CN113549664A - 高纯度甜菊醇糖苷 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷，特别是莱鲍迪苷A、D和M的方法。所述方法包括利用重组微生物将各种起始组合物转化成靶甜菊醇糖苷。此外，公开了新的甜菊醇糖苷reb D2、reb M2和reb I，及其制备方法。高度纯化的莱鲍迪苷可以用作可食和可咀嚼组合物中的无热量甜味剂，所述组合物如任何饮料、糖食、烘焙产品、饼干和口香糖。
Description
本申请是申请号为201580061214.2(PCT/US2015/046354)、申请日为2015年8月21日、发明名称为“高纯度甜菊醇糖苷”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物的生物催化方法，所述组合物包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。本发明还涉及新的甜菊醇糖苷、及其分离方法和新甜菊醇糖苷的用途。
背景技术
高强度甜味剂具有高于蔗糖甜度水平许多倍的甜度水平。它们基本上是无热量的并且通常用于低热和减热产品中，包括食品和饮料。高强度甜味剂不会引起升糖反应，这使其适用于针对糖尿病和其他对控制碳水化合物摄入感兴趣的人群的产品中。
甜菊醇糖苷是一类在甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的叶中发现的化合物，甜菊是南美某些地区土生土长的菊科(Asteraceae)(菊科(Compositae))多年生灌木。它们在结构上通过单碱基甜菊醇来表征，因位置C13和C19的碳水化合物残基的存在而不同。它们在甜菊叶中累积，构成总干重的大约10％-20％。基于干重，在甜菊叶中发现的四种主要的糖苷通常包括蛇菊苷(9.1％)、莱鲍迪苷A(3.8％)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0％)和杜克苷A(0.3％)。其他已知甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷B、C、D、E、F和M、甜菊醇双苷(steviolbioside)和悬钩子苷(rubusoside)。
尽管用于从甜菊制备甜菊醇糖苷的方法是已知的，但这些方法中的许多不适用于商业使用。
因此，对简单、有效且经济的用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物的方法仍然存在需求，所述组合物包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。
另外，对于新的甜菊醇糖苷及其制备和分离方法仍然存在需求。
发明内容
本发明提供了用于制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化方法，通过将包含有机底物的起始组合物与微生物和/或生物催化剂接触，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
起始组合物包含有机化合物。在一个实施方案中，起始组合物选自多元醇和各种碳水化合物。
靶甜菊醇糖苷可以是任何甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊醇单苷(steviolmonoside)、甜菊醇双苷、悬钩子苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、蛇菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷。
在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。
在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。
在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷M。
微生物可以是包含至少一种适用于将起始组合物转化成靶甜菊醇糖苷的生物催化剂的任何微生物。
生物催化剂可以位于微生物表面上和/或微生物内部。
生物催化剂包括甜菊醇生物合成酶和UDP-葡糖基转移酶(UGT)，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)途径酶。
在另一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非-甲羟戊酸-2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶。
在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶选自香叶基香叶基二磷酸合成酶、柯巴基(copalyl)二磷酸合成酶、贝壳杉烯合成酶、贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷(cytidyl)-2-C-甲基-D-赤藓醇合成酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合成酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(HDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰基-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、细胞色素P450还原酶等。
UDP-葡糖基转移酶可以是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物来提供靶甜菊醇糖苷的UDP-葡糖基转移酶。
微生物可以是任一种合适的微生物。在一个实施方案中，微生物可以是例如大肠杆菌(E.coli)、酵母属(Saccharomyces sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、耶氏酵母属(Yarrowia sp.)。在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是合成的。
在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶选自UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1、UGT91D2或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至悬钩子苷形成蛇菊苷的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGT91D2或与UGT91D2具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT91D2变体。
在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至蛇菊苷形成莱鲍迪苷A的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷A形成莱鲍迪苷D的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGT91D2或与UGT91D2具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT91D2变体。
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷D形成莱鲍迪苷M的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷I形成莱鲍迪苷M的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGTSL或与UGTSL具有高于75％氨基酸序列同一性的UGTSL变体。
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是任一种能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷E形成莱鲍迪苷M的UDP-葡糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡葡糖基转移酶是UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
任选地，本发明的方法进一步包括再循环UDP来提供UDP-葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括通过提供再循环催化剂和再循环底物来再循环UDP，使得使用催化量的UDP-葡糖基转移酶和UDP-葡萄糖来进行甜菊醇糖苷底物变成靶甜菊醇糖苷的生物转化(图3)。
在一个实施方案中，再循环催化剂是蔗糖合成酶。
在一个实施方案中，再循环底物是蔗糖。
任选地，本发明的方法进一步包括纯化包含靶甜菊醇糖苷的组合物。可以通过任何合适的方法，如，例如，结晶、通过膜分离、离心、提取、色谱分离或这些方法的组合，来纯化包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
在一个实施方案中，纯化产生包含基于无水基础高于约80％重量的靶甜菊醇糖苷的组合物。在另一个实施方案中，纯化产生包含高于约90％重量的靶甜菊醇糖苷的组合物。在特定实施方案中，组合物包含高于约95％重量的靶甜菊醇糖苷。
靶甜菊醇糖苷可以是任何多晶形或无定形形式，包括水解物、溶剂化物、无水物或其组合。
本发明还提供了包含通过所公开的方法制备的组合物的消费产品。合适的消费品包括，但不限于，食品、饮料、药物组合物、烟草制品、营养保健品组合物、口服卫生组合物和化妆品组合物。
本发明还提供新的甜菊醇糖苷reb D2和reb M2，其分别是reb D和reb M的异构体。在一个实施方案中，提供了分离并纯化的reb D2。在另一个实施方案中，提供了分离并纯化的reb M2。reb D2和reb M2也存在于本文中公开的任一种消费品中。在特定实施方案中，提供了包含reb D2和/或reb M2的饮料。
本文中还提供了制备reb D2和reb M2的方法。两者都是在reb A至reb D的生物转化过程中形成的。认为reb M2从原位reb D2的生物转化形成。
本文中还提供了通过具有β-1,6-葡糖苷酶活性的酶，选择性水解reb D2和/或rebM2中的1,6-β-糖苷键的方法。
在一个实施方案中，为了选择性水解reb D2和/或reb M2中的1,6-β-糖苷键，至少一种酶选自糖苷酶(NC-IUBMB EC 3.2.1.)、葡糖苷酶、葡聚糖酶、Isolase(011410；National Enzyme Company，USA)、Aromase(GLY0151441；Amano Enzyme，日本)、柚皮苷酶(NAH0550102；Amano Enzyme，日本)、纤维素酶(例如，来自里氏木霉(Trichoderma reesei)ATCC 26921的纤维素酶；Sigma C2730)、纤维二糖酶(例如，来自米曲霉(Aspergillusniger)的纤维二糖酶，Sigma C6105)、Viscozyme L(Sigma V2010)等。
在一个实施方案中，本发明是用于制备包含reb D2的组合物的方法，其包括：(a)将包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化成reb D2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物，和(b)分离包含reb D2的组合物。
在另一个实施方案中，本本发明是用于制备包含reb M的组合物的方法，其包括：(a)将包含reb D的起始组合物与能够将reb D转化成reb M的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb M的组合物，和(b)分离包含reb M的组合物。
在再一个实施方案中，本发明是用于制备包含reb M的组合物的方法，其包括：(a)将包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化成reb D的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb D的组合物，和(b)任选地，分离包含reb D的组合物，(c)将包含reb D的组合物与能够将reb D转化成reb M的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb M的组合物，和(d)分离包含reb M的组合物。
组合物可以进一步被纯化，以提供基于干基具有高于约95％总量的纯度的reb D或reb M。
附图说明
包括附图来提供本发明的进一步理解。附图说明了本发明的实施方案并且与描述一起用于解释本发明实施方案的原理。
图1显示了reb M的结构。
图2显示了从蛇菊苷生物催化生产reb M。
图3显示了使用酶UGT76G1以及伴随经由蔗糖合成酶的UDP至UDP葡萄糖的再循环，从蛇菊苷生物催化生产reb A。
图4显示了reb M的IR谱。
图5显示了如实施例14中详述的，从reb D生物催化生产reb M的产物的HPLC色谱。具有24.165分钟停留时间的峰对应于未处理的reb D。具有31.325分钟停留时间的峰对应于reb M。
图6显示了通过生物催化从reb D产生的纯化reb M的HPLC色谱。
图7显示了reb M标准品的HPLC色谱。
图8显示了reb M标准品以及从reb D的生物转化纯化的reb M的共同注入的HPLC色谱。
图9显示了reb M标准品以及从reb D生物合成后纯化的reb M的1H NMR谱的重叠。
图10显示了从reb D生物催化产生后纯化的reb M的HRMS谱。
图11显示了半合成甜菊醇糖苷混合物的LC-MS分析，批号CB-2977-106，显示出TIC(A)、1.8分钟处的峰的MS(B)、4.1分钟处的reb M2峰的MS(C)、6.0分钟处的reb D峰的MS(D)、7.7分钟处的reb D2峰的MS(E)、9.4分钟处的峰的MS(F)、15.2分钟处的莱鲍迪苷A峰的MS(G)、16.5分钟处的峰的MS(H)和18.3分钟处的峰的MS(I)。
图12显示了半合成甜菊醇糖苷混合物的痕迹，批号CB-2977-106。色谱网格线不均匀，因为检测器在注入后14分钟重新校准。
图13显示了半合成甜菊醇糖苷混合物的HPLC分析，批号CB-2977-106(A)、分离的reb M2(B)、分离的reb D(C)和分离的reb D2(D)。
图14显示了reb D2的1H NMR谱(500MHz，吡啶-d5)。
图15显示了reb D2的13C NMR谱(125MHz，吡啶-d5)。
图16显示了reb D2的13C NMR谱(125MHz，吡啶-d5)的展开。
图17显示了reb D2的1H-1H COSY谱(500MHz，吡啶-d5)。
图18显示了reb D2的HSQC-DEPT谱(500MHz，吡啶-d5)。
图19显示了reb D2的HMBC谱。
图20显示了reb D2的HMBC谱(500MHz，吡啶-d5)的展开。
图21显示了reb M2的1H NMR谱(500MHz，D2O)。
图22显示了reb M2的13C NMR谱(500MHz，D2O/TSP)。
图23显示了reb M2的13C NMR谱(125MHz，D2O/TSP)的展开。
图24显示了reb M2的1H-1H COSY谱(500MHz，D2O)。
图25显示了reb M2的HSQC-DEPT谱(500MHz，D2O)。
图26显示了reb M2的HMBC谱(500MHz，D2O)。
图27显示了reb M2的HMBC谱(500MHz，D2O)的展开。
图28显示了针对实施例47中进行的分析的HPLC色谱。
图29显示了针对实施例47中进行的分析的HPLC色谱。
图30显示了实施例47中进行的LC-CAD分析。
图31显示了如实施例47中所述的ESI-TOF质谱。
图32显示了如实施例47中所述的质谱。
图33显示了如实施例47中所述的MS/MS谱。
图34显示了如实施例47中所述的MS/MS谱。
图35显示了如实施例47中所述的1H NMR的结果。
图36显示了如实施例47中所述的1H NMR的结果。
图37显示了如实施例47中所述的1H NMR的结果。
图38显示了如实施例47中所述的13C NMR的结果。
图39显示了如实施例47中所述的13C NMR的结果。
图40显示了如实施例47中所述的1H-1H COSY的结果。
图41显示了如实施例47中所述的HSQC-DEPT的结果。
图42显示了如实施例47中所述的HMBC的结果。
图43显示了如实施例47中所述的HMBC的结果。
图44显示了如实施例47中所述的NOESY的结果。
图45显示了如实施例47中所述的NOESY的结果。
图46显示了如实施例47中所述的1D TOCSY的结果。
图47显示了如实施例47中所述的1D TOCSY的结果。
图48显示了如实施例47中所述的1D TOCSY的结果。
图49显示了如实施例47中所述的1D TOCSY的结果。
图50显示了如实施例47中所述的1D TOCSY的结果。
图51显示了HPLC(CAD)图，该图显示了蛇菊苷转化成莱鲍迪苷A。
图52显示了HPLC(CAD)图，该图显示了莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M。
图53a-e显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例20的HPLC测试结果。
图54显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例21的HPLC测试结果。
图55a-e显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例22的HPLC测试结果。
图56a-b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例23的HPLC测试结果。
图57a-b显示了LC-MS色谱，该色谱显示了实施例24的LC-MS测试结果。
图58显示了图，该图显示了实施例25的反应特征。
图59a-b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例28的HPLC测试结果。
图60a-b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例29的HPLC测试结果。
图61显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例30的HPLC测试结果。
图62显示了LS-MS色谱，该色谱显示了实施例31的LS-MS测试结果。
图63a-c显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例32的HPLC测试结果。
图64显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例35的HPLC测试结果。
图65显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例37的HPLC测试结果。
图66显示了图，该图显示了实施例43的HPLC结果。
图67显示了图，该图显示了实施例46的反应特征。
图68a-f显示了实施例49的反应特征。
图69a-c显示了图，该图显示了实施例50的HPLC结果。
图70a-d显示了实施例51的反应特征图。
图71显示了实施例52的反应特征图。
图72a显示了实施例54的反应特征图。
图72b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例54的HPLC分析。
图73a显示了实施例55的反应特征图。
图73b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例55的HPLC分析。
图74a显示了实施例56的反应特征图。
图74b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例56的HPLC分析。
图75a显示了实施例57的反应特征图。
图75b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例57的HPLC分析。
图76a显示了实施例58的反应特征图。
图76b显示了HPLC色谱，该色谱显示了实施例58的HPLC分析。
发明详述
本发明提供了用于制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化方法，通过将包含有机底物的起始组合物与微生物接触，由此产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。
本发明的一个目的是提供用于从起始组合物制备甜菊醇糖苷的有效生物催化方法，所述甜菊醇糖苷特别是蛇菊苷、reb E、reb A、reb D、reb D2、reb M和reb M2。
如本文中使用的，“生物催化”或“生物催化的”是指使用天然或遗传工程化的生物催化剂，如细胞、蛋白酶，对有机化合物进行单个或多个步骤的化学转化。生物催化包括发酵、生物合成和生物转化方法。分离的酶和完整细胞生物催化方法都是本领域已知的。生物催化剂蛋白酶可以是天然产生的蛋白或是重组蛋白。
本文中所列的所有序列，包括任何核酸或氨基酸序列，包括与本文中所述的核酸或氨基酸序列具有>75％、>80％、>90％、>95％、>96％、>97％、>98％或>99％序列同一性的变体。
如本文中使用的，术语“甜菊醇糖苷”是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于天然产生的甜菊醇糖苷，例如，甜菊醇单苷、甜菊醇双苷、悬钩子苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、蛇菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O，合成甜菊醇糖苷，例如，酶糖基化的甜菊醇糖苷，及其组合。
甜菊醇及其糖苷的化学结构
(Glc＝葡萄糖)
起始组合物
如本文中使用的，“起始组合物”是指含有一种或多种包含至少一个碳原子的有机化合物的任何组合物(通常是水溶液)。
在一个实施方案中，起始组合物选自多元醇和各种碳水化合物。
术语“多元醇”是指含有超过一个羟基基团的分子。多元醇可以是分别含有2、3和4个羟基基团的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇还可以含有超过四个羟基基团，如戊元醇、己元醇、庚元醇等，其分别含有5、6或7个羟基基团。另外，多元醇还可以是糖醇、多元醇(polyhydric alcohol)或多元醇(polyalcohol)，其是碳水化合物的还原形式，其中羰基基团(醛或酮，还原糖)已经还原成伯或叔羟基基团。多元醇的实例包括，但不限于，赤藓醇、麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、木糖醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、丙三醇、苏糖醇、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖、还原的异麦芽低聚糖、还原的木糖低聚糖、还原的龙胆-低聚糖、还原的麦芽糖糖浆、还原的葡萄糖糖浆、氢化淀粉水解物、多羟糖醇(polyglycitol)和糖醇或任何其他能够被还原的碳水化合物。
术语“碳水化合物”是指通式(CH2O)n(其中n为3-30)的被多个羟基基团取代的醛或酮化合物，及其寡聚物和聚合物。本发明的碳水化合物另外可以在一个或多个位置被取代或脱氧。如本文中使用的，碳水化合物包括未修饰的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物和修饰的碳水化合物。如本文中使用的，短语“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物表示其中已经添加、去除或取代至少一个原子或其组合的任何碳水化合物。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的单糖、双糖、低聚糖和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选可以在任何相应的C-位置脱氧，和/或被一个或多个部分取代，所述部分如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰基氧、氨基、酰胺、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巯基、亚氨基、磺酰基、硫基、亚磺酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺、膦酰基、次膦酰基、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨基甲酰、磷酸基、膦酸基(phosphonato)，或任何其他可行的官能团，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物起到改善甜味剂组合物的甜味的作用。
根据本发明可以使用的碳水化合物的实例包括，但不限于，塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各种环糊精、环状低聚糖、各种类型的麦芽糖糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、苏糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麦芽糖、转化糖、异海藻糖、新海藻糖、异麦芽酮糖、赤藓糖、脱氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纤维二糖、支链淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸-内酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜低聚糖、异麦芽低聚糖(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖封端的低聚糖、龙胆低聚糖(龙胆二糖、龙胆三糖、龙胆四糖等)、山梨糖、黑曲霉低聚糖、帕拉金糖低聚糖、果糖低聚糖(蔗果三糖、真菌四糖等)、麦芽四糖醇、麦芽三糖醇、麦芽低聚糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖、麦芽庚糖等)、淀粉、菊粉、菊粉-低聚糖、乳果糖、蜜二糖、蜜三糖、核糖、异构化液体糖(如高果糖玉米糖浆)、偶联糖和大豆低聚糖。另外，本文中使用的碳水化合物可以是D-或L-构型。
起始组合物可以是合成的或纯化的(部分或完全)、商业上可获得的或制得的。
在一个实施方案中，起始组合物是甘油。
在另一个实施方案中，起始组合物是葡萄糖。
在再另一个实施方案中，起始组合物是蔗糖。
在再另一个实施方案中，起始组合物是淀粉。
在另一个实施方案中，起始组合物是麦芽糖糊精。
在另一个实施方案中，起始组合物是甜菊醇糖苷。
如本文中所述的，起始组合物的有机化合物用作用于生产靶甜菊醇糖苷的底物。
靶甜菊醇糖苷
本发明方法的靶甜菊醇糖苷可以是通过本文中公开的方法制备的任一种甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷选自甜菊醇单苷、甜菊醇双苷、悬钩子苷、杜克苷B、杜克苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、蛇菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷M、莱鲍迪苷M2、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷D2、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或其他甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷。在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb A。在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb E。在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb D。在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb D2。在进一步的实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb M。在再另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb M2。
靶甜菊醇糖苷可以是任一种聚合或无定形形式，包括水解物、溶剂化物、无水或其组合。
在一个实施方案中，本发明是用于生产reb D的生物催化方法。
在再另一个实施方案中，本发明是用于生产reb D2的生物催化方法。
在再另一个实施方案中，本发明是用于生产reb M的生物催化方法。
在更多实施方案中，本发明是用于生产reb M2的生物催化方法。
在一个实施方案中，本发明是用于生产reb I的生物催化方法。
在再另一个实施方案中，本发明是用于生产reb E的生物催化方法。
任选地，本发明的方法进一步包括从起始组合物中分离靶甜菊醇糖苷。可以通过任何合适的方法，如，例如，结晶、通过膜分离、离心、提取、色谱分离或这些方法的组合，来分离靶甜菊醇糖苷。
在特定实施方案中，本文中所述的方法获得高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。如本文中使用的，术语“高度纯化的”是指基于无水基础具有高于约80％重量的靶甜菊醇糖苷的组合物。在一个实施方案中，高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物基于无水基础含有高于约90％重量的靶甜菊醇糖苷，如，例如，基于干基，高于约91％、高于约92％、高于约93％、高于约94％、高于约95％、高于约96％、高于约97％、高于约98％或高于约99％靶甜菊醇糖苷含量。
在一个实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb M时，本文中所述的方法提供了基于干基具有高于约90％重量的reb M含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb M时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb M含量的组合物。
在另一个实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb M2时，本文中所述的方法提供了基于干基具有高于约90％重量的reb M2含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb M2时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb M2含量的组合物。
在再另一个实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的reb D含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb D含量的组合物。
在再另一个实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D2时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的reb D2含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D2时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb D2含量的组合物。
在进一步的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的reb A含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb A含量的组合物。
在再进一步的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb E时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的reb E含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb E时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb E含量的组合物。
在一个实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb I时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的reb I含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb I时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的reb I含量的组合物。
在再进一步的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷时，本文中所述的方法提供了基于干基高于约90％重量的蛇菊苷含量的组合物。在另一个特定的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是蛇菊苷时，本文中所述的方法提供了基于干基包含高于约95％重量的蛇菊苷含量的组合物。
微生物
在本发明的一个实施方案中，将微生物与起始组合物接触，以产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物。微生物可以是具有适用于将起始组合物转化成靶甜菊醇糖苷的生物催化剂的任何微生物。这些生物催化剂在微生物的基因组内被编码。
在一个实施方案中，微生物可以是，例如，大肠杆菌(E.coli)、酵母属(Saccharomyces sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、耶氏酵母属(Yarrowia sp.)等。
生物催化剂可以位于微生物细胞的表面上和/或微生物细胞的内部。
可以从微生物分离出生物催化剂并用于将起始组合物转化成靶甜菊醇糖苷。可以通过本领域已知的任何方式，包括但不限于微生物细胞的裂解、离心、过滤，来实现所述分离。
可以从微生物提取生物催化剂(胞外酶)并用于将起始组合物转化成靶甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，生物催化剂是甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGT)，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
甜菊醇生物合成可以是任何甜菊醇生物合成酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括甲羟戊酸(MVA)途径酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在另一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶包括非-甲羟戊酸2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸途径(MEP/DOXP)酶，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在一个实施方案中，甜菊醇生物合成酶选自香叶基香叶基二磷酸合成酶、柯巴基二磷酸合成酶、贝壳杉烯合成酶、贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-羟化酶(KAH)、甜菊醇合成酶、脱氧木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合成酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合成酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(HDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶(HDR)、乙酰乙酰基-CoA硫解酶、截短的HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、细胞色素P450还原酶等，或其具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
UDP-葡糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单体添加至甜菊醇和或甜菊醇糖苷底物来提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡糖基转移酶。
在一个实施方案中，微生物是游离的。在另一个实施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于从无机或有机材料制得的固体支持物上。适用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括衍化的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。例如，微生物可以通过共价连接、吸附、交联、包埋或包胶，固定于固体支持物。
在一个实施方案中，微生物在水性介质中，所述水性介质包含水和选自碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等的各种成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可以包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白质。
在特定实施方案中，所述介质包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在特定实施方案中，所述介质包含磷酸缓冲液。
在一个实施方案中，所述介质还可以包括有机溶剂。
在一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至悬钩子苷，由此产生蛇菊苷的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT91D2或与UGT91D2具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT91D2变体。
在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至悬钩子苷，由此产生莱鲍迪苷E的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGTSL2或与UGTSL2具有高于75％氨基酸序列同一性的UGTSL2变体。
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷E，由此产生莱鲍迪苷D的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
在再一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至蛇菊苷，由此产生莱鲍迪苷A的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷A，由此产生莱鲍迪苷D和/或莱鲍迪苷D2和/或莱鲍迪苷M2的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT91D2或UGTSL2或其与UGT91D2或UGTSL2具有高于75％氨基酸序列同一性的变体。
在再一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷I，由此产生莱鲍迪苷M的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGTSL或与UGTSL具有高于75％氨基酸序列同一性的UGTSL变体。
在再一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷E，由此产生莱鲍迪苷M的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
在另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶能够添加至少一个葡萄糖单体，以产生靶甜菊醇糖苷，与选自以下GenInfo识别号列表的至少一种酶具有高于75％氨基酸序列同一性，优选选自表1中呈现的组，并且更优选选自表2中呈现的组。
表1
表2
| GI编号 | 登录号 | 来源 |
| 460409128 | XP.004249992.1 | 番茄 |
| 460386018 | XP.004238697.1 | 番茄 |
| 460409134 | XP.004249995.1 | 番茄 |
| 460410132 | XP.004250485.1 | 番茄 |
| 460410130 | XP.004250484.1 | 番茄 |
| 460410128 | XP.004250483.1 | 番茄 |
| 460378310 | XP.004234916.1 | 番茄 |
| 209954733 | BAG80557.1 | 枸杞 |
| 209954725 | BAG80553.1 | 枸杞 |
在再另一个实施方案中，UDP-葡糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单体添加至莱鲍迪苷D，由此产生莱鲍迪苷M和/或莱鲍迪苷M2的任何UDP-葡糖基转移酶。UDP-葡糖基转移酶可以是例如UGT76G1或与UGT76G1具有高于75％氨基酸序列同一性的UGT76G1变体。
任选地，本发明的方法进一步包括再循环UDP，以提供UDP-葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括通过提供再循环催化剂来再循环UDP，即，能够UDP-葡萄糖生产过剩的生物催化剂，并再循环底物，使得使用催化量的UDP-葡糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行底物甜菊醇糖苷转化成靶甜菊醇糖苷(图3)。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖再循环催化剂是蔗糖合成酶。
在一个实施方案中，再循环底物是蔗糖。
任选地，本发明的方法进一步包括水解reb D2和/或reb M2中的1,6-β-糖苷键。在一个实施方案中，所述方法包括通过提供β-葡糖苷酶水解reb D2和/或reb M2中的1,6-β-糖苷键。
在一个实施方案中，与UDP-再循环生物催化剂和UGT一起提供β-葡糖苷酶，以最小化最终反应混合物中的reb D2和/或reb M2的含量并最大化reb M的产量。
在特定实施方案中，为了最小化最终反应混合物中的reb D2和/或reb M2含量和最大化reb M的产量，与UDP-再循环催化剂UGT76G1和UGTSL2或其与UGT76G1或UGTSL2具有高于75％氨基酸序列同一性的变体一起提供β-葡糖苷酶。
任选地从所得到的组合物中纯化靶甜菊醇糖苷。可以通过任何合适的方法来实现从反应介质中纯化靶甜菊醇糖苷，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。合适的方法包括结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备性或分析)，或这些方法的组合。
化合物和方法
本发明还提供了分离和高度纯化的reb D2。Reb D2是reb D的异构体并具有以下结构：
13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]等效-16-贝壳杉烯-19-酸(ent-kaur-16-en-19-oic acid)-[(6-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯]
在另一个实施方案中，本发明提供了基于无水基础具有高于约95％重量纯度的reb D2，如，例如，高于约96％重量、高于约97％重量、高于约98％重量或高于约99％重量。
在再另一个实施方案中，本发明在甜菊醇糖苷混合物中提供了具有高于约95％重量纯度的reb D2，如，例如，高于约96％重量、高于约97％重量、高于约98％重量或高于约99％重量。
本发明还提供了包含reb D2的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了用于制备reb D2的方法，包括：
a.将包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化成reb D2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物；和
b.分离包含reb D2的组合物。
在一些实施方案中，能够将reb A转化成reb D2的酶是UDP-葡糖基转移酶，如，例如，UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GI No.460410132版本XP_004250485.1)、GINo.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GI No.115454819版本NP_001051010.1、GINo.187373030版本ACD03249.1、GI No.222619587版本EEE55719.1、GI No.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
能够将reb A转化成reb D2的酶可以是固定的或以重组微生物的形式来提供。
在一个实施方案中，酶是固定的。在另一个实施方案中，以重组微生物的形式来提供酶。
在一个实施方案中，微生物是游离的。在另一个实施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于由无机或有机材料制成的固体支持物上。适用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括衍化的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。微生物可以例如，通过共价连接、吸附、交联、包埋或包胶，固定于固体支持物上。
合适的微生物包括，但不限于，大肠杆菌、酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属。
在一个实施方案中，微生物在水性介质中，所述水性介质包含水和选自碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等的各种成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可以包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白质。
在特定实施方案中，所述介质包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在特定实施方案中，所述介质包含磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，所述介质还可以包括有机溶剂。
在特定实施方案中，酶是能够将reb A转化成reb D2的UDP-葡糖基转移酶并且包含在大肠杆菌中。
在更特别的实施方案中，酶选自UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)、GI No.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GINo.115454819版本NP_001051010.1、GI No.187373030版本ACD03249.1、GI No.222619587版本EEE55719.1、GI No.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11，并且包含在大肠杆菌中。
在再更特别的实施方案中，酶是UGTSL2并且包含在大肠杆菌中。
可以通过任何合适的方法来实现从反应介质中分离reb D2，以提供包含reb D2的组合物。合适的方法包括，但不限于，裂解、结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备性或分析)，或这些方法的组合。在特定的实施方案中，可以通过裂解和离心来实现分离。
在一些实施方案中，分离可以获得基于无水基础低于约95％重量的reb D2纯度，并且组合物可以含有例如甜菊醇糖苷和/或残余的反应产物。可以将包含reb D2的组合物进一步纯化，来提供高度纯化的reb D2，即，基于无水基础具有高于约95％重量纯度的rebD2。在一些实施方案中，可以将包含reb D2的组合物进一步纯化，以提供基于无水基础具有高于约96％、高于约97％、高于约98％或高于约99％重量纯度的reb D2。
可以通过本领域技术人员已知的任何方式来实现纯化，所述方式包括但不限于，结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备性或分析)，或这些方法的组合。在特定实施方案中，使用HPLC来纯化reb D2。在更特别的实施方案中，使用半制备性HPLC来纯化reb D2。
例如，可以使用两步半制备性HPLC纯化。第一步利用C18柱，使用含有A(水中25％MeCN)和B(水中30％MeCN)的移动相，所述移动相具有以下梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
第二步利用相同的柱和条件，但只使用等度移动相：水中20％MeCN。
本领域技术人员将认识到特定的柱、移动相、注射体积和其他HPLC参数可以改变。
在一个实施方案中，本发明提供了分离和高度纯化的reb M2。reb M2是reb M的异构体并具有以下结构：
(13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]等效-16-贝壳杉烯-19-酸[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-6-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯])
在另一个实施方案中，本发明提供了基于无水基础具有高于约95％重量纯度的reb M2，如，例如，高于约96％重量、高于约97％重量、高于约98％重量或高于约99％重量。
在再另一个实施方案中，本发明在甜菊醇糖苷混合物中提供了具有高于约95％重量纯度的reb M2，如，例如，高于约96％重量、高于约97％重量、高于约98％重量或高于约99％重量。
在再另一个实施方案中，本发明在甜菊提取物中提供了具有高于约95％重量纯度的reb M2，如，例如，高于约96％重量、高于约97％重量、高于约98％重量或高于约99％重量。
本发明还提供了包含reb M2的组合物。
已经发现了在reb A生物转化成reb D的过程中产生reb M2。如上所述，reb A生物转化成reb D还产生了reb D2。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于制备reb M2的方法，包括：
a.将包含reb A和/或reb D2的起始组合物与能够将reb A和/或reb D2转化成rebM2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；和
b.分离包含reb M2的组合物。
不希望受理论的束缚，当前认为途径从reb A转化成reb D2开始，接着是reb D2转化成reb M2。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于制备reb M2的方法，包括：
a.将包含reb D2的起始组合物与能够将reb D2转化成reb M2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；和
b.分离包含reb M2的组合物。
在再另一个实施方案中，用于制备reb M2的方法包括：
a.将包含reb A的起始组合物与能够将reb A转化成reb D2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb D2的组合物；
b.任选地，分离包含reb D2的组合物；
c.将包含reb D2的起始组合物与能够将reb D2转化成reb M2的酶、UDP-葡萄糖和任选的UDP-葡萄糖再循环酶接触，以产生包含reb M2的组合物；和
d.分离包含reb M2的组合物。
酶可以是UDP-葡糖基转移酶，如，例如，UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)、GI No.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GINo.115454819版本NP_001051010.1、GI No.187373030版本ACD03249.1、GI No.222619587版本EEE55719.1、GI No.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11。
酶可以是固定的或在重组微生物中。
在一个实施方案中，酶是固定的。在另一个实施方案中，酶在重组微生物中。
在一个实施方案中，微生物是游离的。在另一个实施方案中，微生物是固定的。例如，微生物可以固定于由无机或有机材料制成的固体支持物上。适用于固定微生物的固体支持物的非限制性实例包括衍化的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。微生物可以例如，通过共价连接、吸附、交联、包埋或包胶，固定于固体支持物上。
合适的微生物包括，但不限于，大肠杆菌、酵母属、曲霉属、毕赤酵母属、芽孢杆菌属、耶氏酵母属。
在一个实施方案中，微生物在水性介质中，所述水性介质包含水和选自碳源、能源、氮源、微量元素、维生素、磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷、有机盐和无机盐、有机酸和矿物酸、碱等的各种成分。碳源包括甘油、葡萄糖、二氧化碳、碳酸盐、碳酸氢盐。氮源可以包括硝酸盐、亚硝酸盐、氨基酸、肽、蛋白胨或蛋白质。
在特定实施方案中，所述介质包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，但不限于，PIPES缓冲剂、醋酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在特定实施方案中，所述介质包含磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，所述介质还可以包括有机溶剂。
在特定实施方案中，酶是能够将reb A和/或reb D2转化成reb M2的UDP-葡糖基转移酶并且包含在大肠杆菌中。
在更特别的实施方案中，酶选自UGT91D2、UGTSL、UGTSL_Sc、UGTSL2(GINo.460410132版本XP_004250485.1)、GI No.460409128(UGTSL)版本XP_004249992.1、GINo.115454819版本NP_001051010.1、GI No.187373030版本ACD03249.1、GI No.222619587版本EEE55719.1、GI No.297795735版本XP_002865752.1或EUGT11并且包含在大肠杆菌中。
在再更特别的实施方案中，酶是UGTSL2并且包含在大肠杆菌中。
可以通过任何合适的方法来实现从反应介质中分离reb M2，以提供包含reb M2的组合物。合适的方法包括，但不限于，裂解、结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备性或分析)，或这些方法的组合。在特定的实施方案中，可以通过裂解和离心来实现分离。
在一些实施方案中，分离可以获得基于无水基础低于约95％重量的reb M2纯度，并且组合物可以含有例如甜菊醇糖苷和/或残余的反应产物。
可以将包含reb M2的组合物进一步纯化，来提供高度纯化的reb M2，即，基于无水基础具有高于约95％重量纯度的reb M2。在一些实施方案中，可以将包含reb M2的组合物进一步纯化，以提供基于无水基础具有高于约96％、高于约97％、高于约98％或高于约99％重量纯度的reb M2。
可以通过本领域技术人员已知的任何方式来实现纯化，所述方式包括但不限于，结晶、通过膜分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备性或分析)，或这些方法的组合。在特定实施方案中，使用HPLC来纯化reb M2。在更特别的实施方案中，使用半制备性HPLC来纯化reb M2。
例如，可以使用两步半制备性HPLC纯化。第一步利用C18柱，使用含有A(水中25％MeCN)和B(水中30％MeCN)的移动相，所述移动相具有以下梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
第二步利用相同的柱和条件，但只使用等度移动相：水中20％MeCN。
本领域技术人员将认识到特定的柱、移动相、注射体积和其他HPLC参数可以改变。
根据本发明制备的纯化甜菊醇糖苷可以用于各种消费品中，所述消费品包括但不限于食品、饮料、药物组合物、烟草制品、营养保健品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
本发明获得的高纯度reb M，具有1291.29的分子量，C56H90O33的分子式，CAS注册号1220616-44-3，并且结构呈现于图1中，是白色和无味的粉末形式。当与10％蔗糖溶液相比时，化合物甜度比糖甜约200倍。红外吸收光谱显示于图4中。
纯的reb M化合物的其他特性包括249-250℃的熔点和50％乙醇中[α]D 25-19.0°的比旋(C＝1.0)。reb M在水中的溶解度为大约0.3％，并且随着温度的提高而提高。
reb M溶于甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的稀溶液中。然而，其不溶于丙酮、苯、氯仿和醚。
根据本发明获得的reb M是热和pH稳定的。
根据本发明获得的高度纯化的靶糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以“按原样”使用或结合其他甜味剂、香精和食品成分使用。
香精的非限制性实例包括酸橙、柠檬、橙子、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦杏仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖和香草香精。
其他食品成分的非限制性实例包括香精、酸化剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、质构剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。
根据本发明获得的高度纯化的靶糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以制成各种聚合形式，包括但不限于，水解物、溶剂化物、无水、无定形形式和/或其混合物。
根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以作为高强度天然甜味剂掺入食品、饮料、药物组合物、化妆品、口香糖、餐桌上用的产品、谷类、乳制品、牙膏和其他口腔组合物等中。
作为增甜化合物的高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以作为唯一的甜味剂来使用，或可以与其他天然产生的高强度甜味剂一起使用，如蛇菊苷、reb A、reb B、reb C、reb D、reb E、reb F、甜菊醇双苷、杜克苷A、悬钩子苷、罗汉果苷、甜味蛋白、新橙皮苷二氢查耳酮、甘草酸及其盐、索马甜、紫苏糖、pernandulcin、mukurozioside、白元参苷、糙苏苷-I、二甲基-六氢芴-二羧酸、abrusoside、巴西甘草甜素、carnosifloside、甜茶树苷、pterocaryoside、polypodoside A、巴西红木素、hernandulcin、phillodulcin、菝葜苷、根皮苷、三叶苷、二氢黄酮醇、二氢榭皮素-3-醋酸盐、新落新妇苷(neoastilibin)、反式-肉桂醛、莫纳甜及其盐、selligueain A、苏木精、莫内林、水龙骨甜素、pterocaryoside A、pterocaryoside B、马槟榔甜素、pentadin、改味糖蛋白、仙茅甜蛋白、neoculin、绿原酸、西那林、罗汉果甜味剂、罗汉果苷V、赛门苷等等
在特定的实施方案中，reb D2和/或reb M2可以与甜味剂组合物一起使用，所述甜味剂组合物包含选自reb A、reb B、reb D、NSF-02、罗汉果苷V、赤藓醇及其组合物的化合物。
高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，也可以结合合成的高强度甜味剂来使用，所述合成的高强度甜味剂如三氯蔗糖、安赛蜜钾、阿斯巴甜、阿力甜、糖精、橘皮苷二氢查耳酮、环己基氨基磺酸盐、纽甜、甘素、suosan advantame、其盐等。
此外，高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以结合天然甜味剂遏制剂来使用，所述天然甜味剂遏制剂如匙羹藤酸、勿甜素、ziziphin、lactisole等等。reb D、reb D2、reb M和/或reb M2也可以结合各种鲜味(umami)增强剂。reb D、reb D2、reb M和/或reb M2可以与鲜味和甜味氨基酸混合，所述氨基酸如谷氨酸盐、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸酯、赖氨酸和色氨酸。
高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M，可以结合一种或多种选自碳水化合物、多元醇、氨基酸及其相应的盐、聚氨基酸及其相应的盐、糖酸及其相应的盐、核苷酸、有机酸、无机酸、有机盐(包括有机酸盐和有机碱盐)、无机盐、苦味化合物、风味剂和风味成分、涩味化合物、蛋白质或蛋白质水解产物、表面活性剂、乳化剂、黄酮类化合物、醇、聚合物及其组合物的添加剂来使用。
高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以结合多元醇或糖醇来使用。术语“多元醇”是指含有超过一个羟基基团的分子。多元醇可以是各自含有2、3和4个羟基基团的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇还可以含有超过四个羟基基团，如戊醇、己醇、庚醇等，其各自含有5、6或7个羟基基团。另外，多元醇还可以是碳水化合物还原形式的糖醇、多元醇或多醇，其中羰基基团(醛或酮，还原糖)已经还原成伯或仲羟基基团。多元醇的实例包括，但不限于，赤藓醇、麦芽糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖醇、木糖醇、肌醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油、苏糖醇、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖、还原的异麦芽糖寡糖、还原的木糖寡糖、还原的龙胆低聚糖、还原的麦芽糖糖浆、还原的葡萄糖糖浆、氢化淀粉水解产物、多羟糖醇和糖醇，或任何其他能够被还原且没有不利地影响甜味剂组合物味道的碳水化合物。
高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以结合减热甜味剂，如D-塔格糖、L-糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖等等。
高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，还可以结合各种碳水化合物。术语“碳水化合物”通常是指通式(CH2O)n(其中n为3-30)的被多个羟基基团取代的醛或酮化合物，及其低聚物和聚合物。本发明的碳水化合物可以另外在一个或多个位置被取代或脱氧。本文中使用的碳水化合物包括未修饰的碳水化合物、碳水化合物衍生物、取代的碳水化合物和修饰的碳水化合物。本文中使用的短语“碳水化合物衍生物”、“取代的碳水化合物”和“修饰的碳水化合物”是同义的。修饰的碳水化合物表示任何碳水化合物，其中至少一个原子已经被添加、去除或取代，或其组合。因此，碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物包括取代和未取代的单糖、双糖、低聚糖和多糖。碳水化合物或取代的碳水化合物任选可以是在任何相应的C-位置脱氧的，和/或被一个或多个部分取代，所述部分如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰基氧、氨基、酰胺、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺基、巯基、亚氨基、磺酰基、硫基、亚磺酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺、膦酰基、次膦酰基、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨基甲酰、磷、膦酸基，或任何其他可行的官能团，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物起到改善甜味剂组合物的甜味的作用。
根据本发明可以使用的碳水化合物的实例包括，但不限于，阿洛酮糖、松二糖、阿罗糖、塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各种环糊精、环状低聚糖、各种类型的麦芽糖糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、苏糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麦芽糖、转化糖、异海藻糖、新海藻糖、异麦芽酮糖、赤藓糖、脱氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、赤藓酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纤维二糖、支链淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸-内酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜低聚糖、异麦芽低聚糖(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖封端的低聚糖(xylo-terminated oligosaccharides)、龙胆低聚糖(龙胆二糖、龙胆三糖、龙胆四糖等)、山梨糖、黑曲霉低聚糖、帕拉金糖低聚糖、果糖低聚糖(蔗果三糖、真菌四糖等)、麦芽四糖醇、麦芽三糖醇、麦芽低聚糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽戊糖、麦芽己糖、麦芽庚糖等)、淀粉、菊粉、菊粉-低聚糖(inulo-oligosaccharide)、乳果糖、蜜二糖、蜜三糖、核糖、异构化液体糖(如高果糖玉米糖浆)、偶联糖和大豆低聚糖。另外，本文中使用的碳水化合物可以是D-或L-构型。
根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以结合各种生理活性物质或功能性成分来使用。功能性成分通常归成如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养保健品、黄酮类化合物、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇(plant sterol)和甾烷醇(stanol)(植物甾醇(phytosterol)和植物甾烷醇(phytostanol))；多元醇；益生元；益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素和矿物质这样的类别。功能性成分还可以基于其健康益处来归类，如心血管、胆固醇-降低和抗炎。示例性功能性成分提供于WO2013/096420中，将其内容由此按引用并入。
根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以用作高强度甜味剂，以产生具有改善的味道特征的零热量、减热或糖尿病饮料和食品。其还可以用于其中不能使用糖的饮料、食品、药品和其他产品中。此外，高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，不仅可以用作用于专用于人食用的饮料、食品和其他产品的甜味剂，也可以用于具有改善的特征的动物饲料和草料中。
其中高度纯化的靶甜菊醇糖苷(特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2)可以用作增甜化合物的消费品的实例包括，但不限于，含醇饮料，如伏特加、葡萄酒、啤酒、利口酒和清酒等；天然汁液；清凉饮料；碳酸软饮料；低热饮料；零热量饮料；减热饮料和食品；酸奶饮品；速溶汁液；速溶咖啡；粉末类型的速溶饮料；罐头产品；糖浆；发酵的大豆酱；酱油；醋；沙拉酱；蛋黄酱；番茄酱；咖喱；汤；速溶肉汤；粉末状酱油；粉末状醋；各种类型的饼干；米饼；克力架；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；果脯和腌制蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；花酱；奶粉；冰淇淋；果汁冰糕；包装在瓶中的蔬菜和水果；罐装和煮沸的豆；在甜味酱汁中煮沸的肉和食品；农业蔬菜食品；海产品；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼酱；油炸鱼产品；干燥的海产品；冷冻食品；腌制的海藻；腌制的肉；番茄；药品；等等。原则上，其可以具有无限的应用。
在如食品、饮料、药品、化妆品、餐桌上用的产品和口香糖这些产品的制造过程中，可以使用常规方法，如混合、捏合、溶解、酸浸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌输和其他方法。
此外，根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2，可以以干的形式或液体形式来使用。在一个实施方案中，提供了包含reb D2的餐桌上用的甜味剂。在另一个实施方案中，提供了包含reb M2的餐桌上用的甜味剂。
可以在食品热处理之前或之后，加入高度纯化的靶甜菊醇糖苷。高度纯化的靶甜菊醇糖苷(特别是reb D、reb D2、reb M和/或reb M2)的含量取决于使用目的。如以上讨论的，可以单独加入或结合其他化合物。
本发明还涉及使用reb D2增强饮料甜度。本发明还涉及包含reb M2增强饮料甜度。因此，本发明提供了包含甜味剂和作为甜味增强剂的reb D2和/或reb M2的饮料，其中reb D2和/或reb M2以等于或低于其各自的甜度感知阈值的浓度存在。
如本文中使用的，术语“甜味增强剂”是指能够增强或加强组合物(如饮料)中的甜味感知的化合物。术语“甜味增强剂”与术语“甜味增效剂”、“甜度增效剂”、“甜度增大剂”和“甜度强化剂”同义。
如本文中概括使用的术语“甜味识别阈值浓度”是人味觉可感知的甜味化合物的最低已知浓度，通常为约1.0％蔗糖当量(1.0％SE)。通常，当以等于或低于给定的甜味增强剂的甜味识别阈值浓度存在时，甜味增强剂可以增强或加强甜味剂的甜味，而自身没有提供任何可感知的甜味；然而，甜味增强剂自身在高于其甜味识别阈值浓度的浓度下可以提供甜味。甜味识别阈值浓度对于特定的增强剂是特异性的，并且可以基于饮料基质而改变。可以通过品尝测试递增浓度的给定增强剂直至检测到给定饮料基质中高于1.0％蔗糖当量，来容易地测定甜味识别阈值浓度。提供约1.0％蔗糖当量的浓度被认为是甜味识别阈值。
在一些实施方案中，甜味剂以约0.5％至约12％重量，如，例如，约1.0％重量、约1.5％重量、约2.0％重量、约2.5％重量、约3.0％重量、约3.5％重量、约4.0％重量、约4.5％重量、约5.0％重量、约5.5％重量、约6.0％重量、约6.5％重量、约7.0％重量、约7.5％重量、约8.0％重量、约8.5％重量、约9.0％重量、约9.5％重量、约10.0％重量、约10.5％重量、约11.0％重量、约11.5％重量或约12.0％重量的量存在于饮料中。
在特定实施方案中，甜味剂以约0.5％至约10％，如，例如，约2％至约8％、约3％至约7％或约4％至约6％重量的量存在于饮料中。在特定实施方案中，甜味剂以约0.5％至约8％重量的量存在于饮料中。在另一个特定的实施方案中，甜味剂以约2％至约8％重量的量存在于饮料中。
在一个实施方案中，甜味剂是传统的热量甜味剂。合适的甜味剂包括，但不限于，蔗糖、果糖、葡萄糖、高果糖玉米糖浆和高果糖淀粉糖浆。
在另一个实施方案中，甜味剂是赤藓醇。
在再另一个实施方案中，甜味剂是稀有糖。合适的稀有糖包括，但不限于，D-阿洛糖、D-阿洛酮糖、L-核糖、D-塔格糖、L-葡萄糖、L-果糖、L-阿拉伯糖、D-松二糖、D-明串珠菌二糖及其组合。
考虑了甜味剂可以单独使用，或结合其他甜味剂使用。
在一个实施方案中，稀有糖是D-阿洛糖。在更特别的实施方案中，D-阿洛糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在另一个实施方案中，稀有糖是D-阿洛酮糖。在更特别的实施方案中，D-阿洛酮糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在再另一个实施方案中，稀有糖是D-核糖。在更特别的实施方案中，D-核糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在再另一个实施方案中，稀有糖是D-塔格糖。在更特别的实施方案中，D-塔格糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在进一步的实施方案中，稀有糖是L-葡萄糖。在更特别的实施方案中，L-葡萄糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在一个实施方案中，稀有糖是L-果糖。在更特别的实施方案中，L-果糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在另一个实施方案中，稀有糖是L-阿拉伯糖。在更特别的实施方案中，L-阿拉伯糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在再另一个实施方案中，稀有糖是D-松二糖。在更特别的实施方案中，D-松二糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
在再另一个实施方案中，稀有糖是D-明串珠菌二糖。在更特别的实施方案中，D-明串珠菌二糖以约0.5％至约10％重量，如，例如，约2％至约8％的量存在于饮料中。
与不存在甜味增强剂的相应饮料相比时，以等于或低于其甜味识别阈值的浓度添加甜味增强剂提高了包含甜味剂和甜味增强剂的饮料检测到的蔗糖当量。此外，在不存在任何甜味剂的情况中，可以通过超过含有相同浓度的至少一种甜味增强剂的溶液的可检测甜度的量来提高甜度。
因此，本发明还提供了一种用于增强包含甜味剂的饮料的甜度方法，包括提供包含甜味剂的饮料并添加选自reb D2、reb M2或其组合的甜味增强剂，其中reb D2和reb M2以等于或低于其甜味识别阈值的浓度存在。
将等于或低于甜味识别阈值浓度的reb D2和/或reb M2加入含有甜味剂的饮料中，可以将检测到的蔗糖当量从1.0％提高至约5.0％，如，例如，约1.0％、约1.5％、约2.0％、约2.5％、约3.0％、约3.5％、约4.0％、约4.5％或约5.0％。
以下实施例说明了本发明针对制备高度纯化的靶甜菊醇糖苷(特别，reb D、rebD2、reb M和/或reb M2)的优选实施方案。应当理解本发明不限于实施例中所列的材料、比例、条件和程序，其只是说明性的。
实施例1
UGT76G1的体内产生
将NcoI和NdeI限制位点添加至Genbank登录号no.AAR06912.1中所述的初始核酸序列中。密码子优化后，获得了以下的核酸序列：
使用NdeI和XhoI克隆位点合成基因并亚克隆至pET30A+载体中后，通过电穿孔将UGT76G1_pET30a+质粒引入大肠杆菌B121(DE3)和大肠杆菌EC100中。将获得的细胞生长于存在卡那霉素的皮氏培养皿中并且选择合适的克隆，使其在液体LB培养基中生长(锥形烧瓶)。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中，并且将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃。
将含有pET30A+_UGT76G1质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在135rpm和30℃下振荡8小时。
生产培养基含有60g/L过夜表达已配制好的TB培养基(Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。使培养基在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。培养物获得显著生长并且获得了良好的OD。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻，产生12.7g细胞湿重。
通过添加Bugbuster Master混合物(Novagen)进行裂解并且通过离心收集裂解产物并保持冷冻。使用融化的裂解产物进行活性测试。
实施例2
UGT76G1的体外生产
使用来自Promega的S30 T7高产量表达系统试剂盒。将4μg来自大肠杆菌EC100的UGT76G1_pET30a+质粒与80μL S30 Premix Plus混合并加入72μL S30 T7提取物。加入无核酸酶水，以获得200μL的总体积，并且将所得到的溶液在30℃下孵育2小时。将180μL用于催化测试反应中。
实施例3
UGT91D2的体外生产
将NcoI和NdeI限制侧添加至如Genbank登录号ACE87855.1中所述的初始核酸序列。密码子优化后，获得以下核酸序列：
使用NcoI和XhoI克隆位点合成基因并亚克隆至pET30A+后，通过电穿孔，将UGT91D2_pET30a+引入大肠杆菌EC100中。在卡那霉素存在下，使获得的细胞生长并且选择合适的克隆，使其在液体LB培养基中生长(锥形烧瓶)。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中，并且将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃。
将来自Promega的S30 T7高产量蛋白表达系统试剂盒用于蛋白质的体外合成。
将4μg UGT91D2_pET30a+质粒与80μL S30 Premix Plus混合并加入72μL S30 T7提取物。加入无核酸酶水，以获得200μL的总体积，并且将所得到的溶液在30℃下孵育2小时。将5μL用于SDS-page分析，同时将剩余的45μL用于催化测试反应中。
实施例4
使用体内产生的UGT76G1的催化反应
反应的总体积为5.0mL，具有以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mM MgCl2，2.5mM UDP-葡萄糖，0.5mM蛇菊苷和500μL UGT76G1融化的裂解产物。在135rpm的轨道振荡器上在30℃下运行反应。对于每个样品，用40μL 2N H2SO4和420μL甲醇/水(6/4)骤冷460μL反应混合物。立即将样品离心并且在通过HPLC(CAD)分析前保持在10℃。HPLC表明蛇菊苷几乎完全转化成莱鲍迪苷A，如图51中所示的。
实施例5
使用体外产生的UGT91D2的催化反应
反应的总体积为0.5mL，具有以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mM MgCl2，3.8mM UDP-葡萄糖，0.1mM莱鲍迪苷A和180μL体外产生的UGT91D2。在135rpm的轨道振荡器上在30℃下运行反应。对于每个样品，用45μL 2N H2SO4和405μL 60％MeOH骤冷450μL反应混合物。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC表明了在120小时后，4.7％的莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D。
实施例6
使用体外产生的UGT76G1的催化反应
反应的总体积为2mL，具有以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2，3mM MgCl2，3.8mMUDP-葡萄糖，0.5mM莱鲍迪苷D和180μL体外产生的UGT76G1。在135rpm的轨道振荡器上在30℃下运行反应。对于每个样品，用40μL 2N H2SO4和360μL 60％MeOH骤冷400μL反应混合物。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC表明了在120小时后，80％的莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M，如图52中所示的。
对于实施例7至12，使用了以下缩写：
LBGKP培养基：20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素或氨苄青霉素
LB培养基：(20g/L Luria肉汤Lennox)
实施例7
通过pET30a+质粒和BL21(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
将pET30a+_UGT76G1质粒转化至BL21(DE3)表达菌株(Lucigen E.
EXPRESS电感受态细胞)中。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。使培养基在20℃下搅拌，同时取样测量OD(600nm)和pH。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为10.58g。
通过添加8.1ml“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和3.5mL水来裂解3.24g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例8
通过pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热休克处理，将pET30a+_UGT76G1质粒转化至Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)中。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入100mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中。使这个培养物在30℃下振荡15小时。将4.4mL这种培养物用于接种200mL含有LB的生产培养基。使该培养基在37℃下搅拌，直至获得0.9的OD(600nm)，此后，加入400μL 100mM IPTG溶液，并且使培养基在30℃下搅拌4小时。通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为1.38g。
通过添加4.9mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和2.1mL水来裂解获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例9
通过pMAL质粒和BL21表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
使用Nde1和Sal1克隆位点，将合成的UGT76G1基因亚克隆至pMAL质粒后，通过热休克处理，将pMAL_UGT76G1质粒转化至BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)中。在氨苄青霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。使培养基在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为5.86g。
通过添加9.6mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和4.1mL水来裂解2.74g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例10
通过pMAL质粒和Arct icExpress表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热休克处理，将pMAL_UGT76G1质粒转化至ArticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)中。在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。使培养基在12℃下搅拌，同时取样测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为8.96g。
通过添加8.73mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和3.79mL水来裂解2.47g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例11
通过pCOLDIII质粒和ArcticExpress表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
使用Nde1和Xho1克隆位点，将合成的UGT76G1基因亚克隆至pCOLDIII质粒后，通过热休克处理，将pCOLDIII_UGT76G1质粒转化至ArcticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)中。在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。使培养基在12℃下搅拌，同时取样测量OD(600nm)和pH。63小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为6.54g。
通过添加9.8mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和4.2mL水来裂解2.81g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例12
通过pCOLDIII质粒和Origami2(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制备和活性
通过热休克处理，将pCOLDIII_UGT76G1质粒转化至Origami2(DE3)表达菌株(Novagen OrigamiTM2(DE3)感受态细胞)中。在氨苄青霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素)中。使这个培养物在30℃下振荡8h，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。使培养基在12℃下搅拌，同时取样测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为2.53g。
通过添加6.0mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和1.9mL水来裂解1.71g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并保持冷冻。
实施例13
活性的测定
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用500μL融化的裂解产物，用于将蛇菊苷转化成莱鲍迪苷A以及将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M，以5mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。针对不同UGT76G1制备物的结果概括于下表中。
*注释
按照每mL裂解产物来提及蛇菊苷和莱鲍迪苷M的转化活性。在30℃和pH 7.2下，在1小时中，1U将转化1μmol底物。
实施例14
用于莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M的50mL规模反应
将5mL实施例12的裂解产物用于50mL规模的莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M。反应介质由50mM磷酸钠缓冲液pH7.2、3mM MgCl2、2.5mM UDP-葡萄糖和0.5mM莱鲍迪苷D组成。使反应在30℃下振荡90小时后，加入50mL乙醇，并将所得到的混合物在-20℃下振荡1小时。在5000g下离心10分钟后，通过超滤(Vivaflow MWCO 30000)纯化上清液。获得78mL透过液，并用9mL乙醇稀释9mL截留物，并再次接受超滤(Vivaflow MWCO 30000)。获得另外的14mL滤液，将其与第一个透过液合并。将合并的透过液在30℃下减压浓缩，直至获得32mL澄清溶液。
产品混合物的HPLC痕迹显示于图5中。在配备了双泵、自动取样机和恒温柱室的Agilent 1200系列上进行HPLC。所述方法是等度的，使用由70％水(0.1％甲酸)：30％乙腈的移动相。流速为0.1μL/分钟。使用的柱为Phenomenex Prodigy 5μODS(3)100A；250×2mm。柱温维持在40℃。注入体积为20-40μl。
实施例15
使用pMAL质粒和BL21表达菌株的UGT91D2的制备
使用Nde1和Sal1克隆位点，将合成的UGT91D2基因亚克隆至pMAL质粒后，通过热休克处理，将pMAL_UGT91D2质粒转化至BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)中。在氨苄青霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。使培养基在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为12.32g。
通过添加7.7mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和3.2mL水来裂解2.18g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并直接用于活性测试。
实施例16
使用pMAL质粒和ArcticExpress表达菌株的UGT91D2的制备
通过热休克处理，将pMAL_UGT91D2质粒转化至ArcticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)中。在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。使培养基在20℃下搅拌16小时，接着在12℃下再搅拌50小时，同时取样测量OD(600nm)和pH。通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为15.77g。
通过添加9.0mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和3.8mL水来裂解2.57g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并直接用于活性测试。
实施例17
使用pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株的UGT91D2的制备
通过热休克处理，将pET30a+_UGT91D2质粒转化至Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)中。在卡那霉素素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入100mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中。使这个培养物在30℃下振荡15小时。将6.2mL这种培养物用于接种500mL含有LB的生产培养基。使该培养基在37℃下搅拌，直至获得0.9的OD(600nm)，此后，加入500μL 100mM IPTG溶液(培养基中的IPTG浓度为100μM)，并且使培养基在30℃下搅拌4小时。通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为4.02g。
通过添加6.8mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和2.8mL水来裂解1.92g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并直接用于活性测试。
实施例18
使用pET30a+质粒和ArcticExpress表达菌株的UGT91D2的制备通过热休克处理，将pET30a+_UGT91D2质粒转化至ArcticExpress(DE3)表达菌株(Agilent ArcticExpress感受态细胞)中。在氨苄青霉素和遗传霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中的LB琼脂上。选择合适的克隆并使其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。加入甘油并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)中。使这个培养物在30℃下振荡8小时，并随后用于接种400mL含有60g/L“过夜表达已配制好的TB培养基”(Novagen，参照71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。使培养基在20℃下搅拌16小时，接着在12℃下再搅拌50小时，同时取样测量OD(600nm)和pH。60小时后，通过离心收集细胞并冷冻。获得的细胞湿重为16.07g。
通过添加11.4mL“Bugbuster Master混合物”(Novagen，参照71456)和4.8mL水来裂解3.24g获得的沉淀。通过离心收集裂解产物并直接用于活性测试。
实施例19
UGT91D2体内制备物的活性测定
使用50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mM MgCl2，使用1000μL裂解产物用于悬钩子苷转化成蛇菊苷，以5mL规模进行活性测试。取样并通过HPLC分析。针对不同UGT91D2制备物的结果概括于下表中。
*注释：按照每mL裂解产物来提及活性。在30℃和pH 7.2下，在1小时中，1U将转化1μ mol底物。
实施例20
用于莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷D转化的其他酶
从公众数据库鉴定了以下的UDP-葡糖基转移酶基因，通过DNA2.0合成并随后在pET30a+载体中亚克隆。
| 微量滴定平板 | 位置 | 基因名称 | 内部参照 | RebA转化成RebD |
| C908201 | A1 | gi115454819_NP_001051010.1 | S115N01 A1 | 有活性 |
| C908201 | G2 | gi187373030_ACD03249.1 | S115N01 G2 | 有活性 |
| C908201 | A7 | gi460409128_XP_004249992.1 | S115N05 A7 | 有活性 |
| C912666 | E1 | gi222619587_EEE55719.1 | S115N06 E1 | 有活性 |
| C912666 | C2 | gi297795735_XP_002865752.1 | S115N06 C2 | 有活性 |
氨基酸序列如下：
＞gi|115454819|ref|NP_001051010.1|Os03g0702500[粳稻日本晴(Oryzasativa Japonica Group)]
＞gi|187373030|gb|ACD03249.1|UDP-葡糖基转移酶[糙伏毛燕麦(Avenastrigosa)]
>gi|460409128|ref|XP_004249992.1|PREDICTED：花青素-3-O-糖苷2-O-糖苷葡糖醛酸基转移酶样[番茄(Solanum lycopersicum)]
>gi|222619587|gb|EEE55719.1|假定蛋白OsJ_04191[粳稻日本晴(Oryza sativaJaponica Group)]
>gi|297795735|ref|XP_002865752.1|UDP-葡糖醛酸基/UDP-葡糖基转移酶家族蛋白[琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)琴叶亚种]
在含有质粒的微滴定平板中接收测试的质粒，所述质粒作为冻干固体在每个分开的孔中。
质粒的悬浮。向每个孔中，加入24μL超纯无菌水，并且将微滴定平板在室温下振荡30分钟。随后，将平板在4℃下孵育1小时。通过上下吸移，进一步混合每个孔的内容物。使用1μL悬浮液，通过Qubi t2.0分析进行质粒定量。测定的质粒含量为：
| 微量滴定平板 | 位置 | 内部参照 | [质粒]ng/μL |
| C908201 | A1 | S115N01 A1 | 32.8 |
| C908201 | G2 | S115N01 G2 | 41.0 |
| C908201 | A7 | S115N05 A7 | 56.6 |
| C912666 | E1 | S115N06 E1 | 64.0 |
| C912666 | C2 | S115N06 C2 | 31.4 |
用质粒转化感受态细胞。从-80℃的冰箱中取出化学感受态EC100细胞的等份试样并且储存在冰上。使细胞在冰上融化10分钟。将10μL上述质粒溶液的稀释液加入1.5mL的无菌微管中(使得用50pg DNA转化每个细胞)并且储存在冰上。将100μL化学感受态细胞加入每个微管中。在冰上孵育化学感受态细胞质粒混合物20分钟后，进行了42℃下30秒的热休克。
在冰上再进行孵育2分钟。向每个微管中，加入300μL SOC培养基，并将所得到的混合物转移至无菌的15mL试管中。在37℃下孵育1小时，同时在135rpm下振荡，将混合物涂布在含有50μg/mL卡那霉素的固体Luria肉汤培养基上。使皮氏培养皿在37℃下孵育16小时。
甘油中的储液的制备和质粒的纯化。向50mL无菌Falcon试管中，加入10mL含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤培养基。给培养基接种从上述皮氏培养皿中分离的克隆，并使培养物在37℃下孵育16小时，同时在135rpm下振荡。
向含有300μL 60％无菌甘油溶液的1.5mL的无菌微管中，加入600μL培养物。将储液储存在-80℃。
将剩余的培养物在10℃下，在5,525g下，离心10分钟，并且除去上清液后，将沉淀物储存在冰上。根据Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(参照：27106)纯化所产生的质粒，并且在260nm下测量了质粒产量。将质粒溶液储存在4℃。如下测定了质粒含量：
| 微量滴定平板 | 位置 | 测试的内部参照 | [质粒]ng/μL |
| C908201 | A1 | S115N01 A1 | 115.7 |
| C908201 | G2 | S115N01 G2 | 120.4 |
| C908201 | A7 | S115N05 A7 | 293.8 |
| C912666 | E1 | S115N06 E1 | 126.1 |
| C912666 | C2 | S115N06 C2 | 98.8 |
酶的体外表达。根据Promega S30 T7高产量蛋白表达系统(参照：L1110)试剂盒，将18μL质粒溶液(含有大约1.5μg质粒)用于体外表达。如下产生了表达培养基：
将制备的表达培养基混合物加入质粒溶液中并且使溶液在30℃下孵育3小时，同时每45分钟混合该混合物。将5μL混合物冷冻，同时将剩余的用于针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的催化测试。
针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的催化测试。将430μL含有0.5mM莱鲍迪苷A、3mMMgCl2、50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.2)和2.5mM UDP-葡萄糖的反应混合物加入1.5mL无菌微管中。加入52μL酶表达培养基并使所得到的混合物在30℃下反应24小时。在2小时、16小时和24小时后取出125μL样品并加入115μL 60％甲醇和10μL 2N H2SO4中。将骤冷的样品在RT下在18,000g下离心2分钟。将200μL转移至HPLC小瓶中并分析。
HPLC分析。如下进行HPLC测试：
装置
仪器条件
| 柱温 | 55℃ |
| 检测 | UV205nm；bw 400nm CAD检测 |
| 分析持续时间 | 15分钟 |
| 注入的体积 | 10μL |
| 流速 | 1mL/分钟 |
移动相梯度方案
| 时间(分钟) | 含有0.04％醋酸的水％ | 甲醇％ |
| 0 | 40 | 60 |
| 8 | 25 | 75 |
| 10 | 25 | 75 |
| 11 | 40 | 60 |
| 15 | 40 | 60 |
以下提供了HPLC测试结果并显示于图53a-e中：
酶S115N05 A7对于Reb A转化成Reb D具有最高活性(大约22.4％)。
至少三种酶产生了显著含量的未知糖苷(标记为Reb UNK；之后鉴定为reb D2)连同reb D。
实施例21
体外产生的EUGT11的活性
通过DNA2.0合成了专利申请WO/2013/022989A2中所述的EUGT11基因并随后在pET30a+载体中亚克隆。
氨基酸序列如下：
>gi|41469452|gb|AAS07253.1|推定的UDP-葡糖醛酸基和UDP葡糖基转移酶[粳稻日本晴(Oryza sativa Japonica Group)]EUGT11酶来自专利申请WO/2013/022989A2
在含有质粒的微滴定平板中接收测试的质粒，所述质粒作为冻干固体在每个分开的孔中。
质粒的悬浮。向每个孔中，加入24μL超纯无菌水，并且将微滴定平板在室温下振荡30分钟。随后，将平板在4℃下孵育1小时。通过上下吸移，进一步混合每个孔的内容物。使用1μL悬浮液，通过Qubit2.0分析进行质粒定量。测定的质粒含量为：
| 微量滴定平板 | 位置 | 试验的内部参照 | [质粒]ng/μL |
| C912666 | G4 | S115N08 G4 | 19.2 |
用质粒转化感受态细胞。从-80℃的冰箱中取出化学感受态EC100细胞的等份试样并且储存在冰上。使细胞在冰上融化10分钟。将10μL上述质粒溶液的稀释液加入1.5mL的无菌微管中(使得用50pg DNA转化每个细胞)并且储存在冰上。将100μL化学感受态细胞加入每个微管中。在冰上孵育化学感受态细胞/质粒混合物20分钟后，进行了42℃下30秒的热休克。
在冰上再进行孵育2分钟。向每个微管中，加入300μL SOC培养基，并将所得到的混合物转移至无菌的15mL试管中。在37℃下孵育1小时，同时在135rpm下振荡，将混合物涂布在含有50μg/mL卡那霉素的固体Luria肉汤培养基上。使皮氏培养皿在37℃下孵育16小时。
甘油中的储液的制备和质粒的纯化。向50mL无菌Falcon试管中，加入10mL含有50μg/mL卡那霉素的Luria肉汤培养基。给培养基接种从上述皮氏培养皿分离的克隆，并使培养物在37℃下孵育16小时，同时在135rpm下振荡。
向含有300μL 60％无菌甘油溶液的1.5mL的无菌微管中，加入600μL培养物。将储液储存在-80℃。
将剩余的培养物在10℃下，在5,525g下，离心10分钟，并且除去上清液后，将沉淀物储存在冰上。根据Qiagen Qiaprep Spin Miniprep试剂盒(参照：27106)纯化所产生的质粒，并且在260nm下测量了质粒产量。将质粒溶液储存在4℃。如下测定了质粒含量：
| 微量滴定平板 | 位置 | 测试的内部参照 | [质粒]ng/μL |
| C912666 | G4 | S115N08 G4 | 38.4 |
EUGT11的体外表达。根据Promega S30 T7高产量蛋白表达系统(参照：L1110)试剂盒，将18μL稀释的质粒溶液(含有大约1.5μg质粒)用于体外表达。产生了表达培养基，如下：
将制备的表达培养基混合物加入质粒溶液中并且使溶液在30℃下孵育3小时，同时每45分钟混合该混合物。将5μL混合物冷冻，同时将剩余的用于针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的催化测试。
针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的催化测试。将430μL含有0.5mM莱鲍迪苷A、3mMMgCl2、50mM磷酸盐缓冲剂(pH7.2)和2.5mM UDP-葡萄糖的反应混合物加入1.5mL无菌微管中。加入52μL酶表达培养基并使所得到的混合物在30℃下反应24小时。在2小时、16小时和24小时后取出125μL样品并加入115μL 60％甲醇和10μL 2N H2SO4中。将骤冷的样品在RT下在18,000g下离心2分钟。将200μL转移至HPLC小瓶中并分析。
HPLC分析。按照实施例20中所述的进行HPLC测试。
HPLC测试结果显示于图54中。
实施例22
酶的体内生产
在体内产生了实施例20中所述的酶。
通过热休克，将含有对应于酶的基因的pET30A+载体引入大肠杆菌BL21(DE3)中。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中，并选择合适的克隆，使其在液体LB培养基中(锥形烧瓶)生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将含有pET30A+_UGT质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在135rpm和30℃下振荡8小时。
生产培养基含有60g/L过夜表达已配制好的TB培养基(Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。将预培养物加入400mL的这种培养基中，并使溶液在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。培养物获得显著生长并且获得了良好的OD。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻。以下提及了以下的细胞湿重(CWW)产量。
| GI编号 | 版本 | CWW |
| 115454819 | NP_001051010.1 | 9.2g |
| 187373030 | ACD03249.1 | 7.4g |
| 460409128 | XP_004249992.1 | 6.8g |
| 222619587 | EEE55719.1 | 7.5g |
| 297795735 | XP_002865752.1 | 8.8g |
通过添加Bugbuster Master混合物(Novagen)进行裂解，通过离心收集裂解产物，并新鲜使用。
活性的测定。使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mM MgCl2，使用1,000μL融化的裂解产物，用于转化莱鲍迪苷A，以5mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。
HPLC分析。按照实施例20中所述的进行了HPLC测试。
以下提供了针对不同的酶的结果并显示于图55a-e中。
| GI编号 | 版本 | 45小时后的转化 | Reb D选择性 |
| 115454819 | NP_001051010.1 | 1.1％ | 100％ |
| 187373030 | ACD03249.1 | 0.8％ | 100％ |
| 460409128 | XP_004249992.1 | 62.1％ | 43.6％ |
| 222619587 | EEE55719.1 | 2.9％ | 未检测到Reb D |
| 297795735 | XP_002865752.1 | 0.0％ | 未检测到Reb D |
实施例23
糖苷的鉴定
通过LC-MS另外测试代表GI No.460409128的反应混合物，特别是实施例20的样品“12400S115N05A7 T24h 130627ABA”(下文称为S115N05A7)和实施例22的样品“12400S129N04 T45h 130712ABA”(下文称为S129N04)，来鉴定未知的糖苷。使用了Agilent1200系列HPLC系统，其配备了双泵(G1312B)、自动取样机(G1367D)、恒温柱室(G1316B)、DAD检测仪(C1315C)，连接Agilent 6110A MSD，并与“LC/MSD Chemstation”软件配合。
仪器条件
移动相梯度方案
| 时间(分钟) | A(％)：甲酸0.1％ | B(％)：乙腈 |
| 0 | 75 | 25 |
| 8.5 | 75 | 25 |
| 10.0 | 71 | 29 |
| 16.5 | 70 | 30 |
在3.5分钟的LCMS系统上观察到的化合物对应于样品“S115N05A7”(实施例20)中的化合物“未知＠4.508”和样品“S129N04”(实施例22)中的化合物“未知＠RT4.526”。LCMS数据表明这种化合物在其结构中具有六个葡糖苷残基(C56H90O33)，并且发现了是reb M的异构体，命名为reb M2(对于讨论，参见实施例40)。
而在7.6分钟的LCMS上观察到的化合物对应于样品“S115N05A7”(实施例20)中的化合物“reb UNK”和样品“S129N04”(实施例22)中的化合物“reb UNK”。LCMS数据表明“rebUNK”在其结构中具有五个葡糖苷残基(C50H80O28)，并且发现了是reb D的异构体，命名为rebD2(对于讨论，参见实施例39)。以下提供了这些化合物的比例和LCMS色谱。
实施例24
糖苷的鉴定
连同PureCircle Sdn Bhd(马来西亚)生产的甜菊叶提取物“MLD1”，通过LC-MS另外测试了代表GI No.460409128的反应混合物，特别是实施例22的样品“12400S129N04T45h 130712ABA”(下文称为S129N04)，来测定天然出现的S129N04糖苷。
图57a-b中的测试表明实施例23中在3.5分钟的LCMS系统上观察到的化合物(C56H90O33；之后证实为reb M2)和实施例23中在7.6分钟的LCMS系统上观察到的化合物(C50H80O28；reb UNK；之后证实为reb D2)出现在甜菊植物的提取物中。
实施例25
莱鲍迪苷E转化成莱鲍迪苷D
反应的总体积为5.0mL，具有以下组成：100mM磷酸钾缓冲液pH7.5，3mM MgCl2，2.5mM UDP-葡萄糖，0.5mM莱鲍迪苷E和500μL UGT76G1融化的裂解产物(UGT76G1基因在pET30a+载体中克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达)。在135rpm的轨道振荡器上在30℃下运行反应。为了取样，用30μL 2N H2SO4和270μL甲醇/水(6/4)骤冷300μL反应混合物。立即将样品离心并且在通过HPLC(CAD检测)分析前保持在10℃。获得了图58中显示的反应特征，对应于莱鲍迪苷E完全转化成莱鲍迪苷D。
实施例26
用于将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M的UGT76G1的定向进化
从Genbank(AAR06912.1)中所述的UGT76G1的氨基酸序列开始，鉴定了在各种氨基酸位置的不同突变，所述突变可以改变将莱鲍迪苷D(Reb D)转化成莱鲍迪苷M(Reb M)的酶的活性。这种通过DNA2.0ProteinGPSTM策略设计的突变列表随后用于合成96个含有这些突变中的3、4或5个的变体基因，所述突变对于在大肠杆菌中的表达是密码子优化的。将基因在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿中的固体LB培养基中生长。选择合适的克隆，使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的这些储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基中(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。使这个培养物在135rpm和30℃下在96微滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得显著生长并获得了良好的OD(600nm；1cm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。用100μL新鲜裂解产物进行了活性测试，所述裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。
使反应在30℃下运行并且在2、4、7和24小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M所述的分析方法，通过HPLC(CAD检测)来测定转化和初始速率。结果显示于下表中。
*突变如下注释：初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，位置33的丙氨酸突变成甘氨酸注释为A33G。
实施例27
UGTSL2的体内产生
UGTSL2(GI_460410132/XP_004250485.1)氨基酸序列：
通过热休克，将含有UGTSL2基因的pET30A+载体引入大肠杆菌Bl21(DE3)中。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中，并选择合适的克隆，使其在液体LBG培养基中(锥形烧瓶)生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将含有pET30A+_UGTSL2质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基中(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。使这个培养物在135rpm和30℃下振荡8小时。
生产培养基含有60g/L过夜表达已配制好的TB培养基(Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。将预培养物加入200mL的这种培养基中，并使溶液在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。培养物获得显著生长并且获得了良好的OD。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻，获得6.22g细胞湿重。
通过添加Bugbuster Master混合物(Novagen)对1.4g细胞进行裂解，通过离心收集裂解产物并新鲜使用。
实施例28
用UGTSL和UGTSL2将蛇菊苷转化成莱鲍迪苷E的活性的测定根据实施例22制得了UGTSL，并根据实施例27制得了UGTSL2。
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用600μL的裂解产物，用于蛇菊苷的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。
HPLC分析。按照实施例20中所述的进行了HPLC测试。
以下提供了针对不同的酶的结果和相应色谱并显示于图59a-b中。
注释：1基于蛇菊苷的初始浓度
实施例29
用UGTSL和UGTSL2将悬钩子苷转化成莱鲍迪苷E的活性的测定
根据实施例22制得了UGTSL，并根据实施例27制得了UGTSL2。
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用600μL的裂解产物，用于悬钩子苷的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。按照实施例20中所述的进行了HPLC测试。
以下提供了针对不同的酶的结果和相应色谱并显示于图60a-b中。
注释：1基于悬钩子苷的初始浓度
实施例30
用UGTSL2将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性的测定
根据实施例27制得了UGTSL2。
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用60μL的裂解产物，用于莱鲍迪苷A的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。按照实施例20中所述的进行了HPLC测试。
以下提供了23小时反应后的结果和相应色谱并显示于图61中。
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实施例31
蛇菊苷的鉴定
连同PureCircle Sdn Bhd(马来西亚)生产的甜菊叶提取物“MLD1”，通过LC-MS分析了根据实施例30制备并孵育45小时的反应混合物，来测定天然形成的糖苷的出现。
使用了Agilent 1200系列HPLC系统，其配备了双泵(G1312B)、自动取样机(G1367D)、恒温柱室(G1316B)、DAD检测仪(G1315C)，连接Agilent 6110A MSD，并与“LC/MSDChemstation”软件配合。
仪器条件
移动相梯度方案
| 时间(分钟) | A(％)：甲酸0.1％ | B(％)：乙腈 |
| 0 | 75 | 25 |
| 30 | 75 | 25 |
| 33 | 68 | 32 |
| 75 | 68 | 32 |
图62中所示的测试表明了在11.77分钟的LC-MS系统上观察到的化合物与实施例23中3.5分钟的化合物相同(C56H90O33；之后证实为reb M2)，在26.64分钟观察到的化合物与实施例23中7.6分钟的化合物相同(C50H80O28；reb UNK；之后证实为reb D2)。在13.96分钟观察到了reb X的其他异构体，在25.06分钟观察到了reb D的另一种异构体形式。所有观察到的化合物都出现在甜菊提取物中。
实施例32
UGTLB的体内制备和活性测定
UGTLB(GI_209954733/BAG80557.1)氨基酸序列
通过热休克，将含有UGTLB基因的pET30A+载体引入大肠杆菌Bl21(DE3)中。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中，并选择合适的克隆，使其在液体LB培养基中(锥形烧瓶)生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将含有pET30A+_UGTLB质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入30mL的LBGKP培养基中(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。使这个培养物在135rpm和30℃下振荡8小时。
生产培养基含有60g/L过夜表达已配制好的TB培养基(Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。将预培养物加入200mL的这种培养基中，并使溶液在20℃下搅拌，同时取样测量OD和pH。培养物获得显著生长并且获得了良好的OD。40小时后，通过离心收集细胞并冷冻，获得5.7g细胞湿重。
通过添加6mL Bugbuster Master混合物(Novagen)对1.2g细胞进行裂解，通过离心收集裂解产物并新鲜使用。
用UGTLB将蛇菊苷转化成莱鲍迪苷E的活性的测定
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用600μL的裂解产物，用于蛇菊苷的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。相应色谱描绘于图63a中。
注释：1基于蛇菊苷的初始浓度
用UGTLB将悬钩子苷转化成莱鲍迪苷E的活性的测定
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用600μL的裂解产物，用于悬钩子苷的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。相应色谱描绘于图63b中。
注释：1基于悬钩子苷的初始浓度
用UGTLB将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性的测定
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用600μL的裂解产物，用于莱鲍迪苷A的转化，以3mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。反应23小时后的相应色谱描绘于图63c中。
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实施例33
用UGTSL、UGTSL2和UGTLB的悬钩子苷和蛇菊苷转化的反应产物的测定
以实施例28相似的方式进行了用UGTSL和UGTSL2的蛇菊苷转化，并以实施例29相似的方式进行了用UGTSL和UGTSL2的悬钩子苷转化。以实施例32相似的方式进行了用UGTLB的悬钩子苷和蛇菊苷的转化。
通过LCMS分析了反应混合物来测定所有反应产物。
悬钩子苷转化产物
蛇菊苷转化产物
可以看到在悬钩子苷转化产物中，除了蛇菊苷、Reb E和Reb D，存在至少3种另外的具有804分子量的化合物。这些化合物的停留时间与Reb B不匹配，已知其与蛇菊苷具有相同的分子量。因为这些化合物与蛇菊苷具有相同的分子量，可以认为这些新的甜菊醇糖苷是蛇菊苷的异构体。另一方面，在蛇菊苷转化产物中，除了Reb E和Reb D，存在至少3种另外的具有966分子量的化合物。这些化合物的停留时间与Reb A不匹配，已知其与Reb E具有相同的分子量。因为这些化合物与Reb A和Reb E具有相同的分子量，可以认为这些新的甜菊醇糖苷是Reb A(Reb E)的异构体。
实施例34
酿酒酵母(S.cerevisiae)中UGT76G1的体内产生
UGT76G1[甜菊](gi_37993653/gb_AAR06912.1)
上述氨基酸序列对于在酿酒酵母中的表达是密码子优化的。此外，在ATG起始密码子前，添加酵母共有序列AACACA。使用Hind III和Xba I限制位点，在pYES2载体中亚克隆合成基因。将pYES2_UGT76G1_Sc载体用于转化化学感受态酿酒酵母INVSc1细胞(Invitrogen)。
将细胞生长于含有2％葡萄糖缺少尿嘧啶的固体合成最小培养基上，并且挑选单个克隆并使其在缺少尿嘧啶的液体合成最小培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)中生长。离心后，用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮细胞。将等份试样储存在-80℃，并且将一个等份试样用于起始在SC-U(含有2％葡萄糖)中的培养，在30℃下持续43小时。将这个培养物的一部分离心并悬浮于孵育培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中，在30℃下持续19小时30分钟。
通过离心获得细胞并用五体积的CelLyticTM Y细胞裂解试剂(Sigma)裂解。将裂解产物直接用于活性测试(UGT76G1_Sc)。
实施例35
UGT76G1_Sc用于将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷M的活性的测定
根据实施例34制得了UGT76G1_Sc。
使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mMMgCl2，使用200μL的裂解产物，用于莱鲍迪苷D的转化，以2mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。相应色谱描绘于图64中。
| 酶内部参照 | 莱鲍迪苷D转化<sup>1</sup>(反应时间) | 莱鲍迪苷M选择性<sup>1</sup> |
| UGT76G1_Sc | 85％(21小时) | 100％ |
注释：1基于莱鲍迪苷D的初始浓度
实施例36
酿酒酵母中UGTSL的体内产生
UGTSL[番茄](gi_460409128/XP_004249992.1)
上述氨基酸序列对于在酿酒酵母中的表达是密码子优化的。此外，在ATG起始密码子前，添加酵母共有序列AACACA。使用Hind III和Xba I限制位点，在pYES2载体中亚克隆合成基因。将pYES2_UGTSL_Sc载体用于转化化学感受态酿酒酵母INVSc1细胞(Invitrogen)。
将细胞生长于含有2％葡萄糖缺少尿嘧啶的固体合成最小培养基上，并且挑选单个克隆并使其在缺少尿嘧啶的液体合成最小培养基(含有2％葡萄糖的SC-U)中生长。离心后，用SC-U(含有2％葡萄糖)和60％甘油/水悬浮细胞。将等份试样储存在-80℃，并且将一个等份试样用于起始在SC-U(含有2％葡萄糖)中的培养，在30℃下持续43小时。将这个培养物的一部分离心并悬浮于孵育培养基(含有2％半乳糖的SC-U)中，在30℃下持续19小时30分钟。
通过离心获得细胞并用五体积的CelLyticTM Y细胞裂解试剂(Sigma)裂解。将裂解产物直接用于活性测试(UGTSL_Sc)。
实施例37
UGTSL_Sc用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性的测定
根据实施例36制得了UGTSL_Sc。使用50mM pH7.2的磷酸钠缓冲液中的0.5mM底物、2.5mM UDP-葡萄糖和3mM MgCl2，使用200μL的裂解产物，用于莱鲍迪苷A的转化，以2mL规模进行了活性测试。取样并通过HPLC分析。相应色谱描绘于图65中。
| 酶内部参照 | 莱鲍迪苷A转化<sup>1</sup>(反应时间) | 莱鲍迪苷D选择性<sup>1</sup> |
| UGTSL_Sc | 46％(4h.) | 42％ |
注释：1基于莱鲍迪苷A的初始浓度
实施例38
莱鲍迪苷M的分离
实施例14的产物混合物的量不足以通过制备性HPLC方法来分离。因此，使用一系列注入的分析性HPLC来分离混合物的组分。根据以上实施例14中所述的方法进行了分离，以提供对应于图5的HPLC痕迹中的两个主峰：级分A(停留时间24.165分钟)和级分B(停留时间31.325分钟)。
级分A的停留时间与reb D一致，表明是来自生物转化反应的未反应起始材料。
纯化的级分B的停留时间(图6)与reb M一致，表明了从reb D的成功生物转化。通过共同注入纯化的级分B与reb M标准品(获自PureCircle，图7中显示的reb M标准品的HPLC痕迹)来证实级分B中作为reb M收集的材料的性质。发现级分B和reb M标准品都在相同的停留时间洗脱(图8)，表明级分B是reb M。
通过NMR和HRMS也分开证实了级分B作为reb M的性质。为了取样，在旋转蒸发仪下浓缩级分B，冷冻干燥以及在40℃下干燥40小时。
将NMR样品溶解于氘代吡啶(C5D5N)中并使用标准脉冲顺序在Varian Unity Plus600MHz仪器上获取了质谱。将级分B的NMR谱与reb M的NMR谱相比。两个谱的重叠(图9)显示了级分B的峰与reb M的一致性。以下显示了reb M的NMR分配表：
C5D5Na-c中莱鲍迪苷M的1H和13C NMR谱数据
a基于COSY、HMQC和HMBC关联进行分配；b化学位移值以δ(ppm)计；c耦合常数以Hz计。
用配备了以正离子模式运行的电喷雾电离源的Waters Premier四极杆时间飞行(Q-TOF)质谱仪产生了HRMS(图10)。将样品溶解于甲醇中并在2:2:1的甲醇:乙腈:水中洗脱，并使用舱内注射泵通过输注引入。通过m/z 1313.5265的[M+Na]+加合物证实了reb M的存在，其对应于C56H90O33的分子式。
莱鲍迪苷D 莱鲍迪苷M
化学式：C50H80O28 化学式：C56H90O33
分子量：1128 分子量：1290
实施例39
Reb D2的分离和表征
粗反应样品。根据实施例22，用UGTSL(GI#460409128)制备用于分离的批号CB-2977-106的样品。
HPLC分析。使用Waters 2695 Alliance系统进行了初步HPLC分析，使用以下方法：Phenomenex Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；移动相A：水中0.0284％醋酸铵(NH4OAc)和0.0116％醋酸(HOAc)；移动相B：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过UV(210nm)和CAD来检测。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-8.5 | 75 | 25 |
| 10.0 | 71 | 29 |
| 16.5 | 70 | 30 |
| 18.5-24.5 | 66 | 34 |
| 26.5-29.0 | 48 | 52 |
| 31-37 | 30 | 70 |
| 38 | 75 | 25 |
用以下方法进行了半制备性纯化级分的分析：Waters Atlantis dC18，4.6×100mm，5μm(p/n 186001340)；移动相A：水中25％MeCN；移动相B：水中30％MeCN；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过CAD来检测。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
LC-MS。使用以负离子模式运行的Waters 3100质量检测仪，在WatersAutoPurification HPLC/MS系统上进行了半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用以下方法进行了样品的分析：Phenomenex Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；移动相A：水中0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；移动相B：MeCN；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过UV(210nm)和MSD(-ESI m/z 500-2000)来检测。梯度条件如上所列。
通过HPLC的分离。以两步进行了纯化。以下概述了用于半制备性纯化的第一种方法。柱：Waters Atlantis dC18，30×100mm，5μm(p/n 186001375)；移动相A：水中25％MeCN；移动相B：水中30％MeCN；流速：45mL/分钟；注入载量：20mL水中溶解的160mg。通过UV来检测(205nm)。
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
第二次纯化使用了相同的柱和条件，但使用了等度移动相：水中20％MeCN。
从天然提取物纯化。以三步进行了纯化。以下概括了用于制备性纯化的第一种方法。主要过程：Waters Symmetry C18，50×250mm，7μm(p/n WAT 248000)；等度移动相：水中50％甲醇(MeOH)，含有0.05％HOAc；流速：85mL/分钟；注入载量：溶解于50mL移动相中的6g粗提物。通过UV(210nm)来检测。靶分析物洗脱后，用水中85％MeOH冲洗柱。
第二种方法：Waters Symmetry Shield RP18，50×250mm，7μm(p/n WAT248000)；等度移动相：水中20％MeCN；流速：100mL/分钟；注入载量：溶解于30mL水中的0.5g第一级分。通过UV(210nm)来检测。
第三种方法：Waters Symmetry Shield RP18，50×250mm，7μm(p/n WAT248000)；等度移动相：水中20％MeCN；流速：100mL/分钟；注入载量：溶解于30mL水中的0.5g第二级分。通过UV(210nm)来检测。
MS和MS/MS。用配备了电喷雾电离源的Waters QT of Premier质谱仪来产生MS和MS/MS数据。通过负ESI分析样品。用H2O:乙腈(1:1)稀释样品50倍并使用舱内注射泵经由输注引入。将样品稀释，以产生良好的s/n，其出现在0.01mg/mL的合适浓度下。
NMR。通过将1-2mg溶解于150μL吡啶-d5中制备了样品并且在具有2.5mm逆检测探头的Bruker Avance 500MHz仪器上获取了NMR数据，使用。1H NMR谱参照残余溶剂信号(对于吡啶-d5，δH 8.74和δC 150.35)。
结果和讨论
分离和纯化。对根据实施例22使用UGTSL(GI#460409128)制备的批号CB-2977-106的甜菊醇糖苷混合物进行了分离。使用上述的方法，通过LC-MS分析了所述材料，并且结果提供于图11中。感兴趣的靶峰在TIC色谱图中的7.7分钟。这个峰的质谱提供了m/z 1127.6的[M-H]-。所提供的样品是使用以上提供的第一种方法条件以单次注入(160mg)初步制备的。这种方法将所述材料分成糖苷的“极性”和“非极性”混合物。然后使用以上的第二步条件再次处理“极性”混合物。半制备性HPLC痕迹提供于图12中。从这个半制备性集合，分离了具有纯度>99％的化合物(CAD，AUC)。级分分析提供于图13中。纯化后，通过在35℃下的旋转蒸发来浓缩合并的级分并冻干。获得大约1-2mg，用于表征。
质谱。通过灌输样品获得的ESI-TOF质谱显示了m/z 1127.4709的[M-H]-。[M-H]-离子的质量与分子式C50H80O28非常一致(计算为C50H79O28:1127.4758，误差：-4.3ppm)。MS数据证实了具有分子式C50H80O28的1128道尔顿的名义质量。
MS/MS谱(选择m/z 1127.5的[M-H]-离子，用于分裂)表明了m/z641.3187、479.2655和317.2065处的两个葡萄糖单体的丢失和三个葡萄糖部分的按序丢失。
NMR光谱测定。进行了一系列包括1H NMR(图14)、13C NMR(图15和16)、1H-1H COSY(图17)、HSQC-DEPT(图18)、HMBC(图19和20)和1D-TOCSY的NMR实验，以允许化合物的分配。
1H、1H-1H COSY、1H-13C HSQC-DEPT和1H-13C HMBC NMR数据表明了糖苷的中心核是双萜。在1H和1H-13C HSQC-DEPT谱中观察到的五个异头质子的存在证实了结构中的五个糖单体。1H-13C HSQC-DEPT谱中δC 69.9处的亚甲基13C共振表明了结构中1→6糖键的存在。使用1H-13C HMBC和1D-TOCSY关联分配了糖单体的键。
来自δH 1.29的甲基质子与δC 177.7的羰基的HMBC关联允许分配叔甲基基团之一(C-18)以及C-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始点。来自甲基质子(H-18)与δC38.9、45.0和57.8的碳的其他HMBC关联允许C-3、C-4和C-5的分配。1H-13C HSQC-DEPT数据的分析表明δC 38.9的碳是亚甲基基团，而δC 57.8的碳是次甲基，其分别被分配为C-3和C-5。剩下的δC 45.0的碳，其在HSQC-DEPT谱中没有显示出关联，被分配为季碳，C-4。使用HSQC-DEPT数据来分配C-3(δH 0.98和2j.36)和C-5(δH 1.04)的1H化学位移。H-3质子之一(δH0.98)和δH 1.43的质子之间的COSY关联允许分配H-2质子中的一个，其转而显示出与分配为C-1的δH 0.75的质子的关联。随后基于其他的COSY和HSQC-DEPT关联来分配针对C-1和C-2的剩余1H和13C化学位移并概括于下表中。
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，Reb D2的分配
在δH 1.30观察到的其他叔甲基单峰显示出与C-1和C-5的HMBC关联并且被分配为C-20。甲基质子显示出与季碳(δC 40.3)和次甲基碳(δC 54.5)(其分别被分配为C-10和C-9)另外的HMBC关联。H-5(δH 1.04)与δH 1.92和2.43之间的COSY关联随后允许分配H-6质子，其转而显示出与分配为C-7的δH 1.22和1.30的质子的关联。随后从HSQC-DEPT数据测定了针对C-6(δC 22.7)和C-7(δC 42.2)的13C化学位移。H-9(δH 0.88)与δH 1.65和1.69的质子之间的COSY关联允许分配H-11质子，其转而显示出与分配为H-12质子的δH 1.99和2.25的质子的COSY关联。随后将HSQC-DEPT数据用于分配C-11(δC 21.1)和C-12(δC 37.5)。来自H-12质子(δH 2.25)与δC 87.1和154.7的碳的HMBC关联分别允许分配C-13和C-16。在δH 5.01和5.64观察到的烯烃质子显示出与C-13的HMBC关联并被分配为C-17(经由HSQC-DEPT，δC105.2)。烯烃质子H-17和次甲基质子H-9显示出与分配为C-15的δC 48.3的碳的HMBC关联。来自H-9与δC 44.5的亚甲基碳的另外的HMBC关联随后允许C-14的分配。使用HSQC-DEPT数据分配了C-14(δH 1.80和2.65)和C-15(δH 1.31和2.04)的1H化学位移。
以下提供了用于分配糖苷配基区域的关键HMBC和COSY关联：
1H-13C HSQC-DEPT数据的分析证实了五个异头质子的存在。三个异头质子在1HNMR谱中的δH 6.02(δC 96.1)、5.57(δC 105.3)和5.34(δC 105.3)处得到了充分的分辨。通过1H-13C HSQC-DEPT数据鉴定了在δH 5.04(δC 105.6)和5.07(δC 98.7)观察到的剩余的两个异头质子，其在1H谱中被溶剂(HOD)共振遮掩了。在δH 6.02观察到的异头质子显示出与C-19的HMBC关联，这表明了其对应于GlcI的异头质子。相似地，在δH 5.07观察到异头质子显示出与C-13的HMBC关联，允许其被分配为GlcII的异头质子。
GlcI异头质子(δH 6.02)显示出与被分配为GlcI H-2的δH 4.07的质子的COSY关联，GlcI H-2转而显示出与δH 4.22(GlcI H-3)的质子的COSY关联，GlcI H-3显示出与δH4.12(GlcI H-4)的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许H-5或H-6质子的分配。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcI异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实了针对GlcI H-2至H-4的分配，1D-TOCSY数据显示出分配为GlcI H-5的δH 4.04的质子和分配为GlcI H-6质子之一的δH 4.68的质子。后一个质子也用于1D-TOCSY实验。使用几个不同混合时间的H-6的选择性照射也证实了GlcI H-1至H-5的分配以及H-6(δH 4.30)的剩余亚甲基质子。使用1H-13C HSQC-DEPT数据测定了针对GlcI C-2(δC 74.2)、C-3(δC 79.1)、C-4(δC 72.1)、C-5(δC 78.5)和C-6(δC 69.9)的13C化学位移的分配，以完成GlcI的分配。此外，1H-13C HSQC-DEPT谱中δC 69.9的亚甲基13C共振的存在表明了结构中GlcI的1→6糖键。
四个剩余的未分配葡萄糖部分中，一个基于1H-13C HSQC-DEPT、HMBC和1D-TOCSY关联被分配为GlcI的C-6的取代基。HSQC-DEPT谱中δC 69.9的亚甲基13C共振的相对低场位移表明了GlcI的1→6糖键。δH 5.04观察到的异头质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并被分配为GlcV的异头质子。相似地，GlcI的亚甲基质子表明了与GlcV的异头碳的HMBC关联，证实了GlcI和GlcV之间1→6糖键的存在。GlcV异头质子显示出与分配为GlcV H-2的δH 4.00的质子的COSY关联，GlcV H-2转而显示出与δH4.22(GlcV H-3)的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许基于GlcV H-3的COSY关联来分配GlcV H-4。然而，在HMBC谱中，GlcV H-3显示出与GlcV C-5(δC 78.9)的关联。在HSQC-DEPT中，GlcVC-5显示出与δH 3.89(GlcV H-5)的关联。GlcV H-5显示出与δH 4.21，4.37和4.48的COSY关联。在HSQC-DEPT谱中，δH 4.21显示出与δC 71.4(GlcV H-4)的关联，而δH 4.37和4.48显示出与δC 63.1的关联并分别被分配为GlcV H-6a和H-6b。使用1H-13C HSQC-DEPT数据确定了针对GlcV C-2(δC 75.7)和C-3(δC79.1)的13C化学位移的分配，以完成GlcV的分配。
针对C-19的糖苷的1H和13C化学位移的概述显示于下表中：
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，reb D2 C-19糖苷的分配
*异头质子被溶剂(HDO)共振遮掩。因此，没能测定耦合常数值。
#1H和13C值在位置Glc1-3、GlcV-3和GlcIV-3之间可以交换。
以下提供了用于分配C-19糖苷的关键HMBC、COSY和1D-TOCSY关联的概述。
以相似的方式进行了GlcII的分配。GlcII异头质子(δH 5.07)显示出与分配为GlcIIH-2的δH 4.37的质子的COSY关联，GlcII H-2转而显示出与δH 4.18(GlcII H-3)的质子的COSY关联。这后一质子显示出与δH 3.88(GlcII H-4)的质子的其他关联，其也显示出与δH3.79(GlcII H-5)的质子的COSY关联。GlcII H-5还显示出与GlcII H-6质子(δH 4.08和4.46)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据测定了针对GlcII C-2(δC 81.3)、C-3(δC 88.4)、C-4(δC71.1)、C-5(δC 77.9)和C-6(δC 63.2)的13C化学位移的分配。来自GlcII H-3至C-2和C-4以及还来自GlcII H-4至C-2和C-5的HMBC关联证实了以上进行的分配。GlcII H-4至GlcII C-6的其他HMBC关联进一步支持完成GlcII的分配。
基于HMBC关联，将剩余两个未分配的葡萄糖部分分配为GlcII的C-2和C-3的取代基。在δH 5.57观察到的异头质子显示出与GlcII C-2的HMBC关联并且被分配为GlcIII的异头质子。在δH 5.34观察到的异头质子显示出与GlcII C-3的HMBC关联并且被分配为GlcIV的异头质子。还观察到了来自GlcII H-2与GlcIII的异头碳以及来自GlcII H-3与GlcIV的异头碳的相互HMBC关联。
GlcIII的异头质子(δH 5.57)显示出与分配为GlcIII H-2的δH 4.19的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许H-3至H-6质子的分配。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcIII异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实针对GlcIII H-2的分配，1D-TOCSY数据显示δH 4.24(GlcIII H-3)、δH 4.27(GlcIII H-4)和δH 3.94(GlcIIIH-5)的质子。一旦使用1D-TOCSY数据分配H-4，将来自H-4与H-5以及转而与H-6的COSY关联用于分配H-6。在COSY谱中，GlcIII H-4显示出与GlcIII H-5的关联，其转而显示出分别与GlcIII H-6a和H-6b的δH 4.41和4.50的COSY关联。然后使用1H-13C HSQC-DEPT关联确定针对GlcIII C-2(δC 76.8)、C-3(δC 78.9)、C-4(δC 72.4)、C-5(δC 78.8)和C-6(δC 63.5)的13C化学位移，以完成GlcIII的分配。
GlcIV(δH 5.34)的异头质子显示出与分配为GlcIV H-2的δH 4.06的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许H-3至H-6质子的分配。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcIV异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实针对GlcIV H-2的分配，1D-TOCSY数据显示δH 4.22(GlcIV H-3)、δH 4.18(GlcIV H-4)和δH 4.10(GlcIV H-5)的质子。一旦使用1D-TOCSY数据分配H-4，将来自H-4与H-5以及转而与H-6的COSY关联用于分配H-6。在COSY谱中，GlcIV H-4显示出与GlcIV H-5的关联，其转而显示出分别与GlcIV H-6a和H-6b的δH 4.32和4.58的COSY关联。然后使用1H-13C HSQC-DEPT关联确定针对GlcIV C-2(δC 75.8)、C-3(δC 78.9)、C-4(δC 72.0)、C-5(δC 79.3)和C-6(δC 62.9)的13C化学位移，以完成GlcIV的分配。
针对C-13的糖苷的1H和13C化学位移的概述显示于下表中：
1H和13C NMR(500和125MHz，吡啶-d5)，Reb D2 C-13糖苷的分配
以下提供了用于分配C-13糖苷的关键HMBC、COSY和1D-TOCSY关联的概述：
NMR和MS分析允许以下所示结构的全部分配。化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]等效-16-贝壳杉烯-19-酸-[(6-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯](莱鲍迪苷D2或reb D2)。所述化合物是莱鲍迪苷D的异构体。
实施例40
Reb M2的分离和表征
粗反应样品。根据实施例22，用UGTSL(GI#460409128)制备用于分离的批号CB-2977-106的样品。
HPLC分析。使用Waters 2695Alliance系统进行了初步HPLC分析，使用以下方法：Phenomenex Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；移动相A：水中0.0284％醋酸铵(NH4OAc)和0.0116％醋酸(HOAc)；移动相B：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过UV(210nm)和CAD来检测。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
用以下方法进行了半制备性纯化级分的分析：Waters Atlantis dC18，4.6×100mm，5μm(p/n 186001340)；移动相A：水中25％MeCN；移动相B：水中30％MeCN；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过CAD来检测。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-8.5 | 75 | 25 |
| 10.0 | 71 | 29 |
| 16.5 | 70 | 30 |
| 18.5-24.5 | 66 | 34 |
| 26.5-29.0 | 48 | 52 |
| 31-37 | 30 | 70 |
| 38 | 75 | 25 |
LC-MS。使用以负离子模式运行的Waters 3100质量检测仪，在WatersAutoPurification HPLC/MS系统上进行了半合成甜菊醇糖苷混合物的初步分析。使用以下方法进行了样品的分析：Phenomenex Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；移动相A：水中0.0284％NH4OAc和0.0116％HOAc；移动相B：MeCN；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过UV(210nm)和MSD(-ESI m/z 500-2000)来检测。梯度条件如上所列。
通过HPLC的分离。以两步进行了纯化。以下概述了用于半制备性纯化的第一种方法。柱：Waters Atlantis dC18，30×100mm，5μm(p/n 186001375)；移动相A：水中25％MeCN；移动相B：水中30％MeCN；流速：45mL/分钟；注入载量：20mL水中溶解的160mg。通过UV来检测(205nm)。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-5.0 | 100 | 0 |
| 20 | 20 | 80 |
| 25 | 20 | 80 |
| 30 | 100 | 0 |
第二次纯化使用了相同的柱和条件，但使用了等度移动相：水中20％MeCN。
MS和MS/MS。用配备了电喷雾电离源的Waters QT of Premier质谱仪来产生MS和MS/MS数据。通过负ESI分析样品。用H2O∶MeCN(1∶1)稀释样品50倍并使用舱内注射泵经由输注引入。将样品稀释，以产生良好的s/n，其出现在0.01mg/mL的合适浓度下。
NMR。通过将～1.0mg溶解于150μL D2O中制备了样品并且在具有2.5mm.逆检测探头的Bruker Avance 500MHz仪器上获取了NMR数据。1H NMR和13C NMR谱分别参照残余溶剂信号HDO(δH4.79ppm)和TSP(δC0.00ppm)。
结果和讨论
分离和纯化。对根据实施例22使用UGTSL(GI#460409128)制备的批号CB-2977-106的甜菊醇糖苷混合物进行了分离。使用上述的方法(图11)，通过LC-MS分析了所述材料。感兴趣的靶峰在TIC色谱图中的4.1分钟。这个峰的质谱提供了m/z1289.7的[M-H]-。所提供的样品是使用以上提供的第一种方法条件以单次注入(160mg)初步制备的。这种方法将所述材料分成糖苷的“极性”和“非极性”混合物。然后使用以上的第二步条件再次处理“极性”混合物。半制备性HPLC痕迹显示于图12中。从这个半制备性集合，分离了具有纯度>99％的峰(CAD，AUC)。级分分析提供于图13中。纯化后，通过在35℃下的旋转蒸发来浓缩合并的级分并冻干。获得大约1mg。
质谱。通过灌输样品CC-00300获得的ESI-TOF质谱显示了m/z 1289.5266的[M-H]-。[M-H]-离子的质量与预期为reb M2的分子式C56H90O33非常一致(计算为C56H89O33:1289.5286，误差：-1.6ppm)。MS数据证实了CC-00300具有分子式C56H90O33的1290道尔顿的名义质量。
MS/MS谱(选择m/z 1289.5的[M-H]-离子，用于分裂)表明了m/z 803.3688的三个葡萄糖单体的丢失以及m/z 641.3165、479.2633和317.2082的三个葡萄糖部分的按序丢失。
NMR光谱测定。进行了一系列包括1H NMR(图21)、13C NMR(图22和23)、1H-1H COSY(图24)、HSQC-DEPT(图25)、HMBC(图26和27)和1D-TOCSY的NMR实验，以允许reb M2的分配。
1H、1H-1H COSY、1H-13C HSQC-DEPT和1H-13C HMBC NMR数据表明了糖苷的中心核是双萜。在1H和1H-13C HSQC-DEPT谱中观察到的六个异头质子的存在证实了结构中的六个糖单体。1H-13C HSQC-DEPT谱中δC 70.9处的亚甲基13C共振表明了结构中1→6糖键的存在。使用1H-13C HMBC和1D-TOCSY关联分配了糖单体的键。
来自δH 1.29的甲基质子与δC 181.5的羰基的HMBC关联允许分配叔甲基基团之一(C-18)以及C-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始点。来自甲基质子(H-18)与δC39.8、43.7和59.2的碳的其他HMBC关联允许C-3、C-4和C-5的分配。1H和1H-13C HSQC-DEPT数据的分析表明δC 39.8的碳是亚甲基基团，而δC 59.2的碳是次甲基，其分别被分配为C-3和C-5。剩下的δC 43.7的碳，其在HSQC-DEPT谱中没有显示出关联，被分配为季碳，C-4。使用HSQC-DEPT数据来分配C-3(δH 1.16和2.28)和C-5(δH 1.24)的1H化学位移。H-3质子之一(δH1.16)和δH 1.49的质子之间的COSY关联允许分配H-2质子中的一个，其转而显示出与分配为C-1的δH 0.92的质子的关联。随后基于其他的COSY和HSQC-DEPT关联来分配针对C-1和C-2的剩余1H和13C化学位移并概括于下表中。
1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)，Reb M2糖苷配基的分配
在δH 0.92观察到的其他叔甲基单峰显示出与C-1和C-5的HMBC关联并且被分配为C-20。甲基质子显示出与季碳(δC 42.4)和次甲基(δC 55.5)(其分别被分配为C-10和C-9)另外的HMBC关联。H-5(δH 1.24)与δH 1.73和1.94之间的COSY关联随后允许分配H-6质子，其转而显示出与分配为C-7的δH 1.49和1.56的质子的关联。随后从HSQC-DEPT数据测定了针对C-6(δC 24.4)和C-7(δC 44.2)的13C化学位移。H-9(δH 1.09)与δH 1.66和1.70的质子之间的COSY关联允许分配H-11质子，其转而显示出与分配为H-12质子的δH 1.60和2.00的质子的COSY关联。随后将HSQC-DEPT数据用于分配C-11(δC 22.6)和C-12(δC 39.9)。在δH 4.98和5.16观察到的烯烃质子显示出与C-13(δC 90.9)的HMBC关联并被分配为C-17(经由HSQC-DEPT，δC107.0)。烯烃质子H-17显示出与分配为C-15的δC 49.4的碳的HMBC关联。来自H-9与δC 46.9的亚甲基碳的另外的HMBC关联随后允许C-14的分配。使用HSQC-DEPT数据分配了C-14(δH 1.53和2.21)和C-15(δH 2.15和2.18)的1H化学位移。
以下提供了用于分配糖苷配基区域的关键HMBC和COSY关联的概述：
1H-13C HSQC-DEPT数据的分析证实了六个异头质子的存在。三个异头质子在1HNMR谱中的δH 5.65(δC 95.5)、4.92(δC 104.9)和4.50(δC 105.7)处得到了充分的分辨。在δH4.85(δC 98.4)、4.84(δC 105.0)和4.83(δC 105.3)观察到的剩余的三个异头质子被1H谱中的残余溶剂共振重叠了。在δH 5.65观察到的异头质子显示出与C-19的HMBC关联，这表明了其对应于GlcI的异头质子。相似地，在δH 4.85观察到异头质子显示出与C-13的HMBC关联，允许其被分配为GlcII的异头质子。
GlcI异头质子(δH 5.65)显示出与分配为GlcI H-2的δH 3.96的质子的COSY关联，GlcI H-2转而显示出与δH 3.89(GlcI H-3)的质子的COSY关联，GlcI H-3显示出与δH 3.71(GlcI H-4)的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许H-5或H-6质子的分配。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcI异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实了针对GlcI H-2至H-4的分配，1D-TOCSY数据显示出分配为GlcI H-5的δH3.73的质子和分配为GlcI H-6质子之一的δH 4.15的质子。后一个质子也用于1D-TOCSY实验。使用几个不同混合时间的H-6的选择性照射也证实了GlcI H-1至H-5的分配以及H-6(δH4.00)的剩余亚甲基质子。使用1H-13C HSQC-DEPT数据确定了针对GlcI C-2(δC 80.5)、C-3(δC 79.0)、C-4(δC 71.5)、C-5(δC 79.0)和C-6(δC 70.9)的13C化学位移的分配，以完成GlcI的分配。此外，1H-13C HSQC-DEPT谱中δC 70.9的亚甲基13C共振的存在表明了结构中GlcI的1→6糖键。
两个未分配的葡萄糖部分基于HMBC关联被分配为GlcI的C-2和C-6的取代基。δH4.83观察到的异头质子显示出与GlcI C-2的HMBC关联并被分配为GlcV的异头质子。δH 4.50观察到的异头质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并被分配为GlcVI的异头质子。还观察到了来自GlcI H-2与GlcV的异头质子和来自GlcI H-6与GlcVI的异头质子的相互HMBC关联。
GlcV的异头质子(δH 4.83)显示出与分配为GlcV H-2的δH 3.32的质子的COSY关联。GlcV H-2转而显示出与δH 3.51(GlcV H-3)的质子的COSY关联。这后一质子显示出与δH3.38(GlcV H-4)的质子的其他关联。H-4也显示出与δH 3.55(GlcV H-5)的COSY关联，而GlcVH-5转而显示出与GlcV H-6质子(δH 3.76和3.97)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据确定了针对GlcV C-2(δC 78.5)、C-3(δC 78.7)、C-4(δC 72.9)、C-5(δC 78.8)和C-6(δC 63.6)的13C化学位移的分配。来自GlcV H-3与C-2和C-4以及还来自GlcV H-4与C-3和C-6的HMBC关联证实了以上进行的分配，以完成GlcV的分配。
基于1H-13C HSQC-DEPT和HMBC关联，将另一个葡萄糖部分分配为GlcI的C-6的取代基。HSQC-DEPT谱中δC 70.9的GlcI的亚甲基13C共振的相对低场位移表明GlcI的1→6糖键。在δH 4.50观察到的异头质子显示出与GlcI C-6的HMBC关联并且被分配为GlcVI的异头质子。相似地，GlcI的亚甲基质子显示出与GlcVI的异头碳的HMBC关联，并且这证实了GlcI与GlcVI之间的1→6糖键的存在。GlcVI异头质子显示出与分配为GlcVI H-2的δH 3.33的质子的COSY关联，GlcVI H-2转而显示出与δH 3.49的质子(GlcVI H-3)的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许基于COSY关联分配GlcV H-4至H-6。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcVI异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实了针对GlcVI H-2至H-3的分配，1D-TOCSY数据显示了δH 3.45(GlcVI H-4)和δH 3.48(GlcVI H-5)的质子以及分配为GlcVI H-6质子的δH 3.92和3.94的质子。使用1H-13C HSQC-DEPT数据确定了针对GlcVI C-2(δC 78.1)、C-3(δC 78.6)、C-4(δC 72.3)、C-5(δC 78.8)和C-6(δC 64.1)的13C化学位移的分配，以完成GlcVI的分配。
针对C-19的糖苷的1H和13C化学位移的概述显示于下表中：
Reb M2糖苷的H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)分配
*1H和13C值可以与下表的GlcIV-1交换。
以下提供了用于分配C-19糖苷区域的关键HMBC、COSY和1D-TOCSY关联的概述：
Reb M2糖苷的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR(125MHz，D2O/TSP)
分配
以相似的方式进行了GlcII的分配。GlcII异头质子(δH 4.85)显示了与分配为GlcIIH-2的δH 3.75的质子的COSY关联，GlcII H-2转而显示出与δH 3.98的质子(GlcII H-3)的COSY关联。这后一质子显示出与δH 3.54的质子(GlcII H-4)的其他关联。H-4还显示出与δH3.96的质子(GlcII H-5)的COSY关联。GlcII H-5还显示出与GlcII H-6质子(δH 3.77和3.45)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据确定了针对GlcII C-2(δC 81.7)、C-3(δC 88.0)、C-4(δC71.3)、C-5(δC 80.5)和C-6(δC 63.6)的13C化学位移的分配。来自GlcII H-3与C-2和C-4以及还来自GlcII H-4与C-3和C-6的HMBC关联证实了以上进行的分配，以完成GlcII的分配。
剩余的两个未分配葡萄糖部分基于HMBC关联被分配为GlcII的C-2和C-3的取代基。在δH 4.92观察到的异头质子显示出与GlcII C-2的HMBC关联并且被分配为GlcIII的异头质子。在δH 4.84观察到的异头质子显示出与GlcII C-3的HMBC关联并且被分配为GlcIV的异头质子。还观察到了GlcII H-2与GlcIII异头碳之间以及GlcII H-3与GlcIV的异头碳之间的相互HMBC关联。
GlcIII的异头质子(δH 4.92)显示出与分配为GlcIII H-2的δH 3.32的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许H-3至H-6质子的分配。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcIII异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D-TOCSY实验。除了证实了针对GlcIIIH-2的分配，1D-TOCSY数据显示了δH 3.51(GlcIII H-3)、δH 3.26(GlcIII H-4)和δH 3.44(GlcIII H-5)的质子。一旦使用1D-TOCSY数据分配了H-4，将来自H-4与H-5并且转而与H-6的COSY关联用于分配H-6。在COSY谱中，GlcIII H-4显示出与GlcIII H-5的关联，GlcIII H-5转而显示出分别与δH 3.94和3.75的GlcIII H-6a和GlcIII H-6b的COSY关联。使用1H-13C HSQC-DEPT关联确定了针对GlcIII C-2(δC 76.3)、C-3(δC 78.8)、C-4(δC 73.3)、C-5(δC 78.8)和C-6(δC 64.4)的13C化学位移，以完成GlcIII的分配。
显示出与δH 3.41的质子的COSY关联的GlcIV(δH 4.84)的异头质子被分配为GlcIVH-2，其转而显示出与δH 3.46的质子(GlcIV H-3)的COSY关联。这后一质子显示出与δH 3.45的质子(GlcIV H-4)的其他关联，GlcIV H-4还显示出与δH 3.75的质子(GlcIV H-5)的COSY关联。GlcIV H-5还显示出与GlcIV H-6质子(δH 3.55和3.78)的COSY关联。使用HSQC-DEPT数据确定了针对GlcIV C-2(δC 76.1)、C-3(δC 78.8)、C4(δC 72.5)、C-5(δC 81.7)和C-6(δC65.8)的13C化学位移的分配。来自GlcIV H-3与C-4和C-5以及还来自GlcIV H-4与C-3和C-6的HMBC关联证实了以上进行的分配，以完成GlcIV的分配。
针对C-13的糖苷的1H和13C化学位移的概述显示于下表中：
Reb M2糖苷的1H NMR(500MHz，D2O)和13C NMR
(125MHz，D2O/TSP)分配
以下提供了用于分配C-13糖苷区域的关键HMBC、COSY和1D-TOCSY关联的概述：
NMR和MS分析允许以下所示结构的全部分配。化合物的化学名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)氧]等效-16-贝壳杉烯-19-酸-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-6-O-β-D-吡喃葡糖基-β-D-吡喃葡糖基)酯](莱鲍迪苷M2或reb M2)。所述化合物是莱鲍迪苷M的异构体。
实施例41
UGT76G1用于将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X的定向进化(第2轮)
选择来自第一轮UGT76G1定向进化的最有活性克隆(参见实施例26含有突变Q266E_P272A_R334K_G348P_L379G的UGT76G1var94)作为用于第2轮的基线克隆。建立了含有来自第一轮不同鉴定的正突变和通过DNA2.0 ProteinGPStm策略获得的新突变的53个突变列表。随后将这个突变列表用于设计各自含有3个不同突变的92个变体基因。针对在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UTG76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。用加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中的100μL新鲜裂解产物来进行活性测试。
使反应在30℃下运行并且在2、4、7和24小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X所述的分析方法，通过HPLC(CAD检测)来测定转化和初始速率。平行地，用基线克隆第1轮-Var94进行了实验。将针对这个基线克隆的22小时后的转化和初始速率限定为100％并且针对第2轮克隆的标准化转化和初始速率描绘于下表中：
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于来自第一轮UGT76G1定向进化的变体94，位置33的丙氨酸突变成甘氨酸注释为Round1-Var94(A33G)。
这些结果的建模允许获得每个突变的作用的分级。确定以下突变对于活性是有益的：S42A、F46I、I190L、S274G、I295M、K303G、F314S、K316R、K393R、V394I、I407V、N409K、N409R、Q425E、Q432E、S447A、S456L。
实施例42
AtSUS的体内生产
AtSUS
>gi|79328294|ref|NP_001031915.1∣蔗糖合成酶1[拟南芥]
将AtSUS的合成基因针对大肠杆菌中的表达密码子优化并使用NdeI和XhoI限制位点在pET30a+质粒中亚克隆。将含有AtSUS的pET30A+载体用于转化电感受态大肠杆菌Bl21(DE3)细胞。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞生长于皮氏培养皿中，并选择合适的克隆，使其在液体LB培养基中生长(锥形烧瓶)。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下
将含有pET30A+_AtSUS质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入30mL LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。使这个培养物在135rpm和30℃下振荡8小时。
生产培养基含有60g/L过夜表达已配制好的TB培养基(Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。将预培养物加入800mL这个培养基中，并且使溶液在20℃下搅拌，同时取样来测量OD和pH。培养物获得了良好的生长并获得了良好的OD。40h后，通过离心收集细胞并冷冻，以获得30.1g的细胞湿重。
用1.0mL的50mM Tris缓冲液pH7.5中的200mg细胞的细胞悬浮液，通过Fastprep(MP Biomedicals，裂解基质B，速度6.0，3×40秒钟)进行了裂解。通过离心收集裂解产物并新鲜使用。
实施例43
使用UGTSL2、UGT76G1-R1-F12和AtSUS，用原位制备的UDP-葡萄糖，将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷X
使用磷酸钾缓冲液(50mM终浓度，pH 7.5)中的100mM蔗糖、3mM的MgCl2、0.25mMUDP和0.5mM莱鲍迪苷A，以1mL规模进行了反应。通过添加15μL UGTSL2(参见实施例27)裂解产物(2U/mL)、150μL UGT76G1var94(参见实施例26)(2.5U/mL)和15μL AtSUS(参见实施例42)(400U/mL)，来启动反应。用10μL 2N H2SO4和115μL 60％甲醇骤冷125μL样品后，反应接着是HPLC。21小时反应时间后，获得了68％莱鲍迪苷X和26％莱鲍迪苷M2，如图66中所示。
实施例44
UGT76G1用于将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X的定向进化(第3轮)选择来自第二轮的UGT76G1定向进化的最有活性克隆(参见实施例41含有突变S42A_F46I_I407V的第2轮_UGT76G1var66)作为用于第3轮的基线克隆。建立了含有从第二轮不同鉴定的正突变和通过DNA2.0ProteinGPStm策略获得的30个新突变的56个突变列表。将这个突变列表随后用于设计各自含有3或4个不同突变的92个变体基因。针对在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UGT76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。用加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中的100μL新鲜裂解产物来进行活性测试。
使反应在30℃下运行并且在1、2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X所述的分析方法，通过HPLC(CAD检测)来测定转化和初始速率。平行地，用基线克隆第2轮-Var66进行了实验。将针对这个基线克隆的22小时后的转化和初始速率限定为100％并且针对第3轮克隆的标准化转化和初始速率描绘于下表中：
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于来自第二轮UGT76G1定向进化的变体66，位置190的异亮氨酸突变成亮氨酸注释为第2轮-Var66(I190L)。
这些结果的建模允许获得每个突变的作用的分级。确定以下突变对于活性是有益的：I46L、I295M、S119A、S274G、K334R、F314S、K303G、K316R、K393R、I190L、Q425E、Q432E、N138G、V394I、F182L、V407I、A272P、V264C、E449D、A352G。
实施例45
UGTSL2用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的定向进化(第1轮)
从天然酶UGTSL2(GI_460410132)开始，建立了含有从第一轮不同鉴定的正突变和通过DNA2.0 ProteinGPStm策略获得的新突变的60个突变列表。将这个突变列表随后用于设计各自含有3个不同突变的92个变体基因。针对在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UGTSL2var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。用加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中的100μL新鲜裂解产物来进行活性测试。
使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D所述的分析方法，通过HPLC(CAD检测)来测定转化和初始速率。平行地，用基线克隆UGTSL2进行了实验。将针对这个基线克隆的初始速率限定为100％。作为克隆特异性的指示，在100％UDP-葡萄糖转化下测定了莱鲍迪苷M2含量，并且在50％UDP-葡萄糖转化下测定了莱鲍迪苷D2含量。其中将UDP葡萄糖转化限定为：([Reb D]/[Reb A]0)+([Reb D2]/[Reb A]0)+2*([Reb M2]/[Reb A]0)。
下表中描述了100％UDP-葡萄糖转化下的标准化初始速率、莱鲍迪苷M2含量和50％UDP-葡萄糖转化下的莱鲍迪苷D2含量。
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于UGTSL2，位置240的异亮氨酸突变成亮氨酸，注释为UGTSL2(I240L)
这些结果的建模允许获得每个突变的作用的分级。确定以下突变对于活性是有益的：L276A、T392A、Q27R、N278G、T329V、A341V、I333L、G387E、H247P、M354L、A285V、V270I、N325S、I240L、F253Y、A285L、I352V。
确定以下突变对于较低的莱鲍迪苷M2形成是有益的：Q27R、N325S、G387E、I333L、H247P、T329I、R312L、T199S、E259G、S334T、I131V、A285L、I389L、L393V、V254L、N339S、I345L、T245R。
实施例46
使用UGT76G1将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷I
使用UGT76G1-R1-F12(也称为UGT76G1var94)进行了反应(参见实施例26))。
反应总体积为40mL，具有以下组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.5，3mM MgCl2，2.5mMUDP-葡萄糖，0.5mM莱鲍迪苷A和4mL UGT76G1-1-F12裂解产物(2.5U/mL)。在135rpm的轨道振荡器上在30℃下运行反应。为了取样，用10μL 2N H2SO4和115μL甲醇/水(7/3)骤冷125μL反应混合物。立即将样品离心并且在通过LC-MS分析前保持在10℃。使用了Agilent 1200系列HPLC系统，其配备了双泵(G1312B)、自动取样机(G1367D)、恒温柱室(G1316B)、DAD检测仪(C1315C)，连接Agilent 6110A MSD，并与“LC/MSD Chemstation”软件配合。
仪器条件
移动相梯度方案
| 时间(分钟) | A(％)：甲酸0.1％ | B(％)：乙腈 |
| 0 | 76 | 24 |
| 8.5 | 76 | 24 |
| 10.0 | 71 | 29 |
| 16.5 | 70 | 30 |
获得了图67a中显示的反应特征：
42小时反应后，用20mL乙醇骤冷20mL的反应混合物并用于结构说明。
以相似的方式，针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷I，测试了UGT76G1定向进化第2轮(UGT76G1-R2-B9，以上鉴定为“第2轮-Var66”，参见实施例41)和第3轮(UGT76G1-R3-G3，以上鉴定为“第3轮-Var21”，参见实施例44)的最佳克隆以及天然UGT76G1(参见实施例26)，并且测定了图67b中显示的活性。
实施例47
RebI的分离和表征
粗反应样品。根据实施例46，用UGT76G1制备用于分离的批号CB-2977-198的样品。
HPLC分析。使用Waters 2695Alliance系统进行了初步HPLC分析，使用以下方法：Phenomenex Synergi Hydro-RP，4.6×250mm，4μm(p/n 00G-4375-E0)；柱温：55℃；移动相A：水中0.0284％NH4OAc和0.0116％醋酸；移动相B：乙腈(MeCN)；流速：1.0mL/分钟；注入体积：10μL。通过UV(210nm)和CAD来检测。
梯度：
| 时间(分钟) | ％A | ％B |
| 0.0-8.5 | 75 | 25 |
| 10.0 | 71 | 29 |
| 16.5 | 70 | 30 |
| 18.5-24.5 | 66 | 34 |
| 26.5-29.0 | 48 | 52 |
| 31-37 | 30 | 70 |
| 38 | 75 | 25 |
通过HPLC分离。
使用Waters Atlantis dC18(30×100mm，5μm，p/n 186001375)柱进行了纯化，使用80:20水/MeCN的等度移动相条件。将流速保持在45mL/分钟并且注入载量为180mg。将检测仪波长设定在210nm。
使用Waters Atlantis dC18(4.6×150mm，5μm，p/n 186001342)柱，进行了级分的分析；移动相A：水；移动相B：MeCN；流速：1mL/分钟；等度移动相条件：75:25A/B，持续30分钟。
MS和MS/MS。用配备了电喷雾电离源的Micro质谱仪的Waters QT产生了MS和MS/MS。通过负ESI分离了样品。用H2O:MeCN(1:1)将样品稀释至0.25mg/mL的浓度并且经由流动注入引入，用于MS数据获取。将样品进一步稀释至0.01mg/mL，产生良好的s/n，以针对MS/MS调整，并通过直接输注来获取。将碰撞能量设定为60V，以获取MS/MS数据，其由于分子的性质，具有提高的碎片离子峰。
NMR。通过将～1.0mg溶解于180μL吡啶-d5+TMS中来制备样品，并且在BrukerAvance 500MHz仪器上获取NMR数据，使用2.5mm反向探头或5mm宽频带探头。在RensselaerPolytechnic Institute，分别使用其具有5mm冷冻探头的Bruker Avance 600MHz和800MHz仪器，获取了13C和HMBC NMR数据。将1H和13C NMR谱参照TMS共振(δH 0.00ppm和δC 0.0ppm)。
使用批号CB-2977-198的半合成甜菊醇糖苷混合物，进行了Reb I的分离。按照以上所述的，通过HPLC分析了所述材料。在大约17min的停留时间(tR)，观察到了Reb I峰，如图28中所示。
结果和讨论
按照以上所述的，从反应粗制物分离了reb I峰，并显示于图29中。将分离的级分合并并冻干。如使用上述方法的LC-CAD证实的，终产物的纯度为91％(图30)。提供了大约1mg的RebI，用于分光镜和光谱分析。
质谱。通过灌输reb I的样品获取的ESI-TOF质谱显示出m/z 1127.4741的[M-H]-(图31)。[M-H]-离子的质量与预期为reb I的分子式C50H79O28非常一致(计算为C50H79O28:1127.4758，误差：-1.5ppm)(图32)。MS数据证实了reb I具有分子式C50H80O28的1128道尔顿的名义质量。
reb I的MS/MS谱(选择m/z 1127.4的[M-H]-离子，用于分裂)表明了m/z 803.5301的两个糖单体的丢失，然而使用30V碰撞能量没有显示出其他分裂(图33)。应用较高的碰撞能量时(60V)(图34)，没有观察到亲本离子，但从m/z 803.5301观察到m/z 641.4488、479.3897和317.3023的三个糖单体的按序丢失。
NMR光谱测定。进行了一系列包括1H NMR(图35-37)、13C NMR(图38-39)、1H-1H COSY(图40)、HSQC-DEPT(图41)、HMBC(图42-43)、NOESY(图44-45)和1D-TOCSY(图46-50)的NMR实验，以允许reb I的分配。
在300K获取的reb I的1H NMR谱中(图35)，异头质子之一被水共振完全遮掩。因此，在较低温度(292K)下获取了样品的1H NMR谱，以移出水共振，并且在该温度下，足以分辩异头质子(图36-37)。因此，在292K下获取了reb I的所有其他NMR数据。
1D和2D NMR数据表明了糖苷的中心核是双萜。来自δH 1.22的甲基质子与δC 176.9的羰基的HMBC关联允许分配叔甲基基团之一(C-18)以及C-19并且提供了用于分配剩余的糖苷配基的起始点。来自甲基质子(H-18)与δC 38.5、44.0和57.2的碳的其他HMBC关联允许C-3、C-4和C-5的分配。1H-13C HSQC-DEPT数据的分析表明δC 38.5的碳是亚甲基基团，而δC57.2的碳是次甲基，其分别被分配为C-3和C-5。剩下的δC 44.0的碳，其在HSQC-DEPT谱中没有显示出关联，被分配为季碳，C-4。使用HSQC-DEPT数据来分配C-3(δH 1.02和2.35)和C-5(δH 1.03)的1H化学位移。H-3质子之一(δH 1.02)和δH 1.44的质子之间的COSY关联允许分配H-2质子中的一个，其转而显示出与分配为H-1的δH 0.74的质子的关联。随后基于其他的COSY和HSQC-DEPT关联来分配针对C-1和C-2的剩余1H和13C化学位移并概括于下表中。
1H和13C NMR(500和150MHz，吡啶-d5)，莱鲍迪苷I糖苷配基的分配
在δH 1.26观察到的其他叔甲基单峰显示出与C-1和C-5的HMBC关联并且被分配为H-20。甲基质子显示出与季碳(δC 39.8)和次甲基碳(δC 54.1)(其分别被分配为C-10和C-9)另外的HMBC关联。H-5(δH 1.03)与δH 1.90和2.33之间的COSY关联随后允许分配H-6质子，其转而显示出与分配为H-7的δH 1.29和1.31的质子的关联。随后从HSQC-DEPT数据测定了针对C-6(δC 22.2)和C-7(δC 41.7)的13C化学位移。H-9(δH 0.88)与δH 1.67和1.70的质子之间的COSY关联允许分配H-11质子，其转而显示出与分配为H-12质子的δH 1.98和2.28的质子的COSY关联。随后将HSQC-DEPT数据用于分配C-11(δC 20.5)和C-12(δC 37.3)。在δH 5.02和5.67观察到的烯烃质子显示出与δC 86.7(C-13)的季碳的HMBC关联并被分配为H-17(经由HSQC-DEPT，δC 104.8)。次甲基质子H-9显示出分别与分配为C-8、C-14和C-15的δC 42.3、44.3和47.6的碳的HMBC关联。使用HSQC-DEPT数据分配了C-14(δH 1.78和2.59)和C-15(δH2.04)的1H化学位移。来自H-9与C-11和H-12与C-9的其他HMBC关联进一步证实了以上进行的分配。从H-14与δC 154.0的季碳观察到的HMBC关联允许C-16的分配，以完成中心核的分配。
将NOESY谱中观察到的关联用于分配中心双萜核的相对立体化学。在NOESY谱中，在H-14和H-20之间观察到了NOE关联，表明H-14和H-20位于环的同一面上。相似地，在H-9和H-5以及H-5和H-18之间观察到了NOE关联。没有观察到H-9和H-14之间的NOE关联。因此NOESY数据表明H-5、H-9和H-18与H-14和H-20比较在环的相对面上，如下图中呈现的。这些数据因此表明在糖基化步骤过程中保留了中心核中的相对立体化学。
针对reb I的1H-13C HSQC-DEPT的分析证实了五个异头质子的存在。所有五个异头质子在292K下获取的谱中在δH 6.14(δC 95.3)、5.57(δC 104.6)、5.38(δC 104.7)、5.29(δC105.0)和5.06(δC 98.0)都能分辨。另外，所有五个异头质子具有大的耦合(7.7Hz-8.2Hz)，表明它们具有β-构造。在δH 6.14观察到的异头质子显示出与C-19的HMBC关联，这表明了其对应于GlcI的异头质子。相似地，在δH 5.06观察到的异头质子显示了与C-13的HMBC关联，允许其分配为GlcII的异头质子。
GlcI异头质子(δH 6.14)显示出与分配为GlcI H-2的δH 4.18的质子的COSY关联。由于数据重叠，COSY谱没有允许分配H-3或H-4。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcI异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D TOCSY实验(图46)。除了证实了针对GlcI H-2的分配，TOCSY数据显示出分别分配为H-3、H-4和H-5的δH 4.27、4.25和3.93的质子。在TOCSY谱中δH 4.37观察到的质子被分配为GlcI H-6质子之一。基于来自H-5与δH 4.27的COSY关联，分配了δH 4.27的其他H-6亚甲基质子。使用HSQC-DEPT数据分配了针对GlcI C-2(δC72.5)、C-3(δC 89.4)、C-4(δC 69.2)、C-5(δC 78.2-78.8)和C-6(δC 61.7)的13C化学位移。来自H-1与C-3和H-4与C-6的HMBC关联进一步证实了以上进行的分配，以完成GlcI的分配。
在四个剩余未分配的葡萄糖部分中，基于HMBC关联，将一个分配为GlcI的C-3的取代基。在δH 5.29观察到的异头质子显示出与GlcI C-3的HMBC关联并且被分配为GlcV的异头质子。还观察到了来自GlcI H-3与GlcV的异头碳的相互HMBC关联。
下表显示了针对C-19的糖苷的1H和13C化学位移的概述：
莱鲍迪苷I C-19糖苷的1H和13C NMR(500和150MHz，吡啶-d5)分配
以下提供了用于分配C-19糖苷区的关键HMBC和COSY关联的概述。
GlcV的异头质子(δH 5.29)显示出与分配为GlcV H-2的δH 4.04的质子的COSY关联。随后使用HSQC-DEPT数据来分配GlcV C-2(δC 75.3或75.5)。由于数据重叠，COSY谱没有允许分配剩余的质子。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcV异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D TOCSY实验(图47)。除了证实了针对GlcV H-2的分配，TOCSY数据允许分配GlcV H-3(δH 4.27)、H-4(δH 4.12)和H-5(δH 4.05)。在TOCSY谱中δH 4.56观察到的质子被分配为GlcV H-6质子之一。基于来自H-5与δH 4.26的COSY关联，分配了δH 4.26的其他H-6亚甲基质子。使用HSQC-DEPT数据分配了针对GlcV C-3(δC 78.2-78.6)、C-4(δC 71.5或71.6)、C-5(δC 78.5或78.6)和C-6(δC 62.3或62.4)的13C化学位移，以完成GlcV的分配。
以相似的方式进行了GlcII的分配。GlcII异头质子(δH 5.06)显示出与分配为GlcIIH-2的δH 4.34的质子的COSY关联，其转而显示出与δH 4.20(GlcII H-3)的质子的COSY关联，GlcII H-3显示出与δH 3.97(GlcII H-4)的质子的其他关联，GlcII H-4还显示出与δH 3.80(GlcII H-5)的质子的COSY关联。H-5显示出与分配为H-6的δH 4.18和4.49的质子的其他COSY关联。还使用几个不同的混合时间，使用GlcII异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D TOCSY实验(图48)。TOCSY数据证实了以上的质子分配。针对GlcII C-2(δC 80.2)、C-3(δC87.5)、C-4(δC 70.1)、C-5(δC 77.6)和C-6(δC 62.5)的13C化学位移的分配是基于HSQC-DEPT数据。来自GlcII H-3与C-2和C-4以及还来自GlcII H-4与C-3、C-5和C-6的HMBC关联证实了以上进行的分配，以完成GlcII的分配。
基于HMBC关联，将剩余的两个未分配的葡萄糖部分分配为GlcII的C-2和C-3的取代基。在δH 5.57观察到的异头质子显示出与GlcII C-2的HMBC关联并且被分配为GlcIII的异头质子。在δH 5.38观察到的异头质子显示出与GlcII C-3的HMBC关联并且被分配为GlcIV的异头质子。还观察到了来自GlcII H-2与GlcIII的异头碳以及来自GlcII H-3与GlcIV的异头碳的相互HMBC关联。
GlcIII的异头质子(δH 5.57)显示出与分配为GlcIII H-2的δH 4.21的质子的COSY关联。然后使用HSQC-DEPT数据来分配GlcIII C-2(δC76.3)。由于数据重叠，COSY谱没有允许分配剩余的质子。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcIII异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D TOCSY实验(图49)。除了证实了针对GlcIII H-2的分配，TOCSY数据允许分配GlcIII H-3(δH 4.27)、H-4(δH 4.25)和H-5(δH 3.94)。在TOCSY谱中δH 4.41和δH 4.53观察到的质子被分配为GlcIII H-6质子。使用HSQC-DEPT数据分配了针对C-3(δC 78.2-78.6)、C-4(δC72.1)、C-5(δC 78.2-78.8)和C-6(δC 63.1)的13C化学位移。来自H-5与δC 63.1的碳的HMBC关联进一步证实了GlcIII C-6的分配，以完成GlcIII的分配。
GlcIV的异头质子(δH 5.38)显示出与分配为GlcIV H-2的δH 4.01的质子的COSY关联。然后使用HSQC-DEPT数据来分配GlcIV C-2(δC 75.3或75.5)。由于数据重叠，COSY谱没有允许分配剩余的质子。因此，使用几个不同的混合时间，使用GlcIV异头质子的选择性照射，进行了一系列的1D TOCSY实验(图50)。除了证实了针对GlcIV H-2的分配，1D TOCSY数据允许分配H-3(δH 4.28)、H-4(δH 4.11)、H-5(δH 4.13)和H-6(δH 4.25和4.58)。δH 4.25的质子还显示出与δH 4.58的COSY关联，证实了这些质子术语H-6。使用HSQC-DEPT数据分配了针对C-3(δC 78.2-78.6)、C-4(δC 72.1)、C-5(δC 78.2-78.6)和C-6(δC 62.3或62.4)的13C化学位移。来自H-4与C-6和H-5与C-1的HMBC关联进一步证实了GlcIV C-6的分配，以完成GlcIV的分配。
以下显示了发现的针对C-13的糖苷的1H和13C化学位移的概述：
莱鲍迪苷I C-13糖苷的1H和13C NMR(500和150MHz，吡啶-d5)分配
以下提供了用于分配C-13糖苷区的关键HMBC和COSY关联的概述。
莱鲍迪苷I，reb I的NMR和MS分析允许结构的全部分配，如以下所示。化合物的名称是13-[(2-O-β-D-吡喃葡糖基-3-O-β-D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基)氧]等效-16-贝壳杉烯-19-酸[(3-O-β-D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基)酯]。
实施例48
UGTSL2用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的定向进化(第2轮)
取天然酶UGTSL2(GI_460410132)作为基线，建立了23个突变的列表，其含有来自第一轮的针对活性不同鉴定的正突变(实施例45)和通过DNA2.0 ProteinGPSTM策略获得的新突变。将这个突变列表随后用于设计各自含有3个不同突变的46个变体基因。针对在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UGTSL2var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。
为了测量变体将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性，将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷A(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D所述的分析方法，在HPLC分析(CAD)后，测定初始速率。
平行地，对于最有活性的克隆，将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，针对莱鲍迪苷D转化，在HPLC分析(CAD检测)后，测定初始速率。
除了新变体，还使用基线克隆UGTSL2进行了两个实验。将针对这个基线克隆的莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷D转化的初始速率限定为100％。
将每个克隆的活性与基线克隆UGTSL2相比限定为标准化活性，而每个克隆的特异性表述为针对莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例。
莱鲍迪苷A转化的标准化速率以及莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例描述于下表中。
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于UGTSL2，位置240的异亮氨酸突变成亮氨酸注释为UGTSL2(I240L)。Nd表示未测定。
这些结果的建模允许获得每个突变的作用的分级。确定以下突变对于活性是有益的：
N325S、G387E、A285V、I 333L、V270I、Q27R、N278G、L393V、S258T、A341V、H247P和T392A。
确定以下突变对于提高莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例是有益的：
V270I、T392A、T329V、L276A、L393V、A341V和S255C。
实施例49
β-葡糖苷酶用于将莱鲍迪苷M2转化成莱鲍迪苷D的用途
针对莱鲍迪苷M2的水解，测试了不同的β-葡糖苷酶。靶是选择性地水解(1→6)糖苷键，以获得莱鲍迪苷D。所需的一般反应方案如下：
首先，对参照底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷测试了选定的β-葡糖苷酶，以测定活性。基于测定的活性，将使用的酶量计算为莱鲍迪苷M2水解中使用的单位。
测试的β-葡糖苷酶描述于下表中：
*Isolase(011410；National Enzyme Company，USA)；Aromase(GLY0151441；AmanoEnzyme，日本)；柚皮苷酶(NAH0550102；Amano Enzyme，日本)，来自里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC 26921的纤维素酶(Sigma C2730)；来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维二糖酶(Sigma C6105)；Viscozyme L(Sigma V2010)
测试条件如下：
在含有15mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)和1mM莱鲍迪苷M2的10mL总体积下，在30℃下进行了反应。通过添加酶启动反应。
在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.3小时后，获取625μL的反应混合物样品并且用575μL80％甲醇和50μL 2N H2SO4的混合物骤冷。使用上述的分析方法，通过HPLC分析(CAD检测)，分析了样品。
使用不同β-葡糖苷酶的这些反应的反应特征显示于图68a-f中。
可以推断橙皮苷酶和CWD催化了莱鲍迪苷D2和莱鲍迪苷A的形成，这分别表明了(1→2)键糖解和(1→6)键糖解。可以认为这些酶对于莱鲍迪苷M2的转化是非选择性的。
Isolase、纤维素酶Tr和纤维二糖酶As对于莱鲍迪苷M2转化成莱鲍迪苷D((1→6)糖苷键的水解)具有明确的选择性，而Aromase对于莱鲍迪苷M2的转化具有低的整体活性。
实施例50
在Isolase、纤维素酶Tr和纤维二糖酶As的存在下，莱鲍迪苷的稳定性
为了评价Isolase、纤维素Tr和纤维二糖酶As对莱鲍迪苷M2的选择性，在以下条件下，测试了作为底物的莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M：
在含有15mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)和1mM莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M的10mL总体积下，在30℃下，将反应进行了超过24小时。通过添加酶启动了反应。
在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.3小时后，获取625μL的反应混合物样品并且用575μL80％甲醇和50μL 2N H2SO4的混合物骤冷。通过HPLC分析了样品。
获得了图69a-c中显示的结果。可以观察到在Isolase、纤维素Tr和纤维二糖酶As的存在下，没有观察到莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的显著转化。
实施例51
用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷M的四种酶反应
研究了将Isolase、纤维素Tr或纤维二糖酶As引入使用UGTSL2、UGT76G1-1R-F12和AtSUS的莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷M的一罐反应中的影响。使用了以下反应条件：
没有使用和使用添加的β-葡糖苷酶的实验的结果显示于图70a-d中。可以看到添加纤维二糖酶As阻断了反应并且纤维素酶Tr的添加对反应特征没有影响。然而，将Isolase加入反应混合物中对反应中形成的莱鲍迪苷M的质量具有积极作用。加入Isolase时，观察到了差不多20％的增加。与没有添加β-葡糖苷酶的反应相比，将Isolase加入反应中时，莱鲍迪苷M2含量大约低10％和莱鲍迪苷I含量大约低15％。
通过优化反应参数和Isolase的含量，可以实现Reb M产量的进一步改善以及RebM2和Reb I含量的降低。
实施例52
β-葡糖苷酶用于将莱鲍迪苷I转化成莱鲍迪苷A的用途
对于将莱鲍迪苷I水解成莱鲍迪苷A，测试了三种β-葡糖苷酶。靶是选择性地水解(1→6)糖苷键，以获得莱鲍迪苷D。所需的一般反应方案如下：
对参照底物4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷测试了选定的β-葡糖苷酶，以测定活性。基于测定的活性，将使用的酶量计算为莱鲍迪苷I水解中使用的单位。测试的β-葡糖苷酶描述于下表中：
*Isolase(011410；National Enzyme Company，USA)；来自里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC 26921的纤维素酶(Sigma C2730)；来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维二糖酶(Sigma C6105)
测试条件如下。在含有15mM醋酸钠缓冲液(pH4.5)和1mM莱鲍迪苷I的2mL总体积下，在30℃下进行了反应。通过添加酶启动反应。
在0、1.5、2.5和18小时后，获取125μL的反应混合物样品并且用115μL 80％甲醇和10μL 2N H2SO4的混合物骤冷。使用上述的分析方法，通过HPLC分析(CAD检测)分析了样品。使用莱鲍迪苷I的不同β-葡糖苷酶的反应特征描绘于图71中所示的图中。
可以观察到所有三种测试的β-葡糖苷酶都转化了莱鲍迪苷I。唯一的产物是莱鲍迪苷A。
实施例53
UGTSL2用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的定向进化(第3轮)
取天然酶UGTSL2(GI_460410132)作为基线，制备了在第2轮过程中鉴定了13个突变的列表(实施例48)和通过DNA2.0 ProteinGPSTM策略获得的12个新突变的列表。将这个突变列表随后用于设计各自含有1至8个不同突变的46个变体基因。针对在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UGTSL2var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。
为了测量变体将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性，将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷A(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D所述的分析方法，在HPLC分析(CAD检测)后，测定初始速率。
平行地，将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，在HPLC分析(CAD检测)后，针对莱鲍迪苷D转化，测定初始速率。
除了用于这一轮的新变体，还使用基线克隆UGTSL2进行了两个实验。将针对这个基线克隆的莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷D转化的初始速率限定为100％。
将每个克隆的活性与基线克隆UGTSL2相比限定为标准化活性，而每个克隆的特异性表述为针对莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例。
莱鲍迪苷A转化的标准化速率以及莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例描述于下表中。
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于UGTSL2，位置240的异亮氨酸突变成亮氨酸注释为UGTSL2(I240L)。Nd表示未测定。
这些结果的建模允许获得每个突变的作用的分级。确定以下突变对于活性是有益的：
N130G、H247P、F253Y、V270I、L276A、A285I、A285V、K301E、A341V、T392A、K408R、I412L。
确定以下突变对于提高莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D转化的初始速率之间的比例是有益的：
I203L、S255C、I333L、A341V、H357Y、L393V、K408R、I412L。
实施例54
莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷M的一罐式、四种酶转化
将10mL含有5.0mM莱鲍迪苷A、0.25mM UDP、2mM MgCl2、100mM蔗糖、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5、2.5U的UGTSL2-R3-D2(UGTSL2-第3轮-var12，参见实施例53)、25U的UGT76G1-R3-G3(UGT76G1-第3轮-var21，参见实施例44)、25U的AtSUS和5U的
的反应混合物通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中。将所得到的反应混合物在30℃下温和振荡65小时。
在无菌条件下以规律的间隔获取125μL的反应混合物样品并用10μL 2N H2SO4和765μL 50％甲醇骤冷。离心后，通过HPLC分析了200μL上清液。
获得了图72a中所示的反应特征。48小时反应后的HPLC分析显示于图72b中。
实施例55
莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷M的一罐式、四种酶转化
将10mL含有10.0mM莱鲍迪苷A、0.50mM UDP、3mM MgCl2、100mM蔗糖、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5、5.0U的UGTSL2-R3-D2(UGTSL2-第3轮-var12，参见实施例53)、50U的UGT76G1-R3-G3(UGT76G1-第3轮-var21，参见实施例44)、50U的AtSUS和10U的
的反应混合物通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中。将所得到的反应混合物在30℃下温和振荡66小时。
在无菌条件下以规律的间隔获取125μL的反应混合物样品并用10μL 2N H2SO4和765μL 50％甲醇骤冷。离心后，通过HPLC分析了200μL上清液。
获得了图73a中所示的反应特征。48小时反应后的HPLC分析显示于图73b中。
实施例56
莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷M的一罐式、四种酶转化
将50mL含有10.0mM莱鲍迪苷A、0.5mM UDP、4mM MgCl2、100mM蔗糖、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5、25U的UGTSL2-R3-D2(UGTSL2-第3轮-var12，参见实施例53)、250U的UGT76G1-R3-G3(UGT76G1-第3轮-var21，参见实施例44)、250U的AtSUS和50U的
的反应混合物通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中。将所得到的反应混合物在35℃下温和振荡95小时。
在无菌条件下以规律的间隔获取125μL的反应混合物样品并用10μL 2N H2SO4和765μL 50％甲醇骤冷。离心后，通过HPLC分析了200μL上清液。
反应结束时，反应混合物变成了细悬液。悬浮液的过滤以及残余物和滤液的HPLC分析表明滤液中的Reb M含量为79％并且固体中的Reb M含量为97％。
获得了图74a中所示的反应特征。95小时后反应混合物的HPLC显示于图74b中。
实施例57
莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷M的一罐式、四种酶转化(6.5小时后添加UGT76G1和Isolase)
将含有莱鲍迪苷A、UDP、MgCl2、蔗糖、磷酸钾缓冲液pH7.5、UGTSL2-R3-D2(UGTSL2-第3轮-var12，参见实施例53)和AtSUS通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中。将所得到的反应混合物在35℃下温和振荡6.5小时。加入UGT76G1-R3-G3(UGT76G1-第3轮-var21，参见实施例44)和
将反应混合物通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中并在35℃下温和振荡89小时。反应混合物的终体积为50mL并且试剂和酶的终浓度如下：10.0mM莱鲍迪苷A、0.5mMUDP、4mM MgCl2、100mM蔗糖、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5、25U的UGTSL2-R3-D2、250U的UGT76G1-R3-G3、250U的AtSUS和50U的
在无菌条件下以规律的间隔获取125μL的反应混合物样品并用10μL 2N H2SO4和765μL 50％甲醇骤冷。离心后，通过HPLC分析了200μL上清液。
获得了图75a中所示的反应特征。95小时后反应混合物的HPLC显示于图75b中。
实施例58
莱鲍迪苷A至莱鲍迪苷M的一罐式、四种酶转化(6.5小时后添加UGT76G1和Isolase)
将含有莱鲍迪苷A、UDP、MgCl2、蔗糖、磷酸钾缓冲液pH7.5、UGTSL2-R3-D2(UGTSL2-第3轮-var12，参见实施例53)和AtSUS通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中。将所得到的反应混合物在35℃下温和振荡6.5小时。加入UGT76G1-R3-G3(UGT76G1-第3轮-var21，参见实施例44)和
将反应混合物通过0.2μm滤器过滤至无菌烧瓶中并在35℃下温和振荡89小时。反应混合物的终体积为50mL并且试剂和酶的终浓度如下：10.0mM莱鲍迪苷A、0.5mMUDP、4mM MgCl2、100mM蔗糖、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5、25U的UGTSL2-R3-D2、250U的UGT76G1-R3-G3、250U的AtSUS和25U的
在无菌条件下以规律的间隔获取125μL的反应混合物样品并用10μL 2N H2SO4和765μL 50％甲醇骤冷。离心后，通过HPLC分析了200μL上清液。
反应结束时，反应混合物变成了细悬液。悬浮液的过滤以及残余物和滤液的HPLC分析表明滤液中的Reb M含量为81％并且固体中的Reb M含量为98％
获得了图76a中所示的反应特征。95小时后反应混合物的HPLC显示于图76b中。
实施例59
UGTSL2用于将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的定向进化(第4轮)
将来自第三轮(参见实施例53)的最有活性酶UGTSL2_第3轮-var45用作起始点。将来自第3轮的对于活性的五个最佳突变用于形成一组10个变体，其各自含有这些突变中的两个。对于在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UGTSL2var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。在活性测试前，用水将裂解产物稀释五倍。
为了测量变体将莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D的活性，将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷A(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中。使反应在30℃下运行并且在2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷A转化成莱鲍迪苷D所述的分析方法，在HPLC分析(CAD检测)后，测定活性。
通过测量在100％UDP-Glc转化下形成的莱鲍迪苷M2的量来测定每个克隆的选择性(限定为(2*[Reb M2]+[Reb D])/([Reb A]+[Reb D]+[Reb M2])。
平行地，用基线克隆UGTSL2-第3轮-Var45进行了实验。将针对这个基线克隆的初始速率限定为100％。针对第4轮克隆的相对初始速率以及在100％UDP-Glc转化下形成的莱鲍迪苷M2的含量描述于下表中：
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于UGTSL2，位置240的异亮氨酸突变成亮氨酸注释为UGTSL2(I240L)。
实施例60
UGT76G1用于将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X的定向进化(第4轮)
选择来自第三轮的UGT76G1的定向进化(参见实施例44第3轮_UGT76G1var21，含有突变：I46L_K303G_K393R))的最有活性克隆作为用于第4轮的基线克隆。将来自第3轮的最佳鉴定的突变(S119A、274G、I295M、F314S和K334R)用于形成一组10个变体，其各自含有这些突变中的2个。对于在大肠杆菌中的表达密码子优化后，合成基因，在pET30a+质粒中亚克隆并用于大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞的转化。在卡那霉素的存在下，将获得的细胞在皮氏培养皿的固体LB培养基上生长。选择合适的克隆并使其在试管中的液体LB培养基中生长。将作为冷冻保护剂的甘油加入悬浮液中并将400μL等份试样储存在-20℃和-80℃下。
将这些含有pET30a+_UTG76G1var质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的储存等份试样融化并且加入LBGKP培养基(20g/L Luria肉汤Lennox；50mM PIPES缓冲液pH 7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH 7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)中。使这个培养物在30℃下在96微量滴定平板中振荡8小时。
用50μL上述培养物接种3.95mL含有60g/L Overnight ExpressTM已配制好的TB培养基
10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在48深孔平板中，使所得到的培养物在20℃下搅拌。培养物获得了显著生长并且获得了良好的OD(600nm)。44小时后，通过离心收集细胞并冷冻。
通过将
Master混合物
加入融化的细胞中来进行裂解，并通过离心收集裂解产物。将100μL新鲜裂解产物加入50mM磷酸盐缓冲液pH7.2中的莱鲍迪苷D(终浓度0.5mM)、MgCl2(终浓度3mM)和UDP-葡萄糖(终浓度2.5mM)的溶液中，来进行活性测试。
使反应在30℃下运行并且在1、2、4、6和22小时后取样，使用以上针对莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X所述的分析方法，通过HPLC分析(CAD检测)，来测定转化和初始速率。平行地，用基线克隆第3轮-Var21进行了实验。将针对这个基线克隆的22小时后的转化和初始速率限定为100％，并且针对第4轮克隆的标准化转化和初始速率描述于下表中：
*突变如下注释：参照基因-初始氨基酸-位置-新氨基酸：例如，对于来自UGT76G1的第四轮定向进化的变体1，位置119的丝氨酸突变成丙氨酸，注释为第3轮-Var21(S119A)。
应当理解之前的描述和特定的实施方案已经完全公开、说明和提供了本发明的最佳方式及其原理，并且本领域技术人员可以进行改变和添加，而不脱离本发明的精神和范围，其只受所附权利要求的范围的限制。
序列表
<110> 谱赛科有限责任公司
<120> 高纯度甜菊醇糖苷
<130> 39227-52WO
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 1
ccatggccca tatggaaaac aaaaccgaaa ccaccgttcg tcgtcgtcgc cgtattattc 60
tgtttccggt tccgtttcag ggtcatatta atccgattct gcagctggca aatgtgctgt 120
atagcaaagg ttttagcatt accatttttc ataccaattt taacaaaccg aaaaccagca 180
attatccgca ttttaccttt cgctttattc tggataatga tccgcaggat gaacgcatta 240
gcaatctgcc gacacatggt ccgctggcag gtatgcgtat tccgattatt aacgaacatg 300
gtgcagatga actgcgtcgt gaactggaac tgctgatgct ggcaagcgaa gaagatgaag 360
aagttagctg tctgattacc gatgcactgt ggtattttgc acagagcgtt gcagatagcc 420
tgaatctgcg tcgtctggtt ctgatgacca gcagcctgtt taactttcat gcacatgtta 480
gcctgccgca gtttgatgaa ctgggttatc tggatccgga tgataaaacc cgtctggaag 540
aacaggcaag cggttttccg atgctgaaag tgaaagatat caaaagcgcc tatagcaatt 600
ggcagattct gaaagaaatt ctgggcaaaa tgattaaaca gaccaaagca agcagcggtg 660
ttatttggaa tagctttaaa gaactggaag aaagcgaact ggaaaccgtg attcgtgaaa 720
ttccggcacc gagctttctg attccgctgc cgaaacatct gaccgcaagc agcagcagcc 780
tgctggatca tgatcgtacc gtttttcagt ggctggatca gcagcctccg agcagcgttc 840
tgtatgttag ctttggtagc accagcgaag ttgatgaaaa agattttctg gaaattgccc 900
gtggtctggt tgatagcaaa cagagctttc tgtgggttgt tcgtccgggt tttgttaaag 960
gtagcacctg ggttgaaccg ctgccggatg gttttctggg tgaacgtggt cgtattgtta 1020
aatgggttcc gcagcaagaa gttctggcac acggcgcaat tggtgcattt tggacccata 1080
gcggttggaa tagcaccctg gaaagcgttt gtgaaggtgt tccgatgatt tttagcgatt 1140
ttggtctgga tcagccgctg aatgcacgtt atatgagtga tgttctgaaa gtgggtgtgt 1200
atctggaaaa tggttgggaa cgtggtgaaa ttgcaaatgc aattcgtcgt gttatggtgg 1260
atgaagaagg tgaatatatt cgtcagaatg cccgtgttct gaaacagaaa gcagatgtta 1320
gcctgatgaa aggtggtagc agctatgaaa gcctggaaag tctggttagc tatattagca 1380
gcctgtaata actcgag 1397
<210> 2
<211> 1442
<212> DNA
<213> 甜菊
<400> 2
ccatggcaca tatggcaacc agcgatagca ttgttgatga tcgtaaacag ctgcatgttg 60
caacctttcc gtggctggca tttggtcata ttctgccgta tctgcagctg agcaaactga 120
ttgcagaaaa aggtcataaa gtgagctttc tgagcaccac ccgtaatatt cagcgtctga 180
gcagccatat tagtccgctg attaatgttg ttcagctgac cctgcctcgt gttcaagaac 240
tgccggaaga tgccgaagca accaccgatg ttcatccgga agatattccg tatctgaaaa 300
aagcaagtga tggtctgcag ccggaagtta cccgttttct ggaacagcat agtccggatt 360
ggatcatcta tgattatacc cattattggc tgccgagcat tgcagcaagc ctgggtatta 420
gccgtgcaca ttttagcgtt accaccccgt gggcaattgc atatatgggt ccgagcgcag 480
atgcaatgat taatggtagt gatggtcgta ccaccgttga agatctgacc acccctccga 540
aatggtttcc gtttccgacc aaagtttgtt ggcgtaaaca tgatctggca cgtctggttc 600
cgtataaagc accgggtatt agtgatggtt atcgtatggg tctggttctg aaaggtagcg 660
attgtctgct gagcaaatgc tatcatgaat ttggcaccca gtggctgccg ctgctggaaa 720
ccctgcatca ggttccggtt gttccggtgg gtctgctgcc tccggaagtt ccgggtgatg 780
aaaaagatga aacctgggtt agcatcaaaa aatggctgga tggtaaacag aaaggtagcg 840
tggtttatgt tgcactgggt agcgaagttc tggttagcca gaccgaagtt gttgaactgg 900
cactgggtct ggaactgagc ggtctgccgt ttgtttgggc atatcgtaaa ccgaaaggtc 960
cggcaaaaag cgatagcgtt gaactgccgg atggttttgt tgaacgtacc cgtgatcgtg 1020
gtctggtttg gaccagctgg gcacctcagc tgcgtattct gagccatgaa agcgtttgtg 1080
gttttctgac ccattgtggt agcggtagca ttgtggaagg tctgatgttt ggtcatccgc 1140
tgattatgct gccgattttt ggtgatcagc cgctgaatgc acgtctgctg gaagataaac 1200
aggttggtat tgaaattccg cgtaatgaag aagatggttg cctgaccaaa gaaagcgttg 1260
cacgtagcct gcgtagcgtt gttgttgaaa aagaaggcga aatctataaa gccaatgcac 1320
gtgaactgag caaaatctat aatgatacca aagtggaaaa agaatatgtg agccagttcg 1380
tggattatct ggaaaaaaac acccgtgcag ttgccattga tcacgaaagc taatgactcg 1440
ag 1442
<210> 3
<211> 472
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 3
Met Asp Asp Ala His Ser Ser Gln Ser Pro Leu His Val Val Ile Phe
1 5 10 15
Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu Asp Leu Ala Glu
20 25 30
Arg Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg
35 40 45
Asn Leu Ala Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Glu Leu Ala Glu Leu Val
50 55 60
Asp Leu Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Asp Gly Leu Pro Asp Gly
65 70 75 80
Ala Glu Ala Thr Ser Asp Val Pro Phe Asp Lys Phe Glu Leu His Arg
85 90 95
Lys Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ser Ala Phe Leu Asp Thr
100 105 110
Ala Cys Ala Gly Gly Lys Arg Pro Asp Trp Val Leu Ala Asp Leu Met
115 120 125
His His Trp Val Ala Leu Ala Ser Gln Glu Arg Gly Val Pro Cys Ala
130 135 140
Met Ile Leu Pro Cys Ser Ala Ala Val Val Ala Ser Ser Ala Pro Pro
145 150 155 160
Thr Glu Ser Ser Ala Asp Gln Arg Glu Ala Ile Val Arg Ser Met Gly
165 170 175
Thr Ala Ala Pro Ser Phe Glu Ala Lys Arg Ala Thr Glu Glu Phe Ala
180 185 190
Thr Glu Gly Ala Ser Gly Val Ser Ile Met Thr Arg Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Leu Gln Arg Ser Lys Leu Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Leu Glu
210 215 220
Pro Gly Ala Phe Thr Ile Leu Thr Arg Phe Tyr Gly Lys Pro Val Val
225 230 235 240
Pro Phe Gly Leu Leu Pro Pro Arg Pro Asp Gly Ala Arg Gly Val Ser
245 250 255
Lys Asn Gly Lys His Asp Ala Ile Met Gln Trp Leu Asp Ala Gln Pro
260 265 270
Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Ala Pro Met Ser
275 280 285
Ala Asp Leu Leu Arg Glu Leu Ala His Gly Leu Asp Leu Ala Gly Thr
290 295 300
Arg Phe Leu Trp Ala Met Arg Lys Pro Ala Gly Val Asp Ala Asp Ser
305 310 315 320
Val Leu Pro Ala Gly Phe Leu Gly Arg Thr Gly Glu Arg Gly Leu Val
325 330 335
Thr Thr Arg Trp Ala Pro Gln Val Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val
340 345 350
Cys Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Gly Ser Val Val Glu Gly Leu
355 360 365
Gln Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Leu Gly Asp Gln Gly
370 375 380
Pro Asn Ala Arg Ile Leu Glu Gly Arg Lys Leu Gly Val Ala Val Pro
385 390 395 400
Arg Asn Asp Glu Asp Gly Ser Phe Asp Arg Gly Gly Val Ala Gly Ala
405 410 415
Val Arg Ala Val Val Val Glu Glu Glu Gly Lys Thr Phe Phe Ala Asn
420 425 430
Ala Arg Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Arg Glu Arg Glu Glu Arg
435 440 445
Cys Ile Asp Glu Phe Val Gln His Leu Thr Ser Trp Asn Glu Leu Lys
450 455 460
Asn Asn Ser Asp Gly Gln Tyr Pro
465 470
<210> 4
<211> 502
<212> PRT
<213> 糙伏毛燕麦
<400> 4
Met Ala Val Lys Asp Glu Gln Gln Ser Pro Leu His Ile Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Phe Leu Ala Pro Gly His Leu Ile Pro Ile Ala Asp Met Ala Ala
20 25 30
Leu Phe Ala Ser Arg Gly Val Arg Cys Thr Ile Leu Thr Thr Pro Val
35 40 45
Asn Ala Ala Ile Ile Arg Ser Ala Val Asp Arg Ala Asn Asp Ala Phe
50 55 60
Arg Gly Ser Asp Cys Pro Ala Ile Asp Ile Ser Val Val Pro Phe Pro
65 70 75 80
Asp Val Gly Leu Pro Pro Gly Val Glu Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ser
85 90 95
Pro Ala Asp Arg Leu Lys Phe Phe Gln Ala Val Ala Glu Leu Arg Glu
100 105 110
Pro Phe Asp Arg Phe Leu Ala Asp Asn His Pro Asp Ala Val Val Ser
115 120 125
Asp Ser Phe Phe His Trp Ser Thr Asp Ala Ala Ala Glu His Gly Val
130 135 140
Pro Arg Leu Gly Phe Leu Gly Ser Ser Met Phe Ala Gly Ser Cys Asn
145 150 155 160
Glu Ser Thr Leu His Asn Asn Pro Leu Glu Thr Ala Ala Asp Asp Pro
165 170 175
Asp Ala Leu Val Ser Leu Pro Gly Leu Pro His Arg Val Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Ser Gln Met Met Asp Pro Lys Lys Arg Pro Asp His Trp Ala Leu
195 200 205
Leu Glu Ser Val Asn Ala Ala Asp Gln Lys Ser Phe Gly Glu Val Phe
210 215 220
Asn Ser Phe His Glu Leu Glu Pro Asp Tyr Val Glu His Tyr Gln Thr
225 230 235 240
Thr Leu Gly Arg Arg Thr Trp Leu Val Gly Pro Val Ala Leu Ala Ser
245 250 255
Lys Asp Met Ala Gly Arg Gly Ser Thr Ser Ala Arg Ser Pro Asp Ala
260 265 270
Asp Ser Cys Leu Arg Trp Leu Asp Thr Lys Gln Pro Gly Ser Val Val
275 280 285
Tyr Val Ser Phe Gly Thr Leu Ile Arg Phe Ser Pro Ala Glu Leu His
290 295 300
Glu Leu Ala Arg Gly Leu Asp Leu Ser Gly Lys Asn Phe Val Trp Val
305 310 315 320
Leu Gly Arg Ala Gly Pro Asp Ser Ser Glu Trp Met Pro Gln Gly Phe
325 330 335
Ala Asp Leu Ile Thr Pro Arg Gly Asp Arg Gly Phe Ile Ile Arg Gly
340 345 350
Trp Ala Pro Gln Met Leu Ile Leu Asn His Arg Ala Leu Gly Gly Phe
355 360 365
Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Ser Ala Gly
370 375 380
Val Pro Met Val Thr Trp Pro Arg Phe Ala Asp Gln Phe Gln Asn Glu
385 390 395 400
Lys Leu Ile Val Glu Val Leu Lys Val Gly Val Ser Ile Gly Ala Lys
405 410 415
Asp Tyr Gly Ser Gly Ile Glu Asn His Asp Val Ile Arg Gly Glu Val
420 425 430
Ile Ala Glu Ser Ile Gly Lys Leu Met Gly Ser Ser Glu Glu Ser Asp
435 440 445
Ala Ile Gln Arg Lys Ala Lys Asp Leu Gly Ala Glu Ala Arg Ser Ala
450 455 460
Val Glu Asn Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Val Gly Arg Leu Met Asp
465 470 475 480
Glu Leu Met Ala Arg Arg Ser Ser Val Lys Val Gly Glu Asp Ile Ile
485 490 495
Pro Thr Asn Asp Gly Leu
500
<210> 5
<211> 470
<212> PRT
<213> 番茄
<400> 5
Met Ser Pro Lys Leu His Lys Glu Leu Phe Phe His Ser Leu Tyr Lys
1 5 10 15
Lys Thr Arg Ser Asn His Thr Met Ala Thr Leu Lys Val Leu Met Phe
20 25 30
Pro Phe Leu Ala Tyr Gly His Ile Ser Pro Tyr Leu Asn Val Ala Lys
35 40 45
Lys Leu Ala Asp Arg Gly Phe Leu Ile Tyr Phe Cys Ser Thr Pro Ile
50 55 60
Asn Leu Lys Ser Thr Ile Glu Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser
65 70 75 80
Ile His Leu Ile Glu Leu His Leu Pro Glu Leu Pro Gln Leu Pro Pro
85 90 95
His Tyr His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro Asn Leu Asn Gln Val Leu
100 105 110
Gln Lys Ala Leu Lys Met Ser Lys Pro Asn Phe Ser Lys Ile Leu Gln
115 120 125
Asn Leu Lys Pro Asp Leu Val Ile Tyr Asp Ile Leu Gln Arg Trp Ala
130 135 140
Lys His Val Ala Asn Glu Gln Asn Ile Pro Ala Val Lys Leu Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ala Val Phe Ser Tyr Phe Phe Asn Val Leu Lys Lys Pro
165 170 175
Gly Val Glu Phe Pro Phe Pro Gly Ile Tyr Leu Arg Lys Ile Glu Gln
180 185 190
Val Arg Leu Ser Glu Met Met Ser Lys Ser Asp Lys Glu Lys Glu Leu
195 200 205
Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Leu Leu Val Asp Gly Asn Met Gln
210 215 220
Ile Met Leu Met Ser Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp
225 230 235 240
Phe Cys Thr Ala Leu Thr Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro
245 250 255
Val Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Val Asp Asp Met Glu Leu Ile Asp
260 265 270
Trp Leu Gly Thr Lys Asp Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly
275 280 285
Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe Ala
290 295 300
Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys
305 310 315 320
Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu
325 330 335
Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln Pro
340 345 350
Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly
355 360 365
Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala
370 375 380
Met Pro Met His Leu Asp Gln Pro Met Asn Ala Arg Leu Ile Val Glu
385 390 395 400
Leu Gly Val Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Asp Gly Lys Ile His
405 410 415
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420 425 430
Gly Glu Lys Leu Arg Ala Lys Val Arg Asp Ile Ser Lys Asn Leu Lys
435 440 445
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450 455 460
Leu Cys Arg Asn Gly Asn
465 470
<210> 6
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<212> PRT
<213> 水稻
<400> 6
Met His Val Val Met Leu Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Ile Leu Pro
1 5 10 15
Phe Ala Glu Phe Ala Lys Arg Val Ala Arg Gln Gly His Arg Val Thr
20 25 30
Leu Phe Ser Thr Pro Arg Asn Thr Arg Arg Leu Ile Asp Val Pro Pro
35 40 45
Ser Leu Ala Gly Arg Ile Arg Val Val Asp Ile Pro Leu Pro Arg Val
50 55 60
Glu His Leu Pro Glu His Ala Glu Ala Thr Ile Asp Leu Pro Ser Asn
65 70 75 80
Asp Leu Arg Pro Tyr Leu Arg Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Phe Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Gly Pro Ser Arg Pro Asp Trp
100 105 110
Val Leu Ala Asp Tyr Ala Ala Tyr Trp Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg
115 120 125
His Gly Val Pro Cys Ala Phe Leu Ser Leu Phe Gly Ala Ala Ala Leu
130 135 140
Cys Phe Phe Gly Pro Ala Glu Thr Leu Gln Gly Arg Gly Pro Tyr Ala
145 150 155 160
Lys Thr Glu Pro Ala His Leu Thr Ala Val Pro Glu Tyr Val Pro Phe
165 170 175
Pro Thr Thr Val Ala Phe Arg Gly Asn Glu Ala Arg Glu Leu Phe Lys
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Val Ile Pro Ile Gly Met Phe Pro Pro Pro Pro Pro Gln Asp Val
245 250 255
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305 310 315 320
Pro Gly Gly Phe Lys Glu Arg Val Asn Gly Arg Gly Val Val Cys Arg
325 330 335
Gly Trp Val Pro Gln Val Lys Phe Leu Ala His Ala Ser Val Gly Gly
340 345 350
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Gly Val Arg Leu Val Leu Leu Pro Leu Met Phe Glu Gln Gly Leu Asn
370 375 380
Ala Arg Gln Leu Ala Glu Lys Lys Val Ala Val Glu Val Ala Arg Asp
385 390 395 400
Glu Asp Asp Gly Ser Phe Ala Ala Asn Asp Ile Val Asp Ala Leu Arg
405 410 415
Arg Val Met Val Gly Glu Glu Gly Asp Glu Phe Gly Val Lys Val Lys
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Glu Leu Ala Lys Val Phe Gly Asp Asp Glu Val Asn Asp Arg Tyr Val
435 440 445
Arg Asp Phe Leu Lys Cys Leu Ser Glu Tyr Lys Met Gln Arg Gln Gly
450 455 460
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<212> PRT
<213> 琴叶拟南芥
<400> 7
Met Asp Asp Lys Lys Glu Glu Val Met His Ile Ala Met Phe Pro Trp
1 5 10 15
Leu Ala Met Gly His Leu Leu Pro Phe Leu Arg Leu Ser Lys Leu Leu
20 25 30
Ala Gln Lys Gly His Lys Ile Ser Phe Ile Ser Thr Pro Arg Asn Ile
35 40 45
Leu Arg Leu Pro Lys Leu Pro Ser Asn Leu Ser Ser Ser Ile Thr Phe
50 55 60
Val Ser Phe Pro Leu Pro Ser Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Ser Glu
65 70 75 80
Ser Ser Met Asp Val Pro Tyr Asn Lys Gln Gln Ser Leu Lys Ala Ala
85 90 95
Phe Asp Leu Leu Gln Pro Pro Leu Thr Glu Phe Leu Arg Leu Ser Ser
100 105 110
Pro Asp Trp Ile Ile Tyr Asp Tyr Ala Ser His Trp Leu Pro Ser Ile
115 120 125
Ala Lys Glu Leu Gly Ile Ser Lys Ala Phe Phe Ser Leu Phe Asn Ala
130 135 140
Ala Thr Leu Cys Phe Met Gly Pro Ser Ser Ser Leu Ile Glu Glu Ser
145 150 155 160
Arg Ser Thr Pro Glu Asp Phe Thr Val Val Pro Pro Trp Val Pro Phe
165 170 175
Lys Ser Thr Ile Val Phe Arg Tyr His Glu Val Ser Arg Tyr Val Glu
180 185 190
Lys Thr Asp Glu Asp Val Thr Gly Val Ser Asp Ser Val Arg Phe Gly
195 200 205
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210 215 220
Phe Glu Pro Glu Trp Phe Ser Leu Leu Gln Asp Leu Tyr Arg Lys Pro
225 230 235 240
Val Phe Pro Ile Gly Phe Leu Pro Pro Val Ile Glu Asp Asp Asp Asp
245 250 255
Asp Thr Thr Trp Val Arg Ile Lys Glu Trp Leu Asp Lys Gln Arg Val
260 265 270
Asn Ser Val Val Tyr Val Ser Leu Gly Thr Glu Ala Ser Leu Arg Arg
275 280 285
Glu Glu Leu Thr Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Lys Ser Glu Thr Pro
290 295 300
Phe Phe Trp Val Leu Arg Asn Glu Pro Gln Ile Pro Asp Gly Phe Glu
305 310 315 320
Glu Arg Val Lys Gly Arg Gly Met Val His Val Gly Trp Val Pro Gln
325 330 335
Val Lys Ile Leu Ser His Glu Ser Val Gly Gly Phe Leu Thr His Cys
340 345 350
Gly Trp Asn Ser Val Val Glu Gly Ile Gly Phe Gly Lys Val Pro Ile
355 360 365
Phe Leu Pro Val Leu Asn Glu Gln Gly Leu Asn Thr Arg Leu Leu Gln
370 375 380
Gly Lys Gly Leu Gly Val Glu Val Leu Arg Asp Glu Arg Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Gly Ser Asp Ser Val Ala Asp Ser Val Arg Leu Val Met Ile Asp
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Phe Met Arg Asn Asp Glu Ser Ser Gln Leu Lys Glu Glu Glu Glu Glu
450 455 460
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Glu Lys Glu Leu Asn Leu Asp Leu Lys Glu Glu Lys Arg Arg Ile Ser
485 490 495
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500 505 510
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515
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<211> 772
<212> PRT
<213> 水稻
<400> 8
Met His Val Val Ile Cys Pro Leu Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro
1 5 10 15
Cys Leu Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Cys Gly His Arg Val Ser Phe
20 25 30
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35 40 45
Leu Ala Pro Leu Val Ser Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu
50 55 60
Gly Leu Pro Asn Gly Ala Glu Ser Thr His Asn Val Pro His Asp Arg
65 70 75 80
Pro Asp Met Val Glu Leu His Leu Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala
85 90 95
Pro Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Met Pro
100 105 110
Thr Ser Ser Ala Pro Arg Gln Thr Leu Ser Ser Asn Ile His Arg Asn
115 120 125
Ser Ser Arg Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ser Gly Arg Leu Leu Cys Pro
130 135 140
Ile Thr Pro His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Ala Ala Glu Lys Leu Val
145 150 155 160
Arg Ser Ser Arg Gln Asn Ala Arg Ala Arg Ser Leu Leu Ala Phe Thr
165 170 175
Ser Pro Pro Leu Pro Tyr Arg Asp Val Phe Arg Ser Leu Leu Gly Leu
180 185 190
Gln Met Gly Arg Lys Gln Leu Asn Ile Ala His Glu Thr Asn Gly Arg
195 200 205
Arg Thr Gly Thr Leu Pro Leu Asn Leu Cys Arg Trp Met Trp Lys Gln
210 215 220
Arg Arg Cys Gly Lys Leu Arg Pro Ser Asp Val Glu Phe Asn Thr Ser
225 230 235 240
Arg Ser Asn Glu Ala Ile Ser Pro Ile Gly Ala Ser Leu Val Asn Leu
245 250 255
Gln Ser Ile Gln Ser Pro Asn Pro Arg Ala Val Leu Pro Ile Ala Ser
260 265 270
Ser Gly Val Arg Ala Val Phe Ile Gly Arg Ala Arg Thr Ser Thr Pro
275 280 285
Thr Pro Pro His Ala Lys Pro Ala Arg Ser Ala Ala Pro Arg Ala His
290 295 300
Arg Pro Pro Ser Ser Val Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala
305 310 315 320
Ala Ala Ala Gly Met His Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly
325 330 335
His Leu Leu Pro Cys Leu Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly
340 345 350
His Arg Val Ser Phe Val Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro
355 360 365
Pro Val Arg Pro Ala Leu Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro
370 375 380
Leu Pro Arg Val Glu Gly Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp
385 390 395 400
Val Pro His Asp Arg Pro Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe
405 410 415
Asp Gly Leu Ala Ala Pro Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala
420 425 430
Asp Trp Val Ile Val Asp Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala
435 440 445
Leu Glu His Lys Val Pro Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His
450 455 460
Met Ile Ala Ser Ile Ala Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu
465 470 475 480
Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe
485 490 495
Glu Val Ala Arg Met Lys Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met
500 505 510
Ser Leu Ala Glu Arg Phe Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val
515 520 525
Val Gly Arg Ser Cys Val Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu
530 535 540
Ser Thr Leu Arg Gly Lys Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro
545 550 555 560
Leu His Glu Gly Arg Arg Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp
565 570 575
Leu Asp Ala Gln Pro Ala Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser
580 585 590
Glu Val Pro Leu Gly Val Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu
595 600 605
Glu Leu Ala Gly Thr Arg Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly
610 615 620
Val Ser Asp Ala Asp Leu Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg
625 630 635 640
Gly Arg Gly Val Val Ala Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu
645 650 655
Ala His Ala Ala Val Gly Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser
660 665 670
Thr Ile Glu Gly Leu Met Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile
675 680 685
Phe Gly Asp Gln Gly Pro Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala
690 695 700
Gly Leu Gln Val Ala Arg Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu
705 710 715 720
Gly Val Ala Ala Ala Ile Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser
725 730 735
Lys Val Phe Gln Ala Lys Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp
740 745 750
Met Ala Cys His Glu Arg Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg
755 760 765
Ser Tyr Lys Asp
770
<210> 9
<211> 442
<212> PRT
<213> 番茄
<400> 9
Met Ala Thr Asn Leu Arg Val Leu Met Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly
1 5 10 15
His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Ile Ala Lys Gln Leu Ala Asp Arg Gly
20 25 30
Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Arg Ile Asn Leu Glu Ser Ile Ile
35 40 45
Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ala Asp Ser Ile His Leu Ile Glu Leu
50 55 60
Gln Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro Pro His Tyr His Thr Thr Asn
65 70 75 80
Gly Leu Pro Pro His Leu Asn Pro Thr Leu His Lys Ala Leu Lys Met
85 90 95
Ser Lys Pro Asn Phe Ser Arg Ile Leu Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu
100 105 110
Leu Ile Tyr Asp Val Leu Gln Pro Trp Ala Glu His Val Ala Asn Glu
115 120 125
Gln Asn Ile Pro Ala Gly Lys Leu Leu Thr Ser Cys Ala Ala Val Phe
130 135 140
Ser Tyr Phe Phe Ser Phe Arg Lys Asn Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe
145 150 155 160
Pro Ala Ile His Leu Pro Glu Val Glu Lys Val Lys Ile Arg Glu Ile
165 170 175
Leu Ala Lys Glu Pro Glu Glu Gly Gly Arg Leu Asp Glu Gly Asn Lys
180 185 190
Gln Met Met Leu Met Cys Thr Ser Arg Thr Ile Glu Ala Lys Tyr Ile
195 200 205
Asp Tyr Cys Thr Glu Leu Cys Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro
210 215 220
Pro Phe Gln Asp Leu Ile Thr Asn Asp Ala Asp Asn Lys Glu Leu Ile
225 230 235 240
Asp Trp Leu Gly Thr Lys His Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe
245 250 255
Gly Ser Glu Tyr Phe Leu Ser Lys Glu Asp Met Glu Glu Val Ala Phe
260 265 270
Ala Leu Glu Leu Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro
275 280 285
Lys Gly Glu Glu Arg Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu
290 295 300
Glu Arg Ile Gly Glu Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln
305 310 315 320
Pro Arg Ile Leu Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys
325 330 335
Gly Trp Asn Ser Ala Met Glu Ser Ile Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile
340 345 350
Ala Met Pro Ile His Asn Asp Gln Pro Ile Asn Ala Lys Leu Met Val
355 360 365
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Lys Ser Ile Arg Asp Glu Glu Met Asp Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile
420 425 430
Gln Leu Cys Arg Asn Ser Asn Lys Ser Lys
435 440
<210> 10
<211> 454
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 10
Met Gly Thr Glu Val Thr Val His Lys Asn Thr Leu Arg Val Leu Met
1 5 10 15
Phe Pro Trp Leu Ala Tyr Gly His Ile Ser Pro Phe Leu Asn Val Ala
20 25 30
Lys Lys Leu Val Asp Arg Gly Phe Leu Ile Tyr Leu Cys Ser Thr Ala
35 40 45
Ile Asn Leu Lys Ser Thr Ile Lys Lys Ile Pro Glu Lys Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Ile Gln Leu Ile Glu Leu His Leu Pro Glu Leu Pro Glu Leu Pro
65 70 75 80
Pro His Tyr His Thr Thr Asn Gly Leu Pro Pro His Leu Asn His Thr
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Leu Gln Lys Ala Leu Lys Met Ser Lys Pro Asn Phe Ser Lys Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Leu Lys Pro Asp Leu Val Ile Tyr Asp Leu Leu Gln Gln Trp
115 120 125
Ala Glu Gly Val Ala Asn Glu Gln Asn Ile Pro Ala Val Lys Leu Leu
130 135 140
Thr Ser Gly Ala Ala Val Leu Ser Tyr Phe Phe Asn Leu Val Lys Lys
145 150 155 160
Pro Gly Val Glu Phe Pro Phe Pro Ala Ile Tyr Leu Arg Lys Asn Glu
165 170 175
Leu Glu Lys Met Ser Glu Leu Leu Ala Gln Ser Ala Lys Asp Lys Glu
180 185 190
Pro Asp Gly Val Asp Pro Phe Ala Asp Gly Asn Met Gln Val Met Leu
195 200 205
Met Ser Thr Ser Arg Ile Ile Glu Ala Lys Tyr Ile Asp Tyr Phe Ser
210 215 220
Gly Leu Ser Asn Trp Lys Val Val Pro Val Gly Pro Pro Val Gln Asp
225 230 235 240
Pro Ile Ala Asp Asp Ala Asp Glu Met Glu Leu Ile Asp Trp Leu Gly
245 250 255
Lys Lys Asp Glu Asn Ser Thr Val Phe Val Ser Phe Gly Ser Glu Tyr
260 265 270
Phe Leu Ser Lys Glu Asp Arg Glu Glu Ile Ala Phe Gly Leu Glu Leu
275 280 285
Ser Asn Val Asn Phe Ile Trp Val Ala Arg Phe Pro Lys Gly Glu Glu
290 295 300
Gln Asn Leu Glu Asp Ala Leu Pro Lys Gly Phe Leu Glu Arg Ile Gly
305 310 315 320
Asp Arg Gly Arg Val Leu Asp Lys Phe Ala Pro Gln Pro Arg Ile Leu
325 330 335
Asn His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Ile Ser His Cys Gly Trp Asn Ser
340 345 350
Val Met Glu Ser Val Asp Phe Gly Val Pro Ile Ile Ala Met Pro Ile
355 360 365
His Leu Asp Gln Pro Met Asn Ala Arg Leu Ile Val Glu Leu Gly Val
370 375 380
Ala Val Glu Ile Val Arg Asp Asp Tyr Gly Lys Ile His Arg Glu Glu
385 390 395 400
Ile Ala Glu Ile Leu Lys Asp Val Ile Ala Gly Lys Ser Gly Glu Asn
405 410 415
Leu Lys Ala Lys Met Arg Asp Ile Ser Lys Asn Leu Lys Ser Ile Arg
420 425 430
Asp Glu Glu Met Asp Thr Ala Ala Glu Glu Leu Ile Gln Leu Cys Lys
435 440 445
Asn Ser Pro Lys Leu Lys
450
<210> 11
<211> 458
<212> PRT
<213> 甜菊
<400> 11
Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile
1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu
20 25 30
Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr
35 40 45
Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg
50 55 60
Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro
65 70 75 80
Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His
85 90 95
Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser
100 105 110
Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr
115 120 125
Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu
130 135 140
Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln
145 150 155 160
Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu
165 170 175
Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser
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805
Claims (10)
1.用于生产高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的方法，包括下列步骤：
a.提供包含至少一种有机化合物的起始组合物；
b.提供含有甜菊醇生物合成酶、UDP-糖基转移酶并且可选地含有UDP-葡萄糖再循环酶的重组微生物；
c.将所述重组微生物与包含起始组合物的培养基接触，以产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物；和
d.从所述培养基中分离所述靶甜菊醇糖苷，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述起始组合物选自多元醇、碳水化合物及其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述微生物选自大肠杆菌(E.coli)、酵母属(Saccharomycessp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)和耶氏酵母属(Yarrowia sp.)。
4.权利要求1的方法，其中靶甜菊醇糖苷选自蛇菊苷、reb A、reb D、reb D2、reb M、rebM2、reb I及其组合。
5.权利要求1的方法，其中使用结晶、通过膜分离、离心、提取、色谱分离或这些方法的组合，从培养基中分离靶甜菊醇糖苷。
6.权利要求1的方法，其中高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物包含基于干基含量高于约95％重量的靶甜菊醇糖苷。
7.权利要求6的方法，其中靶甜菊醇糖苷选自蛇菊苷、reb A、reb E、reb D、reb D2、rebM、reb M2和reb I。
8.权利要求6的方法，其中靶甜菊醇糖苷是reb I。
9.根据权利要求1的方法制备的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其包含基于干基含量高于约95％重量的靶甜菊醇糖苷内容物。
10.权利要求9的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其中靶甜菊醇糖苷选自reb D、rebM和reb I。
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