MX2014014080A

MX2014014080A - Glucosidos de esteviol de alta pureza.

Info

Publication number: MX2014014080A
Application number: MX2014014080A
Authority: MX
Inventors: Avetik Markosyan; Indra Prakash; Venkata Sai Prakash Chaturvedula; Cyrille Jarrin; Patrick Robe; Rob Ter Halle
Original assignee: Purecircle Sdn Bhd
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2015-07-21
Also published as: JP2024040374A; EP2852296A1; JP6346174B2; US20170112176A1; US20220071252A1; US20200221746A1; JP6612389B2; MX352678B; BR112014028819A2; JP2015519059A; US9243273B2; US20150031869A1; CN103974628A; CN110358795A; JP2022082472A; EP4012041A1; JP2018139613A; WO2013176738A9; US20160192685A1; JP2020018322A

Abstract

Se describen métodos para preparar glucósidos de esteviol altamente purificados, particularmente Rebaudiósidos A, D y X. El método incluye la expresión de UDP-glucosiltransferasas de la Stevia rebaudiana Bertoni, que son capaces de convertir ciertos glucósidos de esteviol a los Rebaudiósidos A, D y X. Los Rebaudiósidos A, D y X altamente purificados, son útiles como edulcorante no calórico en composiciones comestibles y masticables tales como cualquiera de las bebidas, confituras, productos de panadería, galletitas y gomas de mascar.

Description

GLUCÓSIDOS DE ESTEVIOL DE ALTA PUREZA CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona a un proceso biocatalítico para preparar composiciones que comprenden glucósidos de esteviol, incluyendo composiciones de glucósidos de esteviol altamente purificadas.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA DEL LISTADO DE SECUENCIAS El archivo de texto titulado "PureCircle_22PCT_ST25.txt", creado el 12 de marzo del 2013, que tiene 5 KB (kilobytes) de datos, y presentado concurrentemente con la presente, se incorpora aquí por referencia en su totalidad en esta solicitud.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los edulcorantes de alta intensidad poseen un nivel de dulzura que es muchas veces más grande que el nivel de dulzura de la sacarosa. Esencialmente son no calóricos y comúnmente se utilizan en productos de dieta y reducidos en calorías, incluyendo alimentos y bebidas. Los edulcorantes de alta intensidad no· inducen una respuesta glucémica, haciéndolos adecuados para el uso en productos dirigidos a diabéticos y otros interesados en controlar su consumo de -carbohidratos.

Los glucósidos de esteviol son una clase de compuestos encontrados en las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni, un arbusto perenne de la familia Asteraceae ( Compositae ) nativo de ciertas regiones de Sudamérica. Ellos se caracterizan estructuralmente por una sola base, esteviol, difiriendo por la presencia de residuos de carbohidrato en las posiciones C13 y C19. Se acumulan en las hojas de Stevia, constituyendo aproximadamente 10% - 20% del peso seco total. En una base de peso seco, los cuatro glucósidos mayores encontrados en las hojas de Stevia típicamente incluyen esteviósido (9.1%), rebaudiósido A (3.8%), rebaudiósido C (0.6-1.0%) y dulcósido A (0.3%). Otros glucósidos de esteviol conocidos incluyen rebaudiósido B, C, D, E, F y X, esteviolbiósido y rubusósido.

Aunque se conocen métodos para preparar glucósidos de esteviol a partir de Stevia rebaudiana, muchos de estos métodos son inadecuados para el uso comercialmente.

Por consiguiente, aún permanece una necesidad por métodos simples, eficientes y económicos para preparar composiciones que comprenden glucósidos de esteviol, incluyendo composiciones de glucósido de esteviol altamente purificadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un proceso biocatalitico para preparar una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo al poner en contacto una composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol con UDP-glucosiltransferasa, para de esta manera producir una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo que comprende una o más unidades de glucosa adicionales que el substrato de glucósido de esteviol.

La composición de partida puede ser cualquier composición que comprende por lo menos un substrato de glucósido de esteviol. En una modalidad, el substrato de glucósido de esteviol se selecciona del grupo que consiste de esteviolmonósido, esteviolbiósido, rubusósido, dulcósido B, dulcósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido G, esteviósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, rebaudiósido A, rebaudiósido I, rebaudiósido E, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido J, rebaudiósido X, rebaudiósido D, rebaudiósido N, rebaudiósido O, un glucósido de esteviol sintético o combinaciones de los mismos. La composición de partida puede ser comercialmente disponible o preparada. La composición de partida puede comprender un substrato de glucósido de esteviol purificado o un substrato de glucósido de esteviol parcialmente purificado.

En una modalidad, el substrato de glucósido de esteviol es rubusósido.

En otra modalidad, el substrato de glucósido de esteviol es esteviósido.

En aun otra modalidad, el substrato de glucósido de esteviol es rebaudiósido A.

En todavía otra modalidad, el substrato de glucósido de esteviol es rebaudiósido D.

El glucósido de esteviol objetivo puede ser cualquier glucósido de esteviol conocido. En una modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es esteviolmonósido, esteviolbiósido, rubusósido, dulcósido B, dulcósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido G, esteviósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, rebaudiósido A, rebaudiósido I, rebaudiósido E, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido J, rebaudiósido X, rebaudiósido D, rebaudiósido N, rebaudiósido O o un glucósido de esteviol sintético.

En una modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es esteviósido.

En otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es rebaudiósido A.

En aun otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo rebaudiósido D.

En todavía otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es rebaudiósido X.

La UDP-glucosiltransferasa puede ser cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al substrato de glucósido de esteviol para proporcionar el glucósido de esteviol objetivo. En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se produce en un hospedero. El hospedero puede ser, pór ejemplo, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp. En otra modalidad, se sintetiza la UDP-glucosiltransferasa.

La UDP-glucosiltransferasa se puede proporcionar en cualquier forma adecuada, incluyendo libre, inmovilizada o como un sistema de células completas. El grado de pureza de la UDP-glucosiltransferasa puede variar, por ejemplo, se puede proporcionar como una preparación(s) de enzima cruda, semi-purificada o purificada.· En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa está libre. En otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se inmoviliza, por ejemplo sobre un soporte inorgánico u orgánico. En todavía otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se proporciona en la forma de un sistema de célula completa, por ejemplo como una célula microbiana viviente o en la forma de un U sado de células.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rubusósido para formar esteviósido. En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al esteviósido para formar rebaudiósido A. En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1.

En otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rebaudiósido A para formar rebaudiósido D. En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2.

En todavía otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rebaudiósido D para formar rebaudiósido X. En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1.

Opcionalmente, el método de la presente invención además comprende recielar UDP para proporcionar UDP-glucosa. En una modalidad, el método comprende reciclar UDP al proporcionar un catalizador de reciclado y un substrato de reciclado, tal que la biotransformación del substrato de glucósido de esteviol al glucósido de esteviol objetivo se lleva a cabo utilizando cantidades catalíticas de UDP-glucosiltransferasa y UDP-glucosa (FIG.3).

En una modalidad, el catalizador de reciclado es sacarosa sintasa.

En una modalidad, el substrato de reciclado es sacarosa.

Opcionalmente, el método de la presente invención además comprende separar el glucósido de esteviol objetivo de la composición de partida. El glucósido de esteviol objetivo se puede separar mediante cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, cristalización, separación por membranas, centrifugación, extracción, separación cromatográfica o una combinación de tales métodos.

En una modalidad, la separación produce una composición que comprende mayor que aproximadamente 80% en peso del glucósido de esteviol objetivo en una base anhidra, es decir, una composición de glucósido de esteviol altamente purificada. En otra modalidad, la separación produce una composición que comprende mayor que aproximadamente 90% en peso del glucósido de esteviol objetivo. En modalidades particulares, la composición comprende mayor que aproximadamente 95% en peso del glucósido de esteviol objetivo.

El glucósido de esteviol objetivo puede estar en cualquier forma polimórfica o amorfa, incluyendo hidratos, solvatos, anhidros o combinaciones de los mismos.

Los glucósidos de esteviol objetivo purificados se pueden utilizar en productos consumibles como un edulcorante. Los productos consumibles adecuados incluyen, pero no están limitados a, alimentos, bebidas, composiciones farmacéuticas, productos de tabaco, composiciones nutracéuticas, composiciones para higiene oral y composiciones cosméticas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos acompañantes se incluyen para proporcionar un entendimiento adicional de la invención. Los dibujos ilustran modalidades de la invención y junto con la descripción sirven para explicar los principios de las modalidades de la invención.

La FIG.1 muestra la estructura de reb X.

La FIG. 2 muestra la producción biocatalitica de reb X a partir del esteviósido.

La FIG. 3 muestra la producción biocatalitica de reb ? a partir del esteviósido utilizando la enzima UGT76G1 y el recielado concomitante de UDP a UDP glucosa por la via de la sacarosa sintasa.

La FIG.4 muestra el espectro de IR del reb X.

La FIG. 5. muestra el cromatograma de HPLC del producto de la producción biocatalitica de reb X a partir de reb D, como se detalla en el Ejemplo 14. El pico con tiempo de retención de 24.165 minutos corresponde a reb D no reaccionado. El pico con tiempo de retención de 31.325 minutos corresponde a reb X.

La FIG.6. muestra el cromatograma de HPLC de reb X purificado producido mediante biocatálisis del reb D.

La FIG. 7 muestra el cromatograma de HPLC de un estándar de reb X.

La FIG.8 muestra el cromatograma de HPLC de la coinyección de un estándar de reb X y el reb X purificado de la biotransformación a partir de reb D.

La FIG. 9 muestra una sobreposición de los espectros de 1H NMR de un estándar de reb X y reb X purificado después de la biosíntesis a partir de reb D.

La FIG. 10 muestra el espectro de HRMS de reb X purificado después de la producción biocatalítica a partir de reb D.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona un proceso biocatalítico para la preparación de una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo a partir de una composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol, en donde el glucósido de esteviol objetivo comprende una o más unidades de glucosa adicionales que el substrato de glucósido de esteviol.

Un objetivo de la invención es proporcionar un método biocatalítico eficiente para preparar glucósidos de esteviol, particularmente esteviósido, reb A, reb D y reb X, a partir de otros glucósidos de esteviol y/o mezclas de los mismos.

Como se utiliza en la presente, "biocatálisis" o "biocatalítico" se refiere al uso de catalizadores naturales, tales como enzimas de proteína, para realizar transformaciones químicas en compuestos orgánicos. La biocatálisis alternativamente se conoce como biotransformación o biosíntesis. Ambos de los métodos de biocatálisis aislado y de célula completa son conocidos en la téenica. Las enzimas de proteína de biocatalizador pueden ser proteínas que ocurren naturalmente o recombinantes.

Como se utiliza en la presente, el término "glucósido (s) de esteviol" se refiere a un glucósido de esteviol, incluyendo, pero no limitado a, glucósidos de esteviol que ocurren naturalmente, por ejemplo, esteviolmonósido, esteviolbiósido, rubusósido, dulcósido B, dulcósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido G, esteviósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, rebaudiósido A, rebaudiósido I, rebaudiósido E, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido J, rebaudiósido X, rebaudiósido D, rebaudiósido N, rebaudiósido O, glucósidos de esteviol sintéticos, por ejemplo, glucósidos de esteviol enzimáticamente glucosilados y combinaciones de los mismos.

Estructuras químicas de esteviol y sus glucósidos (Glc=glucosa) Composición de Partida Como se utiliza en la presente, la "composición de partida" se refiere a cualquier composición (generalmente una solución acuosa) que contiene uno o más glucósidos de esteviol, donde el uno o más glucósidos de esteviol sirven como el substrato para la biotransformación.

En una modalidad, la composición de partida comprende uno o más glucósidos de esteviol seleccionados del grupo que consiste de esteviolmonósido, esteviolbiósido, rubusósido, dulcósido B, dulcósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido G, esteviósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, rebaudiósido A, rebaudiósido I, rebaudiósido E, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido <J, rebaudiosido X, rebaudiosido D, rebaudiosido N, rebaudiosido O o un glucósido de esteviol sintético. En una modalidad particular, la composición de partida comprende dos o más glucósidos de esteviol.

En una modalidad, la composición de partida comprende el rubusósido de substrato de glucósido de esteviol.

En una modalidad, la composición de partida comprende el esteviósido de substrato de glucósido de esteviol.

En otra modalidad, la composición de partida comprende el rebaudiósido A de substrato de glucósido de esteviol.

En todavía otra modalidad, la composición de partida comprende el rebaudi sido D de substrato de glucósido de esteviol.

La composición de partida puede ser sintética o purificada (parcial o completamente), comercialmente disponible o preparada. Un ejemplo de una composición de partida útil en el método de la presente invención es un extracto obtenido de la purificación del material de planta (por ejemplo, hojas) Stevia rebaudíana . Otro ejemplo de una composición de partida es un extracto de Stevia comercialmente disponible llevado en solución con un solvente. Todavía otro ejemplo de una composición de partida es una mezcla comercialmente disponible de glucósidos de esteviol llevados en solución con un solvente. Otras composiciones de partida adecuadas incluyen sub-productos de procesos para aislar y purificar glucósidos de esteviol.

En una modalidad, la composición de partida comprende un substrato de glucósido de esteviol purificado. Por ejemplo, la composición de partida puede comprender mayor que aproximadamente 99% de un glucósido de esteviol de substrato particular en peso en una base seca.

En otra modalidad, la composición de partida comprende una composición de glucósido de esteviol de substrato parcialmente purificada. Por ejemplo, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de un glucósido de esteviol de substrato particular en peso en una base seca.

En una modalidad, la composición de partida comprende rubusósido purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene >99% de rubusósido en peso en una base seca. En otra modalidad, la composición de partida comprende rubusósido parcialmente purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de rubusósido en peso en una base seca.

En una modalidad, la composición de partida comprende esteviósido purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene >99% de esteviósido en peso en una base seca. En otra modalidad, la composición de partida comprende esteviósido parcialmente purificada. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de esteviósido en peso en una base seca.

En otra modalidad, la composición de partida comprende rebaudiósido A purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 99% de rebaudiósido A en peso en una base seca. En otra modalidad, la composición de partida comprende rebaudiósido A parcialmente purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% o el rebaudiósido A en peso en una base seca.

En todavía otra modalidad, la composición de partida comprende rebaudiósido D purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 99% de rebaudiósido D en peso en una base seca. En otra modalidad, la composición de partida comprende rebaudiósido D parcialmente purificado. En una modalidad particular, la composición de partida contiene mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente del 80% o aproximadamente 90% de rebaudiósido D en peso en una base seca.

El componente(s) de glucósido de esteviol de la composición de partida sirve como un substrato(s) para la producción del glucósido(s) de esteviol objetivo, como es descrito en la presente. El objetivo(s) de glucósido de esteviol objetivo difiere químicamente de su substrato(s) de glucósido de esteviol correspondiente mediante la adición de una o más unidades de glucosa.

Glucósido de Esteviol Objetivo El glucósido de esteviol objetivo del presente método puede ser cualquier glucósido de esteviol que se puede preparar por el proceso descrito en la presente. En una modalidad, el glucósido de esteviol objetivo se selecciona del grupo que consiste de esteviolmonósido, esteviolbiósido, rubusósido, dulcósido B, dulcósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido G, esteviósido, rebaudiósido C, rebaudiósido F, rebaudiósido A, rebaudiósido I, rebaudiósido E, rebaudiósido H, rebaudiósido L, rebaudiósido K, rebaudiósido j, rebaudiósido X, rebaudiósido D, rebaudiósido N o rebaudiósido O.

En una modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es esteviósido. En otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es reb A. En todavía otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es reb D. En todavía otra modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es reb X.

El glucósido de esteviol objetivo puede estar en cualquier forma polimórfica o amorfa, incluyendo hidratos, solvatos, anhidra o combinaciones de los mismos.

En una modalidad, la presente invención es un proceso biocatalítico para la producción de esteviósido a partir de rubusósido, donde la composición de partida comprende el substrato de glucósido de esteviol de rubusósido. En una modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalítico para la producción de esteviósido a partir de rubusósido, donde la composición de partida comprende rubusósido parcialmente purificado. En otra modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalítico para la producción de esteviósido a partir de rubusósido, donde la composición de partida comprende rubusósido purificado.

En una modalidad, la presente invención es un proceso biocatalítico para la producción de reb A a partir de esteviósido, donde la composición de partida comprende el substrato de glucósido de esteviol esteviósido. En una modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb A a partir de esteviósido, donde la composición de partida comprende esteviósido parcialmente purificado. En otra modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb A a partir de esteviósido, donde la composición de partida comprende esteviósido purificado.

En otra modalidad, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb D a partir de reb A, donde la composición de partida comprende el substrato de glucósido de esteviol reb A. En una modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb D a partir de reb A, donde la composición de partida comprende reb A parcialmente purificado. En otra modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb D a partir de reb A, donde la composición de partida comprende reb A purificado.

En todavía otra modalidad, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb X a partir de reb D, donde la composición de partida comprende el substrato de glucósido de esteviol reb D. En una modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalitico para la producción de reb X a partir de reb D, donde la composición de partida comprende reb D parcialmente purificado. En otra modalidad particular, la presente invención es un proceso biocatalítico para la producción de reb X a partir de reb D, donde la composición de partida comprende reb D purificado.

En una modalidad particular, el glucósido de esteviol objetivo está presente en una mezcla. Por ejemplo, en una modalidad, el glucósido de esteviol objetivo es reb X presente en una mezcla. En una modalidad, la pureza del glucósido de esteviol objetivo se incrementa con relación a la pureza del glucósido de esteviol objetivo presente en la composición de partida. Por ejemplo, la pureza de reb X presente en la composición de partida se incrementa como resultado de llevar a cabo el método de la presente invención.

Opcionalmente, el método de la presente invención además comprende separar el glucósido de esteviol objetivo a partir de la composición de partida. El glucósido de esteviol objetivo se puede separar mediante cualquier método adecuado, tal como, por ejemplo, cristalización, separación mediante membranas, centrifugación, extracción, separación cromatográfica o una combinación de tales métodos.

En modalidades particulares, el proceso descrito en la presente da por resultado en una composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada. El término "altamente purificado", como se utiliza en la presente, se refiere a una composición que tiene mayor que aproximadamente 80% en peso del glucósido de esteviol objetivo en una base anhidra. En una modalidad, la composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada contiene mayor que aproximadamente 90% en peso del glucósido de esteviol objetivo en una base anhidra, tal como, por ejemplo, 91% mayor que aproximadamente 92%, mayor que aproximadamente 93%, mayor que aproximadamente 94%, mayor que aproximadamente 95%, mayor que aproximadamente 95%, mayor que aproximadamente 97%, mayor que aproximadamente 98% o mayor que aproximadamente 99% del contenido de glucósido de esteviol objetivo en una base seca.

En una modalidad más particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb X, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que contiene mayor que aproximadamente 90% de reb X de contenido en peso en una base seca. En otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb X, el proceso·descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 95% de reb X de contenido en peso en una base seca.

En otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb D, el proceso descrito en la presente proporciona una composición mayor que aproximadamente 90% de reb D de contenido en peso en una base seca. En otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb D, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 95% de reb D de contenido en peso en una base seca.

En todavía otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb A, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 90% de reb A de contenido en peso en una base seca. En otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es reb A, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 95% de reb A de contenido en peso en una base seca.

En todavía otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es esteviósido, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 90% de contenido de esteviósido en peso en una base seca. En otra modalidad particular, cuando el glucósido de esteviol objetivo es esteviósido, el proceso descrito en la presente proporciona una composición que comprende mayor que aproximadamente 95% de esteviósido de contenido en peso en una base seca.

En una modalidad, el método biocatalítico de la presente invención se lleva a cabo más de una vez, tal que el glucósido de esteviol objetivo producido por un primer proceso biocatalitico sirve como el substrato de glucósido de esteviol (que también se podría considerar un glucósido de esteviol objetivo intermediario) para un segundo proceso biocatalitico en el cual se produce el glucósido de esteviol objetivo.

En una modalidad particular, la presente invención proporciona un proceso biocatalitico para preparar una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo al poner en contacto una composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol con una UDP-glucosiltransferasa, para de esta manera producir una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo intermediario que comprende una o más unidades de glucosa adicionales que el substrato de glucósido de esteviol; poner en contacto la composición que comprende el glucósido de esteviol objetivo intermediario con UDP-glucosiltransferasa, para de esta manera producir una composición que comprende un glucósido de esteviol objetivo intermediario que comprende una o más unidades de glucosa que el glucósido de esteviol objetivo intermediario. Dependiendo del número de veces que el método se lleva a cabo, puede haber más uno o más glucósidos de esteviol objetivo intermediarios (por ejemplo, un primer glucósido de esteviol objetivo intermediario, un segundo glucósido de esteviol objetivo intermediario, un tercer glucósido de esteviol objetivo intermediario) involucrado en la producción del glucósido de esteviol objetivo.

UDP-glucotransferasa El presente método es biocatalitico, es decir, utiliza un catalizador biológico. En una modalidad, el biocatalizador es la enzima de proteina. En una modalidad particular, el biocatalizador es una UDP-glucosiltransferasa, la UDP-glucosiltransferasa puede ser cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al substrato de glucósido de esteviol para proporcionar el glucósido de esteviol objetivo.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se produce en un hospedero, tal como un microorganismo. Por ejemplo, una secuencia de DNA que codifica UDP-glucosiltransferasa se clona en un vector de expresión y se transfiere a un hospedero de producción tal como un microbio, por ejemplo una bacteria. Ejemplos no limitantes de hospederos adecuados incluyen E. coli, Saccharomyces sp., ñspergillus sp., Pichia sp. La proteina sobreexpresada se puede aislar del extracto de células en base de sus propiedades físicas y químicas, utilizando téenicas conocidas en el arte. Las técnicas no limitantes representativas para aislar UDP-glucosiltransferasa a partir de hospedero incluyen la centrifugación, electroforesis, cromatografía líquida, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía con filtración en gel o cromatografía por afinidad.

La UDP-glucosiltransferasa se puede proporcionar como una preparación(s) de enzima cruda, semi-purificada y purificada.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa está libre. En otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es inmovilizada. Por ejemplo, una UDP-glucosiltransferasa se puede inmovilizar con un soporte sólido hecho de materiales inorgánicos u orgánicos. Ejemplos no limitantes de soportes sólidos adecuados para inmovilizar la UDP-glucosiltransferasa incluyen celulosa derivada o vidrio, cerámicas, óxidos de metal o membranas. La UDP-glucosiltransferasa se puede inmovilizar con al soporte sólido, por ejemplo, mediante-unión covalente, adsorción, reticulación, atrapamiento o encapsulación.

El medio de reacción para conversión es generalmente acuoso, por ejemplo, agua purificada, solución amortiguadora o una combinación de las mismas. En una modalidad particular, el medio de reacción es una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, solución amortiguadora PIPES, solución amortiguadora de acetato y solución amortiguadora de fosfato. En una modalidad particular, el medio de reacción es una solución amortiguadora de fosfato. El medio de reacción también puede ser, alternativamente, un solvente orgánico.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se proporciona en forma de un sistema de células completas, tal como una célula microbiana viviente. El sistema de células completas opcionalmente se puede inmovilizar, también, utilizando las téenicas identificadas en lo anterior con respecto a la inmovilización de la enzima.

En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualguier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rubusósido, para de esta manera producir esteviósido. La UDP-glucosiltransferasa puede ser, por ejemplo, UGT91D2.

En otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al esteviósido, para de esta manera producir rebaudiósido A. La UDP-glucosiltransferasa puede ser, por ejemplo, UGT76G1.

En aun otra modalidad, la UDP-glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rebaudiósido A, para de esta manera producir rebaudiósido D. La UDP-glucosiltransferasa puede ser, por ejemplo, UGT91D2.

En todavía otra modalidad, la UDP- glucosiltransferasa es cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al rebaudiósido D para formar rebaudiósido X. La UDP-glucosiltransferasa puede ser, por ejemplo, UGT76G1.

Opcionalmente, el método de la presente invención además comprende recielar UDP para proporcionar UDP-glucosa. En una modalidad, el método comprende reciclar UDP al proporcionar un catalizador de reciclado, es decir, un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP-glucosa, y un substrato de reciclado, tal que la conversión del glucósido de esteviol de substrato al glucósido de esteviol objetivo se lleva a cabo utilizando cantidades catalítica de UDP-glucosiltransferasa y UDP-glucosa (Fig.3).

En una modalidad, el catalizador de reciclado de UDP-glucosa es sacarosa sintasa.

En una modalidad, el substrato de reciclado es sacarosa.

La conversión de rubusósido a esteviósido En una modalidad, una composición de partida que comprende rubusósido se pone en contacto con una UDP-glucosiltransferasa capaz de catalizar la reacción de UDP-glucosa y esteviósido para producir esteviósido. En una modalidad, la composición de partida comprende rubusósido parcialmente purificado. En otra modalidad, la composición de partida comprende rubusósido purificado. En una modalidad particular, la composición de partida comprende >99% de rubusósido. En una modalidad particular, la composición de partida comprende mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de rubusósido.

En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2, que se ha descrito por Joseph y colaboradores. (GenBank acceso no. ACE87855). Se ha observado que la secuencia similar se describió posteriormente en la solicitud de Patente PCT/US2011/038967 y se nombró UGT91D2e. UGT91D2e comparte >95% de identidad con UGT91D11 (GenBank acceso no. AAR06918) y >99% de identidad con UGT de Joseph y colaboradores. (GenBank acceso no. ACE87855).

En algunas modalidades, la UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT91D2, se prepara mediante la expresión en un microorganismo hospedero. Los microorganismos hospederos adecuados incluyen, pero no están limitados a, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp. En una modalidad particular, UGT91D2 se expresa en E. coli .

La UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT91D2, se puede proporcionar libre o en una forma inmovilizada. La preparación de enzima puede ser cruda, semi-purificada y purificada. En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se proporciona como un sistema de célula completa, por ejemplo una célula microbiana viviente, o células microbianas completas, lisado de células y/o cualquier otra forma conocida en la téenica.

El medio de reacción para conversión es generalmente acuoso, y puede ser agua purificada, solución amortiguadora o combinación de las mismas. En una modalidad particular, el medio de reacción es una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, solución amortiguadora PIPES, solución amortiguadora de acetato y solución amortiguadora de fosfato. En una modalidad, el medio de reacción es la solución amortiguadora de fosfato.

En una modalidad, la conversión de rubusósido a esteviósido además comprende la adición de compuestos diferentes de UDP-glucosa, rubusósido y la UDP-glucosiltransferasa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el medio de reacción incluye MgCl2 y/o MnCl2.

La reacción se puede llevar a cabo a temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 60°C, tal como, por ejemplo, aproximadamente 10°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 50°C o aproximadamente 60°C. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente 30°C.

La reacción puede proceder por una duración de tiempo entre 1 hora y 1 semana, tal como, por ejemplo, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 120 horas, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 dias, aproximadamente 5 dias, aproximadamente 6 dias o aproximadamente 7 dias. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 120 horas.

Opcionalmente, la UDP-glucosa, que se utiliza como donador de glucosa, se puede recielar mediante el uso de la enzima sacarosa sintasa (FIG.3). El rubusósido se transforma en esteviósido con UDP-glucosa que se recicla mediante la reacción entre sacarosa y UDP. Como una consecuencia, rubusósido y sacarosa se utilizan en cantidades estequiométricas mientras que UDP está presente en cantidades catalíticas.

La reacción se puede monitorear mediante un método adecuado que incluyendo, pero no limitado a, HPLC, LCMS, TLC, IR o NMR.

En una modalidad, la conversión de rubusósido a esteviósido es por lo menos aproximadamente 2% completa, como es determinado por cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior. En una modalidad particular, la conversión de rubusósido a esteviósido es por lo menos aproximadamente 10% completa, por lo menos aproximadamente 20% completa, por lo menos aproximadamente 30% completa, por lo menos aproximadamente 40% completa, por lo menos aproximadamente 50% completa, por lo menos aproximadamente 60% completa, por lo menos aproximadamente 70% completa, por lo menos aproximadamente 80% completa o por lo menos aproximadamente 90% completa. En una modalidad particular, la conversión de rubusósido a esteviósido es por lo menos aproximadamente 95% completa.

La conversión de esteviósido a reb A En una modalidad, una composición de partida que comprende esteviósido se pone en contacto con una UDP-glucosiltransferasa capaz de catalizar la reacción de UDP-glucosa y esteviósido para producir reb A. Químicamente, una unidad de glucosa se adiciona al disacárido en la posición C13 de esteviósido para proporcionar reb A. En una modalidad, la composición de partida comprende esteviósido parcialmente purificado. En otra modalidad, la composición de partida comprende esteviósido purificado. En una modalidad particular, la composición de partida comprende >99% de esteviósido. En una modalidad particular, la composición de partida comprende mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de esteviósido.

En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1. La UGT76G1 se ha descrito por Richman y colaboradores. (Richman, D., Swanson, A., Humphrcy, T., Chapman, R., McGarvey, B., Pocs, R., Brandle, J. genomics uncovers three glucosyltransferases involved in the synthesis of the major sweet glucosides Stevia rebaudiana . The Plant Journal, 2005, 41, 56-67) y es accesible en GenBank (ACT33422.1) y Uniprot (C7EA09). La enzima se sobreexpresó en E. coli y se mostró que transforma el esteviósido a reb A.

En algunas modalidades, la UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT76G1, se puede preparar mediante la expresión en un microorganismo hospedero. Los microorganismos hospederos adecuados incluyen, pero no están limitados a, E. coli, Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Pichia sp. En una modalidad particular, UGT76G1 se expresa en E. coli .

La UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT76G1, puede estar libre o inmovilizada. Esta puede estar en la forma de preparación (s) de enzima cruda, semi-purificada y purificada. La UDP-glucosiltransferasa también se puede proporcionar como un sistema de célula completo, por ejemplo una célula microbiana viviente, una célula microbiana completa o U sado de células y/o cualquier otra forma conocida en la téenica.

El medio de reacción para la conversión es generalmente acuoso, y puede ser agua purificada, solución amortiguadora o una combinación de las mismas. En una modalidad particular, el medio de reacción es una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, solución amortiguadora PIPES, solución amortiguadora de acetato y solución amortiguadora de fosfato. En una modalidad, el medio de reacción es la solución amortiguadora de fosfato.

En una modalidad, la conversión de esteviósido a reb A además comprende la adición de compuestos diferentes de UDP-glucosa, esteviósido y la UDP-glucosiltransferasa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el medio de reacción incluye MgCl2 y/o MnCl2.

La reacción se puede llevar a cabo a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 60°C, tal como, por ejemplo, aproximadamente 10°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 50°C o aproximadamente 60°C. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente 30°C.

La reacción puede proceder por una duración de tiempo entre 1 hora y 1 semana, tal como, por ejemplo, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 120 horas, aproximadamente 3 dias, aproximadamente 4 dias, aproximadamente 5 dias, aproximadamente 6 dias o aproximadamente 7 días. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 120 horas Opcionalmente, la UDP-glucosa, que se utiliza como donador de glucosa, se puede recielar mediante el uso de la enzima sacarosa sintasa (FIG.3). El esteviósido se transforma en reb A con UDP-glucosa que se recicla mediante la reacción entre sacarosa y UDP. Como una consecuencia, esteviósido y sacarosa se utilizan en cantidades estequiométricas mientras que UDP está presente en cantidades catalíticas.

La reacción se puede monitorear mediante un método adecuado que incluye, pero no limitado a, HPLC, LCMS, TLC, IR o NMR.

En una modalidad, la conversión biocatalítica o biotransformación del esteviósido a reb A es por lo menos aproximadamente 50% completa, como es determinado por cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior. En una modalidad particular, la conversión de esteviósido a reb A es por lo menos aproximadamente 60% completa, por lo menos aproximadamente 70% completa, por lo menos aproximadamente 80% completa o por lo menos aproximadamente 90% completa. En una modalidad particular, la conversión de esteviósido a reb A es por lo menos aproximadamente.95% completa.

La conversión de reb A a reb D En una modalidad, una composición de partida que comprende reb A se pone en contacto con una UDP-glucosiltransferasa capaz de catalizar la reacción de UDP-glucosa y reb A para producir reb D. Químicamente, se adiciona a una unidad de glucosa al monosacárido en la posición C19 del reb A, para proporcionar reb D. En una modalidad, la composición de partida comprende reb A parcialmente purificado. En otra modalidad, la composición de partida comprende reb A purificado. En una modalidad particular, la composición de partida comprende >99% reb A. En una modalidad particular, la composición de partida comprende mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de reb A.

En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2, que ha sido descrito por Joseph y colaboradores. (GenBank acceso no. ACE87855). Tiene que ser mencionado que la secuencia similar se describió posteriormente en una solicitud de Patente PCT/US2011/038967 y se nombró UGT91D2e. El UGT91D2e comparte >95% de identidad con UGT91D11 (GenBank acceso no. AAR06918) y >99% de identidad con UGT de Joseph y colaboradores. (GenBank acceso no. ACE87855).

La UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT91D2 se puede proporcionar libre o en una forma inmovilizada. La preparación de enzima puede ser cruda, semi-purificada y purificada. En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se proporciona como un sistema de célula completa, por ejemplo, una célula microbiana viviente, o células microbianas completas, lisado de células y/o cualquier otra forma conocida en la téenica.

En una modalidad, la conversión de reb A a reb D además comprende la adición de compuestos diferentes de UDP-glucosa, Reb A y la UDP-glucosiltransferasa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el medio de reacción incluye MgCl2 y/o Mh012.

La reacción puede proceder por una duración de tiempo entre 1 hora y 1 semana, tal como, por ejemplo, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 120 horas, aproximadamente 3 dias, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 120 horas.

Opcionalmente, la UDP-glucosa, que se utiliza como donador de glucosa, se puede recielar mediante el uso de la enzima sacarosa sintasa (FIG.3). El reb A se transforma en reb D con UDP-glucosa que se recicla mediante la reacción entre sacarosa y UDP. Como una consecuencia, reb A y sacarosa se utilizan en cantidades estequiométricas mientras que UDP está presente en cantidades catalíticas.

La reacción se puede monitorear mediante un método adecuado que incluye, pero no limitado a, HPLC, LCMS, TLC, IR o N R.

En una modalidad, la conversión de reb A reb D es por lo menos aproximadamente 2% completa, como es determinada por cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior. En una modalidad particular, la conversión de reb A a reb D es por lo menos aproximadamente 10% completa, por lo menos aproximadamente 20% completa, por lo menos aproximadamente 30% completa, por lo menos aproximadamente 40% completa, por lo menos aproximadamente 50% completa, por lo menos aproximadamente 60% completa, por lo menos aproximadamente 70% completa, por lo menos aproximadamente 80% completa o por lo menos aproximadamente 90% completa. En una modalidad particular, la conversión de reb A a reb D es por lo menos aproximadamente 95% completa.

La conversión de reb D a reb X En una modalidad, la composición de partida comprende reb D, que se pone en contacto con una UDP-glucosiltransferasa capaz de catalizar la reacción de UDP-glucosa y reb D para producir reb X. Químicamente, una unidad de glucosa se adicional al disacárido en la posición C19 de reb D para proporcionar reb X. En una modalidad, la composición de partida comprende reb D parcialmente purificada. En otra modalidad, la composición de partida comprende reb D purificado. En una modalidad particular, la composición de partida comprende >99% de reb D. En una modalidad particular, la composición de partida comprende mayor que aproximadamente 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80% o aproximadamente 90% de reb D. En una modalidad particular, la UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1.

En algunas modalidades, la UDP-glucosiltransferasa, tal como UGT91D2, se puede preparar mediante la expresión en un microorganismo hospedero. Los microorganismos hospederos adecuados incluyen, pero no están limitados a, E. coli, Saccharomyces sp ., Aspergillus sp., Pichia sp. En una modalidad particular, UGT91D2 se expresa en E. coli .

La UDP-glucosiltransferasa, como UGT91D2, se puede proporcionar como libre o inmovilizada. La preparación enzimática puede ser cruda, semi-purificada y purificada. En una modalidad, la UDP-glucosiltransferasa se proporciona como una preparación de célula completa, por ejemplo, células microbianas vivientes, o en la forma de células microbianas completas, U sado de células y/o cualquier otra forma conocida en la téenica.

El medio de reacción para la conversión es generalmente acuoso, y puede ser agua purificada, solución amortiguadora o combinaciones de las mismas. En una modalidad particular, el medio de reacción es una solución amortiguadora. Las soluciones amortiguadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, solución amortiguadora PIPES, solución amortiguadora de acetato y solución amortiguadora de fosfato. En una modalidad, el medio de reacción es la solución amortiguadora de fosfato.

En una modalidad, la conversión de reb D a reb X emplea compuestos además de UDP-glucosa, reb D y la UDP-glucosiltransferasa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el medio de reacción incluye de MgCl2 y/o MnCl2.

La reacción puede proceder por una duración de tiempo entre 1 hora y 1 semana, tal como, por ejemplo, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 12 horas, aapprrooxxiimmaaddaammeennttee 24 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 120 horas, aproximadamente 3 dias, aproximadamente 4 dias, aproximadamente 5 días, aproximadamente 6 días o aproximadamente 7 días. En una modalidad particular, la reacción se lleva a cabo durante aproximadamente 120 horas.

Opcionalmente, la UDP-glucosa, que se utiliza como donador de glucosa, se puede recielar mediante el uso de la enzima sacarosa sintasa (FIG.3). La reb D se transforma en reb X con UDP-glucosa que se recicla mediante la reacción entre sacarosa y UDP. Como consecuencia, el reb D y sacarosa se utilizan en cantidades estequiométricas mientras que UDP está presente en cantidades catalíticas.

En una modalidad, la conversión de reb D a reb X es por lo menos aproximadamente 50% completa, como es determinada por cualquiera de los métodos mencionados en lo anterior. En una modalidad particular, la conversión de reb D a reb X es por lo menos aproximadamente 60% completa, por lo menos aproximadamente 70% completa, por lo menos aproximadamente 80% completa o por lo menos aproximadamente 90% completa. En una modalidad particular, la conversión de reb D a reb X es por lo menos aproximadamente 95% completa.

El glucósido de esteviol objetivo opcionalmente se purifica a partir de la composición resultante. La purificación del glucósido de esteviol objetivo a partir del medio de reacción se puede lograr mediante cualquier método adecuado para proporcionar una composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada. Los métodos adecuados incluyen cristalización, separación por membranas, centrifugación, extracción (fase líquida o sólida), separación cromatográfica, HPLC (preparativa o analítica) o una combinación de tales métodos.

En una modalidad, la conversión biocatalitica particular se puede inactivar para detener la reacción. La mezcla resultante luego se centrifuga. El sobrenadante generalmente contiene los glucósidos de esteviol objetivo, y luego se puede purificar adicionalmente, si es deseado. Por ejemplo, a HPLC analítica o preparativa se puede utilizar para separar el objetivo restante o glucósido(s) de estev-iol de partida o subproductos de reacción del glucósido de esteviol objetivo. En una modalidad, la separación se logra con HPLC analítica. En otra modalidad, la separación se logra con HPLC preparativa. Uno de habilidad en la téenica reconocerá que el método de HPLC particular utilizado puede variar en base al sistema particular, solvente y columna. Un sistema adecuado para separar reb X del reb D se proporciona en el Ejemplo 20.

Se contempla que el método proporcionado en la presente se puede repetir, en donde la composición que resulta del proceso inicial, es decir, la composición que comprende el glucósido de esteviol objetivo, luego se puede utilizar como 1.a composición de partida cuando el método se lleva a cabo una segunda vez - u opcionalmente, el glucósido de esteviol objetivo se puede purificar de la composición que comprende el glucósido de esteviol objetivo para proporcionar un glucósido de esteviol objetivo altamente parificado o composición de glucósido de esteviol. De acuerdo con esta modalidad, el glucósido de esteviol objetivo producido cuando el método se lleva a cabo por primera vez se puede considerar un primer glucósido de esteviol objetivo o un glucósido de esteviol objetivo intermediario, útil como substrato para la producción de un segundo glucósido de esteviol objetivo, un segundo glucósido de esteviol objetivo intermediario o un glucósido de esteviol objetivo final. El proceso se puede repetir tantas veces como se ha requerido para llegar al glucósido de esteviol objetivo final. En una modalidad, el método se repite una vez. En otra modalidad, el método se repite dos veces. En todavía otra modalidad, el método se repite tres veces. En aún otras modalidades, el método se repite cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve veces. Uno se habilidad en la téenica reconocerá que la UDP-glucosiltransferasa particular utilizada en cada reacción puede ser ya sea la misma o diferente, dependiendo del sitio particular sobre el substrato de glucósido de esteviol, donde va a ser adicionada a la glucosa.

Por consiguiente, en una modalidad, el método se repite una vez, en donde la composición de partida del primer método comprende reb A y el glucósido de esteviol objetivo es reb D, y en donde la composición en partir del segundo método comprende reb D y el glucósido de esteviol objetivo es reb X.

En otra modalidad, el método se repite dos veces, en donde la composición de partida del primer método comprende esteviósido y el glucósido de esteviol objetivo es reb A; la composición de partida del segundo método comprende reb A y el glucósido de esteviol objetivo es reb D; y la composición de partida del tercer método comprende reb D y el glucósido de esteviol objetivo es reb X.

En todavía otra modalidad, el método se repite tres veces, donde la composición de partida del primer método comprende rubusósido y glucósido de esteviol objetivo es esteviósido; la composición de partida del segundo método comprende esteviósido y el glucósido de esteviol objetivo es reb A; la composición de partida del tercer método comprende reb A y el glucósido de esteviol objetivo es reb D; y la composición de partida del cuarto método comprende reb D y el glucósido de esteviol objetivo es reb X.

En una modalidad, un método para producir la composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificado comprende: a. poner en contacto una primera composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol con una primera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo; b. opcionalmente separar el primer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; c. poner en contacto la composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo o la primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una segunda UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un segundo glucósido de esteviol objetivo; d. opcionalmente separar el segundo glucósido de esteviol objetivo del medio para producir una segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; e. poner en contacto la composición que comprende el segundo glucósido de esteviol objetivo o la segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una tercera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un tercer glucósido de esteviol objetivo; y f. opcionalmente separar el tercer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una tercera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada.

En una modalidad, la primera composición de partida comprende esteviósido, el primer glucósido de esteviol objetivo es reb A, y la primera UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1.

En una modalidad adicional, la segunda UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2 y el segundo glucósido de esteviol objetivo es reb D.

En todavía una modalidad adicional, la tercera UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2 y el tercer glucósido de esteviol objetivo es reb X.

En una modalidad, una o más de las etapas de contacto de la composición que comprende el substrato de glucósido de esteviol con UDP-glucosiltransferasa además incluyen proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el recielado y un substrato para el reciclado.

En una modalidad más particular, un método para producir una composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada comprende: a. poner en contacto una primera composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol con una primera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo; b. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el reciclado y un substrato para el reciclado; c. opcionalmente separar el primer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; d. poner en contacto la composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo o la primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una segunda UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un segundo glucósido de esteviol objetivo; e. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el recielado y un substrato para el reciclado; f. opcionalmente separar el segundo glucósido de esteviol objetivo del medio para producir una segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; g. poner en contacto la composición que comprende el segundo glucósido de esteviol objetivo o la segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con un tercera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un tercer glucósido de esteviol objetivo; y h. opcionalmente separar el tercer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una tercera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada.

En una modalidad, la primera composición de partida comprende el esteviósido, el primer glucósido de esteviol objetivo es reb A, y la primera UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1.

En otra modalidad particular, un método para producir una composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada comprende: a. poner en contacto una primera composición de partida que comprende un substrato de glucósido de esteviol con una primera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo; b. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el recielado y un substrato para el reciclado; c. opcionalmente separar el primer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; d. poner en contacto la composición que comprende un primer glucósido de esteviol objetivo o la primera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una segunda UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un segundo glucósido de esteviol objetivo; e. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el recielado y un substrato para el reciclado; f. opcionalmente separar el segundo glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; g. poner en contacto la composición que comprende el segundo glucósido de esteviol objetivo o la segunda composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una tercera UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un tercer glucósido de esteviol objetivo; y h. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el reciclado y un substrato para el reciclado; i. opcionalmente separar el tercer glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar una tercera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada; j. poner en contacto la composición que comprende el tercer glucósido de esteviol objetivo o la tercera composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada con una cuarta UDP-glucosiltransferasa para producir una composición que comprende un cuarto glucósido de esteviol objetivo; y k. opcionalmente proporcionar un biocatalizador capaz de la sobreproducción de UDP y el recielado y un substrato para el reciclado; l. opcionalmente separa el cuarto glucósido de esteviol objetivo del medio para proporcionar .una cuarta composición de glucósido de esteviol objetivo altamente purificada.

En una modalidad, la primera composición de partida comprende rubusósido, el primer glucósido de esteviol objetivo es esteviósido y la primera UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2.

En una modalidad adicional, la segunda UDP-glucosiltransferasa es UGT76G1 y el segundo glucósido de esteviol objetivo es reb A.

En una modalidad adicional, la tercera UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2 y el tercer glucósido de esteviol objetivo es reb D.

En todavía una modalidad adicional, la cuarta UDP-glucosiltransferasa es UGT91D2 y el cuarto glucósido de esteviol objetivo es reb X.

Los glucósidos de esteviol purificados, preparados de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar en una variedad de productos que incluyen, pero no limitados a, alimentos, bebidas, composiciones farmacéuticas, productos de tabaco, composiciones nutracéuticas, composiciones para higiene oral y composiciones cosméticas.

El reb X de alta pureza obtenido en esta invención, que tiene un peso molecular de 1291.29, una fórmula molecular de C56H90O33 y la estructura presentada en la FIG.1, está en la forma de u6n polvo blanco y sin olor. El compuesto es aproximadamente 200 veces más dulce que el azúcar cuando se compara con una solución de sacarosa al 10%. El espectro de absorción infrarroja se muestra en la FIG.4.

Otras propiedades del compuesto reb X puro incluyen un punto de fusión de 249-250°C, y una rotación especifica de [a]D25 -19.0° en etanol al 50% (C=1.0). La solubilidad de reb X en agua es de alrededor de 0.3% y se incrementa con un incremento de la temperatura.

El reb X es soluble en soluciones diluidas de metanol, etanol, n-propanol e isopropanol. Sin embargo, es insoluble en acetona, benceno, cloroformo y éter.

El reb X obtenido de acuerdo con la presente invención es estable al calor y al pH.

El glucósido(s) objetivo altamente purificado, reb D y/o reb X obtenido de acuerdo con esta invención se puede utilizar "como se encuentra" o en combinación con otros edulcorantes, sabores e ingredientes alimenticios.

Ejemplos no limitantes de sabores incluyen lima, limón, naranja, fruta, plátano, uva, pera, piña, mango, almendra amarga, cola, canela, azúcar, caramelo de algodón y sabores de vainilla.

Ejemplos no limitantes de otros ingredientes alimenticios incluyen sabores, acidulantes, orgánicos y aminoácidos, agentes colorantes, agentes de volumen, almidones modificados, gomas, texturizadores, conservadores, antioxidantes, emulsificantes, estabilizadores, espesantes y agentes de gelificación.

El glucósido (s) objetivo altamente purificado particular, reb D y/o reb X obtenido de acuerdo con esta invención se puede preparar en varias formas polimórficas, incluyendo pero no limitadas a hidratos, solvatos, anhidros, formas amorfas y/o mezclas de los mismos.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente reb D y/o reb X obtenido de acuerdo con esta invención se puede incorporar como un edulcorante natural de alta intensidad en materiales alimenticios, bebidas, composiciones farmacéuticas, cosméticos, gomas de mascar, productos de mostrador, cereales, productos lácteos, pastas de dientes y otras composiciones para la cavidad oral, etc.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X como un compuesto de endulzamiento se puede emplear como el único edulcorante, o puede utilizar junto con otros edulcorantes de alta intensidad de ocurre naturalmente tales como esteviósido, reb A, reb B, reb C, reb D, reb E, reb F, esteviolbiósido, dulcósido A, rubusósido, mogrósidos, brazzeina, neohesperidina dihidrocalcona, ácido glicirricico y sus sales, taumatina, perillartina, pernandulcina, mucuroziósidos, baiyunósido, flomisósido-I, ácido dimetil-hexahidrofluoren-dicarboxílico abrusósidos, periandrina, carnosiflósidos, ciclocariósido, pterocariósidos, polipodósido A, brazilina, hernandulcina, filodulcina, glicifilina, florizina, trilobatina, dihidroflavonol, dihidroquercetin-3-acetato, neoastilibina, trans-cinnamaldehído, monatina y sus sales, selligueaina A, hematoxilina, monelina, osladina, pterocariósido A, pterocariósido B, mabinlina, pentadina, miraculina, curculina, neoculina, ácido clorogénico, cinarina, edulcorante de Luo Han Guo, mogrósido V, siamenósido y otros.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X también se puede utilizar en combinación con edulcorantes de alta intensidad, sintéticos tales como sucralosa, acesulfame de potasio, aspartame, alitame, sacarina, neohesperidina de dihidrocalcona, cielamato, neotame, dulcina, suosan, áster 1-metilico de N- [N [3-(3-hidroxi-4-metoxifenil)propil]-L-a-aspartil]-L-fenilalanina, áster 1-metílico de N-[N-[3- (3-hidroxi-4-metoxifenil)-3-metilbutil]-L-a-aspartil]-L-fenilalanina, áster 1-metílico de N-[N-[3-(3-metoxi-4-hidroxifenil)propil]-L-a-aspartil]-L-fenilalanina, sales de los mismos y los similares.

Por otra parte, el glucósido (s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X se pueden utilizar en combinación con supresores de edulcorantes naturales tal como ácido gimnémico, hodulcina, zizifina, lactisol y otros. El reb D y/o reb X también se pueden combinar con varios aumentadores de sabor umami. El reb D y/o reb X se pueden mezclar con aminoácidos de sabor y dulces de umami tales como glutamato, ácido aspártico, glicina, alanina, treonina, prolina, serina, glutamato y triptófano.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X también se puede combinar con polioles o alcoholes de azúcar. El término "poliol" se refiere a una molécula que contiene más de un grupo hidroxilo. Un poliol puede ser un diol, triol o un tetraol que contienen 2, 3 y 4 grupos hidroxilo, respectivamente. Un poliol también puede contener más de cuatro grupos hidroxilo, tal como pentaol, hexaol, heptaol o los similares, que contienen 5, 6 o 7 grupos hidroxilo, respectivamente. Adicionalmente, un poliol también puede ser un alcohol de azúcar, alcohol polihidrico o polialcohol que es una forma reducida de carbohidrato, en donde el grupo carbonilo (aldehido o cetona, azúcar de reducción) se ha reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario. Ejemplos de polioles incluyen, pero no están limitados a, eritritol, maltitol, manitol, sorbitol, lactitol, xilitol, inositol, isomalta, propilenglicol, glicerol, treitol, galactitol, isomaltulosa hidrogenada, isomalto-oligosacáridos reducidos, xilo-oligosacáridos reducidos, gentio-oligosacáridos reducidos, jarabe de maltosa reducido, jarabe de glucosa reducido, hidrolizados de almidón hidrogenado, poliglicitoles y alcoholes de azúcar o cualquiera de otros carbohidratos capaces de ser reducido sin afectar adversamente el sabor de la composición edulcorante.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X se puede combinar con edulcorantes calóricos reducidos tales como D-tagatosa, L-azúcares, L-sorbosa, L-arabinosa y otros.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado particularmente, reb D y/o reb X también se puede combinar con varios carbohidratos. El término "carbohidratos" generalmente se refiere a compuestos de aldehido o de cetona sustituidos con múltiples grupos hidroxilo, de la fórmula general (CH2O)n, en donde n es 3-30, así como sus oligómeros y polímeros. Los carbohidratos de la presente invención, además, pueden ser sustituidos o desoxigenados en una o más posiciones. Los carbohidratos, como se utilizan en la presente, abarcan carbohidratos no modificados, derivados de carbohidrato, carbohidratos sustituidos y carbohidrato modificados. Como se utiliza en la presente, las frases "derivados de carbohidrato", "carbohidrato sustituido" y "carbohidratos modificados" son sinónimos. El carbohidrato modificado significa cualquier carbohidrato en donde por lo menos un átomo se ha adicionado, removido o sustituido, o combinaciones de los mismos. De esta manera, los derivados de carbohidrato o carbohidratos sustituidos incluyen monosacáridos sustituidos y no sustituidos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los derivados de carbohidratos o carbohidrato sustituidos opcionalmente se pueden desoxigenar en cualquier posición de C correspondiente, y/o sustituido con uno o más porciones tales como hidrógeno, halógeno, haloalquilo, carboxilo, acilo, aciloxi, amino, amido, derivados de carboxilo, alquilamino, dialquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, sulfo, mercapto, imino, sulfonilo, sulfenilo, sulfinilo, sulfamoílo, carboalcoxi, carboxamido, fosfonilo, fosfinilo, fosforilo, fosfino, tioéster, tioéter, oximino, hidrazino, carbamilo, fosfato, fosfonato o cualquier otro grupo funcional viable con la condición de que el derivado de carbohidrato o carbohidrato sustituido funciones para mejorar el sabor dulce de la composición edulcorante.

Ejemplos de carbohidratos que pueden ser utilizados de acuerdo con esta invención incluyen, pero no están limitados a, tagatosa, trehalosa, galactosa, ramnosa, varias ciclodextriñas, oligosacáridos cíclicos, varios tipos de maltodextrinas, dextrano, sacarosa, glucosa, ribulosa, fructosa, treosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, mañosa, idosa, lactosa, maltosa, azúcar invertida, isotrehalosa, neotrehalosa, isomaltulosa, eritrosa, desoxirribosa, gulosa, idosa, talosa, eritrulosa, xilulosa, psicosa, turanosa, celobiosa, amilopectina, glucosamina, manosamina, fucosa, ácido glucurónico, ácido glucónico, glucono-lactona, abecuosa, galactosamina, oligosacáridos de betabel, isomalto-oligosacáridos (isomaltosa, isomaltotriosa, panosa y los similares), xilo-oligosacáridos (xilotriosa, xilobiosa y los similares), oligosacáridos xilo-terminados, gentio-oligosacáridos (gentiobiosa, gentiotriosa, gentiotetraosa y los similares), sorbosa, nigero-oligosacáridos, oligosacáridos de palatinosa, fructooligosacáridos (questosa, nistosa y los similares), maltotetraol, maltotriol, malto-oligosacáridos (maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa, maltoheptaosa y los similares), aallmmiiddóónn,, iinnuulliinnaa,, inulo-oligosacáridos, lactulosa, melibiosa, rafinosa, ribosa, azúcares líquidos isomerizados tales como jarabes de maíz altos fructosa, azúcares de acoplamiento y oligosacáridos de soja. Adicionalmente, los carbohidrato como se utilizan en la presente pueden estar ya sea en la configuración de D- o L.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X obtenido de acuerdo con esta invención se puede utilizar en combinación con varias sustancias fisiológicamente activas o ingredientes funcionales. Los ingredientes funcionales generalmente se clasifican en categorías tales como carotenoides, fibra dietética, ácidos grasos, saponinas, antioxidantes, nutracéuticos, flavonoides, isotiocianatos, fenoles, esteróles de plantas y estañóles (fitoesteroles y fitoestanoles); políoles; prebióticos, probióticos; fitoestrógenos; proteína de soja; sulfuros/tioles; aminoácidos; proteínas; vitaminas y minerales. Los ingredientes funcionales también se pueden clasificar en base a sus beneficios para la salud, tales como cardiovasculares, reductores del colesterol y anti-inflamatorios.

El glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X obtenido de acuerdo con esta invención se puede aplicar como un edulcorante de alta intensidad para producir bebidas de cero calorías, reducidas en calorías o para diabéticos y productos alimenticios con características de sabor mejoradas. También se puede utilizar en bebidas, materiales alimenticios, productos farmacéuticos y otros productos en los cuales no se puede utilizar azúcar. Además, el glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X se puede utilizar como un edulcorante no solamente para bebidas, materiales alimenticios y otros productos dedicados para consumo humano, sino también en alimentos y forrajes para animales con características mejoradas.

Ejemplos de productos en los cuales el glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente reb D y/o reb X se pueden utilizar como un compuesto endulzante que incluyen, pero no limitado a, bebidas alcohólicas tales como vodka, vino, cerveza, licor y sake, etc.; jugos naturales; bebidas refrescantes; bebidas no alcohólicas carbonatadas; bebidas de dieta; bebidas de cero calóricas; bebidas y alimentos reducidos en calorías; bebidas de yogur; jugos instantáneos; café instantáneo; bebidas instantáneas de tipo de polvo; productos enlatados; jarabes; pasta de soja fermentada; salsa de soja; vinagre; aderezos; mayonesa; cátsup; adobo; sopa; consomé instantáneo; salsa de soja en polvo; vinagre en polvo; tipos de biscochos; biscocho de arroz; galletitas; pan; chocolates; caramelo; dulces; goma de mascar; jalea; budín; frutas y vegetales conservados; crema fresca; jamón; mermelada; pasta de flor; leche en polvo; helado; sorbete; vegetales y frutos envasados en botellas; frijoles enlatados y hervidos; carne y alimentos hervidos en salsa endulzada; productos de alimentos vegetales agrícolas; mariscos; jamón; salchicha; jamón de pescado; salchicha de pescado; pasta de pescado; productos de pescados fritos; intensamente; productos del mar deshidratados; productos de alimentos congelados; algas conservadas; carne conservada; tabaco; productos medicinales y muchos otros. En principio, esto puede tener aplicaciones ilimitadas.

Durante la fabricación de productos tales como materiales alimenticios, bebidas, sustancias farmacéuticas, cosméticos, productos de mostrador y goma de mascar, se pueden utilizar los métodos convencionales tales como mezclado, amasado, disolución, encurtido, permeación, percolación, salpicado, atomización, infusión y otros métodos.

Por otra parte, el glucósido (s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X obtenido en esta invención se puede utilizar en formas secas o líquidas. Este se puede adicionar antes o después del tratamiento con calor de los productos alimenticios. La cantidad del glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X depende del propósito de utilización. Como se escuchó en lo anterior, este se puede adicionar solo o en combinación con otros compuestos.

Los siguientes ejemplos ilustran modalidades preferidas de la invención para la preparación del glucósido(s) de esteviol objetivo altamente purificado, particularmente, reb D y/o reb X. Será entendido que la invención no está limitada a los materiales, proporciones, condiciones y procedimientos expuestos en los ejemplos, que son únicamente ilustrativos.

EJEMPLO 1 Producción in vivo de UGT76G1 Se adicionaron los sitios de restricción Ncol y Ndel a la secuencia nucleica original como es descrito en GenBank acceso no. AAR06912.1. Después de la optimización de codón se obtuvo la siguiente secuencia nucleica (SEQ ID NO. 1): Listado de secuencia sin texto CCATGGCCCATATGGAAAACAAAACCGAAACCACCGTTCGTCGTCGTCGCC GT ATT ATT CT GTTTCCGGTT CCGTTT C AGGGT CAT ATT AAT CCGATT CTGCAG CTGGCAAATGTGCTGTATAGCAAAGGTTTTAGCATTACCATTTTTCATACCAA TTTTAACAAACCGAAAACCAGCAATTATCCGCATTTTACCTTTCGCTTTATTCT GGATAATGATCCGCAGGATGAACGCATTAGCAATCTGCCGACACATGGTCCG CT GGCAG GT ATGCGT ATT CCGATT ATT AACGAACATGGT GC AGAT GAACT GC GTCGT GAACT GGAACT GCT GAT GCT GGCAAGCGAAGAAGAT GAAGAAGTTA GCT GT CT G ATT ACCGAT GCACT GT GGT ATTTT GCACAGAGCGTTGCAGAT AG CCT G AAT CTGCGTCGTCTGGTTCTGAT G ACC AGC AGCCT GTTT AACTTT CAT GCACAT GTT AGCCT GCC GC AGTTTG AT G AACTGGGTT AT CT GG ATCCGGAT G ATAAAACCCGTCT GGAAGAACAGGCAAGCGGTTTT CCGAT GCT GAAAGT G AA AGAT ATC AAAAGCGCCT AT AGCAATTGGC AG ATT CT G AAAG AAATT CTGGGC AAAATGATTAAACAGACCAAAGCAAGCAGCGGTGTTATTTGGAATAGCTTTAA AGAACTGGAAGAAAGCGAACTGGAAACCGTGATTCGTGAAATTCCGGCACC GAGCTTTCTGATTCCGCTGCCGAAACATCTGACCGCAAGCAGCAGCAGCCT GCT GGAT CAT GATCGTACCGTTTTT CAGTGGCT GGAT CAGCAGCCTCCGAGC AGCGTT CT GT AT GTTAGCTTT GGT AGCACCAGCGAAGTT GAT GAAAAAG ATTT TCTGGAAATTGCCCGTGGTCTGGTTGATAGCAAACAGAGCTTTCTGTGGGTT GTTCGTCCGGGTTTTGTTAAAGGTAGCACCTGGGTTGAACCGCTGCCGGAT GGTTTTCTGGGTGAACGTGGTCGTATTGTTAAATGGGTTCCGCAGCAAGAAG TT CT GGCAC AC GGCGC AATT GGT GCATTTT G GACCCATAGC GGTT GGAATAG CACCCTGG AAAGCGTTT GT G AAG GT GTTCCG AT G ATTTTT AGCGATTTT GGT CTGGATCAGCCGCT GAAT GCACGTTATAT GAGT GAT GTTCTGAAAGTGGGT G TGTATCTGGAAAATGGTTGGGAACGTGGTGAAATTGCAAATGCAATTCGTCG TGTTATGGTG G AT GAAG AAG GT G AAT AT ATT C GT C AG AAT GCCC GT GTT CT G AAACAGAAAGCAGATGTTAGCCTGATGAAAGGTGGTAGCAGCTATGAAAGCC T GG AAAGT CTGGTTAGCTAT ATT AGCAGCCT GT AAT AACTCG AG Después de la síntesis del gen y la subclonación en el vector pET30a+ utilizando los sitios de clonación Ndel y Xhol, el plásmido UGT76Gl_pET30a+ se introdujo en B121(DE3) de E . coli y EC100 de E. coli mediante electroporación. Las células obtenidas se cultivaron en cajas de Petri en la presencia de Kana icina y las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LB líquido (matraces Erlenmcyer). Se adicionó glicerol a la suspensión como crioprotector y se almacenaron alícuotas de 400 mL a -20°C y a -80°C.

Las alícuotas de almacenamiento de BL21(DE3) de E. coli que contienen el plásmido pET30A+_UGT76Gl se descongelaron y se adicionaron a 30 mL del medio LBGKP (20 g/L de Caldo Luria Lennox; solución amortiguadora PIPES 50 mM pH 7.00; solución amortiguadora de fosfato 50 mM pH 7.00; 2.5 g/L de glucosa y 50 mg/L de Kana icina). Este cultivo se dejó agitando a 135 rpm a 30°C durante 8 h.

El medio de producción contuvo 60 g/L del medio TB instantáneo express durante la noche (Novagen), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Kanamicina. El medio se dejó agitando a 20°C mientras que se toman muestras para medir la OD y el pH. Lo cultivos dieron el crecimiento significativo y se obtuvo una buena OD. Después de 40 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron para producir 12.7 g de peso húmedo de células.

La lisis se realizó mediante la adición de la mezcla Maestra Bugbuster (Novagen) y el U sado se recuperó mediante centrifugación y se mantuvo congelado. Las pruebas de actividad se realizaron con el U sado descongelado.

EJEMPLO 2 Producción in-vitro de UGT76G1 Se utilizó el equipo de sistema de expresión de proteina de Alto Rendimiento S30 T7 de Promega. 4 mg del plásmido UGT76Gl_pET30a+ de EC100 de E. coli se mezcló con 80 pL de la premezcla S30 plus y se adicionaron 72 mL del extracto S30 T7. Se adicionó agua libre de nucleasa con el fin de obtener un volumen total de 200 pL y la solución resultante se incubó durante 2 h a 30°C. Se utilizaron 180 pL en la reacción de prueba catalítica.

EJEMPLO 3 Producción In-vitro de un UGT91D2 Se adicionaron los sitios de restricción Ncol y Ndel de la secuencia nucleicao original como es descrita en GenBank acceso no. ACE87855.1. Después de la optimización del codón se obtuvo la siguiente secuencia nucleica (SEQ ID NO. 2): Listado de Secuencias sin Texto CCATGGCACATATGGCAACCAGCGATAGCATTGTTGATGATCGTAAACAGCT GCAT GTT GCAACCTTT CCGTGGCT GGCATTT G GT CAT ATTCT GCCGT AT CT G CAGCT GAGCAAACT GATT GCAGAAAAAGGT CAT AAAGT GAGCTTT CT GAGCA CCACCCGT AAT ATT CAGCGT CT GAGCAGCCAT ATT AGTCCGCT G ATT AAT GTT GTT CAGCTG ACCCTGCCT CGTGTT CAAG AACT GCCGG AAG AT GCCG AAGCA ACCACCGAT GTT CAT CCGGAAGAT ATTCCGTAT CT GAAAAAAGCAAGT GAT G GTCTGCAGCCGGAAGTTACCCGTTTTCTGGAACAGCATAGTCCGGATTGGAT CAT CTAT GATT AT ACCCATT ATT GGCT GCCGAGC ATT GCAGCAAGCCT GGGT ATTAGCCGTGCACATTTTAGCGTTACCACCCCGTGGGCAATTGCATATATGG GT CCGAGCGCAGAT GCAAT GATTAATGGTAGT GATGGT CGTACCACCGTT GA AGAT CT G ACCACCCCTCCG AAAT G GTTT CCGTTTCCG ACC AAAGTTT GTTGG CGTAAACATGATCTGGCACGTCTGGTTCCGTATAAAGCACCGGGTATTAGTG ATGGTTATCGTATGGGTCTGGTTCTGAAAGGTAGCGATTGTCTGCTGAGCAA ATGCTATCAT GAATTTGGCACCCAGT GGCT GCCGCT GCTGGAAACCCTGCAT CAGGTT CCGGTT GTT CCGGTGGGTCT GCTGCCT CCGGAAGTT CCGGGT GAT G AAAAAG AT G A AACCT G G GTT AGC AT C AAAAAAT GGCTGGATGGT AAAC AG A AAGGTAGCGTGGTTT AT GTT GCACT GGGT AGCGAAGTT CT GGTTAGCCAGAC CGAAGTT GTT GAACT GGCACT GGGTCT GGAACT GAGCGGT CT GCCGTTT GTT T GGGCAT ATCGT AAACCGAAAGGT CCGGCAAAAAGCGAT AGCGTT GAACTG CCGGATGGTTTT GTT GAACGTACCCGT GAT CGTGGT CTGGTTT GGACCAGCT GGGCACCTCAGCTGCGTATTCTGAGCCATGAAAGCGTTTGTGGTTTTCTGAC CCATT GTGGTAGCGGT AGCATT GTGGAAGGTCT GAT GTTT GGTCATCCGCT G ATT ATGCT GCCG ATTTTT GGT GATCAGCCGCT GAAT GCACGTCT GCT GGAAG ATAAACAGGTTGGTATTGAAATTCCGCGTAATGAAGAAGATGGTTGCCTGAC CAAAGAAAGCGTTGCACGTAGCCTGCGTAGCGTTGTTGTTGAAAAAGAAGGC GAAAT CTATAAAGCCAAT GCACGT GAACT GAGCAAAATCTATAAT GATACCAA AGT G G AAAAAGAATAT GT GAGCCAGTTCGT GG ATT AT CT GG AAAAAAAC ACC CGT GCAGTT GCCATT GATCACGAAAGCTAAT GACTCGAG Después de la síntesis del gen y la subclonación en el vector pET30A+ utilizando los sitios de clonación Ncol y Xhol, el plásmido UGT91D2_pET30a+ se introdujo en EC100 de E. coli mediante la electroporación. Las células obtenidas se cultivaron en la presencia de Kanamicina y se colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LB liquido (matraces Erlenmcyer). Se adicionó glicerol a la suspensión como crioprotector y se almacenaron alícuotas de 400 mL a -20°C y a -80°C.

Se utilizó el equipo del sistema de expresión de Proteína de Alto Rendimiento S30 T7 de Promega para la sintesis in-vitro de la proteína.

Se mezclaron 4 mg del plásmido UGT91D2_pET30a+ con 80 pL de la premezcla S30 plus y 72 pL del extracto S30 T7 se adicionaron. Se adicionó agua libre de nucleasa con el fin de obtener un volumen total de 200 pL y la solución resultante se incubó 2 h a 30°C. Se utilizó 5 pL para el análisis de SDS-page mientras que se utilizaron los 45 pL restantes en la reacción de prueba catalítica.

EJEMPLO 4 Reacción catalítica con UGT76G1 producido in-vivo El volumen total de la reacción fue 5.0 mL con la siguiente composición: solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM pH 7.2, MgCl2 3 mM, UDP-glucosa 2.5 mM, Esteviósido 0.5 mM y 500 pL de lisado descongelado de UGT76G1. Las reacciones se corrieron a 30°C en un agitador orbital a 135 rpm. Para cada muestra, 460 mL de la mezcla de reacción se inactivó con 40 pL de H2SO4 2N y 420 pL de metanol/agua (6/4). Las muestras se centrifugaron inmediatamente y se mantuvieron a 10°C antes del análisis mediante HPLC (CAD). La HPLC indicó la conversión casi completa de esteviósido a rebaudiósido A.

Transformación catalizada con UGT76G1 de esteviósido a Reb A Medida mediante CAD 300000000 ' tiempo (h) Ejemplo 5 Reacción catalítica con UGT91D2 producido in-vitro El volumen total de la reacción fue 0.5 mL con la siguiente composición: solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM pH 7.2, MgCl2, 3 mM, UDP-glucosa 3.8 mM, Rebaudiósido A 0.1 mM y 180 pL de UGT91D2 producido in-vitro. Las reacciones se corrieron a 30°C en un agitador orbital en 135 rpm. Para cada muestra, 450 pL de mezcla de reacción se inactivó con 45 mL de H23042N y 405 pL de MeOH al 60%. Después de la centrifugación, el sobrenadante se analizó mediante HPLC (CAD). La HPLC indicó una conversión de 4.7% del rebaudiósido A a rebaudiósido D después de 120 h.

EJEMPLO 6 Reacción catalítica con U6T76G1 producida in-vitro El volumen total de la reacción fue 2 mL con la siguiente composición: solución amortiguadora de fosfato sodio 50 mM pH 7.2, MgCl2 3 mM, UDP-glucosa 3.8 mM, rebaudiósido D 0.5 M y 180 pL de UGT76G1 producido in vitro.

Las reacciones se corrieron a 30°C en un agitador orbital a 135 rpm. Para cada muestra, 400 pL de la mezcla de reacción se inactivó con 40 pL de H2SO42N y 360 pL de MeOH a 60%. Después de la centrifugación, el sobrenadante se analizó mediante HPLC (CAD). La HPLC indicó 80% de conversión de rebaudiósido D a rebaudiósido X después de 120 h.

Síntesis de rebaudiósido X a partir del rebaudiósido D/detección de CAD catalizada mediante UGT76G1 producida in-vitro 1 200000000 20 40 60 80 100 120 140 Tiempo (h) Para los ejemplos 7 a 12, se utilizaron las siguientes abreviaturas: Medio LBGKP: 20 g/L de Lennox de Caldo Luria; solución amortiguadora PIPES 50 mM pH 7.00; solución amortiguadora de fosfato 50 mM pH 7.00; 2.5 g/L de glucosa y 50 mg/L de medio LB de Kanamicina o Ampicilina: (20 g/L de Lennox de Caldo Luria) EJEMPLO 7 Preparación y actividad de UGT76G1 preparada mediante el plás ido pET30a+ y la cepa de expresión de BL21 (DE3) El plásmido pET30a+_UGT76Gl se transformó en la cepa de expresión BL21 (DE3) (células electrocompetentes EXPRESS de E. Cloni® Lucigen). Las células obtenidas se cultivaron en el medio agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Kanamicina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en un medio LBGKP liquido que contiene Kanamicina. Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 L del medio LBGKP. Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L del "medio TB instantáneo express durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Kanamicina. El medio se dejó agitando a 20°C mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Después de 40 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido fue 10.58 g. 3.24 g de pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 8.1 mL de "Mezcla Maestra de Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 3.5 mL de agua. El U sado se recuperó por centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 8 Preparación y actividad de UGT76G1 preparada mediante el plásmido pET30a+ y la cepa de expresión Tuner (DE3) El plásmido pET30a+_UGT76G1 se transformó en la cepa de expresión Tuner (DE3) (células competentes TunerMR (DE3) de Novagen) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Kanamicina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en un medio LBGKP líquido que contiene Kanamicina). Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se añadió a 100 mL del medio LB que contiene 50 mg/L de Kanamicina. Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 15 h. 4.4 mL de este cultivo se utilizó para inocular 200 mL del medio de producción que contiene LB. Este medio se dejó agitando a 37°C hasta que se obtuvo una OD (600 nm) de 0.9 después de lo cual se adicionaron 400 pL de una solución IPTG 100 mM y el medio se dejó agitando a 30°C durante 4 h. Las células se recolectaron mediante centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido fue 1.38 g.

La pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 4.9 mL de "Mezcla Maestra de Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 2.1 mL de agua. El lisado se recuperó mediante centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 9 Preparación y actividad de UGT7661 preparada mediante el plásmido pMAL y la cepa de expresión BL21 Después de subclonar el gen UGT76G1 sintético en el plásmido pMAL utilizando los sitios de clonación Ndel y Salí, el plásmido pMAL_UGT76Gl se transformó en la cepa de expresión BL21 ( E. coli competente de BL21 de New England Biolabs) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio de agar de LB en cajas Petri en la presencia de Ampicilina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LBGKP líquido que contiene A picilina). Se adicionó un qlicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL de medio LBGKP. Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL de medio de producción que contiene 60 g/L de "medio TB instantáneo exprés durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Ampicilina. El medio se dejó agitando a 20°C, mientras que se toman muestras para medir la OD y pH. Después de 40 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido fue 5.86 g. 2.74 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 9.6 mL de "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 4.1 mL de agua. El lisado se recuperó por centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 10 Preparación y actividad de UGT76G1 preparada mediante el plásmido pMAL y la cepa de expresión ArcticExpress El plásmido pMAL_UGT76Gl se transformó en la cepa de expresión ArcticExpress (células competentes ArcticExpress de Agilent) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio de agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Ampicilina y Geneticina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LBGKP liquido que contiene Ampicilina y Geneticina. Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL de medio LBGKP (que contiene Ampicilina y Geneticina). Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L de "medio TB Instantáneo expresar durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Ampicilina. El medio se dejó agitando a 12°C mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Después de 68 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenida fue 8.96 g. 2.47 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 8.73 mL de la "Mésela Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 3.79 mL de agua. El U sado se recuperó por centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 11 Preparación y actividad de UGT76G1 preparada mediante el plásmido y pCOLDIII y la cepa de expresión ArcticExpress Después de subclonar el gen UGT76G1 sintético en el plásmido pCOLDIII utilizando los sitios de clonación Ndel y Xhol, el plásmido pCOLDIII_UGT76G1 se transformó en la cepa de expresión ArcticExpress (células competentes Agilent ArcticExpress) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio de agar LB en cajas de Petri en la presencia de Ampicilina y Geneticina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LBGKP liquido qüe contiene Ampicilina y Geneticina. Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 L del medio LBGKP (que contiene Ampicilina y Geneticina). Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L del "medio TB Instantáneo expresar durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Kanamicina. El medio se dejó agitando a 12°C mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Después de 63 h, las células se recolectaron mediante centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenida fue 6.54 g. 2.81 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 9.8 mL de la "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 4.2 mL de agua. El lisado se recuperó mediante centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 12 Preparación y actividad de UGT76G1 preparada mediante el plásmido pCOLDIII y la cepa de expresión Origami2 (DE3) El plásmido pCOLDIII_UGT76Gl se transformó en la cepa de expresión 0rigami2 (DE3) (células competentes (DE3) 0rigamiMR2 de Novagen) mediante el tratamiento de choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Ampicilina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LBGKP liquido que contiene Ampicilina. Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL del medio LBGKP (que contiene Ampicilina). Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L del "medio TB instantáneo expresar durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Kanamicina. El medio se dejó agitando a 12°C mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Después de 68 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenida fue 2.53 g. 1.71 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 6.0 mL de la "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 1.9 mL de agua. El lisado se recuperó mediante centrifugación y se mantuvo congelado.

EJEMPLO 13 Determinación de la actividad Las pruebas de actividad se realizaron en una escala de 5 mi con 500 mL de U sado descongelado para la transformación de Esteviósido a Rebaudiósido A y Rebaudiósido D a Rebaudiósido X utilizando 0.5 mM de substrato, 2.5 mM de UDP-glucosa y 3 mM de MgCl2 en solución amortiguadora de Fosfato de Sodio 50 mM en pH 7.2. Las muestras se tomaron y se analizaron mediante HPLC. Los resultados para las diferentes preparaciones de UGT76G1 se resumen en la siguiente tabla.

* Nota Las actividades para la transformación de Esteviósido y Rebaudiósido X se mencionan por mL de lisado. 1 U transformará 1 ymol de substrato en 1 hora a 30°C y pH 7.2 EJEMPLO 14 Reacción de escala de 50 mL para la transformación del Rebaudiósido D al Rebaudiósido X 5 mL de lisado del Ejemplo 12 se utilizó para transformar Rebaudiósido D a Rebaudiósido X en una escala de 50 mi. El medio de reacción consistió de solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM pH 7.2, 3 mM de MgCl2, 2.5 mM de UDP-glucosa y 0.5 mM de Rebaudiósido D.

Después de permitir que sea agitada la reacción a 30°C durante 90 h. 50 mL de etanol se adicionó y la mezcla resultante se dejó agitando a -20°C durante 1 h. Después de la centrifugación a 5000 g durante 10 min el sobrenadante se purificó por la vía de la ultrafiltración (Vivaflow MWCO 30000). 78 mL de material permeado se obtuvo y 9 mi del material retenido se diluyo con 9 mi de etanol y se volvió a someter a ultrafiltración (Vivaflow MWCO 30000). Otros 14 mL de filtrado se obtuvieron, los cuales combinaron con el primer material permeado. Los materiales permeados combinados se concentraron bajo presión reducida a 30°C hasta que se obtuvieron 32 mL de una solución clara.

El trazo de HPLC de la mezcla de producto se muestra en la FIG.5. La HPLC se llevó a cabo en un Agilent 1200 serie equipado con una bomba binaria, auto muestreador y compartimiento de columna de termostato. El método fue isocrático, con una fase móvil compuesta de 70% de agua (ácido fórmico al 0.1%): 30% de acetonitrilo. El gasto de flujo de 0.1 mL/min. La columna utilizada fue Phenomenex Prodigy 5m ODS (3) 100 A; 250x2mm. La temperatura de la columna se mantuvo a 40°C. El volumen de inyección fue de 20-40 pL.

EJEMPLO 15 Preparación de UGT91D2 utilizando el plásmido pMAL y la cepa de expresión BL21 Después de subclonar el gen UGT91D2 sintético en el plásmido pMAL utilizando los sitios de clonación Ndel y Salí, el plásmido pMAL_UGT91D2 se transformó en la cepa de expresión BL21 ( E. coli competente de BL21 New England Biolabs) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio agar LB en cajas de Petri en la presencia de Ampicilina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en un medio LBGKP liquido que contiene Ampicilina). Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL de medio LBGKP. Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL de medio de producción que contiene 60 g/L de "medio TB instantáneo exprés durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/L de Ampicilina. El medio se dejó agitando a 20°C, mientras que se toman muestras para medir la OD y pH. Después de 40 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido es 12.32g. 2.18 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 7.7 mL "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 3.2 mL de agua. El U sado se recuperó por centrifugación y se utilizó directamente para la prueba de actividad.

EJEMPLO 16 Preparación de UGT91D2 utilizando el plásmido pMAL y la cepa de expresión ArcticExpress El plásmido pMAL_UGT9lD2 se transformó en la cepa de expresión ArcticExpress (células competentes Agilent ArcticExpress) por el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Ampicilina y Geneticina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en el medio LBGKP liquido que contiene Ampicilina y Geneticina. Se añadió glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL de medio LBGKP (que contiene Ampicilina y Geneticina). Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L del "Medio TB instantáneo expresar durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 10 g/L de glicerol y 50 mg/1 de Ampicilina. Este medio de dejó agitando a 20°C durante 16 h. seguido por otro 50 h. a 12°C, mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido es 15.77 g. 2.57 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 9.0 mi de la "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 3.8 mL de agua. El U sado se recuperó por centrifugación y se utilizó directamente para la prueba de actividad.

EJEMPLO 17 Preparación de UGT91D2 utilizando el plásmido pET30a+ y la cepa de expresión Tuner (DE3) El plásmido pET30a+_UGT91D2 se transformó en la cepa de expresión Tuner (DE3) (células competentes (DE3) TunerMR de Novagen) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio de agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Kanamicina. Las colonias adecuadas se seleccionaron y se dejaron crecer en un medio LBGKP liquido (que contiene Kanamicina). Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 100 mL de medio LB que contiene 50 mg/L de Kanamicina. Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 15 h. 6.2 mL de este cultivo se utilizó para inocular 500 mL del medio de producción que contiene LB. Este medio se dejó agitando a 37°C hasta que se obtuvo una OD (600 nm) de 0.9 después de lo cual 500 mL de solución de IPTG 100 raM se adicionó (concentración de IPTG en el medio es 100 mM) y el medio se dejó agitando a 30°,C durante 4 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido es 4.02 g. 1.92 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 6.8 mL de la "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 2.8 mL de agua. El lisado se recuperó por centrifugación y se probó directamente para la actividad. EJEMPLO 18 Preparación de UGT91D2 utilizando el plásmido pET30a+ y la cepa de expresión ArcticExpress El plásmido pET30a+_UGT91D2 se transformó en la cepa expresión ArcticExpress (DE3) (células competentes de Agilent ArcticExpress) mediante el tratamiento con choque térmico. Las células obtenidas se cultivaron en el medio de agar de LB en cajas de Petri en la presencia de Kanamicina y Geneticina. Las colonias adecuadas de seleccionaron y se dejaron crecer en un medio LBGKP líquido que contiene Kanamicina y Geneticina. Se adicionó glicerol y alícuotas de 400 mL se almacenaron a -20°C y -80°C.

Una alícuota de almacenamiento se descongeló y se adicionó a 30 mL del medio LBGKP (que contiene Kanamicina y Geneticina). Este cultivo se dejó agitando a 30°C durante 8 h. y subsecuentemente se utilizó para inocular 400 mL del medio de producción que contiene 60 g/L del "medio TB instantáneo expresar durante la noche" (Novagen, referencia 71491-5), 1.0 g/L de glicerol y 50 mg/L de Ampicilina. El medio se dejó agitando a 20°C durante 16 h. seguido por otra 50 h. a 12°C mientras que se toman muestras para medir la OD (600 nm) y el pH. Después de 60 h, las células se recolectaron por centrifugación y se congelaron. El peso húmedo de célula obtenido es 16.07 g. 3.24 g de la pelotilla obtenida se liso mediante la adición de 11.4 mL de la "Mezcla Maestra Bugbuster" (Novagen, referencia 71456) y 4.8 mL de agua. El lisado se recuperó por centrifugación y se utilizó directamente para la prueba de actividad.

EJEMPLO 19 Determinación de la actividad de preparaciones in vivo de UGT91D2 Se realizaron pruebas de actividad en escala de 5 mL con 1000 de lisado para la transformación de Rubusósido a Esteviósido utilizando 0.5 mM de substrato, 2.5 mM de UDP-glucosa y 3 mM de MgCl2 en 50 mM de solución amortiguadora de fosfato de sodio a pH 7.2. Las muestras se tomaron y se analizaron mediante HPLC. Los resultados para las diferentes preparaciones de UGT91D2 se resumen en la siguiente tabla.

* Nota: Las actividades se mencionan por mL de lisado.1 U transformará 1 pmol de substrato en 1 hora a 30°C y el pH 7.2 EJEMPLO 20 Aislamiento del Rebaudiósido X La cantidad de la mezcla de producto del Ejemplo 14 no fue bastante grande para la separación por la vía de los métodos de HPLC preparativa. Por consiguiente, la HPLC analítica con una serie de inyecciones se utilizó para separar los componentes de la mezcla. La separación se condujo de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 14 para proporcionar dos fracciones correspondientes a los dos picos principales en el trazo de HPLC de la FIG.5: Fracción A (tiempo de retención 24.165 minutos) y Fracción B (tiempo de retención 31.325 minutos).

El tiempo de retención de la Fracción A fue consistente con reb D, indicando el material de partida no reaccionado de la reacción de biotransformación.

El tiempo de retención de la Fracción B purificada (Fig. 6) fue consistente con reb X, indicando la biotransformación exitosa a partir de reb D. La identidad del material recolectado en la Fracción B como reb X se confirmó mediante la co-inyección de Fracción B purificada con un estándar de reb X (disponible de Pure Circle, trazo de HPLC del estándar de reb X mostrado en la FIG. 7). Tanto la Fracción B como el estándar de reb X se encontraron para que eluyen en el mismo tiempo de retención (Fig.8) indicando que la Fracción B fue reb X.

La identidad de la Fracción B como reb X también se confirmó por separado mediante NMR y HRMS. Para el muestreo, la Fracción B se concentró bajo roto vapor, se secó por congelación y se secó durante 40 h a 40°C.

La muestra de NMR se disolvió en piridina deuterada (C5D5N) y los espectros se adquirieron en un instrumento Varían Unity Plus 600 MHz utilizando secuencias de pulsos estándares. Los espectros de NMR de la Fracción B se compararon con los espectros de NMR de reb X. Una sobre posición de los dos espectros (FIG.9) mostró la consistencia de los picos de la Fracción B con reb X. Una tabla de las asignaciones de NMR para reb X se muestra enseguida: Datos espectrales de 1H y 13C NMR para Rebaudiósido X en C5D5Nac a asignaciones hechas en la base de las correlaciones COSY, HMQC y HMBC; b Los valores de desplazamiento químico están en d (ppm); c Las constantes de acoplamiento están en Hz.

HRMS (FIG. 10) se generó con un espectrómetro de Masas de Tiempo de Vuelo Quadropole Waters Premier (Q-TOF) equipado con una fuente de ionización de electrorroció, operada en el modo de ion positivo. La muestra se disolvió en metanol y se eluyó en metanol:acetonitrilo:agua 2:2:1 y se introdujo por la vía de la infusión utilizando la bomba de jeringa en el equipo. La presencia de reb X se confirmó mediante un aducto [M+Na]+ en m/z 1313.5265, que corresponde a una fórmula molecular de C56H90O33: Fórmula Química C50Hao°2¾ Fórmula Química : .

Peso Molecular: 1128 Peso Molecular : 1290

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para hacer Rebaudiósido X, caracterizado porque comprende convertir Rebaudiósido D a Rebaudiósido X utilizando UDP-glucosiltransferasa.

2. El Rebaudiósido X hecho por el método de la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una pureza de mayor que aproximadamente 80% en peso.

3. El Rebaudiósido X hecho por el método de la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una pureza de mayor que aproximadamente 90% en peso.

4. El Rebaudiósido X hecho por el método de la reivindicación 1, caracterizado porque tiene una pureza de mayor que aproximadamente 95% en peso.

5. Un producto consumible, caracterizado porque comprende el Rebaudiósido X hecho por el método de la reivindicación 1.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la UDP-glucosiltransferasa comprende cualquier UDP-glucosiltransferasa capaz de adicionar por lo menos una unidad de glucosa al Rebaudiósido D para formar Rebaudiósido X.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la UDP-glucosiltransferasa es capaz de adicionar una unidad de glucosa a una posición C-19 del Rebaudiósido D.