CN103974628B - 高纯度的甜菊醇糖苷 - Google Patents

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Abstract

描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷，特别地莱鲍迪苷A、D和X的方法。所述方法包括表达来自甜叶菊的UDP‑葡萄糖基转移酶，所述酶能够将某些甜菊醇糖苷转化成莱鲍迪苷A、D和X。高度纯化的莱鲍迪苷A、D和X在可食用和可咀嚼组合物例如任何饮料、糕饼、焙烤食品、饼干和口香糖中可用作无热量甜味剂。

Description

高纯度的甜菊醇糖苷
技术领域
本发明涉及用于制备包含甜菊醇糖苷(steviol glycoside)的组合物，包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物的生物催化法。
通过引用并入序列表
将2013年3月12日创建的、具有5KB(千字节)的数据并且与本文同时提交的、标题为"PureCircle_22PCT_ST25.txt"的文本文件通过引用整体并入本申请。
发明背景
高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上是无热量的并且通常用于饮食和低卡路里产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引发升糖反应，从而使得它们适合用于针对糖尿病患者的产品和目的在于控制碳水化合物摄入的其它产品。
甜菊醇糖苷是一类在甜叶菊(stevia rebaudiana Bertoni)(原产于南美某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)叶中发现的化合物。它们的结构特征在于单个碱，甜菊醇，差异在于位置C13和C19上碳水化合物残基的存在。它们在甜菊属(Stevia)叶中积累，构成约10%-20%的总干重。基于干重，在甜菊属叶中发现的4种主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside)(9.1%)、莱鲍迪苷A(3.8%)、莱鲍迪苷C(0.6-1.0%)和杜尔可苷A(dulcoside A)(0.3%)。其它已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷(rebaudioside)B、C、D、E、F和X，甜菊双苷(steviolbioside)和甜叶悬钩子苷(rubusoside)。
虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但这些方法大多不适合于商业使用。
因此，仍然存在对用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效且经济的方法的需要。
发明概述
本发明提供了通过下述来制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法：将包含甜菊醇糖苷底物的起始组合物与UDP-葡萄糖基转移酶接触，从而产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物，所述靶甜菊醇糖苷与甜菊醇糖苷底物相比，包含一个或多个额外的葡萄糖单位。
起始组合物可以是包含至少一种甜菊醇糖苷底物的任何组合物。在一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物选自甜菊单苷(steviolmonoside)、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、合成的甜菊醇糖苷或其组合。起始组合物可以是商购获得的或制备的。起始组合物可包含纯化的甜菊醇糖苷底物或部分纯化的甜菊醇糖苷底物。
在一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是甜叶悬钩子苷。
在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是甜菊苷。
在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是莱鲍迪苷A。
在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是莱鲍迪苷D。
靶甜菊醇糖苷可以是任何已知的甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。
在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。
在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。
在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷X。
UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个实施方案中，在宿主中产生UDP-葡萄糖基转移酶。宿主可以是例如大肠杆菌(E.coli)、酵母菌属的种(Saccharomycessp.)、曲霉菌属的种(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)。在另一个实施方案中，合成UDP-葡萄糖基转移酶。
可以以任何适当形式(包括游离的、固定的形式或作为完整细胞系统)提供UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶的纯度可发生变化，例如，其可以提供为粗制的、半纯化的或纯化的酶制剂。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是游离的。在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是固定的，例如固定在无机或有机支持物上。在另一个实施方案中，以完整细胞系统的形式(例如作为活微生物细胞)或以细胞裂解物的形式提供UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷以形成甜菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊苷以形成莱鲍迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A以形成莱鲍迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷X的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
任选地，本发明的方法还包括再循环UDP以产生UDP-葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括，通过提供再循环催化剂和再循环底物来再循环UDP，从而可使用催化量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行甜菊醇糖苷底物至靶甜菊醇糖苷的生物转化(图3)。
在一个实施方案中，再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一个实施方案中，再循环底物是蔗糖。
任选地，本发明的方法还包括，将靶甜菊醇糖苷与起始组合物分离。可通过任何适当的方法例如结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或这类方法的组合来分离靶甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，分离产生包含按干重计超过约80%的靶甜菊醇糖苷的组合物，即高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。在另一个实施方案中，分离产生包含按重量计超过90%的靶甜菊醇糖苷的组合物。在特定实施方案中，组合物包含按重量计超过约95%的靶甜菊醇糖苷。
靶甜菊醇糖苷可以以任何多态形式或无定形形式(包括水合物、溶剂化物、无水形式或其组合)存在。
纯化的靶甜菊醇糖苷可用作甜味剂用于可消费产品。适当的可消费产品包括但不限于食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
附图概述
附图用于提供对本发明的进一步理解。附图举例说明本发明的实施方案并且与说明书一起用于解释本发明的实施方案的原理。
图1显示reb X的结构。
图2显示从甜菊苷生物催化产生reb X。
图3显示使用酶UGT76G1从甜菊苷生物催化产生reb A，以及通过蔗糖合酶进行UDP至UDP-葡萄糖的伴随再循环。
图4显示reb X的IR谱。
图5显示从reb D生物催化产生reb X的产物的HPLC色谱，如实施例14中描述的。保留时间为24.165分钟的峰对应于未反应的reb D。保留时间为31.325分钟的峰对应于rebX。
图6显示通过生物催化从reb D产生的纯化的reb X的HPLC色谱。
图7显示reb X标准品的HPLC色谱。
图8显示reb X标准品与从reb D的生物转化纯化的reb X的共注射的HPLC色谱。
图9显示reb X标准品和在reb D的生物转化后纯化的reb X的1HNMR谱的叠加。
图10显示从reb D生物催化产生后纯化的reb X的HRMS谱。
详细说明
本发明提供了，从包含甜菊醇糖苷底物的起始组合物制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化方法，其中与甜菊醇糖苷底物相比，靶甜菊醇糖苷包含一个或多个额外的葡萄糖单位。
本发明的一个目的是，提供从其它甜菊醇糖苷和/或其混合物制备甜菊醇糖苷，特别地甜菊苷、reb A、reb D和reb X的高效生物催化方法。
如本文中所用，"生物催化"或"生物催化的"是指，使用天然催化剂例如酶蛋白质来对有机化合物进行化学转化。生物催化也可称为生物转化或生物合成。分离的生物催化法和完整细胞生物催化法都是本领域已知的。生物催化剂酶蛋白可以是天然存在的或重组产生的蛋白质。
如本文中所用，术语"甜菊醇糖苷"是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于天然存在的甜菊醇糖苷，例如甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O，合成的甜菊醇糖苷，例如酶促葡糖基化(glucosylated)的甜菊醇糖苷及其组合。
甜菊醇及其糖苷的化学结构
(Glc=葡萄糖)
起始组合物
如本文中所用，"起始组合物"是指，包含一种或多钟甜菊醇糖苷的任何组合物(通常是水溶液)，其中一种或多种甜菊醇糖苷用作生物转化的底物。
在一个实施方案中，起始组合物包含一种或多种甜菊醇糖苷，所述甜菊醇糖苷选自甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。在特定实施方案中，起始组合物包含两种或更多种甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，起始组合物包含甜菊醇糖苷底物甜叶悬钩子苷。
在一个实施方案中，起始组合物包含甜菊醇糖苷底物甜菊苷。
在另一个实施方案中，起始组合物包含甜菊醇糖苷底物莱鲍迪苷A。
在另一个实施方案中，起始组合物包含甜菊醇糖苷底物莱鲍迪苷D。
起始组合物可以是合成的或纯化的(部分或完全地)，商购可得的或制备的。用于本发明方法的起始组合物的一个实例是，从甜叶菊植物材料(例如叶)的纯化获得的提取物。起始组合物的另一个实例是，与溶剂一起形成溶液的商购可得的甜叶菊提取物。起始组合物的另一个实例是，与溶剂一起形成溶液的商购可得的甜菊醇糖苷的混合物。其它适当的起始组合物包括，分离和纯化甜菊醇糖苷的方法的副产物。
在一个实施方案中，起始组合物包含纯化的甜菊醇糖苷底物。例如，起始组合物可包含按干重计超过约99%的特定底物甜菊醇糖苷。
在另一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的底物甜菊醇糖苷组合物。例如，起始组合物包含按干重计超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的特定底物甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，起始组合物包含纯化的甜叶悬钩子苷。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过99%的甜叶悬钩子苷。在另一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的甜叶悬钩子苷。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的甜叶悬钩子苷。
在一个实施方案中，起始组合物包含纯化的甜菊苷。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过99%的甜菊苷。在另一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的甜菊苷。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的甜菊苷。
在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的莱鲍迪苷A。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约99%的莱鲍迪苷A。在另一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的莱鲍迪苷A。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的莱鲍迪苷A。
在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的莱鲍迪苷D。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约99%的莱鲍迪苷D。在另一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的莱鲍迪苷D。在特定实施方案中，起始组合物包含按干重计超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的莱鲍迪苷D。
起始组合物的甜菊醇糖苷组分用作底物用于产生靶甜菊醇糖苷，如本文中所述。靶甜菊醇糖苷在化学上与其对应的甜菊醇糖苷底物相异在于一个或多个葡萄糖单位的添加。
靶甜菊醇糖苷
本发明的靶甜菊醇糖苷可以是，可通过本文中公开的方法制备的任何甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷选自甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷I、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N或莱鲍迪苷O。
在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb A。在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb D。在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是reb X。
靶甜菊醇糖苷可以是任何多态形式或无定形形式，包括水合物、溶剂化物、无水形式或其组合。
在一个实施方案中，本发明是用于从甜叶悬钩子苷产生甜菊苷的生物催化法，其中起始组合物包含甜菊醇糖苷底物甜叶悬钩子苷。在特定实施方案中，本发明是用于从甜叶悬钩子苷产生甜菊苷的生物催化法，其中起始组合物包含部分纯化的甜叶悬钩子苷。在另一个具体的实施方案中，本发明是用于从甜叶悬钩子苷产生甜菊苷的生物催化法，其中起始组合物包含纯化的甜叶悬钩子苷。
在一个实施方案中，本发明是用于从甜菊苷产生reb A的生物催化法，其中起始组合物包含甜菊醇糖苷底物甜菊苷。在特定实施方案中，本发明是用于从甜菊苷产生reb A的生物催化法，其中起始组合物包含部分纯化的甜菊苷。在另一个具体的实施方案中，本发明是用于从甜菊苷产生reb A的生物催化法，其中起始组合物包含纯化的甜菊苷。
在另一个实施方案中，本发明是用于从reb A产生reb D的生物催化法，其中起始组合物包含甜菊醇糖苷底物reb A。在特定实施方案中，本发明是用于从reb A产生reb D的生物催化法，其中起始组合物包含部分纯化的reb A。在另一个具体的实施方案中，本发明是用于从reb A产生reb D的生物催化法，其中起始组合物包含纯化的reb A。
在另一个实施方案中，本发明是用于从reb D产生reb X的生物催化法，其中起始组合物包含甜菊醇糖苷底物reb D。在特定实施方案中，本发明是用于从reb D产生reb X的生物催化法，其中起始组合物包含部分纯化的reb D。在另一个具体的实施方案中，本发明是用于从reb D产生reb X的生物催化法，其中起始组合物包含纯化的reb D。
在特定实施方案中，靶甜菊醇糖苷存在于混合物中。例如，在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是存在于混合物中的reb X。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷的纯度相对于存在于起始组合物中的靶甜菊醇糖苷的纯度增加。例如，本发明的方法导致存在于起始组合物中的reb X的纯度增加。
任选地，本发明的方法还包括，将靶甜菊醇糖苷与起始组合物分离。靶甜菊醇糖苷可通过任何适当的方法例如结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或这类方法的组合来分离。
在特定实施方案中，本文中公开的方法产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。如本文中所用，术语"高度纯化的"是指，组合物具有按干重计超过约80%的靶甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物包含按干重计超过约90%的靶甜菊醇糖苷，例如，按干重计91%，超过约92%，超过约93%，超过约94%，超过约95%，超过约95%，超过约97%，超过约98%或超过约99%的靶甜菊醇糖苷含量。
在更具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb X时，本文中描述的方法提供了具有按干重计超过约90%的reb X含量的组合物。在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb X时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95%的reb X含量的组合物。
在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D时，本文中描述的方法提供了具有按干重计超过约90%的reb D含量的组合物。在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb D时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95%的reb D含量的组合物。
在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约90%的reb A含量的组合物。在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是reb A时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95%的reb A含量的组合物。
在另一个具体实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是甜菊苷时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约90%的甜菊苷含量的组合物。在另一个具体的实施方案中，当靶甜菊醇糖苷是甜菊苷时，本文中描述的方法提供了包含按干重计超过约95%的甜菊苷含量的组合物。
在一个实施方案中，进行本发明的生物催化法超过一次，从而由第一生物催化法产生的靶甜菊醇糖苷用作其中产生靶甜菊醇糖苷的第二生物催化法的甜菊醇糖苷底物(其也可被认为是中间靶甜菊醇糖苷)。
在特定实施方案中，本发明提供了通过下述来制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法：将包含甜菊醇糖苷底物的起始组合物与UDP-葡萄糖基转移酶接触，从而产生包含中间靶甜菊醇糖苷(其与甜菊醇糖苷底物相比，包含一个或多个额外的葡萄糖单位)的组合物；将包含中间靶甜菊醇糖苷的组合物与UDP-葡萄糖基转移酶接触，从而产生与中间靶甜菊醇糖苷相比包含一个或多个额外的葡萄糖单位的靶甜菊醇糖苷。取决于方法进行的次数，可存在一个或多个参与产生靶甜菊醇糖苷的中间靶甜菊醇糖苷(例如，第一中间靶甜菊醇糖苷、第二中间靶甜菊醇糖苷、第三中间靶甜菊醇糖苷)。
UDP-葡萄糖基转移酶
本发明方法是生物催化性的，即，利用生物催化剂。在一个实施方案中，生物催化剂是酶蛋白质。在特定实施方案中，生物催化剂是UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶在宿主例如微生物中产生。例如，将编码UDP-葡萄糖基转移酶的DNA序列克隆入表达载体，随后转移进入生产宿主例如微生物例如细菌。适当的宿主的非限定性实例包括大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种。可基于其物理和化学性质，使用本领域已知的技术从细胞提取物分离过表达的蛋白质。用于从宿主分离UDP-葡萄糖基转移酶的代表性非限定性技术包括离心、电泳、液相色谱、离子交换层析、凝胶过滤层析或亲和层析。
UDP-葡萄糖基转移酶可以以粗制的、半纯化的和纯化的酶制剂形式提供。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是游离的。在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是固定的。例如，可将UDP-葡萄糖基转移酶固定至从无机或有机材料制造的固体支持物。适合用于固定UDP-葡萄糖基转移酶的固体支持物的非限定性实例包括，衍生的纤维素或玻璃、陶瓷、金属氧化物或膜。可以例如通过共价附着、吸附、交联、捕获或封装将UDP-葡萄糖基转移酶固定至固体支持物。
用于转化的反应介质通常是水性的，例如纯化的水、缓冲液或其组合。在特定实施方案中，反应介质是缓冲液。适当的缓冲液包括但不限于，PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在特定实施方案中，反应介质是磷酸盐缓冲液。或者，反应介质也可以是有机溶剂。
在一个实施方案中，以完整细胞系统例如活微生物细胞的形式提供UDP-葡萄糖基转移酶。同样地，可任选地使用上文中针对酶的固定而描述的技术，固定完整细胞系统。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷，从而产生甜菊苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT91D2。
在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊苷，从而产生莱鲍迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT76G1。
在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A，从而产生莱鲍迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT91D2。
在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D，从而产生莱鲍迪苷X的任何UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶可以是例如UGT76G1。
任选地，本发明的方法还包括，再循环UDP以提供UDP-葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括，通过提供再循环催化剂(即，能够使UDP-葡萄糖过量产生的生物催化剂)和再循环底物来再循环UDP，从而可使用催化量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行底物甜菊醇糖苷至靶甜菊醇糖苷的转化(图3)。
在一个实施方案中，UDP-葡萄糖再循环催化剂是蔗糖合酶。
在一个实施方案中，再循环底物是蔗糖。
甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化
在一个实施方案中，将包含甜叶悬钩子苷的起始组合物与能够催化UDP-葡萄糖与甜叶悬钩子苷的反应以产生甜菊苷的UDP-葡萄糖基转移酶接触。在一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的甜叶悬钩子苷。在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的甜叶悬钩子苷。在特定实施方案中，起始组合物包含超过99%的甜叶悬钩子苷。在特定实施方案中，起始组合物包含超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的甜叶悬钩子苷。
在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2，其已由Joseph等人(Genbank登录号ACE87855)进行了描述。应指出，相似的序列后来在专利申请PCT/US2011/038967中进行了描述并且命名为UGT91D2e。UGT91D2e与UGT91D11(Genbank登录号AAR06918)共有大于95%的同一性，与Joseph等人的UGT(Genbank登录号ACE87855)共有大于99%的同一性。
在一些实施方案中，通过在宿主微生物中表达来制备UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2。适当的宿主微生物包括但不限于大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种。在特定实施方案中，在大肠杆菌中表达UGT91D2。
UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2可以以游离的形式或以固定的形式提供。酶制剂可以是粗制的、半纯化和纯化的。在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶作为完整细胞系统(例如活微生物细胞或完整微生物细胞)、细胞裂解物和/或以本领域已知的任何其它形式提供。
用于转化的反应介质通常是水性的，且可以是纯化的水、缓冲液或其组合。在特定实施方案中，反应介质是缓冲液。适当的缓冲液包括但不限于PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，反应介质是磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化还包括，添加除了UDP-葡萄糖、甜叶悬钩子苷和UDP-葡萄糖基转移酶外的化合物。例如，在一些实施方案中，反应介质包含MgCl2和/或MnCl2。
可在约0℃至约60℃的温度，例如约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃或约60℃进行反应。在特定实施方案中，在约30℃进行反应。
反应可持续进行1小时至1周，例如，约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约120小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在特定实施方案中，反应进行约120小时。
任选地，用作葡萄糖供体的UDP-葡萄糖可通过使用蔗糖合酶进行再循环(图3)。利用通过蔗糖与UDP之间的反应再循环的UDP-葡萄糖，将甜叶悬钩子苷转化成甜菊苷。因此，以化学计量量使用甜叶悬钩子苷和蔗糖，而UDP以催化量存在。
可利用适当的方法(包括但不限于HPLC、LCMS、TLC、IR或NMR)监测反应。
在一个实施方案中，甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化为至少约2%完成，如通过任何上述方法测定的。在特定实施方案中，甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化为至少约10%完成，至少约20%完成，至少约30%完成，至少约40%完成，至少约50%完成，至少约60%完成，至少约70%完成，至少约80%完成，至少约90%完成。在特定实施方案中，甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化为至少约95%完成。
甜菊苷至reb A的转化
在一个实施方案中，将包含甜菊苷的起始组合物与能够催化UDP-葡萄糖与甜菊苷反应以产生reb A的UDP-葡萄糖基转移酶接触。在化学上，将葡萄糖单位添加至甜菊苷的C13位置上的二糖以提供reb A。在一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的甜菊苷。在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的甜菊苷。在特定实施方案中，起始组合物包含超过99%的甜菊苷。在特定实施方案中，起始组合物包含超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的甜菊苷。
在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。UGT76G1已由Richman等人(Richman,A.,Swanson,A.,Humphrey,T.,Chapman,R.,McGarvey,B.,Pocs,R.,Brandle,J.Functional genomics uncovers three glucosyltransferases involved in thesynthesis of the major sweet glucosides of stevia rebaudiana.The PlantJournal,2005,41,56-67)进行了描述，并且可在Genbank(ACT33422.1)和Uniprot(C7EA09)中获得。该酶在大肠杆菌中过表达并且显示将甜菊苷转化成reb A。
在一些实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT76G1可通过在宿主微生物中表达来制备。适当的宿主微生物包括但不限于大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种。在特定实施方案中，UGT76G1在大肠杆菌中表达。
UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT76G1可以是游离的或固定的。其可以以粗制的、半纯化的和纯化的酶制剂形式存在。UDP-葡萄糖基转移酶还可以以完整细胞系统(例如活微生物细胞、完整微生物细胞)或细胞裂解物的形式和/或本领域已知的任何其它形式提供。
用于转化的反应介质通常是水性的，且可以是纯化的水、缓冲液或其组合。在特定实施方案中，反应介质是缓冲液。适当的缓冲液包括但不限于PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，反应介质是磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，甜菊苷至reb A的转化还包括添加除了UDP-葡萄糖、甜菊苷和UDP-葡萄糖基转移酶以外的化合物。例如，在一些实施方案中，反应介质包括MgCl2和/或MnCl2。
可在约0℃至约60℃的温度，例如约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃或约60℃进行反应。在特定实施方案中，在约30℃进行反应。
反应可持续进行1小时至1周，例如例如，约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约120小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在特定实施方案中，反应进行约120小时。
任选地，用作葡萄糖供体的UDP-葡萄糖可通过使用蔗糖合酶进行再循环(图3)。利用通过蔗糖与UDP之间的反应再循环的UDP-葡萄糖，将甜菊苷转化成reb A。因此，以化学计量量使用甜菊苷和蔗糖，而UDP以催化量存在。
可利用适当的方法(包括但不限于HPLC、LCMS、TLC、IR或NMR)监测反应。
在一个实施方案中，甜菊苷至reb A的生物催化转化或生物转化为至少约50%完成，如通过上文提及的任何方法测定的。在特定实施方案中，甜菊苷至reb A的转化为至少约60%完成，至少约70%完成，至少约80%完成或至少约90%完成。在特定实施方案中，甜菊苷至reb A的转化为至少约95%完成。
reb A至reb D的转化
在一个实施方案中，将包含reb A的起始组合物与能够催化UDP-葡萄糖与reb A反应以产生reb D的UDP-葡萄糖基转移酶接触。在化学上，将葡萄糖单位添加至reb A的C19位置上的单糖以提供reb D。在一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的reb A。在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的reb A。在特定实施方案中，起始组合物包含超过99%的reb A。在特定实施方案中，起始组合物包含超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的rebA。
在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2，其已由Joseph等人(Genbank登录号ACE87855)进行了描述。应指出，相似的序列后来在专利申请PCT/US2011/038967中进行了描述并且命名为UGT91D2e。UGT91D2e与UGT91D11(Genbank登录号AAR06918)共有大于95%的同一性，与Joseph等人的UGT(Genbank登录号ACE87855)共有大于99%的同一性。
在一些实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2通过在宿主微生物中表达来制备。适当的宿主微生物包括但不限于大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种。在特定实施方案中，UGT91D2在大肠杆菌中表达。
UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2可以以游离的形式或固定的形式提供。酶制剂可以是粗制的、半纯化和纯化的。在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶作为完整细胞系统(例如活微生物细胞或完整微生物细胞)、细胞裂解物和/或以本领域已知的任何其它形式提供。
用于转化的反应介质通常是水性的，且可以是纯化的水、缓冲液或其组合。在特定实施方案中，反应介质是缓冲液。适当的缓冲液包括但不限于PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，反应介质是磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，reb A至reb D的转化还包括添加除UDP-葡萄糖、reb A和UDP-葡萄糖基转移酶外的化合物。例如，在一些实施方案中，反应介质包含MgCl2和/或MnCl2。
可在约0℃至约60℃的温度，例如约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃或约60℃进行反应。在特定实施方案中，在约30℃进行反应。
反应可持续进行1小时至1周，例如约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约120小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在特定实施方案中，反应进行约120小时。
任选地，用作葡萄糖供体的UDP-葡萄糖可通过使用蔗糖合酶进行再循环(图3)。利用通过蔗糖与UDP之间的反应再循环的UDP-葡萄糖，将Reb A转化成reb D。因此，以化学计量量使用reb A和蔗糖，而UDP以催化量存在。
可利用适当的方法(包括但不限于HPLC、LCMS、TLC、IR或NMR)监测反应。
在一个实施方案中，reb A至reb D的转化为至少约2%完成，如通过任何上述方法测定的。在特定实施方案中，reb A至reb D的转化为至少约10%完成，至少约20%完成，至少约30%完成，至少约40%完成，至少约50%完成，至少约60%完成，至少约70%完成，至少约80%完成，至少约90%完成。在特定实施方案中，reb A至reb D的转化为至少约95%完成。
reb D至reb X的转化
在一个实施方案中，起始组合物包含reb D，其与能够催化UDP-葡萄糖与reb D反应以产生reb X的UDP-葡萄糖基转移酶接触。在化学上，将葡萄糖单位添加至reb D的C19位置上的二糖以提供reb X。在一个实施方案中，起始组合物包含部分纯化的reb D。在另一个实施方案中，起始组合物包含纯化的reb D。在特定实施方案中，起始组合物包含超过99%的reb D。在特定实施方案中，起始组合物包含超过约50%、约60%、约70%、约80%或约90%的rebD。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在一些实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2可通过在宿主微生物中表达来制备。适当的宿主微生物包括但不限于大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种。在具体实施方案中，UGT91D2在大肠杆菌中表达。
UDP-葡萄糖基转移酶例如UGT91D2可以以游离的形式或固定的形式提供。酶制剂可以是粗制的、半纯化和纯化的。在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶作为完整细胞制剂例如活微生物细胞或以完整微生物细胞的形式、作为细胞裂解物和/或以本领域已知的任何其它形式提供。
用于转化的反应介质通常是水性的，且可以是纯化的水、缓冲液或其组合。在特定实施方案中，反应介质是缓冲液。适当的缓冲液包括但不限于PIPES缓冲液、醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。在一个实施方案中，反应介质是磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，reb D至reb X的转化还使用除UDP-葡萄糖、reb D和UDP-葡萄糖基转移酶外的化合物。例如，在一些实施方案中，反应介质包含MgCl2和/或MnCl2。
可在约0℃至约60℃的温度，例如约10℃、约20℃、约30℃、约40℃、约50℃或约60℃进行反应。在特定实施方案中，在约30℃进行反应。
反应可持续进行1小时至1周，例如约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约72小时、约120小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天。在特定实施方案中，反应进行约120小时。
任选地，用作葡萄糖供体的UDP-葡萄糖可通过使用蔗糖合酶进行再循环(图3)。利用通过蔗糖与UDP之间的反应再循环的UDP-葡萄糖，将Reb D转化成reb X。因此，以化学计量量使用reb D和蔗糖，而UDP以催化量存在。
可利用适当的方法(包括但不限于HPLC、LCMS、TLC、IR或NMR)监测反应。
在一个实施方案中，reb D至reb X的转化为至少约50%完成，如通过任何上述方法测定的。在特定实施方案中，reb D至reb X的转化为至少约60%完成，至少约70%完成，至少约80%完成或至少约90%完成。在特定实施方案中，reb D至reb X的转化为至少约95%完成。
任选地，从所得的组合物纯化靶甜菊醇糖苷。从反应介质纯化靶甜菊醇糖苷可通过提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的任何适当的方法来实现。适当的方法包括结晶、通过膜的分离、离心、提取(液相或固相)、色谱分离、HPLC(制备型或分析型)或这类方法的组合。
在一个实施方案中，可淬灭特定的生物催化转化以终止反应。随后离心所得的混合物。上清液通常包含靶甜菊醇糖苷，并且必要时，随后可进行进一步的纯化。例如，可将分析型或制备型HPLC用于将剩余的靶或起始甜菊醇糖苷或反应副产物与靶甜菊醇糖苷分离。在一个实施方案中，通过分析型HPLC实现分离。在另一个实施方案中，利用制备型HPLC实现分离。本领域技术人员理解，使用的具体HPLC法可基于具体的系统、溶剂和柱子而变化。用于将reb X与reb D分离的适当的系统提供于实施例20中。
还可重复本文中提供的方法，其中当第二次进行该方法时，可将由初次处理产生的组合物(即，包含靶甜菊醇糖苷的组合物)用作起始组合物，或任选地，可从包含靶甜菊醇糖苷的组合物纯化靶甜菊醇糖苷，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物。根据本实施方案，可将第一次进行方法时产生的靶甜菊醇糖苷当作第一靶甜菊醇糖苷或中间靶甜菊醇糖苷，并将其用作产生第二靶甜菊醇糖苷、第二中间靶甜菊醇糖苷或最终的靶甜菊醇糖苷的底物。可根据需要，重复方法多次，以获得最终的靶甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，重复方法一次。在另一个实施方案中，重复方法2次。在另一个实施方案中，重复方法3次。在其它实施方案中，重复方法4、5、6、7、8或9次。本领域技术人员理解，各个反应中使用的具体UDP-葡萄糖基转移酶可以是相同的或不同的，这取决于待将葡萄糖添加至其上的甜菊醇糖苷底物的具体位点。
因此，在一个实施方案中，重复方法一次，其中第一方法的起始组合物包含reb A并且靶甜菊醇糖苷是reb D，并且，其中第二方法的起始组合物包含reb D并且靶甜菊醇糖苷是reb X。
在另一个实施方案中，重复方法2次，其中第一方法的起始组合物包含甜菊苷并且靶甜菊醇糖苷是reb A；第二方法的起始组合物包含reb A并且靶甜菊醇糖苷是reb D；并且，第三方法的起始组合物包含reb D并且靶甜菊醇糖苷是reb X。
在另一个实施方案中，重复方法3次，其中第一方法的起始组合物包含甜叶悬钩子苷并且靶甜菊醇糖苷是甜菊苷；第二方法的起始组合物包含甜菊苷并且靶甜菊醇糖苷是reb A；第三方法的起始组合物包含reb A并且靶甜菊醇糖苷是reb D；并且，第四方法的起始组合物包含reb D并且靶甜菊醇糖苷是reb X。
在一个实施方案中，用于产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的方法包括：
a.将包含甜菊醇糖苷底物的第一起始组合物与第一UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物；
b.任选地将第一靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物；
c.将包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物与第二UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物；
d.任选地将第二靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物；
e.将包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物与第三UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第三靶甜菊醇糖苷的组合物；和
f.任选地将第三靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第三靶甜菊醇糖苷组合物。
在一个实施方案中，第一起始组合物包含甜菊苷，第一靶甜菊醇糖苷是reb A，并且第一UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在其它实施方案中，第二UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第二靶甜菊醇糖苷是reb D。
在其它实施方案中，第三UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第三靶甜菊醇糖苷是reb X。
在一个实施方案中，一个或多个将包含甜菊醇糖苷底物的组合物与UDP-葡萄糖基转移酶接触的步骤还包括，提供能够进行UDP-过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物。
在更具体的实施方案中，用于产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的方法包括：
a.将包含甜菊醇糖苷底物的第一起始组合物与第一UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物；
b.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于再循环的底物；
c.任选地将第一靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物；
d.将包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物与第二UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物；
e.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物；
f.任选地将第二靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物；
g.将包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物与第三UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第三靶甜菊醇糖苷的组合物；和
h.任选地将第三靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第三靶甜菊醇糖苷组合物。
在一个实施方案中，第一起始组合物包含甜菊苷，第一靶甜菊醇糖苷是reb A，并且第一UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
在其它实施方案中，第二UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第二靶甜菊醇糖苷是reb D。
在其它实施方案中，第三UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第三靶甜菊醇糖苷是reb X。
在另一个具体的实施方案中，用于产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的方法包括：
a.将包含甜菊醇糖苷底物的第一起始组合物与第一UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物；
b.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物；
c.任选地将第一靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物；
d.将包含第一靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第一靶甜菊醇糖苷组合物与第二UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物；
e.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物；
f.任选地将第二靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物；
g.将包含第二靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第二靶甜菊醇糖苷组合物与第三UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第三靶甜菊醇糖苷的组合物；和
h.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物；
i.任选地将第三靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第三靶甜菊醇糖苷组合物；
j.将包含第三靶甜菊醇糖苷的组合物或高度纯化的第三靶甜菊醇糖苷组合物与第四UDP-葡萄糖基转移酶接触，以产生包含第四靶甜菊醇糖苷的组合物；和
k.任选地提供能够进行UDP过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物；
l.任选地将第四靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的第四甜菊醇糖苷组合物。
在一个实施方案中，第一起始组合物包含甜叶悬钩子苷，第一靶甜菊醇糖苷是甜菊苷，第一UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
在其它实施方案中，第二UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1并且第二靶甜菊醇糖苷是reb A。
在其它实施方案中，第三UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第三靶甜菊醇糖苷是reb D。
在其它实施方案中，第四UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2并且第四靶甜菊醇糖苷是reb X。
按照本发明制备的纯化的甜菊醇糖苷可用于多种产品，包括但不限于食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
本发明中获得的高纯度reb X(具有1291.29的分子量，C56H90O33的分子式和图1中显示的结构)以白色且没有气味的粉剂的形式存在。当与10%蔗糖溶液相比较时，该化合物比糖甜约200倍。红外吸收光谱示于图4中。
纯reb X化合物的其它性质包括，249-250℃的熔点和[α]D 25-19.0°(于50%乙醇中)的比旋光(C=1.0)。reb X在水中的溶解度为约0.3%，并且随温度的升高而增加。
Reb X在甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇的稀释溶液中是可溶的。然而，其在丙酮、苯、氯仿和乙醚中是不溶的。
根据本发明获得的Reb X是热和pH稳定的。
根据本发明获得的高度纯化的靶糖苷特别地reb D和/或reb X可“原样”使用，或与其它甜味剂、香料和食品成分组合使用。
香料的非限定性实例包括，石灰、柠檬、橙、水果、香蕉、葡萄、梨、菠萝、芒果、苦扁桃、可乐、肉桂、糖、棉花糖和香草香精。
其它食品成分的非限定性实例包括香料、酸化剂、有机和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶(gum)、调质剂(texturizer)、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂和胶凝剂。
根据本发明获得的高度纯化的靶糖苷特别地reb D和/或reb X可以以各种多态形式制备，包括但不限于水合物、溶剂化物、无水形式、无定形形式和/或其混合物。
可将根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X作为高强度天然甜味剂掺入食品、饮料、药物组合物、化妆品、口香糖、桌面产品(table topproduct)、谷物、乳制品、牙膏和其它口腔组合物等。
作为增甜化合物的高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X可用作唯一的甜味剂，或其可与其它天然存在的高强度甜味剂一起使用，所述其它天然存在的高强度甜味剂例如，甜菊苷、reb A、reb B、reb C、reb D、reb E、reb F、甜菊双苷、杜尔可苷A、甜叶悬钩子苷、罗汉果甙、甜味蛋白、新橙皮苷二氢查耳酮、甘草酸及其盐、索马汀、紫苏糖、pernandulcin、mukuroziosides、白元参甙、糙苏甙-I、二甲基-六氢芴-二羧酸、abrusosides、巴西甘草甜素、carnosiflosides、甜茶树甙、pterocaryosides、多足蕨甙A、巴西红木素、hernandulcin、phillodulcin、菝葜苷、根皮苷、三叶甙、二氢黄酮醇、二氢槲皮素-3-乙酸盐、neoastilibin、反式-肉桂醛、monatin及其盐、selligueain A、苏木素、莫尼糖蛋白、水龙骨甜素、pterocaryoside A、pterocaryoside B、马槟榔甜蛋白、pentadin、改味糖蛋白、仙茅甜蛋白、neoculin、绿原酸、西那林、罗汉果甜味剂、罗汉果甙V、赛门苷等。
还可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与合成的高强度甜味剂组合使用，所述合成的高强度甜味剂例如，三氯蔗糖、乙酰舒泛钾、阿司帕坦、阿力甜、糖精、新橙皮苷二氢查耳酮、环己氨基磺酸盐、纽甜、甘素、suosan、N-[N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-α-天冬氨酰基]-L-苯丙氨酸1-甲基酯、N-[N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-3-甲基丁基]-L-α-天冬氨酰基]-L-苯丙氨酸1-甲基酯、N-[N-[3-(3-甲氧基-4-羟苯基)丙基]-L-α-天冬氨酰基]-L-苯丙氨酸1-甲基酯、其盐等。
此外，可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与天然甜味剂抑制剂组合使用，所述天然甜味剂抑制剂例如匙羹藤酸、勿甜素、ziziphin、lactisole等。还可将Reb D和/或reb X与各种鲜味增强剂组合。可将Reb D和/或reb X与鲜味和甜味的氨基酸例如谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、谷氨酸盐和色氨酸混合。
还可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与多元醇或糖醇组合。术语"多元醇"是指，包含超过1个羟基的分子。多元醇可以是分别包含2、3和4个羟基的二元醇、三元醇或四元醇。多元醇还可包含超过4个羟基，例如五元醇、六元醇、七元醇等，其分别包含5、6或7个羟基。此外，多元醇(polyol)还可以是糖醇、多羟基醇(polyhydric alcohol)或多元醇(polyalcohol)，其为碳水化合物的还原形式，其中羰基(醛或酮、还原糖)被还原成伯醇或仲醇羟基。多元醇的实例包括但不限于，赤藓醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨醇、拉克替醇、木糖醇、肌醇、异麦芽酮糖醇、丙二醇、甘油、苏糖醇、半乳糖醇、氢化异麦芽酮糖、还原的异麦芽糖寡糖、还原的低聚木糖、还原的龙胆低聚糖、还原的麦芽糖浆、还原的葡萄糖浆、氢化的淀粉水解产物、氢化葡萄糖和糖醇或能够被还原的不会不利地影响甜味剂组合物的味道的任何其它碳水化合物。
可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与降卡路里甜味剂例如D-塔格糖、L-糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖等组合。
还可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与各种碳水化合物组合。术语"碳水化合物"通常是指，用多个羟取代的醛或酮化合物，具有通式(CH2O)n，其中n为3-30，以及它们的寡聚物和多聚物。此外，本发明的碳水化合物可在一个或多个位置上被取代或脱氧。如本文中所用，碳水化合物包括未修饰的碳水化合物、碳水化合物衍生物、经取代的碳水化合物和经修饰的碳水化合物。如本文中所用，短语"碳水化合物衍生物"、"经取代的碳水化合物"和"经修饰的碳水化合物"是同义的。经修饰的碳水化合物意指，其中至少一个原子被添加、除去或取代或其组合的任何碳水化合物。因此，碳水化合物衍生物或经取代的碳水化合物包括取代和未取代的单糖、二糖、寡糖和多糖。碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物任选地可在任何对应的C-位置上被脱氧，和/或可被一个或多个部分取代，所述部分例如氢、卤素、卤代烷基、羧基、酰基、酰氧基、氨基、酰胺基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、硫基、巯基、亚胺基、磺酰基、亚氧硫基、亚硫酰基、氨磺酰基、烷氧羰基、甲酰胺基、膦酰基、氧膦基、磷酰基、膦基、硫酯、硫醚、肟基、肼基、氨基甲酰基、磷酸基、phosphonato或任何其它活性官能团，只要碳水化合物衍生物或取代的碳水化合物能够改善甜味剂组合物的甜味。
可按照本发明使用的碳水化合物的实例包括但不限于，塔格糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、各种环糊精、环状寡糖、各种类型的麦芽糊精、葡聚糖、蔗糖、葡萄糖、核酮糖、果糖、苏糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、艾杜糖、乳糖、麦芽糖、转化糖、异海藻糖、新海藻糖、异麦芽酮糖、赤藓糖、脱氧核糖、古洛糖、艾杜糖、塔洛糖、赤藓酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、松二糖、纤维二糖、支链淀粉、葡糖胺、甘露糖胺、岩藻糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖酸内酯、阿比可糖、半乳糖胺、甜菜寡糖、异麦芽糖寡糖(异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖等)、低聚木糖(木三糖、木二糖等)、木糖末端寡糖(xylo-terminated oligosaccharides)、龙胆低聚糖(龙胆二糖、龙胆三糖、龙胆四糖等)、山梨糖、黑曲霉寡糖、帕拉金糖寡糖、果糖寡聚体(蔗果三糖、霉菌赤藓醛糖等)、麦芽四醇(maltotetraol)、麦芽三醇(maltotriol)、麦芽低聚糖(麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖等)、淀粉、菊粉、菊粉寡糖、乳果糖、蜜二糖、棉子糖、核糖、异构化液体糖例如高果糖玉米糖浆、偶联糖和大豆寡糖。此外，本文中使用的碳水化合物可以为D或L构型。
可将根据发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X与各种生理学活性物质或功能成分组合使用。功能成分通常被分成种类，例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂苷、抗氧化剂、营养制品、黄酮类物质、异硫氰酸盐类、酚类、植物甾醇和甾烷醇(植物甾醇和植物甾烷醇)；多元醇；益生元、益生菌；植物雌激素；大豆蛋白；硫化物/硫醇；氨基酸；蛋白质；维生素；和矿物质。功能成分还可基于它们的健康益处(例如心血管、降胆固醇和抗炎)进行分类。
可将根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X作为高强度甜味剂用于产生零卡路里、降卡路里或糖尿病饮料和食品(具有改善的味道特征)。其还可用于饮料、食品、药物以及其中不能使用糖的其它产品。此外，高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X还可作为甜味剂，不仅可用于饮料、食品和专门用于人消费的其它产品，而且还可用于具有改善的特征的动物饲料和草料。
其中可将高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X用作增甜化合物的产品的实例包括但不限于，酒精性饮料例如伏特加酒、葡萄酒、啤酒、酒(liquor)和清酒(sake)等；天然汁；提神饮料；碳酸软饮料；减肥饮料；零卡路里饮料；降卡路里饮料和食品；酸奶饮料；速溶汁液(instant juices)；速溶咖啡；粉末型速溶饮料；罐头产品；糖浆；发酵豆瓣酱；大豆酱油；醋；敷料；蛋黄酱；蕃茄酱；咖喱食品；汤；即时肉汤(instant bouillon)；粉末大豆酱油；粉末醋；各种类型的饼干；米饼；薄脆饼干(cracker)；面包；巧克力；焦糖；糖果；口香糖；果冻；布丁；腌制水果及蔬菜；鲜奶油；果酱；桔子酱；糖花原料(flower paste)；奶粉；冰淇淋；冰糕；包装在瓶中的蔬菜和水果；罐头和水煮豆类(canned and boiledbeans)；甜酱中煮的肉类和食品；农业蔬菜食品；海产食品；火腿；香肠；鱼火腿；鱼香肠；鱼糊；炸鱼制品；干海鲜产品；冷冻食品；腌制海藻(preserved seaweed)；腌肉；烟草；药品；等等。原则上，其具有不受限制的应用。
在产品例如食品、饮料、药物、化妆品、桌面产品(table top product)和口香糖的制造过程中，可使用常规方法例如混合、捏和、溶出、浸酸、渗透、渗滤、喷洒、雾化、灌注等方法。
此外，根据本发明获得的高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X可以以干燥形式或液体形式使用。其可在食品的热处理之前或之后添加。高度纯化的靶甜菊醇糖苷特别地reb D和/或reb X的量取决于使用目的。如上所述，其可单独地添加，或与其它化合物组合地添加。
下列实施例举例说明用于制备高度纯化的靶甜菊醇糖苷，特别地reb D和/或rebX的本发明优选实施方案。应理解，本发明不限于实施例中所示的、仅为示例性的材料、比例、条件和方法。
实施例1
UGT76G1的体内产生
将NcoI和NdeI限制位点添加至Genbank登录号AAR06912.1中描述的原始核酸序列。在密码子最优化后，获得了下述核酸序列(SEQ ID NO.1)：
序列表
CCATGGCCCATATGGAAAACAAAACCGAAACCACCGTTCGTCGTCGTCGCC
GTATTATTCTGTTTCCGGTTCCGTTTCAGGGTCATATTAATCCGATTCTGCAG
CTGGCAAATGTGCTGTATAGCAAAGGTTTTAGCATTACCATTTTTCATACCAA
TTTTAACAAACCGAAAACCAGCAATTATCCGCATTTTACCTTTCGCTTTATTCT
GGATAATGATCCGCAGGATGAACGCATTAGCAATCTGCCGACACATGGTCCG
CTGGCAGGTATGCGTATTCCGATTATTAACGAACATGGTGCAGATGAACTGC
GTCGTGAACTGGAACTGCTGATGCTGGCAAGCGAAGAAGATGAAGAAGTTA
GCTGTCTGATTACCGATGCACTGTGGTATTTTGCACAGAGCGTTGCAGATAG
CCTGAATCTGCGTCGTCTGGTTCTGATGACCAGCAGCCTGTTTAACTTTCAT
GCACATGTTAGCCTGCCGCAGTTTGATGAACTGGGTTATCTGGATCCGGATG
ATAAAACCCGTCTGGAAGAACAGGCAAGCGGTTTTCCGATGCTGAAAGTGAA
AGATATCAAAAGCGCCTATAGCAATTGGCAGATTCTGAAAGAAATTCTGGGC
AAAATGATTAAACAGACCAAAGCAAGCAGCGGTGTTATTTGGAATAGCTTTAA
AGAACTGGAAGAAAGCGAACTGGAAACCGTGATTCGTGAAATTCCGGCACC
GAGCTTTCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCAAGCAGCAGCAGCCT
GCTGGATCATGATCGTACCGTTTTTCAGTGGCTGGATCAGCAGCCTCCGAGC
AGCGTTCTGTATGTTAGCTTTGGTAGCACCAGCGAAGTTGATGAAAAAGATTT
TCTGGAAATTGCCCGTGGTCTGGTTGATAGCAAACAGAGCTTTCTGTGGGTT
GTTCGTCCGGGTTTTGTTAAAGGTAGCACCTGGGTTGAACCGCTGCCGGAT
GGTTTTCTGGGTGAACGTGGTCGTATTGTTAAATGGGTTCCGCAGCAAGAAG
TTCTGGCACACGGCGCAATTGGTGCATTTTGGACCCATAGCGGTTGGAATAG
CACCCTGGAAAGCGTTTGTGAAGGTGTTCCGATGATTTTTAGCGATTTTGGT
CTGGATCAGCCGCTGAATGCACGTTATATGAGTGATGTTCTGAAAGTGGGTG
TGTATCTGGAAAATGGTTGGGAACGTGGTGAAATTGCAAATGCAATTCGTCG
TGTTATGGTGGATGAAGAAGGTGAATATATTCGTCAGAATGCCCGTGTTCTG
AAACAGAAAGCAGATGTTAGCCTGATGAAAGGTGGTAGCAGCTATGAAAGCC
TGGAAAGTCTGGTTAGCTATATTAGCAGCCTGTAATAACTCGAG
在合成基因并且使用NdeI和XhoI克隆位点将其亚克隆入pET30A+载体后，通过电穿孔将UGT76Gl_pET30a+质粒引入大肠杆菌B121(DE3)和大肠杆菌EC100。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养在培养皿中，选择适当的菌落，让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为抗冻剂添加至悬浮液，且将400μL等分试样贮存于-20℃和-80℃。
将含有pET30A+_UGT76Gl质粒的大肠杆菌BL21(DE3)的贮存等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素)。使该培养物在30℃以135rpm振荡8h。
生产培养基包含60g/L的过夜表达速溶TB培养基(Overnight express instantTB medium，Novagen)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素。在20℃搅拌培养基，同时采集样品以测量OD和pH。培养物显著生长，并且获得了良好OD。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻，产生12.7g的细胞湿重。
通过添加Bugbuster Master混合物(Novagen)进行裂解，通过离心回收裂解物，并且将其保持冷冻。利用解冻的裂解物进行活性测试。
实施例2
UGT76G1的体外产生
使用来自Promega的S30T7高产率蛋白质表达系统试剂盒。将来自大肠杆菌EC100的4μg UGT76Gl_pET30a+质粒与80μL的S30premixplus混合，并添加72μL的S30T7提取物。添加不含核酸酶的水以获得200μL的总体积，并将所得的溶液在30℃温育2h。将180μL用于催化测试反应。
实施例3
UGT91D2的体外产生
将NcoI和NdeI限制位点添加至Genbank登录号ACE87855.1中描述的原始核酸序列。在密码子最优化后，获得下述核酸序列(SEQ ID NO.2)：
序列表
CCATGGCACATATGGCAACCAGCGATAGCATTGTTGATGATCGTAAACAGCT
GCATGTTGCAACCTTTCCGTGGCTGGCATTTGGTCATATTCTGCCGTATCTG
CAGCTGAGCAAACTGATTGCAGAAAAAGGTCATAAAGTGAGCTTTCTGAGCA
CCACCCGTAATATTCAGCGTCTGAGCAGCCATATTAGTCCGCTGATTAATGTT
GTTCAGCTGACCCTGCCTCGTGTTCAAGAACTGCCGGAAGATGCCGAAGCA
ACCACCGATGTTCATCCGGAAGATATTCCGTATCTGAAAAAAGCAAGTGATG
GTCTGCAGCCGGAAGTTACCCGTTTTCTGGAACAGCATAGTCCGGATTGGAT
CATCTATGATTATACCCATTATTGGCTGCCGAGCATTGCAGCAAGCCTGGGT
ATTAGCCGTGCACATTTTAGCGTTACCACCCCGTGGGCAATTGCATATATGG
GTCCGAGCGCAGATGCAATGATTAATGGTAGTGATGGTCGTACCACCGTTGA
AGATCTGACCACCCCTCCGAAATGGTTTCCGTTTCCGACCAAAGTTTGTTGG
CGTAAACATGATCTGGCACGTCTGGTTCCGTATAAAGCACCGGGTATTAGTG
ATGGTTATCGTATGGGTCTGGTTCTGAAAGGTAGCGATTGTCTGCTGAGCAA
ATGCTATCATGAATTTGGCACCCAGTGGCTGCCGCTGCTGGAAACCCTGCAT
CAGGTTCCGGTTGTTCCGGTGGGTCTGCTGCCTCCGGAAGTTCCGGGTGAT
GAAAAAGATGAAACCTGGGTTAGCATCAAAAAATGGCTGGATGGTAAACAGA
AAGGTAGCGTGGTTTATGTTGCACTGGGTAGCGAAGTTCTGGTTAGCCAGAC
CGAAGTTGTTGAACTGGCACTGGGTCTGGAACTGAGCGGTCTGCCGTTTGTT
TGGGCATATCGTAAACCGAAAGGTCCGGCAAAAAGCGATAGCGTTGAACTG
CCGGATGGTTTTGTTGAACGTACCCGTGATCGTGGTCTGGTTTGGACCAGCT
GGGCACCTCAGCTGCGTATTCTGAGCCATGAAAGCGTTTGTGGTTTTCTGAC
CCATTGTGGTAGCGGTAGCATTGTGGAAGGTCTGATGTTTGGTCATCCGCTG
ATTATGCTGCCGATTTTTGGTGATCAGCCGCTGAATGCACGTCTGCTGGAAG
ATAAACAGGTTGGTATTGAAATTCCGCGTAATGAAGAAGATGGTTGCCTGAC
CAAAGAAAGCGTTGCACGTAGCCTGCGTAGCGTTGTTGTTGAAAAAGAAGGC
GAAATCTATAAAGCCAATGCACGTGAACTGAGCAAAATCTATAATGATACCAA
AGTGGAAAAAGAATATGTGAGCCAGTTCGTGGATTATCTGGAAAAAAACACC
CGTGCAGTTGCCATTGATCACGAAAGCTAATGACTCGAG
在合成基因并且使用NcoI和Xho1克隆位点将其亚克隆入pET30A+载体后，通过电穿孔将UGT91D2_pET30a+质粒引入大肠杆菌EC100。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下培养，选择适当的菌落，让其在液体LB培养基(埃伦迈尔烧瓶)中生长。将甘油作为抗冻剂添加至悬浮液，且将400μL等分试样贮存于-20℃和-80℃。
将来自Promega的S30T7高产率蛋白质表达系统试剂盒用于蛋白质的体外合成。
将4μg的UGT91D2_pET30a+质粒与80μL的S30premix plus混合，并添加72μL的S30T7提取物。添加不含核酸酶的水以获得200μL的总体积，并将所得的溶液在30℃温育2h。将5μL用于SDS-page分析，而将剩余的45μL用于催化测试反应。
实施例4
利用体内产生的UGT76G1的催化反应
反应的总体积为5.0mL，且具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2、3mM MgCl2、2.5mM UDP-葡萄糖、0.5mM甜菊苷和500μL的UGT76G1解冻裂解物。在30℃在轨道振荡器上以135rpm运行反应。对于每一个样品，用40μL的2N H2SO4和420μL的甲醇/水(6/4)淬灭用460μL的反应混合物。将样品立即离心，保持在10℃，随后进行HPLC(CAD)分析。HPLC显示，几乎完全的甜菊苷至莱鲍迪苷A的转化。
通过CAD测量的UGT76G1催化的甜菊苷至Reb A的转化
实施例5
利用体外产生的UGT91D2的催化反应
反应的总体积为0.5mL，且具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2,3mM MgCl2,3.8mM UDP-葡萄糖,0.1mM莱鲍迪苷A和180μL的体外产生的UGT91D2。在30℃在轨道振荡器上以135rpm运行反应。对于每一个样品，用45μL的2N H2SO4和405μL的60%MeOH淬灭450μL的反应混合物。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC显示，120h后，4.7%的莱鲍迪苷A转化为莱鲍迪苷D。
实施例6
利用体外产生的UGT76G1的催化反应
反应的总体积为2mL，且具有下列组成：50mM磷酸钠缓冲液pH7.2,3mM MgCl2,3.8mM UDP-葡萄糖,0.5mM莱鲍迪苷D和180μL的体外产生的UGT76G1。在30℃在轨道振荡器上以135rpm运行反应。对于每一个样品，用40μL的2N H2SO4和360μL的60%MeOH淬灭400μL的反应混合物。离心后，通过HPLC(CAD)分析上清液。HPLC显示，120h后，80%的莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷X。
由体外产生的UGT76G1催化的从莱鲍迪苷D至莱鲍迪苷X的合成/CAD检测
对于实施例7至12，使用下列缩写：
LBGKP培养基：20g/L Luria Broth Lennox；50mM PIPES缓冲液pH7.00；50mM磷酸盐缓冲液pH7.00；2.5g/L葡萄糖和50mg/L卡那霉素或氨苄青霉素
LB培养基:(20g/L Luria Broth Lennox)
实施例7
利用pET30a+质粒和BL21(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
将pET30a+_UGT76Gl质粒转化入BL21(DE3)表达菌株(Lucigen E.EXPRESS Electrocompetent Cells)。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，并将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基。使该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在20℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。所得的细胞湿重为10.58g。
通过添加8.1mL的Bugbuster Master混合物(Novagen，目录号71456)和3.5mL的水来裂解3.24g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例8
利用pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
通过热激处理将pET30a+_UGT76Gl质粒转化入Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有卡那霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至100mL的含有50mg/L卡那霉素的LB培养基。使该培养物在30℃振荡15h。将4.4mL的该培养物用于接种200mL的含有LB的生产培养基。在37℃搅拌该培养基直至获得0.9的OD(600nm)，之后添加400μL的100mM IPTG溶液，并在30℃搅拌培养基4小时。通过离心收获细胞，将其冷冻。所得的细胞湿重为1.38g。
通过添加4.9mL的"Bugbuster Master混合物(Novagen，目录号71456)和2.1mL的水来裂解获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例9
利用pMAL质粒和BL21表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
在使用Nde1和Sal1克隆位点将合成的UGT76G1基因亚克隆入pMAL后，通过热激处理将pMAL_UGT76Gl质粒转化入BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)。将获得的细胞在氨苄青霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，并将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。在20℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD和pH。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为5.86g。
通过添加9.6mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和4.1mL的水来裂解2.74g的获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例10
利用pMAL质粒和ArcticExpress表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
通过热激处理将pMAL_UGT76Gl质粒转化入ArcticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。将获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。在12℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为8.96g。
通过添加8.73mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和3.79mL的水来裂解2.47g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例11
利用pCOLDIII质粒和ArcticExpress表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
使用Nde1和Xho1克隆位点将合成的UGT76G1基因亚克隆入pCOLDIII质粒后，通过热激处理将pCOLDIII_UGT76Gl质粒转化入ArcticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。将获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在12℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。63小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为6.54g。
通过添加9.8mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和4.2mL的水来裂解2.81g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例12
利用pCOLDIII质粒和Origami2(DE3)表达菌株制备的UGT76G1的制剂和活性
通过热激处理将pCOLDIII_UGT76Gl质粒转化入Origami2(DE3)表达菌株(NovagenOrigamiTM2(DE3)感受态细胞)。将所获得的细胞在氨苄青霉素存在的情况下于培养皿中培养于LB琼脂培养基上。选择合适的菌落，让其在包含氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素)。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L卡那霉素的生产培养基。在12℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。68小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为2.53g。
通过添加6.0mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和1.9mL的水来裂解1.71g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其保持冷冻。
实施例13
活性的测定
使用0.5mM的底物、2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM MgCl2(于50mM磷酸钠缓冲液，pH7.2中)，利用500μL解冻裂解物，以5mL规模进行关于甜菊苷至莱鲍迪苷A以及莱鲍迪苷D至莱鲍迪苷X的转化的活性测试。采集样品，通过HPLC进行分析。UGT76G1的不同制剂的结果概述于下表中。
*注意
甜菊苷和莱鲍迪苷X的转化的活性表示为每mL裂解物的活性。1U将在30℃和pH7.2下于1小时内转化1μmol的底物。
实施例14
用于将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷X的50mL规模的反应
将5mL实施例12的裂解物用于以50mL规模将莱鲍迪苷D转化成莱鲍迪苷X。反应介质由50mM磷酸钠缓冲液pH7.2,3mM的MgCl2,2.5mM的UDP-葡萄糖和0.5mM的莱鲍迪苷D组成。使反应在30℃振荡90h后，添加50mL的乙醇，并在-20℃搅拌所得的混合物1小时。在以5000g离心10min后，通过超滤(Vivaflow MWCO30000)纯化上清液。获得78mL的渗透物；用9mL的乙醇稀释9mL的渗余物，并使其再次经历超滤(Vivaflow MWCO30000)。获得另外14mL的滤液，将其与第一渗透物组合。在30℃于减压下浓缩组合的渗透物直至获得32mL澄清溶液。
产物混合物的HPLC描迹线示于图5中。在配备有二元泵(binary pump)、自动采样器和恒温柱箱(thermostat column compartment)的Agilent1200系列上进行HPLC。该方法是等强度的(isocratic)，流动相由70%的水(0.1%甲酸):30%乙腈组成。流速为0.1μL/min。使用的柱子是Phenomenex Prodigy5μODS(3)100A；250x2mm。将柱子温度维持在40℃。注射体积为20-40μL。
实施例15
使用pMAL质粒和BL21表达菌株制备UGT91D2
在使用Nde1和Sal1克隆位点将合成的UGT91D2基因亚克隆入pMAL质粒后，通过热激处理将pMAL_UGT91D2质粒转化入BL21表达菌株(New England Biolabs BL21感受态大肠杆菌)。将获得的细胞在氨苄青霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有氨苄青霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。在20℃搅拌培养基，并采集样品以测量OD和pH。40小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为12.32g。
通过添加7.7mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和3.2mL的水来裂解2.18g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其直接用于活性测试。
实施例16
使用pMAL质粒和ArcticExpress表达菌株产生UGT91D2
通过热激处理将pMAL_UGT91D2质粒转化入ArcticExpress表达菌株(AgilentArcticExpress感受态细胞)。将获得的细胞在氨苄青霉素和遗传霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在含有氨苄青霉素和遗传霉素的液体LBGKP培养基中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(含有氨苄青霉素和遗传霉素)。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。在20℃搅拌培养基16h，随后在12℃再搅拌50h，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为15.77g。
通过添加9.0mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和3.8mL的水来裂解2.57g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其直接用于活性测试。
实施例17
使用pET30a+质粒和Tuner(DE3)表达菌株制备UGT91D2
通过热激处理将pET30a+_UGT91D2质粒转化入Tuner(DE3)表达菌株(NovagenTunertm(DE3)感受态细胞)。将获得的细胞在卡那霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在液体LBGKP培养基(含有卡那霉素)中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至100mL的含50mg/L卡那霉素的LB培养基。将该培养物在30℃振荡15h。将6.2mL的该培养物用于接种500mL的含有LB的生产培养基。在37℃搅拌该培养基直至获得0.9的OD(600nm)，随后添加500μL的100mM IPTG溶液(培养基中的IPTG浓度为100μM)，并在30℃搅拌培养基4小时。通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为4.02g。
通过添加6.8mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和2.8mL的水来裂解1.92g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，并直接测试其活性。
实施例18
使用pET30a+质粒和ArcticExpress表达菌株制备UGT91D2
通过热激处理将pET30a+_UGT91D2质粒转化入ArcticExpress(DE3)表达菌株(Agilent ArcticExpress感受态细胞)。将获得的细胞在卡那霉素和遗传霉素存在的情况下于培养皿中培养在LB琼脂培养基上。选择适当的菌落，让其在液体LBGKP培养基(含有卡那霉素和遗传霉素)中生长。添加甘油，将400μL等分试样于-20℃和-80℃贮存。
将贮存的等分试样解冻，添加至30mL的LBGKP培养基(含有卡那霉素和遗传霉素)。将该培养物在30℃振荡8h，随后用于接种400mL的含有60g/L的“过夜表达速溶TB培养基”(Novagen,目录号71491-5)、10g/L甘油和50mg/L氨苄青霉素的生产培养基。在20℃搅拌培养基16h，随后在12℃再搅拌50h，并采集样品以测量OD(600nm)和pH。60小时后，通过离心收获细胞，将其冷冻。获得的细胞湿重为16.07g。
通过添加11.4mL的"Bugbuster Master混合物"(Novagen,目录号71456)和4.8mL的水来裂解3.24g获得的沉淀。通过离心回收裂解物，将其直接用于活性测试。
实施例19
UGT91D2的体内制备物的活性的测定
使用0.5mM底物，2.5mM的UDP-葡萄糖和3mM的MgCl2(于50mM磷酸钠缓冲液，pH7.2中)，利用1000μL的裂解物，以5mL规模进行关于甜叶悬钩子苷至甜菊苷的转化的活性测试。采集样品，并通过HPLC进行分析。UGT91D2的不同制备物的结果概述于下表中。
*注意：活性表示为每mL裂解物的活性。1U将在30℃和pH7.2下于1小时内转化1μmol的底物。
实施例20
莱鲍迪苷X的分离
实施例14的产物混合物的量不够多，无法通过制备型HPLC法进行分离。因此，将具有一系列注射的分析型HPLC用于分离混合物的组分。按照上文实施例14中描述的方法进行分离，以提供对应于图5的HPLC描迹线的两个主峰的两个级分：级分A(保留时间24.165分钟)和级分B(保留时间31.325分钟)。
级分A的保留时间与reb D一致，这指示来自生物转化反应的未反应的起始材料。
纯化的级分B的保留时间(图6)与reb X一致，这表明从reb D的成功生物转化。通过将纯化的级分B与reb X标准品(可从Pure Circle获得，reb X标准品的HPLC描迹线示于图7中)共注射，确认了级分B中收集的材料为reb X的身份。发现级分B和reb X标准品在相同的保留时间洗脱(图8)，这表明级分B是reb X。
级分B为reb X的身份也另外通过NMR和HRMS得到确认。为了取样，将级分B在旋转蒸发器中浓缩，冷冻干燥，和干燥(于40℃，40h)。
将NMR样品溶解于氘化吡啶(C5D5N)中，在Varian Unity Plus600MHz仪上使用标准脉冲序列获得频谱。将级分B的NMR谱与reb X的NMR谱相比较。两个谱的叠加(图9)显示，级分B与reb X的峰一致。reb X的NMR归属(NMR assignments)示于下表中：
C5D5Na-c中的莱鲍迪苷X的1H和13C NMR谱数据
a基于COSY、HMQC和HMBC相关性确认归属；b化学位移值以δ(ppm)表示；c偶联常数以Hz表示。
利用配备有以阳离子模式操作的电喷雾电离源的Waters Premier四极杆时间飞行(Q-TOF)质谱仪产生HRMS(图10)。将样品溶解于甲醇中，于2:2:1的甲醇:乙腈:水中洗脱，并且使用板载注射泵通过输注引入。通过m/z1313.5265处的[M+Na]+加合物(其对应于C56H90O33的分子式)确认reb X的存在。

Claims (3)

1.一种制备莱鲍迪苷X的方法，其中包括使用UDP-葡萄糖基转移酶将莱鲍迪苷D转化为莱鲍迪苷X的步骤，所述莱鲍迪苷X的纯度大于约80％重量，
其中莱鲍迪苷X的结构为：
其中所述UDP-葡萄糖基转移酶能够将至少一个葡萄糖单元添加到莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷X。
2.权利要求1的方法，其中所述UDP-葡萄糖基转移酶能够将葡萄糖单元添加到莱鲍迪苷D的C-19位。
3.权利要求2的方法，其中所述UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
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