CN104203005A

CN104203005A - 二萜的生产

Info

Publication number: CN104203005A
Application number: CN201380006372.9A
Authority: CN
Inventors: 马丁·莱玛恩; 约舒华·特鲁海尔特; 普利斯希勒·扎尔特简斯; 吴亮; 维克多·布尔; 科尼利斯·玛丽亚·雅各布斯·沙吉; 曼杰·库马尔; 伯纳德·迈瑞克; 马克·亚历山大·范·登·贝尔赫
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2012-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2014-12-10
Also published as: CA2862980A1; KR102170340B1; DK2806754T3; EA201400836A8; AU2013211605A1; MX2014008898A; AU2017202390A1; AU2019204690A1; MX355028B; AU2013211605B2; WO2013110673A1; EP3444338A1; EA201400836A1; HK1204529A1; US20150031868A1; KR20140127227A; EP2806754B1; EP2806754A1

Abstract

本发明涉及包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序列编码：具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽、具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽、具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽和具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使微生物至少能够生产甜菊醇。所述重组微生物还可以表达一种或多种UDP-葡糖基转移酶，从而使微生物能够产生一种或多种甜菊糖苷。

Description

二萜的生产

发明领域

本发明涉及能够产生二萜和/或糖基化的二萜的重组微生物和通过利用这种细胞生产二萜和/或糖基化的二萜的方法。本发明还涉及一种发酵液，其中所述发酵液包括通过这种方法可获得的二萜和/或糖基化的二萜。

发明背景

世界各地对高效甜味剂的需求不断增长，而且混合不同的人工甜味剂正在逐渐变成一种常规做法。然而，对甜味剂替代品的需求预计将会增加。多年生草本植物—甜叶菊(Stevia rebaudiana Bert.)—的叶子中积聚了大量极甜的化合物，它们被称为甜菊糖苷。虽然这些化合物的生物学功能还不明确，但由于甜叶菊甜味剂是天然植物产品这一附加优势，它们作为备选的高效甜味剂具有商业意义。

这些甜的甜菊糖苷显示出优于许多高效甜味剂的功能特性和感官性状。此外，研究表明甜菊苷(stevioside)能降低Ⅱ型糖尿病人的血糖水平和中度高血压患者的血压。

甜菊糖苷积聚于甜菊叶中，它们可以占甜菊叶干重的10-20％。甜菊苷和莱鲍迪甙(rebaudioside)A都具有热稳定性和pH稳定性，因此适合用于碳酸饮料和许多其它食物中。甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪甙A比蔗糖甜150-320倍。此外，莱鲍迪甙D也是积聚于甜菊叶的高效二萜糖苷甜味剂，它可能比蔗糖甜约200倍。

目前，甜菊糖苷是从甜菊植物中提取的。在甜菊中，(-)-贝壳杉烯酸(kaurenoic acid,赤霉素(GA)生物合成的中间物)被转换为四环的二萜—甜菊醇，然后甜菊醇继续通过多步骤的葡糖基化途径形成各种甜菊糖苷。然而，产率是可变的并受农业和环境条件的影响。而且，种植甜菊需要大量陆地面积、收获前的长久时间、密集的劳动力以及提取和纯化糖苷的额外费用。

为了满足对高效、天然甜味剂日益增长的商业需求，需要新的、更标准的、完全单一成分的、没有后味的糖苷来源。

发明概述

在甜菊中，通过脱氧木酮糖磷酸酯途径(deoxyxylulose 5-phosphatepathway)形成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)，甜菊醇就是从GGPP合成的。(-)-柯巴基二磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase,CPS)和(-)-贝壳杉烯合酶(kaurene synthase,KS)这两个二萜环化酶的活性导致(-)-贝壳杉烯的形成，然后在一个三步骤的反应中，(-)-贝壳杉烯被(-)-贝壳杉烯氧化酶(kaurene oxidase,KO)氧化形成(-)-贝壳杉烯酸。

在甜菊叶中，(-)-贝壳杉烯酸接着被内根-贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)羟基化以形成甜菊醇。然后，甜菊醇被一系列UDP-葡糖基转移酶(UGTs)葡糖基化。

本发明涉及能够产生二萜(例如甜菊醇)或糖基化的二萜(即二萜糖苷，例如甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷或杜克甙A)的微生物。

因此，本发明提供包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序列编码：

具有内根(ent)CPS活性的多肽；

具有内根KS活性的多肽；

具有内根KO活性的多肽；和

具有KAH活性的多肽，

通过所述核苷酸的表达使重组微生物具有至少能够生产甜菊醇的能力。

本发明还提供包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸编码一种或多种具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽，通过所述核苷酸的表达使重组微生物具有能生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷或杜克甙A中的至少一种的能力。

本发明还提供：

-制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在合适的发酵培养基中发酵本发明所述的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜；

-制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在约29℃或更低的温度下，在合适的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜；

-一种发酵液，其中所述发酵液包括通过本发明所述的方法可以得到的二萜或糖基化的二萜；

-通过本发明所述的方法得到的或从根据本发明所述的发酵液中可以得到的得到的二萜或糖基化的二萜；

-根据本发明所述的二萜或糖基化的二萜，其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D；和

-含有根据本发明所述的二萜或糖基化的二萜的食品、饲料或饮料。

本发明还提供将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜的方法，所述方法包括：

将所述初次糖基化的二萜与根据本发明所述的微生物、来源于这种微生物的无细胞提取物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触，

从而将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜。

附图说明

图1展示了质粒pUG7-EcoRV的示意图。

图2展示了设计ERG20、tHMG1和BTS1过表达盒(A)，并将其整合至酵母基因组(B)的方法的示意图。(C)显示了利用Cre重组酶移除KANMX标记后的最终状态。

图3展示了ERG9敲除构建体的示意图。所述构建体由500bp ERG9的3’部分、98bp TRP1的启动子、TRP1的开放阅读框和终止子以及之后的400bp ERG9的下游序列组成。由于在ERG9的开放阅读框的终点引入了Xbal位点，因此最后的氨基酸变成了丝氨酸，终止密码子变成了精氨酸。新的终止密码子位于TRP1的启动子中，这导致延长了18个氨基酸。

图4展示了将UGT2整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态；C.Cre重组酶表达后的状态。

图5展示了将GGPP到甜菊醇的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态。

图6展示了将GGPP到莱鲍迪甙A(RebA)的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态。

图7展示了菌株STV018中甜菊醇的产量。7天后从摇瓶中取出样品，加热并用乙腈处理，然后用LC/MS测定甜菊醇的浓度。

图8展示了菌株STV006中RebA的产量。7天后从摇瓶中取出样品，加热并用乙腈处理，然后用LC/MS测定RebA的浓度。

图9展示了菌株STV006、STV012、STV016和STV017中RebA的产量。7天后从摇瓶中取出样品，加热并用乙腈处理，然后用LC/MS测定RebA的浓度。

图10展示了菌株STV018、STV019和STV020中甜菊苷和RebA的产量。7天后从摇瓶中取出样品，加热并用乙腈处理，然后用LC/MS测定甜菊苷和RebA的浓度。

图11展示了质粒MB6754的示意图。

图12展示了质粒MB6761的示意图。

图13展示了质粒MB6762的示意图。

图14展示了质粒MB6775的示意图。

图15展示了将GGPP到RebD的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段；B.整合后的状态。

图16展示了菌株STV006和STV015中RebD和RebA的产量。7天后从摇瓶中取出样品，加热并用乙腈处理，然后用LC/MS测定RebD和RebA的浓度。

图17展示了生物合成甜菊糖苷的潜在途径的示意图。

序列表说明

表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号(同样展示于表1)来定义。

发明详述

在本说明书和附属的权利要求书的各个部分，词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为“包含在内”。也就是说，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的元素或整体。

本文中使用的冠词“一”("a"和"an")指的是一个或多于一个(即一个或至少一个)该冠词语法上的宾语。例如，“一个元素”可能意味着一个元素或多于一个元素。

本发明涉及能够产生二萜或糖基化的二萜(通常分别是甜菊醇或甜菊糖苷)的重组微生物。为了本发明的目的，二萜通常意味着由4个异戊二烯单元组成的有机物。这种化合物可来源于香叶基香叶基焦磷酸。糖基化的二萜或二萜糖苷是一种结合有糖的二萜，其中糖通常与非碳水化合物部分相结合。通常，在二萜糖苷中，糖基通过其异头碳(anomric carbon)经由糖苷键与另外一个基团结合。优选的二萜和二萜糖苷分别是甜菊醇和甜菊糖苷。因此，特别地，本发明涉及能够产生甜菊醇和甜菊糖苷的重组微生物。

本发明提供包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序列编码：

具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和

具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，

为了本发明的目的，具有内根-柯巴基焦磷酸合酶(EC5.5.1.13)活性的多肽能够催化如下化学反应：

该酶有一种底物(香叶基香叶基焦磷酸)和一种产物(内根-柯巴基焦磷酸)。该酶参与赤霉素的生物合成。该酶属于异构酶家族，具体是分子内的裂解酶类。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸裂解酶(去环化)。其它的常用名包括内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶A和内根-贝壳杉烯合成酶A。

为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯合酶(EC4.2.3.19)活性的多肽能够催化下述化学反应：

因此，该酶有一种底物(内根-柯巴基二磷酸)和两种产物(内根-贝壳杉烯和二磷酸盐)。

该酶属于裂解酶家族，具体是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶(环化，形成内根-贝壳杉烯)。其它的常用名包括内根-贝壳杉烯合酶B、内根-贝壳杉烯合成酶B、内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶和(环化)。该酶参与二萜类化合物的生物合成。

具有内根-柯巴基二磷酸合酶活性的蛋白质还可以有截然不同的内根-贝壳杉烯合酶的活性。内根-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径中的下一个步骤。这两种类型的酶活性是截然不同的，抑制蛋白质的内根-贝壳杉烯合酶活性的定点突变导致内根-柯巴基焦磷酸的积累。

因此，本发明使用的单个核苷酸序列可编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性和内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者，可以用两段截然不同的、分开的核苷酸序列编码这两种活性。

为了本发明的目的，具有内根-贝壳杉烯氧化酶(EC1.14.13.78)活性的多肽能够催化内根-贝壳杉烯的4-甲基的连续三次氧化以产生贝壳杉烯酸。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。

为了本发明的目的，具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性(EC1.14.13)活性的多肽能够催化利用NADPH和O₂形成甜菊醇(对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-羧酸)的反应。这种活性也可被称为内根-贝壳杉烯13-羟化酶活性。

本发明所述的重组微生物可包括一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物能够生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A中的至少一种。

为了本发明的目的，具有UGT活性的多肽具有糖基转移酶(EC2.4)活性，即作为催化剂能够催化单糖基团从有活性的的核苷酸糖(又称“糖基供体”)转移至糖基受体分子(通常是醇)。UGT的糖基供体通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖，UDP-葡萄糖)。

可以选择所使用的UGTs以产生期望的二萜糖苷，例如甜菊糖苷。Humphrey等人，Plant Molecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人，J.Plant Physiology168(2011)1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意图。此外，图17展示了甜菊糖苷形成的示意图。

莱鲍迪甙A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体而言，莱鲍迪甙A可通过以下步骤形成：首先葡糖基化甜菊醇的13-OH形成13-O-甜菊单糖苷，然后葡糖基化甜菊单糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'形成甜菊醇-1,2二糖苷，接着葡糖基化甜菊醇-1,2二糖苷的C-19羟基形成甜菊糖苷，以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'形成莱鲍迪甙A。各个葡糖基化反应发生的顺序可以变化—参见图17。如该示意图中所示，一种UGT可以催化不止一种转换。

我们已经证明：通过在重组宿主中表达编码功能UGTs(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2)的基因，可以实现从甜菊醇到莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D的转换。因此，当表达这四种UGTs的重组微生物产生甜菊醇或向培养基中补加甜菊醇时，该微生物能够制造莱鲍迪甙A。通常，这些基因中的一个或多个是重组基因，它们被转化到天生不具有这些基因的微生物中。所有这些酶的实例都展示在表1中。本发明的微生物可能包括UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2的任意组合。在表1中，序列UGT64G1被表示为序列UGT1，序列UGT74G1被表示为序列UGT3，序列UGT76G1被表示为序列UGT4，序列UGT2被表示为序列UGT2。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊醇转换为甜菊单糖苷的UGT。因此，这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊单糖苷。

本发明的这种微生物可包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT85C2所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊醇转换为甜菊单糖苷。

UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-OH转移一个葡萄糖单元。因此，合适的UGT85C2可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-OH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶的作用。功能UGT85C2多肽还可以催化葡糖基转移酶反应，该反应利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡糖苷作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT1。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊双糖苷。

本发明所述的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。

本发明所述的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT2所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。

合适的UGT2多肽起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶(也被称为甜菊醇-13-单葡糖苷1,2-转葡糖基酶)的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。通常，合适的UGT2多肽还起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜茶苷转移酶的作用，它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜茶苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。

功能UGT2多肽还可以催化利用甜菊糖苷，而非甜菊醇-13-O-葡糖苷和甜茶苷作为底物的反应，例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作为底物，将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙E。功能UGT2多肽还可以利用莱鲍迪甙A作为底物，将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙D。但是功能UGT2多肽通常不能将葡萄糖部分转移至C-13位有1,3-键葡萄糖的甜菊醇化合物，即不能将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-二苷和1,3-甜菊苷。功能UGT2多肽还可以从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的其他供体转移糖部分。例如，功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸D-木糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用，将木糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。又例如，功能UGT2多肽能够起尿嘧啶5'-二磷酸L-鼠李糖基：甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用，将鼠李糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。这种序列在表1中被表示为序列UGT2。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊双糖苷转换为甜菊苷的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊苷。

本发明所述的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。

合适的UGT74G1多肽可以将葡萄糖单元分别转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH。合适的UGT74G1多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇19-COOH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-O-葡糖苷19-COOH转移酶的作用。功能UGT74G1多肽还可以催化糖基转移酶反应，该反应利用甜菊糖苷，而非甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡糖苷作为底物，或者该反应从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的供体转移糖部分。这种序列在表3中被表示为序列UGT1。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的糖基化的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙A。

本发明所述的微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT76G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列，通过将所述核苷酸序列转化至微生物中，使细胞能够将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A。

合适的UGT76G1将葡萄糖部分添加到受体分子(甜菊醇1,2-糖苷)的C-13-O-葡萄糖的C-3’。因此，UGT76G1起着例如，尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇13-O-1,2葡糖苷C-3’葡糖基转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基：甜菊醇19-O-葡萄糖，13-O-1,2二苷C-3’葡糖基转移酶的作用。功能UGT76G1多肽还可以催化葡糖基转移酶反应，该反应利用含糖(除葡萄糖外)的甜菊糖苷(例如甜菊鼠李糖苷和甜菊木糖苷)作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT4。

本发明所述的微生物可以包括编码具有上述四种UGT活性中的一种或多种的多肽的核苷酸序列。优选地，本发明所述的微生物可以包括编码具有全部上述四种UGT活性的多肽的核苷酸序列。给出的核酸可以编码具有一种或多种上述活性的多肽。例如，编码具有2种、3种或4种上述活性的多肽的核酸。优选地，本发明所述的重组微生物包括UGT1活性、UGT2活性和UGT3活性。更优选地，这种重组微生物还包括UGT4活性。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱鲍迪甙A的葡糖基化。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙D。我们已经证明：表达UGT85C2、UGT2、UGT74G1和UGT76G1多肽组合物的微生物可以产生莱鲍迪甙D。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的糖基化的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱鲍迪甙E的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷转换为莱鲍迪甙E。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙E。

本发明所述的包括编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化莱鲍迪甙E的糖基化的多肽。也就是说，本发明的微生物可包括能够催化将莱鲍迪甙E转换为莱鲍迪甙D的UGT。因此，这种微生物可以将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙D。

本发明所述的重组微生物可表达编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。也就是说，本发明所述的重组微生物可包括编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的序列。

为了本发明的目的，具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性(EC1.6.2.4；又名NADPH:高铁血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450氧化还原酶、POR、CPR、CYPOR)的多肽通常是膜结合型的酶，它使电子从含有FAD和FMN的酶—NADPH:细胞色素P450还原酶(POR；EC1.6.2.4)转移至真核细胞微粒体中的细胞色素P450。

优选地，根据在前的权利要求中的任意一项所述的重组微生物能够表达下述序列中的一种或多种：

a.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号(SEQ IDNO)：54、56、58或78的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：53、55、57或77的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；或者

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，

优选地，本发明所述的重组微生物能够表达以下核苷酸序列中的一种或多种：

a.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：1、3、5、7、17、19、59或61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

b.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

c.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；或者

d.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。

在本发明所述的能够表达编码可催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：35、37、71、147、168、169或189的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

在本发明所述的能够表达编码可催化在甜菊单糖苷C-13位添加葡萄糖(这通常表示甜菊单糖苷的C-13-葡萄糖/13-O-葡萄糖的C-2’的糖基化)的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：88、100、102、104、106、108、110或112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

在本发明所述的能够表达编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：39、41、43、45、47、73、148、170、171、172、173、174或190的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

在本发明所述的表达编码可催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列，所述多肽包括与序列ID号：50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20％，优选地至少25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：49、51、75、149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约15％，优选地至少20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列；

在本发明所述的表达编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列的重组微生物中，其中所述反应为：将甜菊苷或莱鲍迪甙A葡糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍迪甙D，其中所述核苷酸序列可包括：

i.编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列，其中所述反应为：将甜菊苷或莱鲍迪甙A糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E糖基化为莱鲍迪甙D，其中所述多肽包括与序列ID号：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

根据本发明所述的微生物产生香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的能力可能会被上调。在本发明的语境中，“上调”意味着：较同等但未被转化的菌株，本发明的微生物产生更多GGPP。

因此，本发明所述的微生物可包括编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列中的一种或多种，通过将所述核苷酸序列转化至微生物使其生产GGPP的水平提高。

优选地，本发明所述的重组微生物能够表达以下序列中的一种或多种：

a.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：80的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：79的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

b.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：82的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：81的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

c.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：84的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：83的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

本发明涉及一种重组微生物。为了本发明的目的，微生物通常指人类肉眼不可见的(即显微镜可见的)生物体。所述微生物可以来自细菌、真菌、古生菌或原生生物。所述微生物通常是单细胞生物。

本文中使用的“重组微生物”被定义为：被遗传修饰或者被一种或多种核苷酸序列(如在本文中所定义的)转化/转染的微生物。一种或多种这类核苷酸序列的存在改变了微生物产生二萜或二萜糖苷(特别是甜菊醇或甜菊糖苷)的能力。未被转化/转染或遗传修饰的微生物不是重组微生物，其通常不包括能使细胞产生二萜或二萜糖苷的一种或多种核苷酸序列。因此，未被转化/转染的微生物在自然条件下通常不能产生二萜，然而天生能够产生二萜或二萜糖苷并且根据本发明所述经修饰的微生物(以及产生二萜/二萜糖苷的能力改变的微生物)被认为是根据本发明所述的重组微生物。

“序列同一性”在本文中被定义为：两种或多种氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两种或多种核酸(多聚核苷酸)序列之间的关系。通常，序列同一性或相似性是对被比较序列的全长进行比较。在本领域，“同一性”还意味着氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，其由这些序列串之间的匹配程度所决定(视情况而定)。利用本领域的技术人员已知的各种方法易于计算出“同一性”和“相似性”。判断同一性的优选方法被设计成可以给出被检验的序列之间最大程度的匹配。然后，通常在被比较序列的全长范围计算同一性和相似性。判断同一性和相似性的方法被编码成了一些可通过公开途径获得的计算机程序。优选的判断两段序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括，例如BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)，在NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIHBethesda，MD20894)中公开可用)。使用BLASTP对比氨基酸序列时，优选的参数是：空位开放10.0、空位扩展0.5、Blosum62矩阵。使用BLASTP对比核酸序列时，优选的参数是：空位开放10.0、空位扩展0.5、DNA全矩阵(DNA单位矩阵)。

还可以用下述方法定义编码表达于本发明所述细胞中的酶的核苷酸序列：在温和杂交条件下，或者优选地在严格杂交条件下，将所述核苷酸序列与序列ID号：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或84的核苷酸序列或者本文中提到的任何其它序列分别杂交，然后根据它们的杂交性能定义。“严格杂交条件”在本文中被定义为下述条件：在约65℃下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中，允许包括至少约25个核苷酸，优选的约50、75或100个核苷酸，最优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交，然后在65℃下，在含有约0.1M盐(优选的是0.2×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地，杂交持续过夜，即至少10小时；优选地，洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许具有约90％或更高序列同一性的序列特异性杂交。

“温和杂交条件”在本文中被定义为：在约45℃下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中，允许包括至少约50个核苷酸，优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交，然后在室温下，在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地，杂交持续过夜，即至少10小时；优选地，洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许序列同一性最高为50％的序列特异性杂交。本领域的技术人员可以调整这些杂交条件以确切鉴定同一性在50％-90％之间变化的序列。

编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以是原核来源或真核来源。

编码内根-柯巴基焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184中展示的序列。

编码内根-贝壳杉烯合酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184中展示的序列。

编码内根-贝壳杉烯氧化酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186中展示的序列。优选的KO是由在序列ID号:85中展示的核酸编码的多肽。

编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185中展示的序列。优选的KAH是由在序列ID号:33中展示的核酸编码的多肽。

本发明更优选的重组微生物可以表达由序列ID号:85和序列ID号:33或上述二者之一的变体(如本文所述)编码的多肽的组合物。本发明优选的重组微生物可以表达表8中展示的序列组合(与任意UGT2组合，但尤其是与由序列ID号:87编码的UGT2组合)。

编码UGT的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中展示的序列。

编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:79中展示的序列。

编码法尼基-焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:81中展示的序列。

编码香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:83中展示的序列。

编码NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以包括，例如在序列ID号:53、55、57或77中展示的序列。

对于UGT序列，选自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的，其中所述组是：(i)序列ID号:35、37、168、169、71、147或189；(ii)序列ID号:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192；(iii)序列ID号:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190；和(iv)序列ID号:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT，那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT，那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。

本发明可使用与上述序列的序列同一性至少约10％、约15％、约20％，优选地至少约25％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的序列。

为了增加被引入的酶在本发明所述的真核细胞中以活性形式表达的可能性，可修改相应的编码核苷酸序列以将其密码子使用(codon usage)优化为所选真核宿主细胞的密码子使用。编码酶的核苷酸序列相对于所选宿主细胞的密码子使用的适应性可被表示为密码子适应指数(CAI)。“密码子适应指数”在本文中被定义为：一个基因的密码子使用相对高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量值。每种密码子的相对适应度(w)指的是对于同一个氨基酸，该密码子相对于最高丰度密码子的使用率。CAI被定义为这些相对适应性数值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0-1之间，较高的值表示最高丰度的密码子的比例较高(参见Sharp和Li，1987，Nucleic AcidsResearch15:1281-1295；亦可参见:Jansen等人，2003，Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。优选地，经修改的核苷酸序列的CAI值至少为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。

在一个优选的实施方式中，用核苷酸序列遗传修饰根据本发明所述的真核细胞，其中使用密码对优化技术(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)修改所述核苷酸序列的密码子使用为真核细胞的密码子使用。密码对优化技术是用于在宿主细胞中产生多肽的方法，其中就编码多肽的核苷酸序列的密码子使用(尤其是被使用的密码对)对核苷酸序列进行修饰，以改善编码多肽的核苷酸序列的表达和/或提高多肽的产量。密码对被定义为：编码序列中的一组2个连续的三联体(密码子)。

可利用公知的方法(例如易错PCR或定向进化)进一步提高本发明所述的真核宿主细胞体内酶的活性。WO03010183和WO03010311中描述了定向进化的优选方法。

根据本发明的微生物可以是微生物来源的任何合适的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是酵母或丝状真菌。更优选地，所述宿主细胞属于下述属之一：Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen或Yamadazyma或Zygosaccharomyces。

更优选的微生物属于下述物种：Aspergillus niger、Penicilliumchrysogenum、Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、C.glabrata、Hansenula polymorpha、Torulaspora delbrueckii、Brettanomycesbruxellensis、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus或Saccharomyces cerevisiae。优选的真核细胞是Saccharomyces cerevisiae。

可修饰根据本发明所述的重组酵母细胞以使ERG9基因被下调和/或ERG5/ERG6基因被删除。在其它微生物中，可用相同的方法修饰相应的基因。

可以用本文所述的方法转化这种微生物，通过将核苷酸序列转化至所述微生物使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。

根据本发明的优选微生物是酵母，例如Saccharomyces cerevisiae或Yarrowia lipolytica细胞。本发明所述的重组微生物(例如重组的Saccharomyces cerevisiae细胞或Yarrowia lipolytica细胞)可包括以下每组中的一种或多种核苷酸序列：

(i)序列ID号:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、152、153、154、159、160、182或184。

(ii)序列ID号:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184。

(iii)序列ID号:21、23、25、6785、145、161、162、163、180或186。

(iv)序列ID号:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185。

这种微生物通常还包括一种或多种如序列ID号:53、55、57或77中所示的核苷酸序列。

这种微生物还可以包括一种或多种如序列ID号:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中所示的核苷酸序列。对于这些序列，来自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的，其中所述组是：(i)序列ID号:35、37、168、169、71、147或189；(ii)序列ID号:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192；(iii)序列ID号:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190；和(iv)序列ID号:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT，那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT，那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。

这种微生物还可以包括下述核苷酸序列：序列ID号:79、81和83。

对于上述每种序列(或本文提及的任何序列)，可以使用与所述序列的序列同一性至少约15％，优选地至少约20％、25％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的变体。

可将编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列连接至一个或多个核酸构建体以促进根据本发明所述的微生物的转化。

核酸构建体可以是一个质粒，其中所述质粒带有编码上述二萜(例如甜菊醇/甜菊糖苷)途径中的酶的基因；或者核酸构建体可包括两个或三个质粒，其中每个质粒分别带有3个或2个基因，这些基因以任意恰当的方式分布并编码二萜途径中的酶。

可以使用任何合适的质粒，例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。

选自内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的酶可以源于宿主微生物，这样就可以不需要用一种或多种编码这些酶的核苷酸序列转化而使宿主细胞产生二萜或二萜糖苷酶。可以通过经典的菌株改良方法，进一步提高利用宿主微生物生产二萜/二萜糖苷酶的产量。

核酸构建体可以维持游离状态，因此其包括自主复制的序列，例如常染色体复制序列。如果宿主细胞是真菌来源，那么合适的游离核酸构建体可以，例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等人，1991，Biotechnology9:968-975)或者AMA质粒(Fierro等人，1995，Curr Genet.29:482-489)。

或者，可以将每种核酸构建体以单拷贝或多拷贝整合至宿主细胞的基因组。可以通过非同源重组将核酸构建体随机整合至宿主细胞的基因组，但优选地通过本领域公知的同源重组(参见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186)实现。

任选地，核酸构建体中可存在选择标记。本文中使用的术语“标记”涉及编码允许选择或筛选含有此标记的微生物的性状或表型的基因。标记基因可以是抗生素抗性基因，能够通过使用恰当的抗生素从未被转化的细胞中选出被转化的细胞。或者还可以使用非抗生素抗性标记，例如营养缺陷型标记(URA3、TRP1、LEU2)，被这种核酸构建体转化过的宿主细胞可以不含有标记基因。EP-A-0635574中公开了构建不含重组标记基因的微生物宿主细胞的方法，该方法基于双向标记的使用。或者，可以使可筛选的标记(例如绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶)成为本发明所述的核酸构建体的一部分以筛选被转化的细胞。WO0540186中描述了引入异源多聚核苷酸的优选的无标记方法。

在一个优选的实施方式中，编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列各自与启动子操作性连接，所述启动子能够使根据本发明所述的真核细胞中相应核苷酸序列充分表达，从而使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。

本文中使用的术语“操作性连接”指的是多聚核苷酸元件(或编码序列，或核酸序列)以功能关系连接。当一种核酸序列与另一种核酸序列存在功能关系时，则该核酸序列被与另一种核酸序列“操作性连接”。例如，如果一个启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它与编码序列操作性连接。

本文中使用的术语“启动子”涉及控制一个或多个基因转录的核酸片段，其位于基因转录起始位点的上游(相对于转录方向)，在结构上可以根据依赖DNA的RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它的DNA序列(包括但不局限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地从启动子调控转录量的任何其它核苷酸序列)的存在来鉴定。“组成型”启动子指的是在大部分环境和发育条件下活跃的启动子。“诱导型”启动子指的是在环境或发育调控下活跃的启动子。

能够被用来表达编码上文所定义的酶的核苷酸序列的启动子可以不源于编码要表达的酶的核苷酸序列，即启动子和与其操作性连接的核苷酸序列(编码序列)是异源的。优选地，启动子是同源的，即相对于宿主细胞是內源的。

在本发明所述的微生物中，合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其它合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。实施例中陈述了其它合适的启动子。

本发明可以使用任何在细胞中有功能的终止子。优选的终止子是从宿主细胞的天然基因中获得的。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地，在本发明的宿主细胞中，这种终止子与阻止无义介导的mRNA降解的突变体结合(参见实施例：Shirley等人，2002，Genetics161:1465-1482)。

本发明中使用的核苷酸序列可以包括将其锚定至微生物的期望隔室的序列。例如，在本发明所述的一种优选的微生物中，除内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的编码序列外的所有核苷酸序列都可被锚定至细胞溶质。可以在酵母细胞中使用这种方法。

当使用术语“同源的”表示给出的(重组)核酸或多肽分子与给出的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，可以理解为：本质上，核酸或多肽分子由一种宿主细胞或相同物种(优选的是相同变体或菌株)的生物体产生。

当使用术语“异源的”表示核酸(DNA或RNA)或蛋白质时，其中所涉及的核酸或蛋白质在自然条件下并不作为其存在的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的一部分出现，或者是与在自然界发现的不同的细胞、位置、基因组或者DNA或RNA序列中发现的核酸或蛋白质。异源的核酸或蛋白质相对于其被引入的细胞不是內源的，但它是从另外一种细胞或者合成或重组生产获得的。

本发明的重组微生物通常包括异源的核苷酸序列。或者本发明的重组微生物可包括被修饰(如本文所述)的完全同源的序列，以便所述微生物比同种但未被修饰的微生物产生更大量的二萜和/或二萜糖苷。

可过表达一种或多种本文所述的二萜途径中的酶以利用细胞产生充足的二萜。

本领域存在多种用以在本发明的宿主细胞中过表达酶的有效方法。特别地，可以通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数以过表达该酶，例如通过将基因的额外拷贝整合至宿主细胞的基因组中。

根据本发明所述的优选的宿主细胞可以是天然能够产生GGPP的重组细胞。

根据本发明所述的重组微生物可以在本领域已知的任意合适的碳源上生长并将其转换为二萜或二萜糖苷。所述重组微生物可直接转换植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的宿主生物体表达酶，例如将纤维素转换为葡萄糖单体所需的纤维素酶(内纤维素酶和外纤维素酶)、将半纤维素转换为木糖和阿拉伯糖单体所需的半纤维素酶(例如内木聚糖酶、外木聚糖酶、阿拉伯糖酶)、能够将果胶转换为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶或者能够将淀粉转换为葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，所述宿主细胞能够转换的碳源选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。所述宿主细胞可以是，例如如在WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO2006096130或WO04/099381中描述的真核宿主细胞。

另一方面，本发明涉及一种生产二萜或二萜糖苷的方法，其中所述方法包括在合适的发酵培养基中发酵根据本发明的已被转化的真核细胞；以及任选地，回收二萜和/或二萜糖苷。

在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是任何能使特定真核宿主细胞生长的适合的培养基。发酵培养基的基本元素是本领域的技术人员已知的，并可针对所选宿主细胞进行修改。

优选地，发酵培养基包括选自植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油的碳源。优选地，发酵培养基还包括氮源，例如尿素或者铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵)。

可以以分批、补料分批或连续的模式实施根据本发明的发酵方法。也可采用分步水解发酵(SHF)法或同时糖化发酵(SSF)法。为了达到最佳生产力，还可以将这些发酵方法的模式结合。在发酵方法中，如果使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源，那么SSF方法可能特别有吸引力，该方法中可能需要加入水解酶，例如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶以水解底物。

在制备二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的重组微生物可以是任何如上文所定义的适合的微生物。在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中，使用根据本发明的重组真核微生物可能是有利的，因为大部分真核细胞不需要无菌条件来增殖而且对噬菌体感染不敏感。此外，真核宿主细胞可以在低pH条件下生长以避免细菌污染。

根据本发明的重组微生物可以是兼性厌氧微生物。在有氧条件下，兼性厌氧微生物能够增殖至高细胞浓度。然后可以在高细胞密度时进行厌氧阶段，高细胞密度不仅大幅度减少了需要的发酵体积，而且可以最小化好氧微生物污染的风险。

根据本发明所述的生产二萜的发酵方法可以是有氧的或厌氧的发酵方法。

“厌氧发酵方法”在本文中可被定义为：在没有氧气或实质上没有氧气可用(优选的少于5、2.5或1mmol/L/h)的条件下运行的发酵方法，其中有机分子起着电子供体和电子受体的作用。根据本发明的发酵方法还可以首先在有氧条件下运行，然后在无氧条件下运行。

还可以在氧限制(oxygen-limited)或微有氧(micro-aerobical)条件下运行所述发酵方法。或者，可以先在有氧条件下、然后在氧限制条件下运行所述发酵方法。氧限制发酵方法指的是耗氧量受到从气体输送至液体的氧气的限制。氧限制的程度取决于进入气流的量和组分以及所使用的发酵设备的实际混合/传质性能。

根据本发明所述的方法中，可以在宿主细胞的生长期或静止(稳态)期生产二萜，或者在这两个阶段均生产二萜。可以在不同的温度下运行所述发酵方法。

可以在最适合真核细胞的温度下生产二萜或二萜糖苷。最适宜的生长温度可因各种被转化的真核细胞而异，这是本领域的技术人员已知的。所述最适宜的温度可能比最适合野生型生物体的温度高，以便生物体在非无菌条件下，在感染敏感性最小和冷却成本最低时高效生长。或者，可以在并非最适合重组微生物生长的温度下实施该方法。事实上，我们已经证明在低于最适合重组微生物生长的温度下实施制备二萜或二萜糖苷的方法可能是有益的。

在生产二萜或二萜糖苷的方法中，重组微生物的生长温度可以高于20℃、22℃、25℃、28℃或高于30℃、35℃或高于37℃、40℃、42℃，优选地低于45℃。然而在二萜或二萜糖苷的产生阶段，最适宜的温度可能低于平均温度以优化生物质的稳定性。这个阶段的温度可以低于45℃，例如低于42℃、40℃、37℃，例如低于35℃、30℃或者低于28℃、25℃、22℃或者低于20℃，优选地高于15℃。

因此，本发明提供一种制备二萜或糖基化的二萜的方法，所述方法包括在约29℃或更低的温度下，在适合的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜。所述微生物可以是根据本发明的微生物。

这种方法中的发酵温度可以是约29℃或更低、约28℃或更低、约27℃或更低、约26℃或更低，或者更低的温度。

可以在任意合适的pH值下实施根据本发明的生产二萜或二萜糖苷的方法。如果重组微生物是酵母，那么发酵培养基优选的pH值低于6，优选地低于5.5，优选地低于5，优选地低于4.5，优选地低于4，优选地低于3.5或低于3.0或低于2.5，优选地高于2。在这些低pH值下实施发酵过程的一个优势在于，可以防止发酵培养基中污染细菌的生长。

可以以工业规模实施这种方法。

这种方法的产物可以是甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A中的一种或多种。优选地，产生莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。

可以使用本领域已知的方法，例如通过蒸馏、真空抽提、溶剂抽提或蒸发从发酵培养基中回收二萜或二萜糖苷。

根据本发明所述的生产二萜或二萜糖苷的方法中，获得的发酵液的浓度可超过5mg/l，优选地超过10mg/l，优选地超过20mg/l，优选地超过30mg/l，优选地超过40mg/l，更优选地超过50mg/l，优选地超过60mg/l，优选地超过70mg/l的发酵，优选地超过80mg/l，优选地超过100mg/l，优选地超过1g/l，优选地超过5g/l，优选地超过10g/l的，但通常低于70g/l。

本发明还涉及一种发酵液，所述发酵液包括利用根据本发明的方法可得到的二萜和/或二萜糖苷。其中所述二萜或二萜糖苷可以是甜菊糖苷，尤其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。

如果二萜或二萜糖苷表达于微生物中，那么可能需要处理这种细胞以释放二萜/二萜糖苷。

本发明还涉及将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括：将所述初次糖基化的二萜与本文所述的微生物、来源于这种微生物的无细胞提取物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触，从而将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜。

二次糖基化的二萜可能是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。特别地，可以以某种方式实施所述方法以使初次糖基化的二萜是莱鲍迪甙A以及二次糖基化的二萜是莱鲍迪甙D。

利用根据本发明的发酵方法产生的二萜或二萜糖苷(例如莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D)可用于这些化合物已知的任何应用中。特别地，例如它们可以在，例如食品或饮料中被用作甜味剂。例如，甜菊糖苷可以被调配在软饮料中，可以用于桌面甜味剂(tabletop sweetener)、口香糖、乳制品(例如酸奶(例如原味酸奶))、蛋糕、谷物或基于谷物的食品、营养食品、药物、食用胶、糖果食品、化妆品、牙膏或者其它口腔组合物等。此外，二萜或二萜糖苷作为甜味剂不仅能够用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品，而且还能够用于具有改良特性的动物饲料。

因此，本发明此外还提供包括根据本发明的方法制备的二萜或二萜糖苷的食品、饲料或饮料。

在生产食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖时，可使用常规方法，例如混合、揉捏、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。

对于在本发明中得到的二萜或二萜糖苷，可以以干燥形式或液体形式使用。可以在食品热处理之前或之后加入。甜味剂的量取决于使用目的。可以单独加入或者与其它化合物组合加入。

根据本发明的方法生产的化合物可以与一种或多种其它无热量或有热量的甜味剂混合。这种混合物可被用于改善风味或时间变化形廓或稳定性。大范围无热量和有热量的甜味剂可适合与甜菊糖苷混合。例如，无热量的甜味剂，例如罗汉果苷、莫那甜、阿斯巴甜、乙酰舒泛盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、邻磺苯甲酰亚胺盐或赤藓糖醇。适合与甜菊糖苷混合的有热量的甜味剂包括糖醇和碳水化合物(例如蔗糖、葡萄糖、果糖和果葡糖浆)。也可以使用有甜味的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。

二萜或二萜糖苷能够与甜味抑制剂(例如天然甜味抑制剂)组合使用。它可以与鲜味增强剂(例如氨基酸或其盐)组合。

二萜或二萜糖苷能够与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂素、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或植物固醇、多元醇类、益生质、益生素、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或被归为有益健康类的例如有益心血管的、降低胆固醇的或抗炎的物质)组合。

含有二萜或二萜糖苷的组合物可包括增味剂、芳香剂、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味剂、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或脂肪酸盐。

本发明的二萜或二萜糖苷可作为高强度甜味剂被使用以产生具有改良味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病人的饮料和食品。它也能用于不能使用糖的食品、药品和其它产品中。

此外，本发明的二萜或二萜糖苷作为甜味剂，不仅可以用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品，而且可以用于具有改良特征的动物饲料。

使用本发明的二萜或二萜糖苷组合物作为甜味剂的产品实例有：含酒精的饮料(例如伏特加酒、红酒、啤酒、烈酒、日本清酒等)、天然果汁、清凉饮料、碳酸软饮料、低糖饮料、零卡路里饮料、低卡路里饮料和食物、酸奶饮料、速溶果汁、速溶咖啡、粉末型速溶饮料、罐装食品、糖浆剂、发酵豆酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱粉、汤、速食汤、酱油粉、醋粉、饼干类、米饼、咸饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、果脯、榨菜、鲜奶油、果酱、橘子酱、花酱、奶粉、冰激凌、果汁冰糕、瓶装蔬菜、瓶装水果、罐装煮豆、糖酱煮肉和食物、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干海鲜制品、冷冻食品、腌海藻、腊肉、烟草、药品和许多其它产品。原则上，其应用可以不受限制。

甜味组合物包括饮料，其中非限制性的实例包括：非碳酸和碳酸饮料(例如可乐、姜汁汽水、沙士、苹果酒、果味软饮料(例如柑橘类(例如柠檬-酸橙或橘子)风味软饮料)、软饮料粉等)；源于水果或蔬菜的果汁、含有压榨汁或其类似物的果汁、含有水果颗粒的果汁、水果饮料、水果汁饮料、含有水果汁的饮料、果味饮料、蔬菜汁、含有蔬菜的果汁以及含有水果和蔬菜的混合果汁；运动饮料、能量饮料、近似水及其类似物的饮料(例如含有天然或合成调味剂的水)；茶类或最受欢迎类饮料(例如咖啡、可可饮料、红茶、绿茶、乌龙茶等)；含有牛奶成分的饮料(例如牛奶饮料、含有牛奶成分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果乳饮料、饮用酸奶、乳酸菌饮料等)和乳制品。

通常，甜味组合物中的甜味剂的量变化很大，这取决于甜味组合物的具体类型和期望甜味。本领域的普通技术人员能够易于分辨出待放入甜味组合物中的甜味剂的合适量。

在本发明中得到的本发明所述的二萜或二萜糖苷可以干燥形式或液体形式被使用。它可以在热处理食品之前或之后被加入。甜味剂的量取决于使用目的。它能够被单独加入或者与其它化合物组合加入。

在制造食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖的过程中可以使用常规方法，例如混合、捏合、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。

因此，可以利用本领域的技术人员已知的任何方法制造本发明的组合物，其中所述方法能够提供组成成分的同质均一的或同质的混合物。这些方法包括干混合、喷雾干燥、凝聚、湿制颗粒、压缩、共结晶等。

可以以任何适合配送至待加糖食品的形式向消费者提供固体的本发明的二萜或二萜糖苷，其中所述形式包括小袋、小包、散装袋或盒、立方块、片、喷雾或者可溶性的条。可以以单位剂量或大批量配送所述组合物。

对于液体甜味剂系列和方便的液体、半液体、膏状和乳状形式的组合物，应该发明一种便于携带或分配或贮存或运输含有任何上述甜味剂产品或上述产品的组合物的合适的包装，其中所述包装使用合适的任意形状或形式的包装材料。

所述组合物可包括各种填充剂、功能成分、色素和香料。

不能认为本文参考的专利文件或者作为现有技术给出的其它材料承认：截止任意权利要求的优先权日，所述文件或材料是已知的或者其所包含的信息是公众常识的一部分。

本文提及的每个参考文献的公开内容均通过引用的方式被全部并入本文。

通过以下实施例进一步阐释本发明。

实施例

综述

标准的遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶以及宿主细胞的额外遗传修饰)是本领域已知的方法，例如在Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press或者F.Ausubel等人，eds.，"Current protocols in molecular biology"，Green Publishing and WileyInterscience，New York(1987)中所描述的。真菌宿主细胞的转化和遗传修饰的方法可以从，例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671中了解。

实施例1：在Saccharomyces cerevisiae中克隆并表达莱鲍迪甙A生物合成路径

1.1.表达构建体

利用适于S.cerevisiae的密码对方法(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)获得序列ID号79、81和83的序列，并在DNA2.0合成。在组成型启动子之后克隆序列ID号79、81和83的序列，终止子位于编码序列之后。基于S.cerevisiae表达载体pRS414(Sirkoski R.S.和Hieter P，Genetics，1989，122(1):19-27)的多克隆位点，将由合成基因构建体组成的限制片段连接至该载体以创建含有3个表达盒的表达构建体pRS414rebA-01。用连接混合物转化E.coli DH10B(Invitrogen)，从而产生酵母表达构建体pGBS414rebA-01。

利用适于S.cerevisiae的密码对方法(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)获得序列ID号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、53、55、57、59、61、63、65、67、69和77的序列，并在DNA2.0合成。在组成型启动子之后克隆序列ID号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、53、55、57、59、61、63、65、67、69和77的序列，终止子位于编码序列之后。基于S.cerevisiae表达载体pRS415(Sirkoski R.S.和Hieter P，Genetics，1989，122(1):19-27)的多克隆位点，将由合成基因构建体组成的限制片段连接至该载体以创建包含表达盒的多种组合的表达构建体库pRS415rebA-01，其中所述表达盒包括序列ID号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、53、55、57、59、61、63、65、67、69和77的序列。用连接混合物转化E.coli DH10B(Invitrogen)，从而产生酵母表达构建体库pGBS415rebA-01。

利用适于S.cerevisiae的密码对方法(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)获得序列ID号35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73或75的序列，并在DNA2.0合成。在组成型启动子之后克隆序列ID号35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73或75的序列，终止子位于编码序列之后。基于S.cerevisiae表达载体pRS416(Sirkoski R.S.和Hieter P，Genetics，1989，122(1):19-27)的多克隆位点，将由合成基因构建体组成的限制片段连接至该载体以创建包含表达盒的多种组合的表达构建体库pRS416rebA-01，其中所述表达盒包括序列ID号35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73或75的序列。用连接混合物转化E.coli DH10B(Invitrogen)，从而产生酵母表达构建体库pGBS416rebA-01。

1.2.转化

将表达质粒pGBS414rebA-01以及表达质粒库pGBS415rebA-01和pGBS416rebA-01转化至S.cerevisiae菌株CEN.PK113-6B(MATA ura3 52leu2 112trp1-289)。将转化混合物涂布在添加2％葡萄糖的不含氨基酸的酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base,YNB)(Difco)上。

1.3.培养转化株

将转化株接种至Verduyn培养基中，在有氧、厌氧和氧限制条件下于摇瓶中生长，其中所述培养基包括葡萄糖、半乳糖或其它碳源(例如乙醇或甘油)，如果需要的话，补充适当的氨基酸(Verduyn等人，1992，Yeast.Jul；8(7):501-17)。用溶解于乙醇中的0.01g/l麦角固醇和0.42g/l吐温80补充厌氧培养培养基(Andreasen和Stier，1953，J.cell.Physiol，41，23-36；Andreasen和Stier，1954，J.Cell.Physiol，43:271-281)。所有的酵母培养物都在摇床中(250-280rpm、30℃)生长。

1.4.检测莱鲍迪甙A

在不同的培养时间，取出一部分培养物并离心，然后利用LC/MS分析培养基和细胞中莱鲍迪甙A的形成(如下所述)。过夜生长后旋转沉淀细胞，然后利用LC/MS测量莱鲍迪甙A(C44H70O23，单一同位素分子质量＝966.43079)的浓度(如下所述)。为达此目的，将UHPLC系统与三级四极质谱仪结合，以MS/MS模式利用质子化的分子丢失的己糖单元来检测莱鲍迪甙A。

在等度洗脱中使用Waters acquity UPLC BEH amide色谱柱(1.7um，2.1*150mm)。流动相由体积比为8:2的乙腈/溶于MilliQ水的10mMNH₄Ac(pH6.8)组成，流速为300ul/min。注射体积为5μL，色谱柱的温度保持在30℃。

实施例2：在S.cerevisiae中过表达ERG20、BTS1和tHMG

使用如处于联合申请状态的专利申请US61/616254中描述的技术将表达盒整合至一个位点以过表达ERG20、BTS1和tHMG1。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株(van Dijken等人Enzyme and MicrobialTechnology26(2000)706-714)的基因组DNA扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0，不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。这些盒子中的基因的侧翼是组成型启动子和终止子。参见表2。溶解来源于DNA2.0的含有ERG20、tHMG1和BTS1盒子的质粒DNA至浓度为100ng/μl。在50μl PCR混合物中，使用20ng模板和20pmol引物。材料被溶解至浓度为0.5μg/μl。

表2：过表达构建体的组分

启动子	开放阅读框	终止子
			Eno2(序列ID号:201)	Erg20(序列ID号:81)	Adh1(序列ID号:212)
Fba1(序列ID号:202)	tHMG1(序列ID号:79)	Adh2(序列ID号:213)
			Tef1(序列ID号:203)	Bts1(序列ID号:83)	Gmp1(序列ID号:214)

使用pUG7-EcoRV构建体(图1)和合适的引物来扩增选择标记。使用Zymoclean Gel DNA Recovery试剂盒(ZymoResearch)从凝胶中纯化KanMX片段。使用在表3中列出的片段转化酵母菌株Cen.PK113-3C。

表3：用于ERG20、tHMG1和BTS1的转化的DNA片段

片段
	5’YPRcTau3
ERG20盒
	tHMG1盒
KanMX盒
	BTS1盒
3’YPRcTau3

转化后，在30℃下于YEPhD(酵母膏植物蛋白胨葡萄糖；BBL植物蛋白胨来源于BD)中复苏2.5小时，然后将细胞涂布在含200μg/ml G418(Sigma)的YEPhD琼脂上。在30℃下培养平板4天。利用诊断PCR和测序技术确定正确的整合。通过对蛋白质进行LC/MS证实过表达。图2阐释了组装ERG20、tHMG1和BTS1的原理图。该菌株被命名为STV002。

该菌株中CRE重组酶的表达导致KanMX标记的向外重组。利用诊断PCR确定正确的向外重组以及ERG20、tHMG1和BTS1的存在。

实施例3：敲除Erg9

为了降低Erg9的表达，设计并使用含有修饰的3’末端的Erg9敲除构建体，其中所述3’末端延续至驱动TRP1表达的TRP1启动子。

转化含有Erg9敲除片段的构建体至E.coli TOP10细胞。转化株生长于2PY(2倍的植物蛋白胨和酵母膏)-sAMP培养基中。使用QIAprepSpin Miniprep kit(Qiagen)分离质粒DNA，然后用SalI-HF(NewEngland Biolabs)消化。用乙醇沉淀DNA以浓缩。转化所述片段至S.cerevisiae，然后将菌落涂布到不含色氨酸的矿质培养基(Verduyn等人，1992.Yeast8:501-517)琼脂板上。利用诊断PCR和测序技术确定正确整合的Erg9敲除构建体。图2阐释了执行Erg9敲除构建体的转化的原理图。该菌株被命名为STV003。

实施例4：过表达UGT2_1a

使用如处于联合申请状态的专利申请US61/616254和EP12159094.7中描述的技术过表达UGT2_1a。在DNA2.0，UGT2a被整理为一个盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。细节请参见表4。使用如处于联合申请状态的专利申请EP12159094.7中描述的技术以获得含有标记和Cre重组酶的片段。用具有诺尔丝菌素抗性的NAT标记进行筛选。

表4：过表达构建体的组分

使用合适的引物进行扩增。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。

使用表5中列出的片段转化S.cerevisiae酵母菌株STV003，然后将转化混合物涂布在含有50μg/ml诺尔丝菌素(Lexy NTC来源于JenaBioscience)的YEPhD琼脂板上。

表5：用于UGT2a的转化的DNA片段

片段
	5’Chr09.01
UGT2a盒
	NAT‐CR
RE
	3’Chr09.01

半乳糖能够激活CRE重组酶的表达。为了诱导CRE重组酶的表达，将转化株再次划线至YEPh半乳糖培养基上。这导致了位于lox位置之间的标记的向外重组。利用诊断PCR证实UGT2a的正确整合和NAT标记的向外重组。由此产生的菌株被命名为STV004。图4阐释了执行UGT2a构建体的转化的原理图。

实施例5：过表达甜菊醇产生通路：CPS、KS、KO、KAH和CPR

甜菊醇通路

使用如处于联合申请状态的专利申请US61/616254中描述的技术将所有导致甜菊醇产生的通路基因串联整合至一个位点。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0，不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(参见表6)。溶解来源于DNA2.0的DNA至100ng/μl。将该原液进一步稀释至5ng/μl，然后取1μl稀释后的溶液用于50μl-PCR混合物中。反应体系包含25pmol每种引物。扩增后，使用NucleoSpin96PCR Clean-up kit(Macherey-Nagel)纯化DNA或者利用乙醇沉淀以浓缩DNA。

表6.

将所有甜菊醇通路基因、标记和侧翼片段(概述请参见表7)转化至S.cerevisiae酵母菌株STV004。在20℃下于YEPhD中过夜复苏后，将转化混合物涂布至含有200μg/ml G418的YEPhD琼脂板上。然后在25℃下培养3天并在室温下培养一夜。

表7.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH和CPR的转化的DNA片段

片段
	5’INT1
CPS盒
	KS盒
KO盒
	KanMX盒
KAH盒
	CPR盒
3’INT1

利用诊断PCR和序列分析(3500 Genetic Analyzer，AppliedBiosystems)证实正确的整合。使用BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing kit (Life Technologies)完成测序反应。每个反应(10μl)包含50ng模板和3.2pmol引物。通过用乙醇/EDTA沉淀来纯化产物，然后将其溶解在10μl HiDi甲酰胺中并用于仪器。该菌株被命名为STV018。图5阐释了将GGPP到甜菊醇的通路整合至基因组的原理图。

实施例6：过表达RebA产生通路：CPS、KS、KO、KAH、CPR、 UGT1、UGT3和UGT4

使用如处于联合申请状态的专利申请US61/616254中描述的技术将所有导致RebA产生的通路基因整合至一个位点。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0，不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(概述请参见表8)。溶解来源于DNA2.0的DNA至100ng/μl。将该原液进一步稀释至5ng/μl，然后取1μl稀释后的溶液用于50μl-PCR混合物中。反应体系包含25pmol每种引物。扩增后，使用NucleoSpin 96PCR Clean-up kit (Macherey-Nagel)纯化DNA或者利用乙醇沉淀以浓缩DNA。

表8.用于RebA产生通路的序列

将所有RebA通路基因、标记和侧翼片段(概述请参见表9)转化至S.cerevisiae酵母菌株STV004。在20℃下于YEPhD中过夜复苏后，将转化混合物涂布至含有200μg/ml G418的YEPhD琼脂板上。然后在25℃下培养3天并在室温下培养一夜。

表9.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4的转化的DNA片段

片段
	5’INT1
CPS盒
	KS盒
KO盒
	KanMX盒
KAH盒
	CPR盒
UGT1盒
	UGT3盒
UGT4盒
	3’INT1

利用诊断PCR和序列分析(3500Genetic Analyzer，AppliedBiosystems)证实正确的整合。使用BigDye Terminator v3.1 CycleSequencing kit (Life Technologies)完成测序反应。每个反应(10μl)包含50ng模板和3.2pmol引物。通过用乙醇/EDTA沉淀来纯化产物，然后将其溶解在10μl HiDi甲酰胺中并应用于仪器。该菌株被命名为STV006。图6阐释了将GGPP到RebA的通路整合至基因组的原理图。

实施例7：在菌株STV018中生产甜菊醇

含有实施例1、2、3、4和5中所述修饰的S. cerevisiae酵母菌株—菌株STV018生长在含有葡萄糖的YEP(Yeast Extract Peptone，酵母膏蛋白胨)中。在30℃下孵化摇瓶7天。采用以下步骤从细胞中提取产物：在95℃下孵化全部发酵液15分钟，然后加入乙腈(1/2体积当量)，接着混合并旋转沉淀样品。如果需要的话，用33％的乙腈稀释样品。使用LC/MS分析样品中的甜菊醇。使用甜菊醇(Sigma H8664)作为标准物。图7阐释了结果。

实施例8：在菌株STV006中生产RebA

含有实施例1、2、3、4和6中所述修饰的S.cerevisiae酵母菌株—菌株STV006生长在含有葡萄糖的YEP(酵母膏蛋白胨)中。在30℃下孵化摇瓶7天。采用以下步骤从细胞中提取产物：在95℃下孵化全部发酵液15分钟，然后加入乙腈(1/2体积当量)，接着混合并旋转沉淀样品。如果需要的话，用33％的乙腈稀释样品。使用LC/MS分析样品中的RebA。使用RebA(RV0141-94，DAE Pyung Co.Ltd)作为标准物。图8阐释了结果。

表10展示了实施例2—8中使用的菌株

表10.菌株表

实施例9.KO酶和CPR酶变体的影响

我们评估了KO酶和CPR酶的不同组合对RebA产量的影响。使用相同的CPS、KS、KAH、UGT1、UGT3和UGT4盒但不同的KO基因和/或CPR基因的变体构建这些菌株(如实施例6中所述)。使用相同的Sc ENO2.pro启动子和Sc TPI1.ter终止子控制KO基因(如实施例6中所述)。使用相同的Kl prom6.pro启动子和Sc PDC1.ter终止子控制CPR基因(如实施例6中所述)。

表11.带有KO酶和CPR酶的不同组合的菌株

菌株	KO	CPR
			STV006	KO_Gibfu(序列ID号:85)	CPR_3(序列ID号:57)
STV012	KO_2(序列ID号:23)	CPR_3(序列ID号:57)
			STV016	KO_2(序列ID号:23)	CPR_SR(序列ID号:59)
STV017	KO_Gibfu(序列ID号:85)	CPR_SR(序列ID号:59)

将上述菌株接种至摇瓶中并在30℃下培养7天。采用以下步骤从细胞中提取产物：在95℃下孵化全部发酵液15分钟，然后加入乙腈(1/2体积当量)，接着混合样品并旋转沉淀。如果需要的话，用33％的乙腈稀释样品。使用LC/MS分析样品中的RebA。使用RebA(RV0141-94，DAE PyungCo.Ltd)作为标准物。图9阐释了结果。

实施例10：过表达部分产生通路：CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1 和UGT2

我们使用与实施例6中所详述的相似的方案构建了一个表达CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1和UGT2的菌株。该菌株(被命名为STV019)表达的基因除了不含UGT3和UGT4之外，其余均与实施例6中的菌株STV006表达的基因相同。

实施例11：过表达部分产生通路：CPS、KS、KO、KAH、CPR、 UGT1、UGT2和UGT4

我们使用与实施例6中所详述的相似的方案构建了一个表达CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1、UGT2和UGT4的菌株。该菌株(被命名为STV020)表达的基因除了不含UGT4之外，其余均与实施例6中的菌株STV006表达的基因相同。

实施例12：在菌株STV018、STV019和STV020中形成甜菊糖苷

含有实施例1、2、3、4、5、6、10和11中所述修饰的S.cerevisiae酵母菌株—菌株STV018、STV019和STV020，生长在含有葡萄糖的YEP(酵母膏蛋白胨)中。在30℃下孵化摇瓶7天。为了从细胞中提取产物，加热并用乙腈处理全部发酵液，然后旋转沉淀，最后使用LC/MS分析上清中的甜菊苷和RebA。使用RebA(RV0141-94，DAE Pyung Co.Ltd)和甜菊苷(RV0141-95，DAE Pyung Co.Ltd)作为标准物。

出人意料地，我们发现菌株STV019中产生了甜菊苷，菌株STV020中产生了RebA。图10阐释了结果。

这些结果阐释了UGT3不表达时，形成甜菊苷的活性。

实施例13：可变的KO_SR表达

如在实施例1、2、3、4和6中所描述的，我们通过转化构建了表达CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1、UGT2、UGT3和UGT4的菌株。对于贝壳杉烯氧化酶，我们使用KO_SR(序列ID号:67)或者KO_Gibfu(序列ID号:85)。我们使用不同强度的启动子(参加表12)以驱动内根-贝壳杉烯氧化酶的表达。用如实施例8所述的方法测定RebA的产量。对于相同的启动子强度，使用两种不同的内根-贝壳杉烯氧化酶，观察到了相反的结果。

表12：在不同菌株中使用的KO和启动子序列

实施例14.在重组体Yarrowia lipolytica中生产甜菊醇

如下所述，构建编码合成甜菊醇的基因的质粒pMB6754、pMB6761和pMB6762。使用如在PCT/EP2007/05594中所公开的密码对优化技术，对tCPS(序列ID号:182)、tKS(序列ID号:183)、CPSKS(序列ID号:184)、KOGib(序列ID号:186)、KAH4(序列ID号:185)、CPR1(序列ID号:187)和CPR3(序列ID号:188)的开放阅读框进行密码对优化，以使其在Yarrowialipolytica中表达。两侧是60bp期望的启动子和终止子的优化序列由GenScript(序列ID号：182-188)合成，然后通过使用合适引物的PCR进行扩增。利用始于现有构建体(序列ID193-197和199)的PCR来扩增编码终止子-启动子序列、TPI启动子或Yarrowia lipolytica标记的DNA片段。载体DNA(序列ID198)由基于S.cerevisiae着丝粒的URA3质粒YCp50(Rose等人,Gene1987；60(2-3):237-43)组成，同时使用标准技术用来源于Yarrowia的ENOp替换所述质粒上的tet基因，其中所述载体DNA从E.coli制备并被XbaI和SnaBI消化。使用QiaQuick kit(Qiagen)通过凝胶电泳纯化所有的片段。用250ng每种DNA片段转化(Gietz和Schiestl,Nat.Protoc.2007；2(1):31-4)S.cerevisiae菌株10556-23C(W303背景；G.R.Fink)，然后在最低浓度的葡萄糖天冬氨酸培养基上筛选原养型。从原养型转化株中提取质粒(Nucleic Acids Research,Vol.20,No.14,p.3790(1992))，然后用其转化具有氨苄青霉素抗性(100mg/L)E.coliDH5α，并涂布于LB琼脂板上。

通过用pMB4591(tef1-GGS URA2)转化MF350得到香叶基香叶基二磷酸合酶的表达量增加的Yarrowia菌株ML2597(US7851199)。用SfiI消化质粒pMB6754、pMB6761和pMB6762，然后用消化后的质粒转化亮氨酸原养型的ML25979，并涂布于含有腺嘌呤(0.2mM)的最低浓度的葡萄糖天冬氨酸培养基上。将转化株再次划线至选择培养基，随后接种到24孔微量滴定板(MTP)中的0.8mlYPD。用BugStopper mat(Whatman)密封平板，然后使菌株在Multitron培养箱(Infors)(30℃，800rpm)生长6天以产生甜菊醇。

转移500μl发酵液至微量离心管中，加入250μl乙腈和600μl二氧化硅珠子(0.5mm)。用珠子震荡10分钟以破碎细胞，然后在微型离心机中以13,000×g离心细胞碎片1分钟。用体积比为1:2的乙腈:水稀释上清200倍，然后利用LC/MS分析(表14)。使用含有100μg/ml甜菊醇的甜菊苷混合物作为标准物。

表13.甜菊醇&RebA通路质粒

质粒	序列ID	基因型(部分)
			pMB6754	184,185,186,187,194,195,196,197,198,199	CPSKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_1,LEU2
pMB6761	184,185,186,188,194,195,196,197,198,199	tCPS,tKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_1,LEU2
			pMB6762	182,183,185,186,188,193,194,195,196,197,198,199	tCPS,tKS,KAH_4,KO_Gib,CPR_3,LEU2
pMB6775	189,190,191,192,194,195,196,198,199,200	UGT1,UGT3,UGT4,UGT2,HPH

表14.甜菊醇的产量

实施例15.在重组体Yarrowia lipolytica中生产RebA

如下所述，构建编码合成RebA的基因的质粒pMB6775(参见表13和图14)。使用如在PCT/EP2007/05594中所公开的密码对优化技术，对UGT1、UGT3、UGT4和UGT2的开放阅读框进行密码对优化，以使其在Yarrowia lipolytica中表达。两侧是60bp期望的启动子和终止子的优化序列由GenScript(序列ID号：189-192)合成，然后通过使用合适引物的PCR进行扩增。利用始于现有构建体(序列ID号：194-196、199和200)的PCR来扩增编码终止子-启动子序列或Yarrowia lipolytica标记的DNA片段。载体(序列ID号：198)由基于S.cerevisiae着丝粒的URA3质粒YCp50(Rose等人,如上所述)组成，同时使用标准技术用来源于Yarrowia的ENOp替换所述质粒上的tet基因，其中所述载体从E.coli制备并被XbaI和SnaBI消化。使用QiaQuick kit(Qiagen)通过凝胶电泳纯化所有的片段。用250ng每种DNA片段转化(Gietz和Schiestl,如上所述)S.cerevisiae菌株10556-23C(W303背景；G.R.Fink)，并在最低浓度的葡萄糖天冬氨酸培养基上筛选原养型。从原养型转化株中提取质粒(Nucleic Acids Research,Vol.20,No.14,p.3790(1992))，然后用其转化具有氨苄青霉素抗性(100mg/L)E.coliDH5α，并涂布于LB琼脂板上。

用SfiI消化质粒pMB6775，然后用消化后的质粒转化能够产生甜菊醇的具有潮霉素抗性(100mg/L)的Yarrowia菌株ML12925、ML12929和ML12931，并涂布于在YPD琼脂板上。将转化株再次划线至选择培养基，随后接种到24孔微量滴定板(MTP)中的0.8mlYPD。用BugStopper mat(Whatman)密封平板，然后使菌株在Multitron培养箱(Infors)(30℃，800rpm)生长6天以产生甜菊醇。

将由100μl发酵液组成的样品转移至微量离心管中，然后加入700μl33％的乙腈和600μl二氧化硅珠子(0.5mm)。用珠子震荡10分钟以破碎细胞，然后在微型离心机中以13,000×g离心细胞碎片1分钟。用体积比为1:2的乙腈:水稀释上清2.5倍，然后利用LC/MS分析(表15)。此外，离心500μl发酵液，然后将上清稀释20倍用于LC-MS分析(表Z)。使用RebA作为标准物。

表15.RebA的产量

实施例16：在酵母中生物合成莱鲍迪甙D(RebD)

代谢通路中基因表达水平的变化可以导致形成不同的产物和副产物。改变竞争相同的底物的基因的表达水平可以更改产生的产物的数量和性质。改变基因表达水平的一种方法是改变驱动该基因表达的启动子的强度。不同的条件也可以改变基因的表达。我们使用不同的启动子以改变实施例6中所述的UGTs的表达。

将所有导致RebD产生的通路基因整合至STV004菌株背景的一个位点。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点(位置3)的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0，不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(概述请参见表16)。溶解来源于DNA2.0的DNA至100ng/μl。将该原液进一步稀释至5ng/μl，然后取1μl稀释后的溶液用于50μl-PCR混合物中。反应体系包含25pmol每种引物。扩增后，使用NucleoSpin96PCR Clean-up kit(Macherey-Nagel)纯化DNA或者利用乙醇沉淀以浓缩DNA。

表16.CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4过表达构建体的组分

启动子	开放阅读框	终止子
			Kl prom12.pro(序列ID号:205)	CPS(序列ID号:61)	Sc Adh2.ter(序列ID号:213)
Sc Pgk1.pro(序列ID号:204)	KS(序列ID号:65)	Sc Tal1.ter(序列ID号:215)
			Sc Eno2.pro(序列ID号:201)	KO(序列ID号:85)	Sc Tpi1.ter(序列ID号:216)
Ag lox_Tef1.pro(序列ID号:206)	KANMX(序列ID号:211)	Ag Tef1_lox.ter(序列ID号:217)
			Sc Tef1.pro(序列ID号:203)	KAH(序列ID号:33)	Sc Gpm1.ter(序列ID号:214)
Kl prom6.pro(序列ID号:207)	CPR(序列ID号:57)	Sc Pdc1.ter(序列ID号:218)
			Sc Pma1.pro(序列ID号:208)	UGT1(序列ID号:71)	Sc Tdh1.ter(序列ID号:219)
Sc Vps68.pro(序列ID号:209)	UGT3(序列ID号:73)	Sc Adh1.ter(序列ID号:212)
			Sc Oye2.pro(序列ID号:210)	UGT4(序列ID号:75)	Sc Eno1.ter(序列ID号:220)

将所有RebD通路基因、标记和侧翼片段(概述请参见表17)转化至S.cerevisiae酵母菌株STV004。在20℃下于YEPhD中过夜复苏后，将转化混合物涂布至含有200μg/ml G418的YEPhD琼脂板上。然后在30℃下培养3天。

表17.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4的转化的DNA片段

片段
	5’位置3
CPS盒
	KS盒
KO盒
	KanMX盒
KAH盒
	CPR盒
UGT1盒
	UGT3盒
UGT4盒
	3’位置3

利用诊断PCR证实正确的整合。由此得到的菌株被命名为STV015(MATa URA3HIS3LEU2trp1-289MAL2-8C SUC2site1::ERG20、tHMG1、BTS1ERG9::ERG9-KD TRP1site2::UGT2site3::CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3、UGT4)。图15阐释了执行产生通路的转化的原理图。

实施例17.在菌株STV015中生产RebD

含有实施例1、2、3、4、6和16中所述修饰的S.cerevisiae酵母菌株—菌株STV015生长在含有葡萄糖的YEP(酵母膏蛋白胨)中。在30℃下孵化摇瓶7天。采用以下步骤从细胞中提取产物：在95℃下孵化全部发酵液15分钟，然后加入乙腈(1/2体积当量)，接着混合样品并旋转沉淀。如果需要的话，用33％的乙腈稀释样品。使用LC/MS分析样品中的RebA和RebD。使用RebA(RV0141-94,DAE Pyung Co.Ltd)和RebD(ASB-00018229-010,ChromaDex)作为标准物。图16阐释了结果。

实施例18.酶法转换二萜为糖基化的二萜

菌株

在能够激活所引入基因的转录和翻译的合适培养基中培养Saccharomyces cerevisia菌株STV006(参见上述实施例6)。离心得到的细胞，然后储存在-20℃直至分析。

制备无细胞提取物

向8gr细胞沉淀中加入40mL100mM的Tris缓冲液(pH＝7.18)并使其均匀化。随后加入8gr玻璃珠(50-200μm)。将样品放在冰上冷却15分钟。然后以最大速度旋转震荡样品2分钟，接着放在冰上冷却5分钟，重复上述操作四次以破碎细胞。裂解后，将提取物在4℃下以3000g离心60分钟。获得的上清直接用于活性测定。

制备透性化细胞

用40mL40％DMSO的Tris缓冲液(100mM pH＝7.18)均匀化8gr新鲜的细胞沉淀，然后冻存在-20℃。分析前解冻细胞，然后转移5mL至一个新管中，用含有0.1％葡萄糖的100mM的Tris缓冲液(pH＝7.18)洗涤3次。每次以3000g离心后均悬起细胞。最终，细胞被重悬至5mL100mM的Tris缓冲液(pH＝7.18)中。

UDP-葡萄糖基转移酶的酶活性测定

向反应混合物中加入2.5μL酶样品(无细胞提取物、透性化细胞、孤立的或固定化的酶)，其中所述反应混合物包含：

-0.05％葡萄糖(重量/体积；5.55mM)

-5mM UDP-Glc

-2.5％DMSO(体积/体积)

下述化合物作为变量被加入：

-碱性磷酸酶

-10μg/mL乳清蛋白

-金属离子：Mn²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺

-甜菊醇中间底物(均溶于DMSO中)。

总反应体积为100μL。在被加热至30℃的微量滴定板(MTP)中完成测定，其中MTP置于MTP eppendorf培养箱中。

以800rpm震荡培养12小时即完成培养。密封MTP以防止污染和蒸发。

分析

在4℃下离心反应混合物20分钟以终止酶反应，然后收集样品。向100μL样品中加入50μL乙腈以完全终止反应，然后提取形成的所有分子。为达此目的，密封MTP并剧烈震荡。随后，在4℃下离心样品60分钟，然后转移100μL至一个新的MTP中用于LC-MS分析。

用甜菊醇孵化

用上述方法制备无细胞提取物，然后在0μM、30μM、300μM或3000μM甜菊醇中孵化。反应12小时后利用LC-MS分析。

表18.使用甜菊醇作为底物、金属离子为Mn²⁺时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

底物(μM)	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						0	0	<0.5	5	34	<0.5
30	0	4	5	55	0.6
						300	0	8	3	60	0
3000	209	5	0	67	0

表19.金属离子对甜菊醇糖基化的影响。使用300μM甜菊醇作为底物时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

金属离子	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						Mn2+	0	8	2	60	0
Mg2+	0	2	13	39	0
						无	0	1	21	35	0

用甜菊双糖苷孵化

用上述方法制备无细胞提取物，然后在0μM、30μM、300μM或3000μM甜菊苷(RV0141-95,DAE Pyung Co.Ltd)中孵化。反应12小时后利用LC-MS分析。

表20.使用甜菊苷作为底物、金属离子为Mn²⁺时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

底物(μM)	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						0	0	<0,5	5	34	<0.5
30	0	0	5	77	0.7
						300	0	0	15	264	0
3000	0	0	16	1976	0

表21.金属离子对甜菊苷糖基化的影响。使用300μM甜菊苷作为底物时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

金属离子	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						Mn2+	0	0	15	264	0
Mg2+	0	0	65	179	0
						无	0	0	86	176	0

用莱鲍迪甙A孵化

用上述方法制备无细胞提取物，然后在0μM、30μM、300μM或3000μM莱鲍迪甙(RV0141-94,DAE Pyung Co.Ltd。NMR纯度＝83.4％)中孵化。反应12小时后利用LC-MS分析。

表22.使用莱鲍迪甙A作为底物、金属离子为Mn²⁺时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

底物(μM)	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						0	0	<0.5	5	34	<0.5
30	0	0	4	76	0
						300	0	0	11	213	1.9
3000	0	0	0	1855	0

表23.金属离子对莱鲍迪甙糖基化的影响。使用300μM莱鲍迪甙A作为底物时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

金属离子	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						Mn2+	0	0	11	213	1.9
Mg2+	0	1.6	93	163	1.4
						无	0	0	103	155	1.3

用莱鲍迪甙A孵化

用上述方法制备透性化细胞，然后在0μM、30μM、300μM或3000μM莱鲍迪甙(RV0141-94,DAE Pyung Co.Ltd。NMR纯度＝83.4％)中孵化。反应12小时后利用LC-MS分析。

表24.使用莱鲍迪甙A作为底物、金属离子为Mn²⁺时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

底物(μM)	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						0	0	0	5	34	0.6
30	0	0	10	31	0
						300	0	0.4	42	172	0
3000	0	0	0	1855	0

表25.金属离子对莱鲍迪甙糖基化的影响。使用300μM莱鲍迪甙A作为底物时，甜菊糖苷的产量(μg/ml)

金属离子	甜菊醇	甜菊苷	莱鲍迪甙B	莱鲍迪甙A	莱鲍迪甙D
						Mn2+	0	0.4	42	172	0
Mg2+	0	0.3	150	106	0.5
						无	0	0.7	141	125	0.8

实施例19.利用Saccharomyces cerevisiae生产二萜或糖基化的二萜

19.1构建用于生产二萜或糖基化的二萜的重组宿主

上文的实施例6中描述了用于制造二萜或糖基化的二萜的重组宿主(STV006)的构建。

19.2检测莱鲍迪甙A

在不同的发酵时间，取出一部分培养物。加热并用乙腈处理发酵液以提取细胞中的RebA。

利用LC/MS测量莱鲍迪甙A(C₄₄H₇₀O₂₃，单一同位素分子质量＝966.43079)的浓度(如下所述)。为达此目的，将UHPLC系统与三级四极质谱仪结合，以MS/MS模式利用质子化的分子丢失的己糖单元来检测莱鲍迪甙A。

19.3发酵二萜或糖基化的二萜

在摇瓶(500ml，含有50ml培养基)中培养用上述方法构建的酵母菌株STV006持续2天(30℃，280rpm)。上述培养基基于Verduyn等人所述(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992Jul；8(7):501-517)，其中对碳源和氮源进行了改良(如表26所述)。

表26.预培养培养基的组分

原料	分子式	浓度(g/kg)
			葡萄糖	C₆H₁₂O₆	20.0
尿素	(NH₂)₂CO	2.3
			磷酸二氢钾	KH₂PO₄	3.0
硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	0.5
			微量元素溶液		1
维生素溶液		1

^a微量元素溶液

组分	分子式	浓度(g/kg)
			EDTA	C₁₀H₁₄N₂Na₂O₈.2H₂O	15.00
七水硫酸锌	ZnSO₄.7H₂O	4.50
			二水氯化锰	MnCl₂.2H₂O	0.84
六水氯化钴(II)	CoCl₂.6H₂O	0.30
			五水硫酸铜(II)	CuSO₄.5H₂O	0.30
二水钼酸钠	Na₂MoO₄.2H₂O	0.40
			二水氯化钙	CaCl₂.2H₂O	4.50
七水硫酸亚铁	FeSO₄.7H₂O	3.00
			硼酸	H₃BO₃	1.00
碘化钾	KI	0.10

^b维生素溶液

组分	分子式	浓度(g/kg)
			(D-)生物素	C₁₀H₁₆N₂O₃S	0.05
(D+)泛酸钙	C₁₈H₃₂CaN₂O₁₀	1.00
			烟酸	C₆H₅NO₂	1.00
肌醇	C₆H₁₂O₆	25.00
			盐酸氯化硫胺素	C₁₂H₁₈Cl₂N₄OS.xH₂O	1.00
盐酸吡哆醇	C₈H₁₂ClNO₃	1.00
			对氨基苯甲酸	C₇H₇NO₂	0.20

随后，转移6ml摇瓶中的内容物至发酵罐(起始体积为0.3L)，其中所述发酵罐包含如表27所示的培养基。

表27.发酵培养基的组分

原料		终浓度
			硫酸铵	(NH₄)₂SO₄	1
磷酸二氢钾	KH₂PO₄	10
			硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	5
微量元素溶液	-	8
			维生素溶液	-	8

通过加入氨水(12.5重量％)控制pH在5.0。控制温度在27℃、30℃或33℃。通过调节搅拌速度控制溶氧(pO₂)在40％。通过控制向发酵罐补料维持葡萄糖浓度受限。

表28.发酵补料培养基的组分

原材料	分子式	终浓度(g/kg)
			葡萄糖.1aq	C₆H₁₂O₆.1aq	330
磷酸二氢钾	KH₂PO₄	10
			七水硫酸镁	MgSO₄.7H₂O	5
Verduyn微量元素溶液		8
			Verduyn维生素溶液		8

表29.在27℃、30℃和33℃下，补料分批发酵期间的发酵液中RebA的产量(mg/L)

表4所示的结果表明：与在正常温度(30℃)下发酵相比，在27℃下发酵重组Saccharomyces cerevisiae导致RebA的产量更高。

表1：序列表说明

灰色的id是截短的，因此它们是所提及的UniProt id的一个片段。

Claims

1.包括一种或多种核苷酸序列的重组微生物，其中所述核苷酸序列编码：

具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽；

具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽；和

具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽，

通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能够生产甜菊醇。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物包括一种或多种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶活性的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物能生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产甜菊单糖苷。

4.根据权利要求2或3所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊醇或甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产甜菊双糖苷。

5.根据权利要求2-4中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产甜菊苷。

6.根据权利要求2-5中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产莱鲍迪甙A。

7.根据权利要求2-6中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱鲍迪甙A的葡糖基化的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产莱鲍迪甙D。

8.根据权利要求2-7中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的葡糖基化的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产莱鲍迪甙E。

9.根据权利要求2-8中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物包括核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化莱鲍迪甙E的葡糖基化的多肽，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物至少能生产莱鲍迪甙D。

10.根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽。

11.根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达下述序列中的一种或多种：

a.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，

其中所述核苷酸序列包括：

i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

i.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

12.根据权利要求2-11中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化在甜菊醇的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：35、37、71、147、168、169、189的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

13.根据权利要求2-12中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化在甜菊单糖苷的C-13位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

14.根据权利要求2-13中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化在甜菊双糖苷的C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

15.根据权利要求2-14中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括与序列ID号：50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

ii.与序列ID号：49、51或75、149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约15％的核苷酸序列；

16.根据权利要求2-15中的任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物表达核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码能够催化下述反应中的一种或多种的多肽，其中所述反应为：将甜菊苷或莱鲍迪甙A葡糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍迪甙D，其中所述核苷酸序列包括：

i.编码能够催化下述反应中的一种或多种的多肽的核苷酸序列，其中所述反应为：将甜菊苷或莱鲍迪甙A葡糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍迪甙D，其中所述多肽包括与序列ID号：88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20％的氨基酸序列；

17.根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物属于下述属之一，其中所述属是：Saccharomyces、Aspergillus、Pichia、Kluyveromyces、Candida、Hansenula、Humicola、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen、Yarrowia、Yamadazyma或Escherichia。

18.根据权利要求17所述的重组微生物，其中所述微生物是Saccharomyces cerevisiae细胞、Yarrowia lipolitica细胞或Escherichia coli细胞。

19.根据在前的权利要求中的任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的能力被上调。

20.根据权利要求19所述的重组微生物，其中所述微生物包括编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列中的一种或多种，通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物生产GGPP的水平提高。

21.根据权利要求19或20所述的重组微生物，其中所述微生物能够表达下述核苷酸序列中的一种或多种：

iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列，或者

22.制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在合适的发酵培养基中发酵根据在前的权利要求中的任一项所述的微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜。

23.制备二萜或糖基化的二萜的方法，其中所述方法包括在约29℃或更低的温度下，在合适的发酵培养基中发酵能够产生二萜或糖基化的二萜的重组微生物；以及任选地，回收二萜或糖基化的二萜。

24.根据权利要求23所述的制备二萜或糖基化的二萜方法，其中在约28℃或更低的温度下实施所述发酵。

25.根据权利要求22-24中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜方法，其中在约27℃或更低的温度下实施所述发酵。

26.根据权利要求22-25中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜方法，其中在约26℃或更低的温度下实施所述发酵。

27.根据权利要求23-26中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜方法，其中所述重组微生物是根据权利要求1-21中的任一项所述的重组微生物。

28.根据权利要求22-17中的任一项所述的制备二萜或糖基化的二萜方法，其中以工业规模实施所述方法。

29.一种发酵液，其中所述发酵液包括通过根据权利要求22-28中的任一项所述的方法能够得到的二萜或糖基化的二萜。

30.二萜或糖基化的二萜，其中所述二萜或糖基化的二萜通过根据权利要求22-28中的任一项所述的方法得到，或者能够从根据权利要求29所述的发酵液中获得。

31.根据权利要求30所述的二萜或糖基化的二萜，其是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。

32.包含根据权利要求30或31所述的二萜或糖基化的二萜的食品、饲料或饮料。

33.将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜的方法，所述方法包括：将所述初次糖基化的二萜与根据权利要求1-21中的任一项所述的微生物、来源于这种微生物的无细胞提取物或者来源于上述微生物或无细胞提取物之一的酶制剂接触，从而将初次糖基化的二萜转换为二次糖基化的二萜。

34.根据权利要求33所述的方法，其中二次糖基化的二萜是莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。

35.根据权利要求34所述的方法，其中初次糖基化的二萜是莱鲍迪甙A，二次糖基化的二萜是莱鲍迪甙D。