Ile Phe Val Arg Gln Ser Asn Phe Lys

530 535 540

Leu Pro Ala Glu Ser Lys Val Pro Ile Ile Met Val Gly Pro Gly Thr

545 550 555 560

Gly Leu Ala Pro Phe Arg Gly Phe Leu Gln Glu Arg Leu Ala Leu Lys

565 570 575

Glu Ser Gly Val Glu Leu Gly Pro Ser Ile Leu Phe Phe Gly Cys Arg

580 585 590

Asn Arg Arg Met Asp Tyr Ile Tyr Glu Asp Glu Leu Asn Asn Phe Val

595 600 605

Glu Thr Gly Ala Leu Ser Glu Leu Val Ile Ala Phe Ser Arg Glu Gly

610 615 620

Pro Thr Lys Glu Tyr Val Gln His Lys Met Ala Glu Lys Ala Ser Asp

625 630 635 640

Ile Trp Asn Leu Ile Ser Glu Gly Ala Tyr Leu Tyr Val Cys Gly Asp

645 650 655

Ala Lys Gly Met Ala Lys Asp Val His Arg Thr Leu His Thr Ile Met

660 665 670

Gln Glu Gln Gly Ser Leu Asp Ser Ser Lys Ala Glu Ser Met Val Lys

675 680 685

Asn Leu Gln Met Asn Gly Arg Tyr Leu Arg Asp Val Trp

690 695 700

Claims (44)

1.一种用于生产甜菊糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在培养基中生长能够产生一种或多种甜菊醇糖苷的工程化酵母，其中所述工程化酵母以第一范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长；并且其中包含葡萄糖的组合物根据第一模式添加到所述培养基；以及

(b)用所述工程化酵母发酵所述培养基以产生所述一种或多种甜菊醇糖苷，其中在发酵期间，包含葡萄糖的组合物根据不同于所述第一模式的第二模式添加到所述培养基，并且在发酵期间，所述酵母以第二范围内的一种或多种生长速率(稀释速率)生长，其中所述第二范围小于所述第一范围。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述生长速率(稀释速率)为0.06h^-1或更大。

3.如权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中，所述第一范围为0.06h^-1至0.17h^-1。

4.如权利要求3所述的方法，其中在步骤(a)中，所述第一范围为0.09h^-1至0.15h^-1。

5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述生长速率(稀释速率)为0.09h^-1或更小。

6.如权利要求5所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二范围为0.015h^-1至0.09h^-1。

7.如权利要求6所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二范围为0.015h^-1至0.06h^-1。

8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中所述生长速率(稀释速率)的范围为步骤(a)中的最大生长速率(稀释速率)的50％-90％。

9.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，包含葡萄糖的所述组合物根据为非恒定进料速率的所述第一模式添加到所述培养基。

10.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，包含葡萄糖的所述组合物根据为恒定进料速率的所述第二模式添加到所述培养基。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述恒定进料速率不大于10g葡萄糖/L培养基/h。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述恒定进料速率的范围为2g葡萄糖/L培养基/h至10g葡萄糖/L培养基/h。

13.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中包括改变添加葡萄糖的所述第一模式以降低所述工程化酵母的所述生长速率的一个或多个子步骤。

14.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中碱被添加来为所述培养基提供比步骤(a)中所述培养基的pH更高的所述pH。

15.如权利要求14所述的方法，其中在步骤(b)中，所述培养基的所述pH为6.0或更大。

16.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)在所述培养基中的葡萄糖少于3g/L时开始。

17.如权利要求16所述的方法，其中步骤(a)从步骤(a)开始时间进行多至40小时的时间。

18.如权利要求16所述的方法，其中步骤(b)在从步骤(a)开始的30小时或更迟的时间进行。

19.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)从所述工程化酵母的最初培养开始进行多至130小时。

20.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述工程化酵母生长到至少5g dcw/L的生物质量。

21.如权利要求20所述的方法，其中在步骤(a)中，所述工程化酵母生长到20g dcw/L至60g dcw/L范围内的生物质量。

22.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述工程化酵母并不生长到大于180gdcw/L的生物质量。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括提供包含所述工程化酵母的接种培养基的步骤，其中所述接种培养基用于形成步骤(a)的所述第一培养基。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中，所述第二培养基包含葡萄糖、氮源、钾源、镁源、磷酸根源、镁源、痕量金属、维生素以及消泡剂。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷包括莱苞迪苷M、莱苞迪苷D或莱苞迪苷M和莱苞迪苷D两者。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述工程化酵母选自由以下项的物种组成的组：假丝酵母属、克氏酵母属(有孢汉逊酵母属)、克鲁维酵母属、油脂酵母属、毕赤酵母属(汉逊酵母属)、红酵母属、酵母菌、酵母属、裂殖酵母属、球拟酵母属、有孢圆酵母属、耶氏酵母属以及接合酵母属的物种。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述工程化酵母是酿酒酵母。

28.一种发酵培养基，其包含根据前述权利要求中任一项所述的方法获得的甜菊醇糖苷。

29.一种甜菊醇糖苷组合物，其根据权利要求1-28中任一项所述的方法获得。

30.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)期间，所述培养基中的葡萄糖浓度不大于5g/L。

31.如权利要求30所述的方法，其中在步骤(a)期间，所述培养基中的葡萄糖浓度不大于5g/L。

32.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)期间，所述培养基中的葡萄糖浓度不大于5g/L。

33.如权利要求32所述的方法，其中在步骤(b)期间，所述培养基中的葡萄糖浓度不大于5g/L。

34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

i.测量如权利要求1所述的步骤(b)中的所述工程化酵母的呼吸商(RQ)，以确定所述RQ是否处于约0.5至约2.0的范围内；

ii.当所述RQ在所述RQ范围之外时，调节所述第二模式的所述葡萄糖添加速率；以及

iii.在用所述工程化酵母细胞发酵所述培养基的整个步骤中重复步骤(i)和(ii)。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述RQ范围为0.9至约1.5。

36.如权利要求34所述的方法，其中所述RQ范围为1.0至约1.3。

37.如权利要求34所述的方法，其中所述RQ从每四小时测量一次到每小时测量一次。

38.如权利要求34所述的方法，其中步骤(iii)使用连接到测量所述RQ的设备或软件的反馈控制机构来自动地进行。

39.如权利要求34所述的方法，其中约0.5至约2.0的所述所需RQ范围是在所述发酵开始之后的约20-40小时获得。

40.如权利要求34所述的方法，其中测量步骤(i)通过对所述发酵的废气进行采样来进行。

41.如权利要求34所述的方法，其中测量步骤(i)使用质谱仪、红外分析仪或顺磁分析仪来进行。

42.如权利要求34所述的方法，其中在步骤(ii)中，调节所述第二模式的所述葡萄糖添加速率通过当所述RQ降至所述RQ范围以下时增加葡萄糖或当所述RQ高于所述RQ范围时降低所述葡萄糖进料速率来调节。

43.如权利要求34-42中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖添加速率在步骤(ii)中调节以将所述RQ保持在约0.5至约2.0、0.9至约1.5或1.0至约1.3中。

44.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中莱苞迪苷D和莱苞迪苷M的组合生产速率为至少0.02g L^-1h^-1、0.03g L^-1h^-1、0.04g L^-1h^-1、0.05g L^-1h^-1、0.06g L^-1h^-1、0.07g L^-1h^-1或0.075g L^-1h^-1。