JP2018521636A

JP2018521636A - 多段階供給を用いる、ステビオール配糖体を生成するための発酵方法

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Publication number: JP2018521636A
Application number: JP2017561913A
Authority: JP
Inventors: ジェイムズ・シー・アンダーソン; ティン・リウ・カールソン; アーリーン・エム・フォスマー
Original assignee: カーギル・インコーポレイテッド
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2018-08-09
Also published as: US11225678B2; CN107614677A; BR112017025709A2; EP3303552A1; WO2016196368A1; US20180148750A1; AU2020201727A1; AU2016270656A1; US11739353B2; EP3303552A4; US20220154230A1; AU2016270656B2; CA2987630A1; BR112017025709B1

Abstract

組換え酵母菌を使用して、レバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＭ等のステビオール配糖体を生成する方法を開示する。本方法は、少なくとも２つの段階：グルコース含有供給組成物が、各段階において異なる供給方法、例えば可変供給、及び続いて一定供給で培地に提供される、第１及び第２の段階を含む。２段階供給は、第１段階よりも第２段階において遅い増殖速度、並びに、結果的にステビオール配糖体生成速度の増加、発酵時間の減少、及びバイオマス濃度の低下をもたらすことができる。

Description

配列表の参照：
本出願は、２０１６年５月２７日に作成された、「ＣＡＲ０２１２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と題する、９２キロバイトのサイズを有するＡＳＣＩＩテキストファイルとして本明細書と同時に提出された、アミノ酸配列及び／または核酸配列への参照を含む。配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従い、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年５月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／１６８，３７２号に対する優先権を主張し、その全体が本明細書に参照として組み込まれる。

本発明は、ステビオール配糖体を生成するための発酵方法、発酵組成物、及び、発酵により生成されたステビオール配糖体組成物に関する。

スクロース、フルクトース及びグルコース等の糖類は、飲料、食料、薬剤、及び口腔衛生／化粧用製品に気持ちの良い風味をもたらすために利用されている。特にスクロースは、消費者に好まれる風味を付与する。スクロースは優れた甘味特性をもたらすが、カロリーが高い。消費者の需要を満たすために、非高カロリー、または低カロリーの甘味料が導入されてきており、好ましい風味特性を有するこれらの種類の甘味料に対する要求が存在する。

ステビアは、ヒマワリ科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）における約２４０種の草本及び低木の属であり、北米の西部から南アメリカの亜熱帯及び熱帯領域に原生している。スイートリーフ（ｓｗｅｅｔｌｅａｆ）、スイートリーフ（ｓｗｅｅｔｌｅａｆ）、糖葉、または単にステビアとして一般に知られている種Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａは、その甘みのある葉のために、広範にわたり栽培されている。ステビアベースの甘味料は、葉から１種以上の甘味化合物を抽出することにより得てもよい。これら化合物の多くはステビオール配糖体であり、これらはステビオールの配糖体、すなわちジテルペン化合物である。これらのジテルペン配糖体は、糖類よりも約１５０〜４５０倍甘い。ステビオール配糖体は、甘味度（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓｐｏｗｅｒ）、及び、苦味、長続きする後味といった風味の質に寄与する他の感覚的特徴が互いに異なっている。Ａ．Ｄ．，Ｓｔｅｖｉａ：ＴｈｅｇｅｎｕｓＳｔｅｖｉａ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００２）を参照のこと。

ステビオール配糖体の例は、ＷＯ２０１３／０９６４２０（図１の一覧を参照のこと）、及び、Ｏｈｔａｅｔ．ａｌ．，“ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｏｖｅｌＳｔｅｖｉｏｌＧｌｙｃｏｓｉｄｅｓｆｒｏｍＬｅａｖｅｓｏｆＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＭｏｒｉｔａ，”Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｉ．，５７，１９９−２０９（２０１０）（例えば、ｐ２０４の表４を参照のこと）に記載されている。構造上、ジテルペン配糖体は単一コア構造であるステビオールを特徴とし、図２ａ〜２ｋに示すように、位置Ｃ１３及びＣ１９における糖質残基の存在が異なる。ＰＣＴ特許公報第ＷＯ２００１３／０９６４２０号もまた参照のこと。

通常、乾燥重量基準で、ステビアの葉で見出される４種類の主要なステビオール配糖体は、ズルコシドＡ（０．３％）、レバウディオサイドＣ（０．６〜１．０％）、レバウディオサイドＡ（３．８％）、及びステビオシド（９．１％）である。ステビア抽出物で同定された他のグリコシド類としては、レバウディオサイドＢ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、ステビオルビオシド、及びルブソシドの１つ以上が挙げられる。

主要なステビオール配糖体であるＲｅｂＡは、飲料用途において甘味剤として一般に使用されるものの、異味問題を有する。更に最近では、よりよい風味特性を有する、特定の種の微量のステビオール配糖体に焦点が置かれている。例えば、レバウディオサイドＭはより高い甘味強度を有し、他のステビオール配糖体よりも一層強力である（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８：１５２３−１５２６、及びＷＯ２０１３／０９６４２０を参照のこと）。レバウディオサイドＤの味はスクロースよりも約２００〜２２０倍甘く、感覚的評価では、甘みはゆっくりと始まってとてもすっきりしていた、即ち、スクロースよりも全体的に甘く、スクロースと比較して長続きする甘い後味が少なかった（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ，Ｉ．，ｅｔａｌ．（２０１２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３：１５１２６−１５１３６を参照のこと）。

発酵によりステビオール配糖体を合成可能な組換え生命体を調製するために、分子技術が使用されてきた。例えば、ステビオール配糖体合成に関係する、複数の導入遺伝子をコードする酵素を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え株は、レバウディオサイドＭ及びレバウディオサイドＤの生成のために使用されてきた（例えば、ＷＯ２０１４／１２２２２７を参照のこと）。しかし、組換え生命体を使用する現在の発酵方法は、望ましいステビオール配糖体の生成速度を十分にもたらすことはなく、多量のバイオマスの生成、及び、所望のステビオール配糖体の力価を達成するための、より長い発酵時間とも関係している。

本発明は一般に、組換え酵母菌を使用したステビオール配糖体の生成方法、及び発酵組成物、並びに、１種以上のステビオール配糖体を含む発酵製品に関する。本開示の発酵状態は、以下の１つ以上を促進することができる：組換え酵母菌からのステビオール配糖体の力価の増加、ステビオール配糖体の生成速度の増加を含む、細胞活性の増加、収率の増加、発酵時間の減少、及び、バイオマス濃度の低下。代表的実施形態において、本方法は、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、及びこれらの組み合わせ等のステビオール配糖体の生成に使用することができる。

本発明の一実施形態は、ステビオール配糖体（複数可）の生成方法を提供し、この方法は、
（ａ）培地中で１種以上のステビオール配糖体（複数可）を生成可能な組換え酵母菌を増殖させることであって、組換え酵母菌は、第１の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））にて増殖し、グルコース含有組成物が、第１の方法に従い培地に添加されることを含む、増殖させることと、
（ｂ）培地を組換え酵母菌により発酵させ、１種以上のステビオール配糖体（複数可）を生成することであって、発酵中に、第１の方法とは異なる第２の方法に従い、グルコース含有組成物が培地に添加され、発酵中に、酵母菌は、第２の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））で増殖し、第２の範囲は第１の範囲よりも小さい、生成することと、
を含む。

本発明の別の実施形態は、ステビオール配糖体（複数可）の生成方法を提供し、この方法は、
組換え酵母菌の増殖及び発酵を伴う、少なくとも工程（ａ）及び（ｂ）。工程（ａ）（即ち、第１段階）において、１種以上のステビオール配糖体（複数可）を生成可能な組換え酵母菌は、第１の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））にて、培地内で増殖する。工程（ａ）ではまた、酵母菌を第１の範囲内で増殖させる第１の方法に従い、グルコース含有組成物が培地に添加される。工程（ｂ）（即ち、第２段階）において、組換え酵母菌を発酵させて、１種以上のステビオール配糖体（複数可）を生成し、ここで、第１の方法とは異なる第２の方法に従い、グルコース含有組成物が培地に添加される。工程ｂ）の間に、第２の方法に従った添加を行うことで、第１の範囲よりも小さい第２の範囲内で、酵母菌が１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））にて増殖する。
を含む。

例示的な方法において、酵母菌は、工程（ａ）において、約０．０６ｈ^−１〜約０．１５ｈ^−１の範囲の増殖速度、及び、工程（ｂ）において、約０．０１５ｈ^−１〜約０．０９ｈ^−１の範囲の増殖速度を有する。工程（ａ）から工程（ｂ）への増殖速度の変化は、例えば、グルコース含有組成物を培地に添加する速度を変更すること、または、グルコース含有組成物を培地に添加する方法の変化、例えば、工程（ａ）において非一定速度の供給を行い、次いで工程（ｂ）において、一定速度の供給を行うことによる、添加「方法」の変化により引き起こすことができる。

別の例示的な方法において、組換え酵母菌は、工程（ａ）において、５ｇｄｃｗ／Ｌ〜６０ｇｄｃｗ／Ｌの範囲でバイオマス量まで、続いて、工程（ｂ）において、１５０ｇｄｃｗ／Ｌを超えないバイオマス量まで増殖する。

更に別の例示的方法では、組換え酵母菌は、呼吸商（ＲＱ）、酸素吸収速度（ＯＵＲ）、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）、またはこれらの組み合わせに基づいて、グルコースの供給速度を制御することにより増殖する。いくつかの例示的方法において、発酵段階の間にグルコースを、約０．５〜約２．０の範囲内のＲＱに調節する。

本発明はまた、本開示の方法に従って得られるステビオール配糖体（複数可）を含む発酵培地、及びまた、発酵培地から得たステビオール配糖体組成物も提供する。

例示的なメバロン酸経路を示す。

例示的な非メバロン酸経路を示す。

ステビオール生成のための例示的経路を示す。

ステビオールからのステビオール配糖体の生合成のための例示的経路を示す。

本明細書で記載される本開示の実施形態は排他的であることを意図するものでなく、または、本発明を、以下の詳細の説明に開示される正確な形態に限定することを意図するものでもない。むしろ、選択及び記載される実施形態の目的は、本発明の原理及び実践の当業者による評価及び理解を促進することを可能にするということである。

本開示の発酵方法では、ステビオール配糖体を生成可能な組換え酵母菌を用いる。ステビオール配糖体を生成可能な組換え酵母菌は、細胞内で１種以上のステビオール配糖体の形成を促進する酵素（複数可）をコードする１種以上の外来性核酸を含むことができる。

本明細書で使用する場合、用語「ステビオール配糖体（複数可）」は、ステビオールの配糖体を意味する。例示的なステビオール配糖体としては、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＧ、レバウディオサイドＨ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＬ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＯ、ステビオシド、ステビオルビオシド、ズルコシドＡ、ルブソシドが挙げられるが、これらに限定されない。組換え酵母菌は、自然に見出される（自然に発生する）ステビオール配糖体と同じステビオール配糖体、及び、自然に見出されないステビオール配糖体を生成することができる。ステビオール配糖体は、酵素プロセスにより組換え酵母菌内で形成することができる。

構造上、ステビオール配糖体は中心の分子部位を有し、これは単一のステビオール基部、並びに、以下に示す基部での原子ナンバリングに従った、ステビオール基部のＣ１３及び／またはＣ１９原子に結合したグルコピラノシル残基である。即ち、グルコピラノシル残基は、以下の式において、Ｒ_２基及びＲ_１基を示す。

以下の表Ａは、種々のステビオール配糖体、並びに対応するＲ_１基及びＲ_２基を示す。

Ｇｌｕ：グルコース
Ｒｈａ：ラムノース

本開示に従うと、ステビオール配糖体は、少なくとも２つの段階：グルコース含有供給組成物が、各フェーズにおいて異なる供給方法、例えば可変供給、及び続いて一定供給で培地に提供される、第１及び第２段階を有するプロセスで生成される。本明細書に記載した２段階供給プロセスは、第１段階よりも第２段階において遅い増殖速度、並びに、結果的にステビオール配糖体生成速度の増加、発酵時間の減少、及びバイオマス濃度の低下をもたらすことができる。組換え酵母菌は、ステビオール配糖体の合成のための経路を提供する一連の酵素を有することができる。例えば、本プロセスは、ＲｅｂＭ及びＲｅｂＤ等のステビオール配糖体を生成することができる。

本開示の方法は、組換えを行った種々の酵母菌宿主細胞を使用して、１種以上のステビオール配糖体への経路を提供することができる。このような細胞は、ステビオール配糖体合成のための、１つ以上のＤＮＡ構築物（複数可）をコードする酵素により形質転換することができる。ステビオール配糖体経路酵素をコードする外来性ＤＮＡ構築物に対する宿主に使用可能な例示的な酵母菌としては、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な種は、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。更に、宿主細胞はまた、発酵の間に向上した性能を付与し得る、ステビオール配糖体経路のもの以外の遺伝子組換えも含むことができる。

「組換え酵母菌」とは、細胞のゲノムに統合されたか、またはプラスミドもしくはエピソーム等の染色体外構築物に存在するかのいずれかの、細胞に導入された少なくとも１つの外来性ＤＮＡ配列を有する酵母細胞を意味する。用語「外来性」とは、宿主酵母菌に導入された分子（例えば核酸）、または活性（例えば酵素活性）を意味する。外来性核酸を、周知の技術によって酵母菌宿主に導入することが可能であり、かつ、宿主染色体物質の外部で維持可能である（例えば、非統合ベクターで維持可能である）か、または、例えば組換え事象により、酵母菌の染色体に統合することができる。一般に、組換え酵母菌のゲノムは、１つ以上の組換え遺伝子を安定的に導入することより補完される。外来性核酸は、酵母菌に相同または異種のいずれかである酵素、またはその一部をコードすることができる。外来性核酸は、分子技術により操作される１つ以上の方法で、自然に存在しない形態となった核酸を意味する「組換え遺伝子またはＤＮＡ構築物」の形態で存在することができる。

用語「異種」（例えば「非ネイティブ」）とは、言及される分子または生命体とは異なる源からの分子または活性を意味する。したがって、言及される生命体に異種である遺伝子またはタンパク質は、その生命体では見出されない遺伝子またはタンパク質である。本開示との関係においては、「異種グリコシルトランスフェラーゼ」とは、宿主生命体に対してネイティブであり得るあらゆるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドとも異なるグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを意味する。例えば、第１の種で見出され、第１の種とは異なる宿主酵母菌生命体に外来的に導入される特定のグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、宿主酵母菌に対して「異種」である。

組換え酵母菌は、ステビオール配糖体経路酵素をコードする核酸を有する形質転換体を選択するのに好適な栄養素要求性マーカーを用いることができる。宿主酵母菌は、栄養素要求性を制御する１種以上の遺伝子、例えばＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、及びＴＲＰ１における変異（欠失等）を含むことができる。１種以上の外来性遺伝子を導入するための所望の遺伝的背景を有する宿主細胞を用いることで、１つ以上の遺伝子構築物（複数可）を細胞に導入してゲノムに統合するか、または安定して保持され、発現を可能にする。遺伝子構築物を宿主細胞に導入するための方法としては形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、及び電気穿孔法が挙げられる。特に、酵母菌の形質転換は、酢酸リチウム法、プロトプラスト法等を使用して実施することができる。導入される遺伝子構築物は、プラスミドの形態で、または宿主の遺伝子内への挿入により、または宿主の遺伝子による相同組み換えにより、染色体に組み込まれてよい。遺伝子構築物が導入される形質転換酵母菌を、選択マーカー（例えば、上述した栄養素要求性マーカー）を用いて選択することができる。発現したタンパク質の活性、またはステビオール配糖体等のバイオ生成物の生成を測定することにより、更なる確認を行うことができる。

ステビオール経路遺伝子を含む外来性核酸配列の形質転換を、当該技術分野において周知の方法を用いて確認することができる。このような方法としては、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、もしくは遺伝子産物の発現のための免疫ブロット法、または、導入した核酸配列、もしくは対応するその遺伝子産物の発現を試験するための、他の好適な分析方法等の核酸分析が挙げられる。所望の生成物を生成するのに十分な量で外来性核酸が発現していることが、当業者によって理解されており、当該技術分野において周知の方法、及び本明細書で開示した方法を使用して、発現レベルを最適化して十分な発現を得ることができることが更に理解されている。

テルペノイド化合物であるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、組換え酵母菌において、ステビオール配糖体の化学物質前駆体として機能することができる。植物、昆虫、及びいくつかの微生物種を含むいくつかの生命体は、一連の化学的中間体を経由して、アセチル−ＣｏＡをＩＰＰ及びＤＭＡＰＰに転換するメバロン酸（ＭＶＡ）経路を有する。いくつかの生命体は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸（ＰＹＲ）から始まる非メバロン酸経路（メチルＤ−エリスリトール４−リン酸またはＭＥＰ経路としても知られている）によりＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを生成する。

酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはメバロン酸経路の遺伝子を自然に発現する。メバロン酸経路遺伝子は、（ａ１）アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、（ｂ１）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＣ４．１．３．５）；（ｃ１）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４）；（ｄ１）メバロン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．３６）；（ｅ１）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．２）；及び（ｆ１）メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．３３）を含む。メバロン酸経路の酵素は、以下の通りにアセチル−ＣｏＡをＩＰＰに転換する：アセチル−ＣｏＡ→アセトアセチル−ＣｏＡ→３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ→メバロン酸→メバロン酸−５−リン酸→メバロン酸−５−ピロリン酸→ＩＰＰ。図１もまた参照のこと。

いくつかの実施形態では、組換え酵母菌は、１つ以上の変異を含み、アセチル−ＣｏＡからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流動を増加させることができ、これにより、ステビオールへの経路に使用するためのＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰのプールの増加をもたらす。変異としては、例えば、発現の増加をもたらすプロモーターの制御下において、酵母菌細胞に相同もしくは異種である酵素をコードする核酸を配置すること、核酸の複数のコピーを使用すること、及び／または、ネイティブ酵素と比較して、より高レベルの酵素活性を提供する、異種酵素、変異酵素（例えば１つ以上のアミノ酸置換基を含むもの）、もしくは変異異種酵素を使用すること等により、１つ以上のメバロン酸経路酵素（ａ１）〜（ｆ１）の発現または活性を増加させること、を挙げることができる。

あるいは、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路を使用して、ステビオール配糖体生成の前駆体として、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを提供することができる。酵母菌Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ＭＥＰ経路の遺伝子を自然には発現しないが、所望により組換えを行うことで、ＭＥＰ経路遺伝子を付与することができる。理論上、ＭＥＰ経路は一般的に、ＭＶＡ経路と比較して、ＣＯ２として失う炭素がより少ない（ＭＥＰ経路：１ＣＯ２／ＩＰＰ；ＭＶＡ経路：４ＣＯ２／ＩＰＰ；炭素源としては糖）ため、エネルギー的により効率的である。

特に、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路においては、化合物のイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）は、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルベート（ＰＹＲ）から導かれる一連の中間体により生成され、多数の酵素がこの転換を担う。Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及びＤＭＡＰＰへの生合成経路に関与する酵素としては、（ａ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ２）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ｉｓｐＣ）、（ｃ２）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＩｓｐＤ）、（ｄ２）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＩｓｐＥ）、（ｅ２）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＦ）、（ｆ２）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＩｓｐＧ）、（ｇ２）４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＩｓｐＨ）、及び（ｈ２）イソペンテニル−二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）が挙げられる。図２を参照のこと。

発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法では、１つ以上の遺伝子変異を有する組換え酵母菌を使用して、Ｇ３Ｐ及びＰＹＲからＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰへの流動を増加させることができ、これにより、ステビオールへの経路に使用するためのＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰのプールの増加をもたらす。変異としては、例えば、発現の増加をもたらすプロモーターの制御下において、酵母菌細胞に異種の酵素をコードする核酸を配置すること、核酸の複数のコピーを使用すること、及び／または、高レベルの酵素活性を付与する異種酵素、変異酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換基を含むもの）、もしくは変異異種酵素により、１種以上の酵素（ａ２）〜（ｈ２）の発現または活性を増加させること等を挙げることができる。

組換え酵母菌を用いることができる、発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法はまた、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに転換する経路も含むことができる。例えば、いくつかの態様において、組換え酵母菌は、以下の酵素：（ａ３）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、（ｂ３）コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＰＳ）、（ｃ３）カウレンシンターゼ（ＫＳ）、（ｄ３）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、及び（ｅ３）カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）を発現する外来性核酸を含むことができる。図３を参照のこと。メバロン酸経路の酵素は、以下の通りにＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰをステビオールに転換する：ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ→ゲラニルゲラニル二リン酸→コパリル二リン酸→カウレン→カウレン酸→ステビオール。図３を参照のこと。酵母菌細胞に異種の酵素（ａ３）〜（ｅ３）をコードする外来性核酸を、核酸の複数のコピーを使用すること、及び／または変異酵素（例えば、１つ以上のアミノ酸置換基を含むもの）、もしくは、高レベルの酵素活性をもたらす変異異種酵素を使用して、発現の増加をもたらすプロモーターの制御下において配置することができる。

発酵によりステビオール配糖体（複数可）を生成するための本開示の方法では、ステビオールをステビオール配糖体に転換する任意の経路を有する組換え酵母菌を用いることができる。２種以上のステビオール配糖体経路酵素が組換え酵母菌に存在する場合、酵母菌は異なるステビオール配糖体を生成することが可能であり得る。例えば、酵母菌は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１種以上の異なるステビオール配糖体種を生成することが可能であり得る。

ステビオール配糖体経路は、活性化したヌクレオチド糖から受容体分子への、グリコシル残基の移動を仲立ちする１種以上のウリジン二リン酸（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含むことができる。ステビオール配糖体経路の場合、単糖類を、ステビオールもしくはステビオール配糖体分子上のヒドロキシルもしくはカルボキシル部位、または、ステビオール基部に結合したグルコース基上のヒドロキシル基に移動することができる。図４を参照のこと。ＵＧＴは、配列相同性に基づいてファミリー及びサブファミリーに分類されている。Ｌｉ，ｅｔａｌ．，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８−４３４３を参照のこと。それぞれが４２個のアミノ酸コンセンサス配列を含有する、ＵＧＴをコードする１００種以上の遺伝子のスーパーファミリーがモデル植物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａで同定されており、ＵＧＴをコードする遺伝子がいくつかの他のより高次の植物種でも同定されている。

例示的なＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ステビオール及び／またはステビオール配糖体基質に少なくとも１つのグルコース単位を付加して標的ステビオール配糖体をもたらすことができる、任意のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼであることができる。一実施形態では、組換え酵母菌は、群ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号：１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号：２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号：３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号：４）、並びにまた、これらのポリペプチドに実質的同一性（例えば＞８５％、＞７５％、＞６５％、＞５５％、＞４５％及び＞３５％）を有するＵＧＴから選択される、１つ以上のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを含むことができる。組換え酵母菌は、これらのＵＧＴをコードする１つ以上の外来性核酸分子（複数可）を含むことができる。

組換え酵母菌は更に、１種以上のＵＧＴ、及びＵＧＴ−グルコース再利用酵素（複数可）を含むことができる。少なくとも１つのグルコース単位をルブソシドに付加させてステビオシドを形成可能な、例示的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２である。少なくとも１つのグルコース単位をステビオシドに付加させてレバウディオサイドＡを形成可能な、例示的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。少なくとも１つのグルコース単位をレバウディオサイドＡに付加させて、レバウディオサイドＤを形成可能な例示的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ９１Ｄ２である。少なくとも１つのグルコース単位をレバウディオサイドＤに付加させて、レバウディオサイドＭを形成可能な例示的ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ＵＧＴ７６Ｇ１である。

ステビオール配糖体生成のための組換え微生物、及びステビオール配糖体経路酵素について記載している代表的な出版物としては、例えば、ＵＳ２０１４／０３５７５８８、ＷＯ２０１４／１９３９３４、ＷＯ２０１４／１９３８８８、及びＷＯ２０１４／１２２２２７が挙げられ、これらそれぞれの全体が参考として本明細書に組み込まれる。

一実施形態では、ステビオール配糖体の生成に有用な組換え酵母菌は、以下の酵素：ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）、ｅｎｔコパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、カウレンシンターゼ（ＫＳ）；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５Ｃ２及びＥＵＧＴ１１を発現する。ＷＯ２０１４／１２２２２７は、これらの酵素を発現する組換え酵母菌株について記載している。ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ポリペプチドをコードする遺伝子、例えば、ＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号：１）、ＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号：２）、ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号：３）、ＵＧＴ９１Ｄ２（配列番号：４）、及びＥＵＧＴ１１（配列番号：１３）であることができる。これらの遺伝子は、多数の反応を行うことが可能なポリペプチド、例えば、ａ）ステビオール配糖体の１９−ＯグルコースのＣ２’のβ−１，２グルコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｂ）ステビオール配糖体の１３−Ｏ−グルコースのＣ２’のβ−１，２−グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオール配糖体の１９−Ｏ−グルコースのＣ３’のβ−１，３グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｄ）ステビオール配糖体の１３−Ｏ−グルコースのＣ３’のβ−１，３−グリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｉ）ステビオールまたはステビオール配糖体の１３−ＯＨのグリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子；（ｊ）ステビオールまたはステビオール配糖体のＣ−１９カルボキシル基のグリコシル化が可能なポリペプチドをコードする遺伝子をコードする。例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２は反応（ｉ）を行い、ＵＧＴ７４Ｇ１は反応（ｊ）を行い、ＵＧＴ９１Ｄ２は反応（ａ；弱く）、（ｂ）を行い、ＵＧＴ７６Ｇ１は反応（ｃ）及び（ｄ）を行い、ＥＵＧＴ１１は反応（ａ）、（ｂ；さほど良好でない）を行う。

用語「培地」とは、組換え酵母菌または菌類を維持可能、これらが増殖可能、発酵可能、またはこれらの組み合わせが可能な液体組成物を意味する。「培地」はまた、「液体培地」または「細胞培養液」のように呼ばれてもよく、用語「増殖」「分裂」「呼吸」、及び「発酵」等の用語は、培地で発生する細胞活性の種類をより具体的に規定するために用いられ得る。

培地は、培地に存在する構成成分、及びそれらの量、例えば、（ａ）糖質（グルコース等）及びデンプン生成物（マルトデキストリン等）を含む炭素源；（ｂ）酵母菌窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ等の窒素源；（ｃ）リン酸カリウム（一塩基性、二塩基性）、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、及び塩化カルシウム等の塩類；（ｄ）ビオチン、パントテン酸カルシウム、葉酸、（ｍｙｏ）−イノシトール、ニコチン酸、ｐ−アミノ安息香酸、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣＬ、及びクエン酸等のビタミン類；並びに／または（ｅ）ホウ酸、硫酸銅、塩化コバルト、塩化カルシウム、ヨウ化カリウム、塩化第二鉄、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、モリブデン酸ナトリウム、及び硫酸亜鉛等の微量金属に対応して規定することができる。培地中の構成成分は、乾燥重量基準で規定することができる。更に、培地は水ベース、即ち「水性」組成物である。培地はまた、ｐＨ、及び生体適合性酸、塩基、及び、培地のｐＨを制御するために使用する緩衝液に関して規定することができる。

例示的実施形態において、工程（ａ）及び（ｂ）での培地内のグルコースの濃度を、約０ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、または０ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌの範囲に維持する。例示的実施形態において、酵母菌窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、酵母菌抽出物等の、培地内の窒素源（総量）の濃度は、約５ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌの範囲内である。例示的実施形態において、培地中の塩（総量）、例えば硫酸マグネシウムを含む塩の濃度は約０ｇ／Ｌ〜約１２ｇ／Ｌの範囲内であり、リン酸カリウムを含む塩の濃度は約０ｇ／Ｌ〜約２２ｇ／Ｌの範囲内である。例示的実施形態において、培地中の微量金属（総量）の濃度は、約０ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／Ｌ、または０ｇ／Ｌ〜約０．２ｇ／Ｌの範囲内である。

組換え酵母菌を含む培地に組成物（「供給組成物」）を添加して、培地の体積を増加させることができ、組換え酵母菌が培地内で増殖するにつれ、バイオマスの量が増加する。供給組成物は、酵母菌増殖及び発酵のための構成成分を含み、所望の培地を形成することができる。供給組成物としては、糖質（複数可）、窒素源（例えば水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム）、酵母菌抽出物、またはこれらの任意の組み合わせ；塩類、ビタミン類、及び微量金属を挙げることができる。供給組成物中の構成成分の濃度は、培地中の構成成分の濃度より高くてよく、そのため、供給組成物が添加された場合、組換え酵母菌の発酵に好適な培地中に、所望の量の構成成分をもたらす。

組換え酵母菌の発酵は、任意の植物及び植物部位、例えば塊茎、根、茎、葉、及び種子に由来可能な植物物質を含有するデンプン及び／または糖を用いて行うことができる。デンプン及び／または糖含有植物物質は、穀物、例えば大麦、小麦、トウモロコシ、ライ麦、サトウモロコシ、雑穀、大麦、ジャガイモ、キャッサバ、または米及びこれらの任意の組み合わせから入手することができる。デンプン及び／または糖含有植物物質は、例えばミリング、麦芽製造法、または部分的麦芽製造法等の方法により、加工することができる。いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び（ｂ）用の培地は、処理済みデンプンを含む。例えば、増殖及び／または発酵用培地は、部分加水分解デンプンを含むことができる。部分加水分解デンプンは、より分子量の大きいデキストリン、及びより分子量の大きいマルトデキストリンを含むことができる。ステビオール配糖体生成に有益な所望の範囲内の量で、デンプン及びデンプン分解生成物を有する部分加水分解デンプン生成物を使用することができる。

所望により、発酵段階の間に組換え酵母菌により利用可能な、グルコース等の単糖類の濃度を増加させるために、デンプン物質を含む培地に、デンプン分解酵素を添加することができる。例示的なデンプン分解酵素としては、グリコアミラーゼ及びアミラーゼ等のデンプン分解酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、フルクトース、スクロース、マルトース、マルトトリオース等の発酵可能な糖を、グルコースの代わりに、またはグルコースに加えて、培地中に含めることができる。

いくつかの任意の実践方法において、ステビオール含有化合物を含む培地内で発酵を行うことができる。このような化合物は、組換え酵母菌内のグルコシルトランスフェラーゼにより直接使用することができる。例えば、所望により、ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドまたはステビオール−１９−Ｏ−グルコシド含有培地内で発酵を行うことができる。この培地を用いることで、微生物が、機能的ＥＵＧＴ１１、機能的ＵＧＴ７４Ｇ１、機能的ＵＧＴ８５Ｃ２、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１、及び機能的ＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有し、これらを発現し得る。レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、及びレバウディオサイドＭ等の化合物を、発酵培地から入手することができる。別の選択肢として、ルブソシド含有培地内で発酵を行うことができる。この培地を用いることで、微生物が、機能的ＥＵＧＴ１１、機能的ＵＧＴ７６Ｇ１、及び機能的ＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有し、これらを発現し得る。レバウディオサイドＡ、Ｄ、及びＭ等の化合物を、発酵後の培地から入手してよい。

場合によっては、商業規模での経済的恩恵と制御を達成するために、工業的容量のある発酵槽内で発酵を行う。一実施形態では、発酵は、約１０，０００リットル以上の容量を有する発酵槽内で行われる。

用語「第１段階」及び「第２段階」（及び所望により、必要であれば「前段階」、「第３段階」、「第４段階」、「第５段階」等）を使用して、培地に関して、ステビオール配糖体の生成方法の態様を記載してよい。用語「段階（ｓｔａｇｅ）」を、「段階（ｐｈａｓｅ）」に関して用いてもよい。本プロセスは、例えば、供給組成物を、前の第１段階において供給組成物を添加する方法とは異なる方法で、処理後の第２段階において培地に添加することにより、培地が各段階で異なるように処理される、２つ以上の段階を含む。添加方法の違いは、組換え酵母菌の増殖、及び、本プロセス間におけるステビオール配糖体の生成に影響を与える。

（第１の添加方法により細胞増殖が制御される）第１段階の前に、細胞を「前段階」に従って培養することができる。前段階は、細胞が培地内で増殖し、培地構成成分（糖質、窒素源、塩類、ビタミン類、微量金属）に馴化する「播種／初期増殖段階」であることができる。細胞への糖質の供給は、この段階が第１段階と第２段階の間であるため、細胞が最大の生物学的速度で増殖し得るため、前段階において制御されない。例えば、前段階の細胞はバッチで供給されてよい。細胞が培地に馴化すると、細胞は増殖段階に突入し、細胞数が増加する。前段階の間、組換え酵母菌は出芽により増加することが可能であり、これは酵母菌分裂と呼ばれる。

例えば、前段階の間、糖質（複数可）、窒素源（酵母菌窒素塩基、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの任意の組み合わせ）、塩類、ビタミン類、及び微量金属を含む増殖組成物を、組換え酵母菌を含む培地にバッチプロセスで添加することができる。いくつかの実践方法においては、組成物を添加して、単一の窒素源として、水酸化アンモニウム、尿素、硫酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを有する培地を提供する。同一の組成物を、後の第１段階において供給組成物として使用することができ、この段階では、培地への供給組成物の添加方法により、細胞増殖が制御される。

急速な細胞増殖及びバイオマスの増加を特徴とする前段階の後、第１の添加方法に従って、組成物を含有するグルコースの添加を制御することにより、第１段階（例えば工程ａ）を開始することができる。第１段階は、例えば供給溶液がどのように培地に添加されるのか、そして、添加のその種類に応じてどのように細胞が増殖するのか等、種々の方法で記載することができる。

添加方法が、組換え酵母菌の倍加時間に影響を及ぼす可能性がある。第１段階における倍加時間は、前段階の倍加時間よりも長くすることができる（より遅い増殖）。第１段階の間、培地のバイオマスは増加することができるが、バイオマスは、前段階で見られる増加よりも低い速度で増加し得る。第１段階はまた、第２段階と比較して、細胞がどのように増殖するかの観点から記載することも可能であり、ここでは、供給溶液が、第１の方法とは異なる第２の方法で、培地に添加される。

例えば、第１段階において、酵母菌は１つ以上の増殖速度（複数可）を達成する条件下において、培地内で増殖することができる。増殖速度は、培地を発酵槽に供給し、第２段階における増殖よりも大きな第１の範囲内にある、特定の希釈速度（複数可）に到達する供給速度を制御することにより制御されてよい。例えば、播種／増殖段階において、増殖速度（μ）は、約０．０６ｈ^−１以上、例えば、約０．０６ｈ^−１〜約０．１７ｈ^−１、または約０．０９ｈ^−１〜約０．１５ｈ^−１の範囲内の速度であることができる。増殖は、例えば６００ｎｍにおける光学密度により測定することができる。増殖速度は、増殖速度測定に基づいて供給培地の供給速度を調整することにより、例えば、供給速度を増加させて増殖速度を増加させることにより、または、供給速度を低下させて増殖速度を低下させることにより、制御することができる。

所望により、第１段階は、培地内のグルコース濃度の観点から記載することができる。例えば、いくつかの実践方法においては、第１段階は、培地内に３ｇ／Ｌ未満のグルコースが存在するときに開始される（グルコースは、ＹＳ１２７００ＳｅｌｅｃｔＣｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｚｅｒ，ＹｅｌｌｏｗＳｐｒｉｎｇｓ，ＯＨを使用することにより測定してよい）。例えば、前段階の間の、培地内のグルコースの量を監視することができ、濃度が３ｇ／Ｌ未満に下がったときに、第１段階の供給を開始することができる。

第１段階における所望の増殖速度は、第１の方法に従ってグルコース含有組成物を培地に添加することにより達成可能である。「供給方法」とは、グルコースを含有する供給組成物を、組換え酵母菌を有する培地に添加する方法を意味する。供給方法は、一定速度の供給、非一定速度の供給、供給組成物の連続添加、供給組成物のバルク添加等を含む。いくつかの供給方法においては、第１段階の間に、供給組成物を非一定速度の供給で培地に添加する。例えば、非一定速度の供給は、変更可能な供給速度であることができる。

変更可能な供給速度とは、供給溶液を培地に添加する期間にわたって、２つ以上の異なる速度で、供給溶液を培地に添加することを意味する。いくつかの実践方法においては、変更可能な速度での供給の間に、一定時間を経て速度が低下する。例えば、本プロセスの増殖段階において、供給は、増殖段階初期の、より速い供給速度から、増殖段階後期における、より遅い供給速度に変化することができる。このことは、供給速度を一定に低下させることにより実施することができるか、または、一連の小さな漸減工程により実施することができる。任意の実践方法において、変更可能な供給速度は、供給速度を増加させた後、供給速度を低下させることを含むことができる。

変更可能な供給速度は、変更可能な速度の添加システムを用いて達成することができる。このようなシステムの例は、可変速度ポンプ、またはポンプに操作可能に接続された絞り弁（スロットルバルブ等）を含むことができ、このポンプまたは弁を利用して、時間の経過とともに発酵培地に導入される供給組成物の量を変化させることができる。

第１段階はまた、培地と関係する１つ以上のパラメーター、例えば、第１段階の期間、培地温度、増殖したバイオマスの量、及び培地のｐＨを参照して説明されてよい。いくつかの実践方法においては、変更可能な供給速度を行う第１段階を、約２時間以上〜最大約４０時間の期間行うことができる。例えば、第１段階は約１０時間以上、例えば、約１０時間〜約３０時間、または約１０時間〜約２４時間の期間とすることができる。第１段階は、組換え酵母菌の増殖誘導期の全てまたは一部、及び、組換え酵母菌の増殖対数（指数）期の全てまたは一部を包含してよい。この期間の後、続いて、グルコースを含む供給組成物を培地に添加する方法を（例えば、第２段階の一定供給速度に）変更することができる。

例示的な実践方法において、第１段階においては、培地を約２５〜３５℃、または２８〜３２℃の範囲の温度、最も好ましくは約３０℃に維持する。また、組換え酵母菌の増殖を通気、及び／または攪拌により行うことができる。通気条件は、培地に溶解した酸素量、したがって、組換え酵母菌に利用可能な酸素に影響を及ぼすことができる。組換え酵母菌により取り込まれる酸素の量は、培地中に酸素が、小さな酸素の泡を形成して供給される速度により制御することができ、この制御は攪拌及び／またはスパージにより達成することができる。

培地内においては、第１段階の間に通気を行うことができる。溶存酸素移動速度（単位ｍｇｍｉｎ^−１ｌｉｔｅｒ^−１）の観点から通気について記載してよい。通気はまた、溶存酸素（％）の観点からも記載してよい。（例えば、Ａｎｄｅｒｌｅｉ，Ｔ．，ａｎｄＢｕｃｈｓ，Ｊ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ．Ｊ．３４７８：１−６を参照のこと。）微小な気泡の形成を促進するスパージ技術を実施して、所望の通気をもたらすことができる。いくつかの実践方法においては、第１段階の間、攪拌及び通気は、例えば段階的に増加する。２段階供給プロセスを用いる本開示の方法はまた、培地での通気の必要性を低下させることができながら、依然として所望のステビオール配糖体生成をもたらす。いくつかの実践方法においては、溶存酸素は１５％を超えて維持される。

本明細書で使用する場合、「バイオマス」とは、組換え酵母菌の重量を意味し、バイオマスは、培地１リットルあたりの乾燥細胞重量（グラム）（ＤＣＷ／Ｌ）で測定することができる。別の例示的なパラメーターとして、いくつかの実践方法においては、変更可能な供給速度を用いる第１段階では、少なくとも約５ｄｃｗ／Ｌの量のバイオマスを生成する。生成されるバイオマスの量は、約５ｇｄｃｗ／Ｌ〜約６０ｇｄｃｗ／Ｌ、約２０ｇｄｃｗ／Ｌ〜約６０ｇｄｃｗ／Ｌ、または約２０ｇｄｃｗ／Ｌ〜約４０ｇｄｃｗ／Ｌの範囲であるのが好ましい。

別の例として、いくつかの実践方法においては、変更可能な供給速度を用いる第１段階は、６．０以下、または約５．５未満、及び好ましくは５．２未満、例えば、約４．０〜約５．２の範囲のｐＨにて実施される。第１段階の間、ｐＨは監視することができるので、所望の、より低いｐＨ範囲、例えば約４．０〜５．２の範囲内にとどまっている。酸または塩基を、供給中に培地に添加して、ｐＨを所望の範囲内に維持することができる。

第１段階の後、組換え酵母菌は、「発酵段階」等の第２段階に突入することができ、ここでは、供給組成物の供給方法が第１段階とは異なる。第２段階では、組換え酵母菌の増殖は少なくとも遅くなり、積極的に糖質を同化して、ステビオール配糖体（複数可）を生成する。本明細書で使用する場合、「発酵」は、ステビオール配糖体（複数可）の著しい生成段階を説明するために使用され、発酵は完全に好気性、部分的に好気性、または嫌気性条件で生じることができる。部分的好気性条件では、発酵及び呼吸経路の両方が活性となることができ、若干の細胞増殖が発生し得る。部分的好気性条件では、消費される酸素量は、播種／増殖段階の間より少量であることができる。

第２段階では、グルコースを含む供給組成物を、第１段階とは異なる方法で培地に添加することができる。いくつかの実践方法においては、第１及び第２段階は同一容器で実施され、第１段階の間に、グルコースを含有する供給溶液を変更可能な速度で容器内の培地に添加し、続いて、第２段階では、同じ容器内の培地に一定速度で供給溶液を添加する。

いくつかの実践方法においては、第２段階では、供給組成物を一定の供給速度で培地に添加する。例えば、一定の供給速度は１０ｇグルコース／Ｌ培地／ｈ以下であり、２ｇグルコース／Ｌ培地／ｈ〜１０ｇグルコース／Ｌ培地／ｈの範囲内の一定の供給速度であるのが好ましい。

例えば、ステビオール配糖体の発酵及び生成を含む第２段階において、酵母菌は、範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）を達成する条件下において、培地内で増殖することができる。例えば、第２段階では、増殖速度（複数可）は、約０．０９ｈ^−１以下、例えば、約０．０１５ｈ^−１〜約０．０９ｈ^−１、または約０．０１５ｈ^−１〜約０．０６ｈ^−１の範囲内の速度とすることができる。

いくつかの実践方法においては、一定速度の第２段階を一定期間行い、ステビオール配糖体の所望の生成をもたらすことができる。例えば、第２段階を、約３０時間の時期に、または工程（ａ）の開始後に開始することができ、続いて、工程（ａ）の開始から最大１３０時間実施することができる。第２段階は、ステビオール配糖体の大部分が生成される発酵段階の全てまたは一部を包含してよい。ステビオール配糖体（複数可）の大部分（即ち、５０％超）が、第２段階の間に組換え酵母菌により生成されるのが好ましい。２段階供給を含む本開示の方法は、発酵についての利点をもたらし、対照プロセス（例えば、１段階の発酵）と比較して、発酵時間の最大約２５％減少、あるいは最大約４０％減少を可能にする。

更に、いくつかの実践方法においては、一定の供給速度を用いる第２段階を制御することができるため、組換え酵母菌は１８０ｇｄｃｗ／Ｌより多いバイオマス量まで増殖しない。２段階供給を含む本開示の方法は、バイオマス生成についての利点をもたらし、１段階の発酵を用いる対照プロセスと比較して、生成されるバイオマス量の最大２５％低下を可能にする。

更に、いくつかの実践方法においては、第２段階の間に、培地は、第１段階の間の培地でのｐＨよりも高いｐＨを有することができる。例えば、第２段階の開始時、または間に、塩基を培地に添加し、低いｐＨから高いｐＨにｐＨを増加させることができる。塩基は供給組成物中に存在することができるか、または第２段階用の供給組成物とは別に添加することができる。例えば、第２段階では、ｐＨを約ｐＨ５．８以上、または約ｐＨ６．０以上、例えば、約ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．５以上、または約ｐＨ６．０〜約７．０の範囲内に調節することができる。第２段階の間に、ｐＨを（例えば周期的または連続的に）監視することができ、ｐＨが所望の範囲外に下がると、培地に調整を加えることができる。例えば、ｐＨが６．０または５．８未満に下がると、水酸化アンモニウムを第２の培地に加え、ｐＨを約６．０以上に調節することができる。

例示的な実践方法において、所望により、第２段階での発酵及び増殖を、約２５〜３５℃、または２８℃〜３２℃の範囲の温度、最も好ましくは約３０℃で実施する。また、所望により、第２段階での組換え酵母菌の発酵及び増殖を、通気、及び攪拌を行いながら実施することができる。２段階供給プロセスを用いる本開示の方法はまた、培地での通気の必要性を低下させることができながら、依然として所望のステビオール配糖体生成をもたらす。

発酵中、ステビオール配糖体の生成のために培地を監視することができる。所望のステビオール配糖体の総量及びプロファイルが存在する時点で、発酵を停止することができる。

いくつかの実践方法においては、ステビオール配糖体を生成する発酵の、グルコース供給速度を、呼吸商（ＲＱ）、酸素吸収速度（ＯＵＲ）、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）、またはこれらの組み合わせ等の変数に基づいて制御することができる。これらの変数を、液体培地またはオフガス内で測定することができる。これらの変数（例えば、呼吸商（ＲＱ））によりグルコース供給速度を制御することで生成を増加させることができ、収率を増加、バイオマス生成を減少、並びに、レバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＭ等の所望のステビオール配糖体のエタノール生成を減少させることができる。グルコース供給速度を制御することで、発酵操作の精度を増加させることもできる、即ち、グルコース供給速度または培養生理機能により、バッチの失敗率を低下させ、全体的なシステムの変動性を低下させる。

ＲＱを使用してグルコース供給速度を制御し、毒性エタノールの蓄積、発酵代謝による副生成物を防止することができる。

ＲＱは、培養中に消費した酸素の分子率により除した、生成される二酸化炭素の分子率と定義される。ＲＱは、発酵槽から生じる排出ガスを、二酸化炭素及び酸素の含量について分析することにより測定することができる。この代謝パラメーターは、所望の生成段階を通して連続的に、または断続的に測定することができる。いくつかの実践方法においては、適切な測定間隔は、４時間毎、２時間毎、１時間毎、半時間毎、１５分毎、１０分毎、５分毎、４分毎、３分毎、２分毎、または１分毎である。測定中の期間は、培養開始からステビオール配糖体の生成の間で、条件と共に変化し得る。測定及び制御の例示的期間は、発酵槽での培養開始後２０〜４０時間、１０〜６０時間、５〜７０時間、及び２０〜１１０時間である。

酸素の存在下において、酵母菌細胞は好気性代謝を用いる。この代謝は一層効率的で、例えば、発酵代謝下よりも好気性代謝下において、グルコース１ｍｏｌからより多くのエネルギーが入手される。

グルコースからエタノールのみを生成する培地のＲＱは無限に達する（酸素がほとんど、または全く消費されないため、ＲＱの分母がゼロに達する）一方、純粋なグルコースの好気性代謝に関しては、ＲＱは値１．０に達する（酸素３ｍｏｌが消費され、二酸化炭素３ｍｏｌが生成する）。したがって、１を超える値は、代謝状態の混合を示し、この状態では、好気性及び発酵代謝の両方が同時に発生している。通常、ＲＱをフィードバック制御変数として使用して、酸素移動速度及び／またはグルコース供給速度（もしくは、他の糖質供給速度（複数可））を調節し、この混合代謝を達成することができる。

ＲＱは発酵槽からの排出ガス流で測定することができる。消費した酸素、及び生成した二酸化炭素のモル濃度を確認するための任意の既知、及び好適な方法を使用することができる。使用され得る例示的な技術は、質量分析法、赤外分光法、及び常磁性分析である。例えば質量分光光度計と共に用いられ得る代表的なソフトウエアとしては、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）製のＧａｓＷｏｒｋｓが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＲＱは約０．５〜約２．０に維持される。いくつかの実践方法においては、ＲＱは約０．９〜約１．５、または約１．０〜約１．３に維持される。開示した範囲内にＲＱを維持することで、改善されたステビオール配糖体生成をもたらすことができる。例えば、いくつかの実践方法は、改善されたＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ生成をもたらす。
ＲＱが約１．１〜約２の狭い範囲内に維持されるとき、エタノールの蓄積は、毒性でないレベルに維持される。いくつかの実施形態では、エタノールの濃度は、約５ｇ／Ｌ〜１７ｇ／Ｌの間に維持される。所望であり得るＲＱ範囲としては、約１．０８〜２．０；約１．０８〜１．８５；約１．０８〜１．６５；約１．０８〜１．４５；約１．０８〜１．３５；約１．０８〜１．２５；約１．０８〜１．２；及び約１．０８〜１．１５が挙げられる。他の好適なＲＱ範囲としては１．０８〜１．３５、及び１．１５〜１．２５が挙げられる。いくつかの実施形態では、グルコース添加速度を調節して、ＲＱを約０．５〜約２．０、０．９〜約１．５、または１．０〜約１．３に維持する。

任意の発酵期間、例えば０〜１１０時間、２０〜４０時間、２０〜７０時間、２０〜９０時間、２０〜１１０時間、または任意の他の所望の期間の間、ＲＱを監視して制御することができる。いくつかの実施形態において、段階ＩＩの供給、または発酵段階の間、ＲＱを監視する。

したがって、時間の経過とともに、種々の炭素源を添加することにより、様々な量の炭素源を添加することにより、及び、酸素レベルを操作することにより、ＲＱを操作及び変更することができる。一実施形態では、攪拌を増加または減少させることにより、酸素レベルを操作する。別の実施形態では、ガス供給における、窒素ガスに対する酸素の割合を制御する。酸素移動速度を調節可能な方法としては、空気流束、酸素濃度、細胞密度、温度、及び／または攪拌を変更することが挙げられる。いくつかの実施形態では、グルコース、または他の発酵可能な糖の供給を制御して、ＲＱに影響を与える。供給において使用可能な他の発酵可能な糖としては、フルクトース、スクロース、マルトース、及びマルトトリオースが挙げられるが、これらに限定されない。供給速度または組成物を制御して、ＲＱに影響を与える。ＲＱの制御は、手動または自動であってよい。

「全てのステビオール配糖体」とは、発酵期間後に培地に存在する全てのステビオール配糖体を意味し、液体培地に存在する、及び組換え酵母菌から入手可能なステビオール配糖体の量を含む。ステビオール配糖体の含量は、培地中の全てのステビオール配糖体の量、または、培地中の、全てではないが１種以上のステビオール配糖体の量に関して表すことができる。組成物中のステビオール配糖体の量は互いに関係して、または、ステビオール配糖体の総量に対して、例えば、ステビオール配糖体の総量の重量％、または、重量％もしくはモル％として表現される割合、もしくは割合の範囲により、表すことができる。ステビオール配糖体の量はまた、対照サンプル、例えば、供給の第１段階及び第２段階を含まないプロセスにより調製される対照サンプルに対して表すことができる。

いくつかの実践方法においては、本開示の方法は、特定のステビオール配糖体、例えばレバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＭの生成の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、レバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＭを組み合わせた生成速度は、少なくとも０．０２ｇ／Ｌ／ｈ、０．０３ｇ／Ｌ／ｈ、０．０４ｇ／Ｌ／ｈ、０．０５、０．０６、０．０７、または０．０７５ｇＬ^−１ｈ^−１である。

本開示の方法は、発酵中のステビオール配糖体生成速度の改善をもたらす。例えば、本明細書に記載した第１及び第２段階の方法を使用して増殖及び発酵する組換え酵母菌は、対照プロセスで増殖及び発酵した組換え酵母菌株により生成したステビオール配糖体の速度と比較して、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約５％以上、約７％以上、約１０％以上、約１２％以上、または約１５％以上の、ステビオール配糖体生成速度の増加を示すことができる（第１段階 μ＝０．１２ｈ^−１；第２段階７．７１ｇグルコースＬ^−１ｈ^−１）。

本開示に従った、段階を分けた供給は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ生成、並びに生成速度の増加、収率の増加、発酵時間の減少及びバイオマス濃度の低下をもたらすことができる。

発酵によりステビオール配糖体（複数可）が生成する第２段階に続いて、１種以上のステビオール配糖体（複数可）を含有する組成物を、各種技術を使用して培地から入手することができる。いくつかの実施形態では、透過剤等の化合物を培地に添加し、細胞からステビオール配糖体を取り出し培地に移すことを向上させることができる。

次に、培地を遠心分離または濾過し、組換え細胞を取り除くことができる。培地を所望により、例えば膜透析により処理し、低分子量成分（グルコース、塩基性栄養素、及び塩類）を取り除くことができる。所望の用途に応じて、１種以上のステビオール配糖体化合物（複数可）を含む組成物を使用することができる。

発酵後、熱処理法を使用して組換え酵母菌を所望により処理し、ステビオール配糖体の回収率を向上させることができる。発酵後、ただしあらゆる熱処理の前に、培地は、最適下限量のステビオール配糖体を含有してよく、所望のステビオール配糖体の大部分が組換え酵母菌内にある。ステビオール配糖体の回収率を増加させるために、いくつかの実践方法においては、組換え酵母菌が発酵した、ｐＨがより高い培地等の組成物を、５分〜４８時間の範囲の期間、５０℃〜９５℃、または７０℃〜９５℃の範囲の温度に加熱する。

濃縮または精製形態のステビオール配糖体を含む組成物を提供するのが所望される場合、または、特定のステビオール配糖体が互いに分離される場合、更なる精製を行うことができる。ステビオール配糖体構成成分のこのような濃縮または精製は、発酵が行われる培地で実施することが可能であるか、または、培地を続いて、精製前に乾燥させることができる。例えば、凍結乾燥を用いて培地を乾燥させ、後で処理可能なステビオール配糖体を含む乾燥組成物（例えば粉末またはフレーク）を形成することができる。

本明細書で使用する場合、用語「全てのステビオール配糖体」（ＴＳＧ）は、乾燥（無水）基準での、組成物中の全てのステビオール配糖体の含量の合計として計算される。

いくつかの実践方法においては、ステビオール配糖体用に濃縮した、乾燥した発酵液体培地を、精製の出発物質として使用する。例えば、溶媒、または溶媒の組み合わせを乾燥した発酵液体培地に添加し、ステビオール配糖体を含む物質を溶解または懸濁させることができる。ステビオール配糖体を溶解させるための例示的な組み合わせは、水とアルコールの混合物（例えば、５０：５０エタノール：水）である。溶解または懸濁を促進するために、乾燥した液体培地の物質を、室温を超える温度、例えば４０℃〜６０℃の範囲で加熱することができる。乾燥した液体培地の物質の機械的破壊もまた、例えば音波処理により実施することができる。分取クロマトグラフィー等により、更なる精製の前に、ミクロンまたはサブミクロンを用いて、溶解または懸濁液体培地物質を濾過することができる。

ステビオール配糖体化合物用に濃縮した乾燥した発酵液体培地を、例えば逆相液体クロマトグラフィーにより、精製に通すことができる。好適な樹脂を使用して、カラム内にステビオール配糖体化合物を保持することができ、水等の液体で、カラムを洗浄した親水性化合物を取り除く。カラムからのステビオール配糖体の溶出は、アセトニトリルまたはメタノール等の、好適な溶媒、または溶媒の組み合わせにより達成することができる。

逆相カラムからステビオール配糖体を溶出することにより、種々の目的のいずれか１つに有用となり得る組成物を得ることができる。例えば、精製したステビオール配糖体組成物を、口腔摂取または口腔使用のために、甘味剤組成物として使用可能である。組成物中のステビオール配糖体に関して、組成物を定義することができる。

ステビオール配糖体生成Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、ＷＯ２０１１／１５３３７８、ＷＯ２０１３／０２２９８９、ＷＯ２０１４／１２２２２７、及びＷＯ２０１４／１２２３２８（これらそれぞれの全体が参照として組み込まれている）に記載されている方法を使用して構築した。以下の配列を、親株（株Ａ）の構築のために使用した：Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属ＧＧＰＰＳポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：６）、短縮ＺｅａｍａｙｓＣＤＰＳポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：７）、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＫＳポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：８）、組換えＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＫＯポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：９、配列番号：１０）、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＡＴＲ２をコードする組換え遺伝子（配列番号：１１、配列番号：１２）、ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：１３）、ＳｒＫＡＨｅ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：１４、配列番号：１５）、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＣＰＲ８ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：１６、配列番号：１７）、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：２）、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：１）、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（配列番号：３）、及び、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ９１Ｄ２変異体（または機能的ホモログ）である、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ（配列番号：４）ポリペプチドから生成したステビオール配糖体をコードする組換え遺伝子。

ＵＧＴ９１Ｄ２のＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂ変異体（配列番号：５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１より）は、位置２１１における、メチオニンのロイシンでの置換、及び、位置２８６における、アラニンのバリンでの置換を含む。（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１（その全体が参照として本明細書に組み込まれている）の表１２及び実施例１１に記載されている、Ｔ１４４Ｓ、Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ、及びＧ３８４Ｃ変異体を除く更なる変異体を使用することができる。）Ｌ２１１Ｍ及びＶ２８６Ａのアミノ酸修飾を有する、ＳｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａＵＧＴ９１Ｄ２ｅ−ｂをコードするＧｅｎｅＡｒｔのコドン最適化配列（アミノ酸配列については配列番号：４；コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号：５で説明している）。

株Ｂは上述の親株に由来し、Ｓｔｅｖｉａｒｅｂａｕｄｉａｎａからのコドン最適化ＣＰＲ１（アミノ酸配列番号：１９に対応する配列番号：１８）を更に含む。
実施例１
２段階供給プロセスによる、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成

種菌調製のために、酵母菌株Ｂを、１リットルの振盪フラスコ内の１５０ｍＬの播種フラスコ培地の中で、２５０ｒｐｍ及び３０℃で、２０〜２４時間培養した。
表１播種フラスコ培地

発酵のために、表２のように、０．７５リットルの初期体積で（槽のレベルの３８．５％）、７５ｍＬの播種培養液を最初の発酵培地に移した。流加培養発酵を２ＬのＮｅｗＢｒｕｎｓｗｉｃｋＢｉｏＦｌｏ３１０発酵槽で実施した。１２％のＮＨ_４ＯＨで発酵はｐＨ５．０で制御し、発酵中は温度を３０℃に維持した。発酵中は、空気流速は１．７５ＳＬＰＭであり、攪拌速度は１２００ｒｐｍであった。

発酵供給培地の流速を制御することにより、グルコース濃度は制限を加えたまま維持した。二段階供給方法は、（発酵槽に播種後）１２時間の時点で、増殖速度ｕ＝０．１２ｈ^−１以上にて最初の指数段階（供給段階Ｉ）を伴ったが、供給段階ＩＩは、一定の流速で３５〜３９時間の範囲で開始した。段階ＩＩでの供給は、１４．４〜２２．９６ｇグルコース／Ｌ液体培地／ｈの範囲内での、一定の供給を伴った。１．０リットルの発酵供給培地が送達されるまで、供給を続けた。消泡剤（Ｉｖａｎｈｏｅ１１６３Ｂ）を１．３ｇ／Ｌで供給培地に添加し、５重量％の消泡剤溶液の、追加でのボーラス添加を、必要に応じて加えた。

培地は、表２及び３に記載している修正を加えつつ、Ｖｅｒｄｕｙｎｅｔａｌ（ＶｅｒｄｕｙｎＣ，ＰｏｓｔｍａＥ，ＳｃｈｅｆｆｅｒｓＷＡ，ａｎｄＶａｎＤｉｊｋｅｎＪＰ．Ｙｅａｓｔ．１９９２Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）に基づいた。
表２最初の発酵培地

微量金属原液

ビタミン原液

表３発酵供給培地

ステビオール配糖体の定量化は、以下に記載する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により実施することが可能であり、Ｃｈｒｏｍａｄｅｘから購入した確実な基準を用いて得た較正曲線と比較することが可能である。

１００μＬの発酵培地をピペットで取り、２ｍＬの微細遠心分離管に入れた。９００μＬの６１％メタノール（抽出溶媒）を２ｍＬ微細遠心分離管に加え、サンプル回転機に１０分間配置して攪拌することにより、ステビオール配糖体を抽出した。次に、サンプルを微細遠心分離器で１００００ｒｐｍで３分間遠心分離にかけ、不純物を除去した上清をピペットで取り、分析のためにオートサンプラーバイアルに入れた。

配糖体分離のためのＵＨＰＬＣ法

ステビオール配糖体を、プレカラムフィルターとして導入したＯｐｔｉｍｉｚｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のステムフィルターアセンブリと共に、２個のＡｇｉｌｅｎｔＳＢ−Ｃ１８ＲＲＨＤカラム（２．１ｍｍｘ１５０ｍｍ、１．８ｕｍ）を連続して用いて分離した。使用する移動相はチャネルＡ：水中の０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びチャネルＢアセトニトリルであった。流量は０．３８ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は６５℃であり、検出を、２１０ｎｍの紫外線吸収で行った。
勾配溶離プロファイルを以下に示す：

以下の濃度：０．３５、０．１７５、０．０７、０．０３５、０．０１４、０．００７ｍｇ／ｍＬで、５５％ＭｅＯＨ中のＣａｒｇｉｌｌ，Ｉｎｃ生のＲｅｂＡ（純度９８．８５％）（ロット１００８−００５）を用いて、較正を行った。全てのグリコシドをＲｅｂＡ曲線について定量化した。ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、及びＲｅｂＢについての実験上の相関因子をＲｅｂＡに対して測定しながら、他の全ての分析を分子量で修正した。

液体培地を０．４５マイクロメートルのフィルターで濾過し、３体積の水で洗浄することにより細胞に乾燥重量（バイオマス）を測定し、１０５オーブンで１８時間乾燥させる。

実施例２

種菌調製のために、表１、実施例１の播種フラスコ培地を使用して、実施例１に記載の通りに酵母菌株Ｂを培養した。発酵、最初の発酵培地、及び発酵供給培地は、実施例１に記載の通りである。

段階Ｉの供給速度は一定に保ち、供給段階ＩＩの速度は変更可能であるが、実施例１で用いたものより低い。上で示したデータは、より遅い段階ＩＩの供給速度による、改善した収率を示す。
実施例３

種菌調製のために、表１、実施例１の播種フラスコ培地を使用して、実施例１に記載の通りに酵母菌株Ｃを培養した。実施例１とは異なり、最初の発酵培地はコバルト、モリブデン酸塩及びホウ酸塩を含まず、ビタミン及び微量無機質のみを、発酵供給培地ではなく最初の発酵培地に添加した。

より遅い供給速度により改善した収率は、より速い供給（対照）が、より速い速度だったことから観察された。
実施例４
リアルタイムの呼吸商に基づく、グルコースのフィードバック制御を用いた、流加培養発酵によるＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの生成

種菌調製のために、表１、実施例１の播種フラスコ培地を使用して、実施例１に記載の通りに酵母菌株Ｂを培養した。

発酵のために、７５ｍＬの播種培養液を、実施例１の表２に記載の通りに、最初の発酵培地（０．７５リットルの開始体積）に移した。全体を通して、温度は３０℃に維持した。発酵中、空気流速は１．７５ＳＬＰＭであり、攪拌速度を自動制御して、段階的な方法で４００から９００ｒｐｍに増加させた。１２％のＮＨ４ＯＨで、ｐＨを５．０に制御した。

培地は、実施例１の表２及び３に記載している修正を加えつつ、Ｖｅｒｄｕｙｎｅｔａｌ（ＶｅｒｄｕｙｎＣ，ＰｏｓｔｍａＥ，ＳｃｈｅｆｆｅｒｓＷＡ，ＶａｎＤｉｊｋｅｎＪＰ．Ｙｅａｓｔ．１９９２Ｊｕｌ；８（７）：５０１−１７）に基づいた。尿素処理のために、最初の発酵培地で硫酸アンモニウムを１５ｇ／Ｌに増加させ、発酵供給培地に尿素を３９ｇ／Ｌ添加した。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはクラブトリー陽性の生命体であるため、大変少量のグルコースの存在下でアルコールを生成する。したがって、発酵供給培地の流速を制御することでグルコースの濃度を限定的に維持して（実施例１の表３に示すように）、エタノール生成を最小限に維持しながら増殖を可能にする。

２段階供給方式に関して、最初の指数段階（播種段階Ｉ）は、１０時間の時点でμ＝０．１２１／ｈの増殖速度で開始したが、供給の第２段階（即ち供給段階ＩＩ）は、３３時間の時点で、０．１８０ｍＬ／分の一定の流速で開始した。１．９５リットルの最終体積が１２０時間で得られるまで、供給を続けた。

呼吸商（ＲＱ）に基づく供給のフィードバック制御による処理には、供給段階Ｉでの典型的な指数供給が伴う。次に、３９時間の時点で、供給の供給段階ＩＩにおいて、グルコース培地添加のフィードバック制御を測定し、続いて、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｉｍａＰｒｏＰｒｏｃｅｓｓＭＳ測定により、発酵槽のオフガス対参照ガス（空気）における、酸素及び二酸化炭素濃度のオフガス質量分析によるＲＱのリアルタイム測定により供給を制御した。アルゴリズムで制御する供給は、ＲＱを１．０５〜１．２５の間に維持するように設計した。以下の計算を用いて、二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ）を、酸素吸収速度（ＯＵＲ）で除することにより、（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＧａｓＷｏｒｋｓ製の質量分光光度計ソフトウエアにより）ＲＱを計算した。
ＯＵＲ（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ）＝（Ｆ（Ｌ／ｍｉｎ）×（％Ｏ_２ｉｎ−％Ｏ_２ｏｕｔ）×６０ｍｉｎ／ｈ×１０００ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）／（１００×２４．４５Ｌ／ｍｏｌ×発酵槽の容積（Ｌ））
ＣＥＲの計算：
ＣＥＲ（ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ）＝（Ｆ（Ｌ／ｍｉｎ）×（％ＣＯ_２ｉｎ−％ＣＯ_２ｏｕｔ）×６０ｍｉｎ／ｈ×１０００ｍｍｏｌ／ｍｏｌ）／（１００×２４．４５Ｌ／ｍｏｌ×発酵槽の容積（Ｌ）
ＲＱ＝ＯＵＲ／ＣＥＲ（単位のない割合）

グルコースでのＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの収率を、利用した全てのグルコースに基づいて計算した。バイオマスでのＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの収率は、細胞の乾燥重量に基づいた。細胞の乾燥重量でのバイオマス測定は、当該技術分野において一般的に知られている、濾過／オーブン法に基づいた。
表７呼吸商に基づくフィードバック制御の結果一覧

「通常の２段階供給」は、第１段階：μ＝０．１２ｈ^−１；第２段階＝７．７１ｇＬ^−１ｈ^−１である。
実施例５

呼吸商（ＲＱ、単位のない割合）は、酸素吸収速度（ＯＵＲ、ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ）により除した二酸化炭素放出速度（ＣＥＲ、ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ）に等しい。呼吸商（ＲＱ）目標は、発酵の排出ガス内の二酸化炭素及び酸素の、リアルタイムのオフガス監視からのＲＱ値に基づき、グルコース供給速度を増加または減少させたＢｉｏＣｏｍｍａｎｄソフトウエアのアルゴリズムにより達成した。ＲＱフィードバック制御は、２段階供給の段階ＩＩのみで使用した。

Claims

ステビオール配糖体（複数可）の生成方法であって、前記方法は、
（ａ）培地中で１種以上のステビオール配糖体（複数可）を生成可能な組換え酵母菌を増殖させるステップであって、前記組換え酵母菌は、第１の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））にて増殖し、グルコース含有組成物が、第１の方法に従い前記培地に添加されることを含む、前記増殖させるステップと、
（ｂ）前記培地を前記組換え酵母菌により発酵させ、前記１種以上のステビオール配糖体を生成するステップであって、発酵の間に、前記第１の方法とは異なる第２の方法に従って、前記培地にグルコース含有組成物を添加し、また、発酵の間に、第２の範囲内の１つ以上の増殖速度（複数可）（希釈速度（複数可））で前記酵母菌が増殖し、前記第２の範囲は前記第１の範囲よりも小さい、前記生成するステップと、
を含む、前記方法。
ステップ（ａ）において、前記増殖速度（希釈速度）は０．０６ｈ^−１以上である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）において、前記第１の範囲は０．０６ｈ^−１〜０．１７ｈ^−１である、請求項２に記載の方法。
ステップ（ａ）において、前記第１の範囲は０．０９ｈ^−１〜０．１５ｈ^−１である、請求項３に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記増殖速度（希釈速度）は０．０９ｈ^−１以下である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記第２の範囲は０．０１５ｈ^−１〜０．０９ｈ^−１である、請求項５に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記第２の範囲は０．０１５ｈ^−１〜０．０６ｈ^−１である、請求項６に記載の方法。
ステップ（ｂ）の前記増殖速度（希釈速度）は、ステップ（ａ）の最大増殖速度（希釈速度）の５０〜９０％である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）において、前記グルコース含有組成物は、非一定の供給速度である前記第１の方法に従って、前記培地に添加される、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記グルコース含有組成物は、一定の供給速度である前記第２の方法に従って前記培地に添加される、請求項１に記載の方法。
前記一定の供給速度は、１０ｇグルコース／Ｌ培地／ｈ以下である、請求項１０に記載の方法。
前記一定の供給速度は、２ｇグルコース／Ｌ培地／ｈ〜１０ｇグルコース／Ｌ培地／ｈの範囲内である、請求項１１に記載の方法。
ステップ（ａ）は、グルコースを添加する前記第１の方法を変更し、前記組換え酵母菌の増殖速度を低下させる１つ以上のサブステップを含む、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、塩基を添加して、前記培地を、ステップ（ａ）の前記培地のｐＨよりも高いｐＨとする、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記培地のｐＨが６．０以上である、請求項１４に記載の方法。
ステップ（ａ）は、前記培地中に３ｇ／Ｌ未満のグルコースが存在する時点で開始する、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）は、ステップ（ａ）の開始から最大４０時間実施される、請求項１６に記載の方法。
ステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）の開始から３０時間またはその後の時点で実施される、請求項１６に記載の方法。
ステップ（ｂ）は、前記組換え酵母菌の最初の培養から最大１３０時間実施される、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）において、前記組換え酵母菌は、少なくとも５ｇｄｃｗ／Ｌのバイオマス量まで増殖する、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）において、前記組換え酵母菌は、２０ｇｄｃｗ／Ｌ〜６０ｇｄｃｗ／Ｌの範囲のバイオマス量まで増殖する、請求項２０に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記組換え酵母菌は、１８０ｇｄｃｗ／Ｌを超えるバイオマス量まで増殖しない、請求項１に記載の方法。
前記組換え酵母菌を含む播種培地を提供するステップを更に含み、前記播種培地を使用して、ステップ（ａ）の前記第１の培地を形成することを更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）において、前記第２の培地は、グルコース、窒素源、カリウム源、マグネシウム源、リン酸源、マグネシウム源、微量金属、ビタミン類、及び消泡剤を含む先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記１種以上のステビオール配糖体（複数可）は、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＤ、またはレバウディオサイドＭ及びレバウディオサイドＤの両方を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記組換え酵母菌は、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ（Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、及びＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓの種からなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記組換え酵母菌はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２６に記載の方法。
先行請求項のいずれか一項に記載の方法に従って入手したステビオール配糖体を含む発酵培地。
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法に従って入手したステビオール配糖体組成物。
ステップ（ａ）の間、グルコースの濃度は前記培地中で５ｇ／Ｌ以下である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）の間、グルコースの濃度は前記培地中で５ｇ／Ｌ以下である、請求項３０に記載の方法。
ステップ（ｂ）の間、グルコースの濃度が前記培地中で５ｇ／Ｌ以下である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｂ）の間、グルコースの濃度が前記培地中で５ｇ／Ｌ以下である、請求項３２に記載の方法。
請求項１に記載のステップ（ｂ）において、
（ｉ）前記組換え酵母菌の呼吸商（ＲＱ）を測定して、前記ＲＱが約０．５〜約２．０の範囲内であるか否かを測定するステップと、
（ｉｉ）前記ＲＱが前記ＲＱ範囲の外にある場合に、前記第２の方法のグルコース添加速度を調整するステップと、
（ｉｉｉ）前記組換え酵母菌細胞を用いる、前記培地の発酵工程を通して、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を繰り返すステップと、
を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記ＲＱ範囲は０．９〜約１．５である、請求項３４に記載の方法。
前記ＲＱ範囲は１．０〜約１．３である、請求項３４に記載の方法。
前記ＲＱは、４時間毎〜１時間毎に測定される、請求項３４に記載の方法。
ステップ（ｉｉｉ）は、前記ＲＱを測定するデバイスまたはソフトウエアに接続したフィードバック制御メカニズムを使用して自動的に実施される、請求項３４に記載の方法。
約０．５〜約２．０の前記所望のＲＱ範囲は、発酵開始後約２０〜４０時間の時点のものである、請求項３４に記載の方法。
測定ステップ（ｉ）は、前記発酵の排出ガスをサンプリングすることにより実施される、請求項３４に記載の方法。
測定ステップ（ｉ）は、質量分析計、赤外線分析器、または常磁性分析器を使用して実施される、請求項３４に記載の方法。
ステップ（ｉｉ）において、前記第２の方法のグルコース添加速度の調整は、前記ＲＱが前記ＲＱ範囲以下に下降する場合にグルコースを増加させるか、または、前記ＲＱが前記ＲＱ範囲を超える場合に前記グルコース供給速度を低下させるか、のいずれかにより調整される、請求項３４に記載の方法。
前記グルコース添加速度はステップ（ｉｉ）で調整され、前記ＲＱを約０．５〜約２．０、０．９〜約１．５、または１．０〜約１．３に維持する、請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
レバウディオサイドＤ及びレバウディオサイドＭを組み合わせた生成速度は、少なくとも０．０２ｇＬ^−１ｈ^−１、０．０３ｇＬ^−１ｈ^−１、０．０４ｇＬ^−１ｈ^−１、０．０５ｇＬ^−１ｈ^−１、０．０６ｇＬ^−１ｈ^−１、０．０７ｇＬ^−１ｈ^−１、または０．０７５ｇＬ^−１ｈ^−１である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。