JP2020500520A - カウレン酸ヒドロキシラーゼ - Google Patents
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Abstract
本発明は、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号1または配列番号3に示される配列を含むカウレン酸13−ヒドロキシラーゼと整列された場合に、136位、248位、336位、または403位の任意のアミノ酸位置に対応する少なくとも1つのアミノ酸置換をアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する。本発明のポリペプチドは、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生のために組換え宿主で使用することができる。【選択図】なし
Description
[分野]
本開示は、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。本開示はまた、核酸を含む核酸構築物、および核酸または核酸構築物を含む発現ベクターに関する。さらに、本開示は、核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主に関する。本開示はまた、組換え宿主を発酵させることを含むステビオールまたはステビオール配糖体の調製のためのプロセス、そのようなプロセスによって得られる発酵ブロス、およびそのプロセスによって得られる、または発酵ブロスから得られるステビオール配糖体に関する。加えて、本開示は、2つ以上のステビオール配糖体を含む組成物、およびステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料に関する。さらに、本開示は、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換するための方法、およびカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法に関する。
本開示は、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。本開示はまた、核酸を含む核酸構築物、および核酸または核酸構築物を含む発現ベクターに関する。さらに、本開示は、核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主に関する。本開示はまた、組換え宿主を発酵させることを含むステビオールまたはステビオール配糖体の調製のためのプロセス、そのようなプロセスによって得られる発酵ブロス、およびそのプロセスによって得られる、または発酵ブロスから得られるステビオール配糖体に関する。加えて、本開示は、2つ以上のステビオール配糖体を含む組成物、およびステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料に関する。さらに、本開示は、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換するための方法、およびカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法に関する。
[背景]
多年生植物、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bert)の葉には、ステビオール配糖体として知られている非常に甘い化合物が大量に蓄積されている。これらの化合物の生物学的機能は不明であるが、それらは、代替の強力な甘味料として商業的意味を有する。
多年生植物、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー(Stevia rebaudiana Bert)の葉には、ステビオール配糖体として知られている非常に甘い化合物が大量に蓄積されている。これらの化合物の生物学的機能は不明であるが、それらは、代替の強力な甘味料として商業的意味を有する。
これらの甘いステビオール配糖体は、多くの強力な甘味料の機能特性および知覚特性よりも優れていると思われる機能特性および知覚特性を有する。さらに、研究により、ステビオシドがII型糖尿病患者の血糖値を下げることができ、そして中等度の高血圧患者の血圧を下げることができることが示唆されている。
ステビオール配糖体は、ステビアの葉に蓄積し、それらは葉の乾燥重量の10〜20%を占め得る。ステビオシドおよびレバウジオシドAは、熱安定性、かつpH安定性であり、炭酸飲料での使用に適しており、他の多くの食品にも使用することができる。ステビオシドは、スクロースよりも110〜270倍甘く、レバウジオシドAは、スクロースよりも150〜320倍甘い。さらに、レバウジオシドDは、ステビアの葉に蓄積する強力なジテルペン配糖体甘味料でもある。レバウジオシドDは、スクロースの約200倍甘い可能性がある。レバウジオシドMは、さらに強力なジテルペン配糖体甘味料である。レバウジオシドMは、特定のステビア品種の葉に微量で存在するが、優れた味覚プロファイルを有することが示唆されている。
ステビオール配糖体は、従来、ステビア植物から抽出されてきた。ステビアでは、ジベレリン酸(GA)生合成の中間体である(−)−カウレン酸が、四環式ジテルペンステビオールに変換され、次いで多段階グリコシル化経路を経て様々なステビオール配糖体を形成する。しかしながら、収量は、変動し、農業および環境条件によって影響を受ける可能性がある。また、ステビア栽培は、かなりの土地面積、収穫前の長い時間、多大な労働力、ならびに配糖体の抽出および精製のための追加費用を必要とする。
ごく最近になって、発酵プロセスを用いたステビオール配糖体の生産に関心が集まってきている。国際公開第2013/110673号パンフレットおよび同第2015/007748号パンフレットに、少なくともステビオール配糖体レバウジオシドAおよびレバウジオシドDを生産するために使用できる微生物が記載されている。
より多量のステビオール配糖体を産生することができ、かつ/または追加もしくは新規のステビオール配糖体および/もしくはより多量の特定のステビオール配糖体および/もしくは所望の割合の異なるステビオール配糖体を有するステビオール配糖体の混合物を産生できるようにするためには、そのような微生物のさらなる改良が望ましい。
[概要]
本開示は、新規なカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ(KAH)ポリペプチド、すなわちKAH活性を有する新規なポリペプチドの同定に基づく。これらのポリペプチドは、ステビオールおよび/または1つもしくは複数のステビオール配糖体の産生に適した組換え宿主の作製に使用することができる。
本開示は、新規なカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ(KAH)ポリペプチド、すなわちKAH活性を有する新規なポリペプチドの同定に基づく。これらのポリペプチドは、ステビオールおよび/または1つもしくは複数のステビオール配糖体の産生に適した組換え宿主の作製に使用することができる。
そのような組換え宿主は、参照カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを発現する組換え宿主と比較して、より多量のステビオール配糖体およびより少量の不所望の産物を産生し得る。より多量のステビオール配糖体および/またはより少量の不所望の産物の産生により、ステビオール配糖体の回収をより容易になり得る。また、より高い収量を得ることができる。
したがって、本開示は、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号1(A.thaliana由来の野生型KAH配列)または配列番号3(KAH4_m4)に示される配列を含むカウレン酸13−ヒドロキシラーゼと整列された場合に:
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する。
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する。
本開示はまた以下に関する:
・配列番号5、7、9、11、または13に対して少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも約96%の配列同一性、少なくとも約97%の配列同一性、少なくとも約98%の配列同一性、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド;
・本開示のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む核酸;
・適切な発現宿主においてカウレン酸13−ヒドロキシラーゼの発現を誘導することができる1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本開示の核酸を含む核酸構築物;
・本開示による核酸または核酸構築物を含む発現ベクター;
・本開示の核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主;
・本明細書で開示されるような組換え宿主を適当な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス;
・本明細書に開示されるステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む発酵ブロス;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られるステビオール配糖体;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる2つ以上のステビオール配糖体を含む組成物;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む、あるいは本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる組成物を含む食品、飼料、または飲料;
・第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する方法であって:
前記第1のステビオール配糖体を本明細書に開示される組換え宿主、そのような組換え宿主由来の無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来の酵素調製物と接触させる工程;
それにより、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法;ならびに
・本明細書に開示される宿主細胞を、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼの産生に適した条件下で培養する工程、および任意選択による、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを回収する工程を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを生産するための方法。
・配列番号5、7、9、11、または13に対して少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも約96%の配列同一性、少なくとも約97%の配列同一性、少なくとも約98%の配列同一性、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド;
・本開示のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む核酸;
・適切な発現宿主においてカウレン酸13−ヒドロキシラーゼの発現を誘導することができる1つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本開示の核酸を含む核酸構築物;
・本開示による核酸または核酸構築物を含む発現ベクター;
・本開示の核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主;
・本明細書で開示されるような組換え宿主を適当な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス;
・本明細書に開示されるステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む発酵ブロス;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られるステビオール配糖体;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる2つ以上のステビオール配糖体を含む組成物;
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む、あるいは本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる組成物を含む食品、飼料、または飲料;
・第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する方法であって:
前記第1のステビオール配糖体を本明細書に開示される組換え宿主、そのような組換え宿主由来の無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来の酵素調製物と接触させる工程;
それにより、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法;ならびに
・本明細書に開示される宿主細胞を、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼの産生に適した条件下で培養する工程、および任意選択による、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを回収する工程を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを生産するための方法。
[配列表の説明]
配列番号1は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号1は、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号2は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号3は、KAH4_m4ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、KAH4_m4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号5〜14は表1に示されている。
配列番号15は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)由来のヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号16は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号17は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドンである、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circenelloides)由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号18は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のコパリルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号19は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のカウレンシンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号20は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、イネ馬鹿苗病菌(Giberella fujikuroi)由来のカウレンオキシダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号21は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のチトクロームP450レダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号22は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のUDP−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号23は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のUDP−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号24は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のUDP−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
配列番号25は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のUDP−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
[詳細な説明]
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、「含む(comprise)」、「含む(include)」、および「有する(having)」という語、ならびに「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」などの変形は包含的に解釈されるべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許す限り、具体的に列挙されていない他の要素または整数の包含の可能性を伝えることを意図している。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、「含む(comprise)」、「含む(include)」、および「有する(having)」という語、ならびに「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(includes)」、および「含む(including)」などの変形は包含的に解釈されるべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許す限り、具体的に列挙されていない他の要素または整数の包含の可能性を伝えることを意図している。
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、冠詞の文法上の目的語の1つまたは2つ以上(すなわち、1つまたは少なくとも1つ)を指すために本明細書で使用される。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味し得る。
したがって、本開示によると、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。本開示のポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する。カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性は、ステビオールを形成するC−13位における(−)−カウレン酸のヒドロキシル化の活性である。
本明細書における「レバウジオシド」は、「Reb」または「reb」などと略すことがある。
したがって、本開示の目的のために、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ent−カウレン酸由来のステビオール(ent−kaur−16−エン−13−オール−19−酸)の生成を触媒するかまたは部分的に触媒することができるポリペプチドであり得る。したがって、本開示の目的のために、ポリペプチドは、NADPHおよびO2を使用して、ステビオール(ent−kaur−16−エン−13−オール−19−酸)の生成を触媒するかまたは部分的に触媒することができるカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
そのような活性はまた、ent−ka 13−ヒドロキシラーゼ活性またはent−カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性と呼ぶこともある。
本開示のポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する。
本開示によるポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変されたカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
そのようなポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して低下した特異的カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
そのようなポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して増加した特異的カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
本開示によるポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドであり得る。
本明細書では、本開示のポリペプチドは、「カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ」酵素またはポリペプチド、「カウレン酸ヒドロキシラーゼ」酵素またはポリペプチド、「KAH」酵素またはポリペプチドなどと呼ぶことがある。
本開示のKAHポリペプチド(例えば、本明細書に示される1つまたは複数の置換を有するポリペプチド)は、配列番号1または配列番号3のKAHなどの参照KAHポリペプチドと少なくとも約60%、70%、80%の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約85%の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約90%の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約95%の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約98%の同一性、または参照ポリペプチドと少なくとも約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。そのようなKAHポリペプチドは、典型的には、配列番号1または配列番号3を基準に定義される
136位、248位、336位、または403位
に対応する位置から選択される1つもしくは複数の置換または置換のセットを有するであろう。
136位、248位、336位、または403位
に対応する位置から選択される1つもしくは複数の置換または置換のセットを有するであろう。
参照KAHにおいて本明細書で定義される位置のうちの1つに対応するアミノ酸位置は、記載された任意のアミノ酸位置と多重(タンパク質)配列アラインメントにおいて整列する位置であり得る。
配列番号1または配列番号3を基準に定義される136位、248位、336位、または403位のうちの1つに対応するアミノ酸位置は、KAHポリペプチド配列が適切な配列アラインメント法によって配列番号1または3に示されるアミノ酸配列と整列された場合にKAHポリペプチド配列において同定される位置である。適切な配列アラインメント法は、互いの配列の比較、およびKAHポリペプチドのアミノ酸配列における位置の同定を可能にする方法であり、配列番号1または3に示されるアミノ酸配列と比較すると、同じアミノ酸が存在する(同一の位置)か、または別のアミノ酸が存在する(置換)か、または1つまたは複数の余分なアミノ酸が存在する(挿入または伸長)か、またはアミノ酸が存在しない(欠失または切断)。
2つのアミノ酸配列の比較を可能にする適切な方法は、当業者に公知の任意の適切なペアワイズ配列アラインメント法、好ましくはグローバルペアワイズ配列アラインメント法であり得る。好ましいグローバルペアワイズ配列アラインメント法は、本明細書に記載されるNeedleman−Wunschアラインメントアルゴリズム(2つの配列の全長に沿ってそれらの最適なアラインメント(ギャップを含む)を見出すことを目的とする)(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443−453)に基づくEMBOSS Needle法である。一実施形態では、アミノ酸配列は、好ましくは10のギャップオープンペナルティーおよび0.5のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてEBLOSUM62を使用するEMBOSS Needleアラインメント法を使用して、配列番号1または3に示されるアミノ酸配列と整列される。
本開示による一実施形態では、配列番号1または配列番号3を基準に定義される136位、248位、336位、または403位の任意のアミノ酸に対応する、KAH活性を有するポリペプチドにおける位置は、10のギャップオープンペナルティーおよび0.5のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてEBLOSUM62を使用するEMBOSSパッケージのNEEDLEプログラムなどのEMBOSS Needleアラインメント法を用いて、本開示のKAH活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号1または3に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される。
本開示のKAHは、典型的にはKAH活性を維持するであろう。すなわち、本開示のKAHは、参照ポリペプチドと比較して改変された活性を有するが、典型的には上記の反応を触媒することができるであろう。
好ましくは、本開示のKAHポリペプチドは、典型的にはそれが由来する参照ポリペプチドと比較して、典型的には比活性および/または基質特異性に関して改善された特性を示すであろう。そのような改善された特性は、典型的には、例えばステビオールおよび/またはステビオール配糖体の生産方法(組換え宿主でKAHを発現させることによる)において、以下に示すようにKAHを使用した場合に適切な特性である。
したがって、本開示のKAHは、典型的には、(参照ポリペプチドを発現する、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主と比較して)ステビオールおよび/またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主における前記ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生を増加させることができるKAHである。すなわち、宿主細胞における本開示のKAHポリペプチドの過剰発現は、典型的には、(配列番号1または配列番号3のKAHなどの)宿主ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞と比較して、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生の増加をもたらすであろう。
本開示のKAHは、典型的には、(参照ポリペプチドを発現する、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主と比較して)ステビオールおよび/またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主における1つまたは複数のカウレン酸配糖体などの非ステビオール配糖体の産生を減少させることができるKAHであり得る。すなわち、宿主細胞における本開示のKAHポリペプチドの過剰発現は、典型的には、(配列番号1または配列番号3のKAHなどの)宿主ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞と比較して、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生の増加をもたらすであろう。
少量の非ステビオール配糖体産物の産生により、ステビオール配糖体の回収がより容易になり得る。また、より高い収量を得ることができる。
参照KAHに対して改善された特性を示すKAHは、例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産方法において、典型的にはKAHが本明細書に示される使用により適するように、関連する特性、例えば比活性の測定可能な減少または増加を実証するKAHである。
KAHポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して1つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および/もしくは挿入、ならびに/または参照ポリペプチドと比較して1つまたは複数の切断を有するアミノ酸配列を含む。KAHポリペプチドは、本明細書に記載される1つまたは複数の置換を含み得る。
例えば本明細書に示されるKAH活性を有するポリペプチドであって、配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、
136位、248位、336位、または403位
のアミノ酸のいずれかに対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、KAHは、KAH活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
136位、248位、336位、または403位
のアミノ酸のいずれかに対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、KAHは、KAH活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
アミノ酸の置換は、特定の位置のアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換されていることを示すものとする。
したがって、例えば本明細書に示されるKAH活性を有するポリペプチドであって、配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、KAHは、KAH活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、KAHは、KAH活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
したがって、前記位置のうちの1つまたは複数に存在するアミノ酸は、参照配列中のその位置に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるであろう(その位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される)。
本開示のKAHは、上記の置換のうちの1つを含んでもよいし、またはそれらの2つ、3つもしくは4つの任意の組み合わせを含んでもよい。
本開示のKAHポリペプチドは:
(i)メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)が136位に対応する位置に存在し;
(ii)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)が248位に対応する位置に存在し;
(iii)セリン(S)、アラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
(iv)グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、メチオニン(M)、もしくはセリン(S)が403位に対応する位置に存在する、KAHポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
(i)メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)が136位に対応する位置に存在し;
(ii)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)が248位に対応する位置に存在し;
(iii)セリン(S)、アラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
(iv)グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、メチオニン(M)、もしくはセリン(S)が403位に対応する位置に存在する、KAHポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
上で定義された置換のうちの2つ、3つ、または4つの任意の組み合わせを使用して、本開示のKAHを定義することができる。
本開示のKAHポリペプチドは、好ましくは:
(i)メチオニン(M)もしくはバリン(V)が136位に対応する位置に存在し;
(ii)アスパラギン(N)が248位に対応する位置に存在し;
(iii)セリン(S)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
(iv)グリシン(G)が403位に対応する位置に存在する、KAHポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
(i)メチオニン(M)もしくはバリン(V)が136位に対応する位置に存在し;
(ii)アスパラギン(N)が248位に対応する位置に存在し;
(iii)セリン(S)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
(iv)グリシン(G)が403位に対応する位置に存在する、KAHポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
上で定義された置換の任意の組み合わせを使用して、本開示のKAHを定義することができる。
したがって、本開示のKAHポリペプチドは、配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換:
136位および248位
136位および336位
136位および403位
248位および336位
248位および403位
336位および403位
136位、248位、および403位
136位、336位、および403位
136位、248位、および336位
248位、336位、および403位、または
136位、248位、336位、および403位
を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
136位および248位
136位および336位
136位および403位
248位および336位
248位および403位
336位および403位
136位、248位、および403位
136位、336位、および403位
136位、248位、および336位
248位、336位、および403位、または
136位、248位、336位、および403位
を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
したがって、本開示のKAHポリペプチドは、配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換:
(a)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P);
(b)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(c)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(d)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(e)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(f)336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(g)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(h)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(i)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(j)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、または
(k)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
(a)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P);
(b)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(c)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(d)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(e)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(f)336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(g)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(h)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(i)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(j)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、または
(k)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号1または配列番号3を基準に定義される。
本開示のKAHポリペプチドは、上で定義された5つの置換位置のうちの1つまたは複数以外のさらなる置換、例えば、1つまたは複数のさらなる置換、付加、または欠失を含み得る。
本開示のKAHは、この種の異なる種類の改変の組み合わせを含み得る。KAHは、1つ、2つ、3つ、4つ、少なくとも5つ、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、またはそれ以上のそのような改変(すべて同じ種類の改変であってもよいし、または異なる種類の改変であってもよい)を含み得る。典型的には、さらなる改変は置換であり得る。本開示のKAHポリペプチドは、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、KAHポリペプチドは、136位、248位、336位、または403位における置換の任意の組み合わせを含み得、前記位置は、配列番号1または配列番号3に示されるような適切な参照配列を基準に定義される。
宿主細胞は、本開示の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上のKAHをコードする核酸を含み得る。そのようなKAHポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。宿主細胞は、配列番号1または配列番号3のKAHをコードする核酸、および本開示の1つまたは複数のKAHをコードする核酸を含み得る。すなわち、宿主は、配列番号1または配列番号3のKAHをコードする核酸、および本開示の1つまたは複数のKAHをコードする核酸を含み得、これらはそれぞれ、コピー中に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上存在し得る。
KAHポリペプチドは、典型的には、参照ポリペプチドと比較して改変されたKAH活性を有するであろう。典型的には、改変された活性は、組換え宿主におけるステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生に関して定義することができる。
改変された活性は、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、KAHが宿主細胞で過剰発現されるときのステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生の増加に関して定義することができる。
改変された活性は、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、KAHが宿主細胞で過剰発現されるときの非ステビオール配糖体、例えばカウレン酸配糖体などの不所望の産物の産生の減少に関して定義することができる。
改変された活性は、2つのステビオール配糖体の産生比の変化に関して定義することができ、参照ポリペプチド、例えば、配列番号1または配列番号3の参照ポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、KAHが宿主細胞において過剰発現される場合、例えばレバウジオシドA:レバウジオシドMの比率が増加し得る、あるいはレバウジオシドM:レバウジオシドAの比率が増加し得る。
改変された活性は、産生されたステビオール配糖体の合計のカウレン酸−配糖体の合計に対する比率の変化によって定義することができ、例えばステビオール配糖体の合計:カウレン酸−配糖体の合計の比率は、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、KAHが宿主細胞で過剰発現されるときに増加し得る。
改変された活性はまた、例えば、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドよりも長い半減期を有するKAHの安定性の増加に関して定義することもできる。
改変された活性はまた、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドと比較して、より効率的な電子伝達に関して、例えばより少ないデカップリングに関して定義することもできる。
改変された活性はまた、参照ポリペプチド、例えば配列番号1または配列番号3のポリペプチドと比較して、宿主細胞内のより効率的な電子局在化に関して定義することもできる。
KAHは、例えば、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも100%、またはそれ以上の産生レベルを増加させ得る可能性がある。産生レベルは、g/Lまたはmol/L(M)で表すことができるため、ステビオールおよび/またはステビオール配糖体の産生レベルの増加は、g/Lまたはmol/Lでの高い生産レベルによってはっきりと分かるであろう。
1つまたは複数のカウレン酸配糖体などの不所望の産物の場合、KAHは、例えば、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、またはそれ以上の産生レベルを減少させることが可能であり得る。KAHは、この比率を、例えば、少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも100%、またはそれ以上増加させることが可能であり得る。
上記のように、これはまた、ステビオール配糖体の合計:カウレン酸−配糖体の合計の増加に関しても定義することもできる。
「ポリペプチド」という語は、本明細書では、約7個を超えるアミノ酸残基を含む鎖に対して使用される。本明細書のすべてのポリペプチド配列は、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に書かれる。本明細書で使用されるアミノ酸の一文字コードは当技術分野で一般的に知られており、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)に見ることができる。
本開示のKAHポリペプチドは、実質的に単離された形態などの単離された形態であり得る。「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質のことである。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製された組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたと見なされる。本開示によるKAHポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって組換え細胞の培養物から回収および精製することができる。
本開示のKAHポリペプチドは、化学合成手順の生成物、ならびに、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む原核宿主または真核宿主からの組換え技術によって産生される産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、本開示のポリペプチドは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本開示のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基も含み得る。
本開示はまた、本開示によるKAHポリペプチドの生物学的に活性な断片を特徴とする。そのような断片は、「本開示のKAH」という用語に包含されると見なされる。
本開示のKAHポリペプチドの生物学的に活性な断片は、完全長タンパク質より少ないアミノ酸を含むが対応する完全長タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性を示す、本開示のKAHタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはこのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な断片は、本開示のKAHタンパク質の少なくとも1つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本開示のKAHの生物学的に活性な断片は、例えば、10、25、50、100、またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製することができ、かつ本開示のポリペプチドの天然の形態の1つまたは複数の生物学的活性について評価することができる。
典型的には、本開示のKAHのタンパク質断片は、本明細書で定義される1つまたは複数の置換を含むであろう。
本開示はまた、上記の生物学的に活性な断片をコードする核酸断片を特徴とする(これらの生物学的に活性な断片はそれ自体が本開示のKAHである)。
本開示は、本開示のKAHポリペプチド(およびその生物学的に活性な断片)をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、本開示のKAHポリペプチドの少なくとも1つの機能的ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。典型的には、そのようなドメインは、本明細書に記載されている1つまたは複数の置換を含むであろう。
本開示の核酸分子は、本明細書に提供される配列情報と組み合わせて使用される、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて作製することができる。例えば、標準的な合成技術を用いて、必要とされる核酸分子を、PCRによって作製するか、または新規に合成することができる。そのような合成プロセスは、典型的には自動化プロセスであろう。
本開示の核酸は、参照KAHをコードする核酸と比較して、1つまたは複数の欠失、すなわちギャップを含み得る。そのような欠失/ギャップは、適切なオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発法を用いて生成することもできる。そのような欠失を生じさせるための技術は当業者に周知である。
さらに、本開示によるヌクレオチド配列に対応するか、またはそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば自動DNA合成装置を用いて調製することができる。
また、相補的な核酸およびアンチセンス核酸も本開示に含まれる。別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるように他のヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸分子である。
本開示の一態様は、本開示のKAHポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片もしくはドメインをコードする単離された核酸分子、ならびに本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子、および本開示の核酸分子の調製などのための、核酸分子の増幅または突然変異のためのPCRプライマーとしての使用に適した、そのような核酸分子の断片に関する。
「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接しているコード配列(5’末端のコード配列および3’末端のコード配列)の両方と直接隣接していないDNAまたはRNAである。したがって、一実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接している5’非コード(例えば、プロモーター)配列の一部またはすべてを含む。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、あるいは原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれているか、または他の配列とは独立に別の分子(例えば、PCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されるcDNAまたはゲノムDNA断片)として存在する組換えDNAを含む。この用語はまた、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地(組換えDNA技術によって作製された場合)、または化学的前駆体もしくは他の化学物質(化学的に合成された場合)を実質的に含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として天然に存在しない、かつ天然の状態でも見出されないであろう核酸断片である。
本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」という用語は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、およびRNA分子(例えば、mRNA)、およびヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNAまたはRNAの類似体を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体(例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を用いて合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば、変更された塩基対形成能力または高いヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製することができる。
本開示はまた、本開示のKAHポリペプチドをコードする核酸配列、およびそれに機能的に連結された、宿主細胞中でこの核酸配列の発現を可能にする制御配列を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、KAHポリペプチドの発現を達成するために、発現ベクターなどのベクターおよび/または宿主細胞に組み込むことができる。
「核酸構築物」という用語は、本明細書では、天然に存在する遺伝子から単離された、またはより典型的には、天然には存在しないように組み合わせられて並置された核酸のセグメントを含むように改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子と呼ばれる。用語、核酸構築物は、コード配列の発現に必要な制御配列のすべてを含む場合、用語「発現カセット」と同義であり、前記制御配列は、前記コード配列に機能的に連結されている。
本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素(またはコード配列または核酸配列)の連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する1つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を指し、DNA依存性RNAポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および当業者に公知の任意の他のDNA配列の存在によって構造的に識別される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生制御下で活性であるプロモーターである。
KAHポリペプチドなどの酵素、または本開示の組換え宿主細胞に導入される任意の他の酵素のような酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に固有ではない、すなわち、それが機能的に連結されているヌクレオチド配列(コード配列)に対して異種であるプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、宿主細胞に対して相同、すなわち内因性である。
この文脈における適切なプロモーターには、構成的および誘導性の天然プロモーターならびに遺伝子的に操作されたプロモーターの両方が含まれ、それらは当業者に周知である。宿主細胞における適切なプロモーターは、GAL7、GAL10、またはGAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、およびAOX1であり得る。他の適切なプロモーターには、PDC、GPD1、PGK1、TEF1、およびTDHが含まれる。
通常は、酵素をコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。宿主細胞において機能的であるいずれのターミネーターも、本開示で使用することができる。好ましいターミネーターは、宿主細胞の天然遺伝子から得られる。適切なターミネーター配列は、当技術分野で周知である。好ましくは、そのようなターミネーターは、本開示の宿主細胞におけるナンセンス媒介mRNA崩壊(nonsense mediated mRNA decay)を防止する変異と組み合わせられる(例えば、Shirley et al.,2002,Genetics 161:1465−1482を参照)。
本開示はさらに、本開示の核酸または本開示の核酸構築物を含む(すなわち、本開示のKAHポリペプチドをコードする配列を含む)ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
KAHの発現および/または翻訳を促進するために、KAHをコードする遺伝子がインビトロまたは本開示の宿主細胞における発現および/または翻訳のための適切な制御配列に機能的に連結されるように、KAHをコードする核酸配列を発現ベクターに含めることができる。すなわち、本開示は、本開示の核酸または核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。
発現ベクターは、組換えDNA法に便利に供することができ、かつKAHポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される細胞とベクターとの適合性によって決まる。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。真菌起源の宿主細胞での使用を意図している場合、適切なエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母2μもしくはpKD1プラスミド(Gleer et al.,1991,Biotechnology 9:968−975)、またはAMAプラスミド(Fierro et al.,1995,Curr Genet.29:482−489)に基づいてもよい。
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製される発現ベクターであり得る。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体中に無作為にまたは所定の標的遺伝子座に組み込まれ得る。本開示の好ましい実施形態では、組込みクローニングベクターは、クローニングベクターの宿主細胞のゲノム中の所定の遺伝子座への組込みを標的とするための、この所定の標的遺伝子座におけるDNA配列と相同なDNA断片を含む。標的組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方の末端、好ましくは両方の末端が標的遺伝子座に相同な配列に隣接するように行われる。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも20bp、少なくとも30bp、少なくとも50bp、少なくとも0.1kb、少なくとも0.2kb、少なくとも0.5kb、少なくとも1kb、少なくとも2kb、またはそれ以上である。宿主細胞のゲノムへの標的組込み、すなわち所定の標的遺伝子座への組込みの効率は、宿主細胞の増強された相同組換え能力によって高められる。
標的遺伝子座と相同であるクローニングベクター中の相同フランキングDNA配列は、高度に発現された遺伝子座から得ることができる、すなわちそれらは、宿主細胞中で高い発現レベルが可能である遺伝子から得られることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書では、例えば誘導条件下で、そのmRNAが全細胞mRNAの少なくとも0.5%(w/w)を構成することができる遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも1%(w/w)を構成することができる、または分泌遺伝子産物の場合には、少なくとも0.1g/lのレベルまで分泌され得る遺伝子として定義される。より典型的には、標的遺伝子座は、遺伝子間位置であり得るため、遺伝子は中断されない。そのような遺伝子座はまた、高い発現レベルを提供し得る。したがって、クローニングベクター中の相同フランキングDNA配列は、遺伝子間標的遺伝子座と相同であり得る。
核酸構築物または発現ベクターは、本開示の宿主細胞中で、インビボで構築され、任意選択により、単一工程で細胞のゲノムに組み込むことができる(例えば、国際公開第2013/076280号パンフレットを参照)。
本開示の核酸構築物または発現ベクターの2つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、核酸構築物内に含まれる核酸配列によってコードされるKAHポリペプチドの産生(過剰発現)を増加させることができる。これは、好ましくは、そのゲノムに2コピー以上の核酸を組み込むことによって、より好ましくは、上で定義したように定義された遺伝子座への核酸の組込みを標的化することによって行うことができる。
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを当業者は理解されよう。本開示の発現ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド(例えば、配列番号1または配列番号3のKAH、例えば機能的等価物または断片、または1つ以上のそのようなKAHを含む融合タンパク質)を産生させることができる。
本開示の核酸構築物およびベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞における本開示のKAHポリペプチドの発現用に設計することができる。
本開示の核酸構築物および/または発現ベクターを、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当業者に周知の宿主細胞に外来核酸(例えば、DNA)を導入するための当技術分野で承認されている様々な技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適した方法は、Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)、Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)、および他の実験マニュアルに見ることができる。
本開示による「機能的等価物」は、本明細書で定義される本開示のKAHの特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離された核酸断片である。したがって、機能的等価物は、生物学的に活性な断片も包含し、そして、それら自体が本開示の用語「KAH」(など)に包含される。
好ましくは、本開示の機能的等価物は、本明細書に記載の1つまたは複数の置換を含む。しかしながら、機能的等価物は、上記の置換に加えて1つまたは複数の改変を含み得る。
機能的核酸等価物は、典型的には、サイレント変異、またはコードされたKAHポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含み得る。したがって、本開示は、特定の生物学的活性、すなわちKAH活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むKAHタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
KAHタンパク質のそのような機能的等価物は、それらが由来する親KAH配列とはアミノ酸配列が異なるが、その少なくとも1つの生物学的活性をなお保持する、好ましくは、少なくともKAH活性を保持する。当業者は、本開示によるヌクレオチド配列に変異によって変化を導入し、それにより、そのようなタンパク質の機能を実質的に変更することなく、得られるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることを理解されよう。
一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、親KAHまたは参照アミノ酸配列(例えば、配列番号1または配列番号3に示される)に対して少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
したがって、本開示のKAHの機能的等価物は、好ましくは、親KAHアミノ酸配列または参照ポリペプチド配列(例えば、配列番号1または配列番号3に示され、典型的には、親KAHポリペプチドの少なくとも1つの機能的活性も保持する)に対して少なくとも約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、98%、約99%、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する本開示のポリペプチドは、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、または配列番号13のいずれか1つに対して、少なくとも約80%の配列同一性、少なくとも約90%の配列同一性、少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本開示のKAHポリペプチドは、表1に定義される配列または表1に定義される置換パターン(位置に関しては、正確でなくても同じアミノ酸置換である)を有し得る。
本開示のKAHポリペプチドは、例えば、適切な参照ポリペプチドの変異体、例えば置換変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。候補変異体は、宿主細胞で発現された場合、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生を(参照ポリペプチドを発現する対応する宿主細胞と比較して)増加させるそれらの能力に基づいてスクリーニングすることができる。
本開示による核酸の断片は、機能的なポリペプチドをコードしない配列を含み得るか、またはそれからなり得る。そのような核酸は、PCR反応用のプローブまたはプライマーとして機能し得る。
機能的なポリペプチドをコードするかまたは非機能的なポリペプチドをコードするかにかかわらず、本開示による核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーとして使用することができる。KAH活性を有するポリペプチドをコードしない本開示の核酸分子の使用は、とりわけ、(1)Verma et al.,Human Chromosomes:a Manual of Basic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)に記載されている、KAHコード遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体スプレッドへのインサイチューハイブリダイゼーション(例えば、FISH);(2)特定の組織および/または細胞におけるKAH mRNAの発現を検出するためのノーザンブロット分析;および(3)所与の生物学的(例えば、組織)試料中のプローブまたはプライマーにハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用することができるそのようなプローブおよびプライマー、を含む。
所与の参照KAH酵素に基づく本開示のKAHは、以下の標準的手順によって得ることができる:
−変異誘発(エラーを起こしやすい、ドープされたオリゴ、スパイクされたオリゴ)または変異体の合成
−例えばY.リポリティカ(Y.lipolytica)またはS.セレビシエ(S.cerevisiae)における形質転換
−形質転換体の培養、形質転換体の選択
−例えばY.リポリティカ(Y.lipolytica)またはS.セレビシエ(S.cerevisiae)における発現
−例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産に基づく一次スクリーニング
−改善されたKAHの同定。
−変異誘発(エラーを起こしやすい、ドープされたオリゴ、スパイクされたオリゴ)または変異体の合成
−例えばY.リポリティカ(Y.lipolytica)またはS.セレビシエ(S.cerevisiae)における形質転換
−形質転換体の培養、形質転換体の選択
−例えばY.リポリティカ(Y.lipolytica)またはS.セレビシエ(S.cerevisiae)における発現
−例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産に基づく一次スクリーニング
−改善されたKAHの同定。
一実施形態では、本開示は、本開示によるKAHポリペプチドを作製する方法に関し、この方法は、以下を含む:
(a)参照KAHポリペプチド(すなわち鋳型または出発ポリペプチド)を選択する工程;
(b)136位、248位、336位または403位
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が配列番号1または配列番号3を基準に定義される、工程;
(c)任意選択による、(b)で定義される1つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程;
(d)工程(a)〜(c)から得られるKAHを調製する工程;
(e)例えば実施例に記載されているように、KAHの特性を決定する工程;および
(f)参照KAHポリペプチドと比較して変更された特性を有するKAHを選択する工程。
(a)参照KAHポリペプチド(すなわち鋳型または出発ポリペプチド)を選択する工程;
(b)136位、248位、336位または403位
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が配列番号1または配列番号3を基準に定義される、工程;
(c)任意選択による、(b)で定義される1つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程;
(d)工程(a)〜(c)から得られるKAHを調製する工程;
(e)例えば実施例に記載されているように、KAHの特性を決定する工程;および
(f)参照KAHポリペプチドと比較して変更された特性を有するKAHを選択する工程。
本開示によるKAHポリペプチドを作製する方法における好ましい実施形態では、参照KAHポリペプチドは配列番号1または配列番号3に示される配列を有する。
より好ましくは、本開示による方法の工程(b)において、136位、248位、336位または403位のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基が置換され、前記位置が配列番号1または配列番号3を基準に定義される。参照ポリペプチドは、配列番号1または配列番号3と少なくとも約80%の相同性を有し得る。
別の実施形態では、本開示は、本開示の核酸、核酸構築物、またはベクターを含む宿主細胞、例えば形質転換宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。本開示による「宿主細胞」または「組換え細胞」は、典型的には、組換えDNA技術によって本開示による核酸、すなわち本開示のKAHをコードする核酸が導入された細胞(または祖先にこの核酸が導入された細胞)である。本開示の文脈において、本開示による「宿主細胞」または前記宿主細胞の親は、あらゆる種類の宿主細胞であり得る。
したがって、本開示の宿主細胞は、本開示の1つまたは複数のKAHポリペプチドをコードする組換え核酸を含み得る。
宿主細胞が真核生物または原核生物の細胞である、前の請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。したがって、原核細胞および真核細胞の両方は、例えば細菌、真菌、および酵母などに含まれ、特に好ましいのは、酵母、例えばS.セレビシエ(S.cerevisiae)、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)、およびK.ラクティス(K.lactis)由来の細胞である。宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38、および脈絡叢細胞系などの哺乳動物細胞株も含まれるが、これらに限定されない。
したがって、本開示は、KAHの産生方法を提供し、この方法は、KAHの産生に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択による、KAHを回収することを含む。典型的には、宿主細胞は、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる。
本開示の組換え宿主は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを含み得る。典型的には、本開示の組換え宿主は、ステビオール配糖体を産生することができる。典型的には、本開示の組換え宿主は、ステビオール配糖体などのグリコシル化ジテルペンを産生することができる。例えば、本開示の組換え宿主は、例えば、ステビオール−13−モノシド、ステビオール−19−モノシド、13−[(β−D−グルコピラノシル)オキシ]カウル−16−エン−18−酸2−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−19−ジシド(diside)、ステビオールビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドE、レバウジオシドD、またはレバウジオシドMのうちの1つまたは複数を産生することが可能であり得る。
本開示の組換え宿主は、UDP−グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)活性を有する1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
本開示の目的のために、UGT活性を有するポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼ(EC2.4)活性を有するポリペプチドであり、すなわち活性化ヌクレオチド糖(「グリコシルドナー」としても知られる)から通常はアルコールであるグリコシル受容体分子への単糖単位の転移のための触媒として作用し得る。UGTのためのグリコシルドナーは、典型的には、ヌクレオチド糖ウリジン二リン酸グルコース(ウラシル二リン酸グルコース、UDPグルコース)である。
そのような追加のUGTは、所望のステビオール配糖体を生成するように選択することができる。ステビオール配糖体形成の概略図は、Humphrey et al.,Plant Molecular Biology(2006)61:47−62、およびMohamed et al.,J.Plant Physiology 168(2011)1136−1141に示されている。さらに、図1は、ステビオール配糖体形成の概略図を示す。
したがって、本開示の組換え宿主は、以下のうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る:
(i)UGT74G1活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT2活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT85C2活性を有するポリペプチド;および
(iii)UGT76G1活性を有するポリペプチド。
(i)UGT74G1活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT2活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT85C2活性を有するポリペプチド;および
(iii)UGT76G1活性を有するポリペプチド。
本開示での使用に適した組換え酵母は、ステビオールへのC−13−グルコースの付加を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオールがステビオールモノシドに変換される反応を触媒することができるUGTを含み得る。
本開示の方法での使用に適したそのような組換え酵母は、UDP−グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)UGT85C2によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールをステビオールモノシドに変換する能力をその酵母に付与する。
UGT85C2活性は、ステビオールの13−OHへのグルコース単位の転移である。したがって、適切なUGT85C2は、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール13−OHトランスフェラーゼ、およびウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−19−0−グルコシド13−OHトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的UGT85C2ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−19−O−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書でUGT1配列と呼ばれることがある。
本開示での使用に適した組換え酵母は、UGT2活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
UGT2活性を有するポリペプチドは、グルコース部分を受容体分子ステビオール−13−O−グルコシドの13−O−グルコースのC−2’に転移させる、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−13−O−グルコシドトランスフェラーゼ(ステビオール−13−モノグルコシド1,2−グルコシラーゼとも呼ばれる)として機能するポリペプチドである。典型的には、適切なUGT2ポリペプチドはまた、グルコース部分を受容体分子ルブソシドの13−O−グルコースのC−2’に転移させるウリジン5’−ジホスホグルコシル:ルブソシドトランスフェラーゼとしても機能する。
UGT2活性を有するポリペプチドはまた、ステビオール−13−0−グルコシドおよびルブソシド以外のステビオール配糖体基質を利用する反応を触媒することもでき、例えば、機能的UGT2ポリペプチドは、基質としてステビオシドを利用して、グルコース部分を19−O−グルコース残基のC−2’に転移させてレバウジオシドEを生成し得る。機能的UGT2ポリペプチドはまた、基質としてレバウジオシドAを利用して、グルコース部分を19−O−グルコース残基のC−2’に転移させてレバウジオシドDを生成し得る。しかしながら、機能的UGT2ポリペプチドは、典型的にはC−13位に1,3−結合グルコースを有するステビオール化合物にグルコース部分を転移しない、すなわちステビオール1,3−ビオシドおよび1,3−ステビオシドへのグルコース部分の転移が典型的には起きない。
UGT2活性を有するポリペプチドはまた、ウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移し得る。例えば、UGT2活性を有するポリペプチドは、ウリジン5’−ジホスホD−キシロシル:ステビオール−13−O−グルコシドトランスフェラーゼとして作用し、キシロース部分を受容体分子ステビオール−13−O−グルコシドの13−O−グルコースのC−2’に転移させる。別の例として、UGT2活性を有するポリペプチドは、ウリジン5’−ジホスホ−L−ラムノシル:ステビオール−13−0−グルコシドトランスフェラーゼとして作用することができ、ラムノース部分を受容体分子ステビオールの13−O−グルコースのC−2’に転移させる。
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、UGT活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびC−19−グルコースのステビオールビオシドへの付加を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え酵母は、ステビオールビオシドがステビオシドに変換される反応を触媒することができるUGTを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオールビオシドをステビオシドに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともステビオシドを産生する能力を組換え酵母に付与し得る。
したがって、本開示の方法で使用するのに適した組換え酵母は、UDP−グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)UGT74G1によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールビオシドをステビオシドに変換する能力を細胞に付与する。
適切なUGT74G1ポリペプチドは、グルコース単位をステビオールの13−OHまたは19−COOHに転移させることが可能であり得る。適切なUGT74G1ポリペプチドは、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール19−COOHトランスフェラーゼおよびウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−13−O−グルコシド19−COOHトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的UGT74G1ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−13−O−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するか、またはウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移させるグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではUGT3配列と呼ばれることがある。
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドのC−13位でグルコースのC−3’のグルコシル化を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドがレバウジオシドAに変換される反応を触媒することができるUGTを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオシドをレバウジオシドAに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともレバウジオシドAを産生する能力を酵母に付与し得る。
したがって、本開示の方法での使用に適した組換え酵母はまた、UDP−グリコシルトランスフェラーゼ(UGT)UGT76G1によって示される活性をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオシドをレバウジオシドAに変換する能力をその酵母に付与する。
適切なUGT76G1は、受容体分子ステビオール1,2グリコシドのC−13−O−グルコースのC−3’にグルコース部分を付加する。したがって、UGT76G1は、例えば、ウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール13−0−1,2グルコシドC−3’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン5’−ジホスホグルコシル:ステビオール−19−0−グルコース、13−0−1,2ビオシドC−3’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能的UGT76G1ポリペプチドはまた、グルコース以外の糖を含むステビオール配糖体基質、例えばステビオールラムノシドおよびステビオールキシロシドを利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではUGT4配列と呼ばれることがある。あるいは、またはさらに、UGT4は、RebDをRebMに変換することが可能であり得る。
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、典型的には、UGT1活性を有する少なくとも1つのポリペプチド、UGT2活性を有する少なくとも1つのポリペプチド、UGT3活性を有する少なくとも1つのポリペプチド、およびUGT4活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。これらの核酸配列のうちの1つまたは複数は組換え体であり得る。所与の核酸は、上記の活性のうちの1つまたは複数を有するポリペプチドをコードし得る。例えば、核酸は、上記の活性のうちの2つ、3つ、または4つを有するポリペプチドをコードし得る。好ましくは、本開示の方法に使用するための組換え酵母は、UGT1、UGT2、およびUGT3、およびUGT4活性を含む。適切なUGT1、UGT2、UGT3、およびUGT4の配列は、国際公開第2015/007748号パンフレットの表1に示されている。
本開示の組換え宿主は、いずれか1つのUGT活性、例えばUGT1、2、3、または4活性を有するポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含み得る。本開示の組換え宿主が、任意の1つのUGT活性を有するポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含む場合、それらの核酸配列は、同じであっても異なっていてもよく、かつ/または同じポリペプチドをコードしてもよいし、もしくは異なるポリペプチドをコードしてもよい。特に、本開示の組換え宿主は、2つの異なるUGT2ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
本開示による組換え宿主は、以下のうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含み得る:
ent−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド;および
ent−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
ent−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド;および
ent−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
本開示による組換え宿主は、本開示のKAHポリペプチド以外の、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え宿主は、本開示のKAHポリペプチドである、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する2つ以上の異なるポリペプチドを含む1つまたは複数のヌクレオチド配列を含み得る。
この酵素は、1つの基質、ゲラニルゲラニルピロリン酸、および1つの生成物、ent−コパリルピロリン酸を有する。この酵素は、ジベレリン生合成に関与している。この酵素は、イソメラーゼのファミリー、特に分子内リアーゼのクラスに属する。この酵素クラスの系統名は、ent−コパリル−二リン酸リアーゼ(非環化)である。一般に使用されている他の名称は、ent−コパリルピロリン酸シンターゼ、ent−カウレンシンターゼA、およびent−カウレンシンテターゼAを有することを含む。
ent−コパリルピロリン酸シンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第2015/007748号パンフレットの配列番号1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182、または184に示される配列を含み得る。
したがって、この酵素は、1つの基質、ent−コパリル二リン酸、ならびに2つの生成物、ent−カウレンおよび二リン酸塩を有する。
この酵素は、リアーゼのファミリー、特にリン酸に作用する炭素−酸素リアーゼのファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は、ent−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ(環化、ent−カウレン形成)である。一般に使用されている他の名称には、ent−カウレンシンターゼB、ent−カウレンシンテターゼB、ent−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ、および(環化)が含まれる。この酵素は、ジテルペノイド生合成に関与している。
ent−カウレンシンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第2015/007748号パンフレットの配列番号9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183、または184に示される配列を含み得る。
ent−コパリル二リン酸シンターゼはまた、同じタンパク質分子に関連した異なるent−カウレンシンターゼ活性を有し得る。ent−カウレンシンターゼによって触媒される反応は、ジベレリンへの生合成経路における次の過程である。2つのタイプの酵素活性は異なっており、タンパク質のent−カウレンシンターゼ活性を抑制するための部位特異的変異誘発は、ent−コパリルピロリン酸の蓄積をもたらす。
したがって、本開示の組換え宿主で使用される単一ヌクレオチド配列は、ent−コパリルピロリン酸シンターゼ活性およびent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る。あるいは、2つの活性は、2つの異なる別個のヌクレオチド配列をコードし得る。
本開示の目的のために、ent−カウレンオキシダーゼ活性(EC1.14.13.78)を有するポリペプチドは、ent−カウレンの4−メチル基の3回の連続的酸化を触媒して、カウレン酸を得ることができるポリペプチドである。そのような活性は、典型的にはチトクロームP450の存在を必要とする。
ent−カウレンオキシダーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第2015/007748号パンフレットの配列番号21、23、25、67、85、145、161、162、163、180、または186に示される配列を含み得る。
本開示のKAHポリペプチド以外の、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第2015/007748号パンフレットの配列番号27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167、または185に示される配列を含み得る。
本開示の組換え宿主は、NADPH−チトクロームp450レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え宿主は、NADPH−チトクロームp450レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することが可能であり得る。本開示の目的のために、NADPH−チトクロームP450レダクターゼ活性(EC1.6.2.4;NADPH:フェリヘムタンパク質オキシドレダクターゼ(ferrihemoprotein oxidoreductase)、NADPH:ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ(hemoprotein oxidoreductase)を有するポリペプチド、NADPH:P450オキシドレダクターゼ、P450レダクターゼ、POR、CPR、CYPORとしても知られる)は、典型的には、FADおよびFMN含有酵素NADPH:チトクロームP450レダクターゼ(POR;EC1.6.2.4)から真核細胞のミクロソーム中のチトクロームP450への電子移動を可能にする膜結合酵素であるポリペプチドである。
本開示の組換え宿主では、ゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)を産生する宿主の能力を、上方制御することができる。本開示の文脈では、上方制御されるとは、組換え宿主が同等の非組換え宿主よりも多くのGGPPを産生することを意味する。
したがって、本開示の組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、このヌクレオチド配列が、微生物の形質転換時に高レベルのGGPPを産生する能力を微生物に付与する。したがって、本開示による組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
したがって、本開示の組換え宿主は、以下のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含み得る:
ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド;
ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ活性を有するポリペプチド:
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド;
ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ活性を有するポリペプチド:
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
本明細書で定義される宿主または宿主細胞は、遺伝子操作に適した生物であり、かつ標的産物の工業生産に有用な細胞密度で培養することができるものである。適切な宿主は、微生物、例えば発酵装置内に維持され得る微生物であり得る。宿主細胞は、天然に見られる宿主細胞、または遺伝子操作もしくは古典的な変異誘発後の親宿主細胞に由来する宿主細胞であり得る。
本明細書で使用される組換え宿主は、本明細書で定義される1つまたは複数のヌクレオチド配列で遺伝子改変された、または形質転換/トランスフェクトされた組換え宿主である。1つまたは複数のそのようなヌクレオチド配列の存在は、ステビオールまたはステビオール配糖体、特に1つまたは複数のステビオール配糖体を産生する微生物の能力を変更する。非組換え宿主、すなわち、形質転換/トランスフェクトまたは遺伝子改変されていない宿主は、典型的には、細胞がステビオール配糖体を産生することを可能にする1つまたは複数のヌクレオチド配列を含まない。したがって、非組換え宿主は、典型的にはステビオール配糖体を天然に産生しない宿主であるが、ステビオールまたはステビオール配糖体を天然に産生し、かつ本開示に従って改変されている(したがってステビオール配糖体を産生するように改変された能力を有する)宿主は、本開示による組換え宿主と見なされる。
特に、ent−コパリルピロリン酸シンターゼ、ent−カウレンシンターゼ、ent−カウレンオキシダーゼ、およびカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ、UGT、ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、およびNADPH−チトクロームp450レダクターゼからなる群から選択される酵素が宿主に固有であること、ならびにこれらの酵素をコードする1つまたは複数のヌクレオチド配列による形質転換が、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生する能力を宿主細胞に付与するために必ずしも存在しなくてもよいことが可能であり得る。本開示による好ましい宿主は、GGPPを天然に(すなわち、その非組換え形態で)産生することができる組換え宿主であり得る。
宿主微生物によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生のさらなる改善は、古典的な菌株の改良によって達成することができる。
宿主細胞は、原核生物、古細菌、または真核生物の宿主細胞であり得る。
原核宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌宿主細胞であり得る。真核宿主細胞は、限定されるものではないが、酵母、真菌、アメーバ、藻類、動物、昆虫の宿主細胞であり得る。
真核宿主細胞は、真菌宿主細胞であり得る。「真菌」は、真菌類(Eumycotina)の亜門のすべての種を含む(Alexopoulos,C.J.,1962,In:Introductory Mycology,John Wiley & Sons,Inc.,New York)。したがって、真菌という用語は、とりわけ、糸状菌および酵母を含む。
「糸状菌」は、本明細書では、(Hawksworth et al.,1995、前出により定義される)真菌類(Eumycotina)および卵菌類(Oomycota)の亜門のすべての糸状形態を含む真核微生物として定義される。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は絶対好気性である。糸状菌株には、限定されるものではないが、アクレモニウム(Acremonium)、アスペルギルス(Aspergillus)、アガリクス(Agaricus)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、コリナスカス(Corynascus)、クリソスポリウム(Chrysosporium)、フィリバシジウム(Filibasidium)、フザリウム(Fusarium)、フミコーラ(Humicola)、マグナポーテ(Magnaporthe)、モナスカス(Monascus)、ムコール(Mucor)、ミセリオフトーラ(Myceliophthora)、モルティエレラ(Mortierella)、ネオカリマスティクス(Neocallimastix)、ニューロスポラ(Neurospora)、ペシロミセス(Paecilomyces)、ペニシリウム(Penicillium)、ピロミセス(Piromyces)、ファネロシェテ(Phanerochaete)、ポドスポラ(Podospora)、ピクノポラス(Pycnoporus)、リゾプス(Rhizopus)、シゾフィラム(Schizophyllum)、ソルダリア(Sordaria)、タラロミセス(Talaromyces)、ラサムソニア(Rasmsonia)、サーモアスカス(Thermoascus)、チエラビア(Thielavia)、トリポクラジウム(Tolypocladium)、トラメテス(Trametes)、およびトリコデルマ(Trichoderma)の菌株が含まれる。宿主細胞として役割を果たすことができる好ましい糸状菌の菌株は、種アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、ラサムソニア・エマーソニイ(Rasamsonia emersonii)(以前はタラロミセス・エマーソニイ(Talaromyces emersonii)として知られていた)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、クリソスポリウム・ラクノウェンセ(Chrysosporium lucknowense)、ミセリオフトーラ・サーモフィラ(Myceliophtora thermophyla)に属する。形質転換細胞および非形質転換細胞の発酵特性を比較するための参照宿主細胞には、例えば、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)CBS120.49、CBS513.88、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)ATCC16868、ATCC20423、IFO4177、ATCC1011、ATCC9576、ATCC14488〜14491、ATCC11601、ATCC12892、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)AF293(CBS101355)、P.クリソゲナム(P.chrysogenum)CBS455.95、ペニシリウム・シトリナム(Penicillium citrinum)ATCC38065、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)P2、アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)ATCC36225、ATCC48272、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)ATCC26921、ATCC56765、ATCC26921、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)ATCC11906、クリソスポリウム・ラクノウェンセ(Chrysosporium lucknowense)ATCC44006、およびこれらすべての菌株の誘導株が含まれる。糸状菌宿主細胞として特に好ましいのは、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)CBS513.88およびその誘導株である。
真核宿主細胞は、酵母細胞であり得る。好ましい酵母宿主細胞は、属:サッカロミセス(Saccharomyces)(例えば、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、S.バヤナス(S.bayanus)、S.パストリアヌス(S.pastorianus)、S.カールスベルゲンシス(S.carlsbergensis))、ブレタノミセス(Brettanomyces)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)(例えば、C.クルセイ(C.krusei)、C.レヴカウフィ(C.revkaufi)、C.プルケリマ(C.pulcherrima)、C.トロピカリス(C.tropicalis)、C.ユチリス(C.utilis))、イサチェンキア(Issatchenkia)(例えば、I.オリエンタリス(I.orientalis))、ピチア(Pichia)(例えば、P.パストリス(P.pastoris))、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、ハンセヌラ(Hansenula)、クロエケラ(Kloeckera)、パキソレン(Pachysolen)、シュワニオミセス(Schwanniomyces)、トリコスポロン(Trichosporon)、ヤロウィア(Yarrowia)(例えば、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)(以前はカンジダ・リポリティカ(Candida lipolytica)と分類されていた))、ヤマダザイマ(Yamadazyma)から選択することができる。
原核宿主細胞は、細菌宿主細胞であり得る。細菌宿主細胞は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌であり得る。細菌の例としては、限定されるものではないが、バチルス(Bacillus)属(例えば、B.サブティリス(B.subtilis)、B.アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B.リケニフォルミス(B.licheniformis)、B.プンティス(B.puntis)、B.メガテリウム(B.megaterium)、B.ハロデュラン(B.halodurans)、B.プミルス(B.pumilus))、アシネトバクター(Acinetobacter)、ノカルジア(Nocardia)、キサントバクタ―(Xanthobacter)、エシェリキア(Escherichia)(例えば、大腸菌(E.coli)(例えば、菌株DH1OB、Stbl2、DH5−α、DB3、DB3.1)、DB4、DB5、JDP682、およびccdA−over(例えば、米国特許出願第09/518,188号明細書)))、ストレプトミセス(Streptomyces)、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)(例えば、S.マルセッセンス(S.marcessans))、シュードモナス(Pseudomonas)(例えば、P.アエルギノサ(P.aeruginosa))、サルモネラ(Salmonella)(例えば、S.ティフィリウム(S.typhimurium)、チフス菌(S.typhi))に属する細菌が挙げられる。細菌にはまた、限定されるものではないが、光合成細菌(例えば、緑色非硫黄細菌(例えば、クロロフレクサス(Choroflexus)細菌(例えば、C.オーランティアカス(C.aurantiacus))、クロロネマ(Chloronema)(例えば、C.ギガテウム(C.gigateum)))、緑色硫黄細菌(例えば、クロロビウム(Chlorobium)細菌(例えば、C.リミコーラ(C.limicola))、ペロディクション(Pelodictyon)(例えば、P.ルテオルム(P.luteolum))、紅色硫黄細菌(例えば、クロマチウム(Chromatium)(例えば、C.オケニイ(C.okenii)))、および紅色非硫黄細菌(例えば、ロドスピリルム(Rhodospirillum)(例えば、R.ルブルム(R.rubrum))、光合成細菌(Rhodobacter)(例えば、R.スフェロイデス(R.sphaeroides)、R.カプスラタス(R.capsulatus))、およびロドミクロビウム(Rhodomicrobium)細菌(例えば、R.バネリイ(R.vanellii))が含まれる。
宿主細胞は、非微生物由来の宿主細胞であり得る。そのような細胞の例としては、限定されるものではないが、昆虫細胞(例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)(例えば、キイロショウジョウバエ(D.melanogaster))、スポドプテラ(Spodoptera)(例えば、S.フルギペルダ(S.frugiperda)Sf9またはSf21細胞)、およびトリコプルサ(Trichoplusa)(例えば、High−Five細胞);線虫細胞(例えば、C.エレガンス(C.elegans)細胞);鳥細胞;両生類細胞(例えば、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)細胞);爬虫類細胞;および哺乳動物細胞(例えば、NIH3T3細胞、293細胞、CHO細胞、COS細胞、VERO細胞、C127細胞、BHK細胞、Per−C6細胞、Bowesメラノーマ細胞、およびHeLa細胞)が挙げられる。
本開示は、以下の工程を含む、本開示のポリペプチドを産生させるための方法をさらに提供する:
(a)宿主細胞によるポリペプチドの産生を促進する条件下で本開示の組換え宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、
(b)ポリペプチドを回収する工程。
(a)宿主細胞によるポリペプチドの産生を促進する条件下で本開示の組換え宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、
(b)ポリペプチドを回収する工程。
本開示による組換え宿主は、当技術分野で公知の任意の適切な炭素源上で増殖することができ、そしてそれをステビオール配糖体、例えばステビオール配糖体に変換することができる。組換え宿主は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、グルコース、ラクトース、またはグリセロールを直接変換可能であり得る。したがって、好ましい宿主は、セルロースのグルコースモノマーへの変換、およびヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの変換に必要なセルラーゼ(エンドセルラーゼおよびエキソセルラーゼ)およびヘミセルラーゼ(例えば、エンド−およびエキソ−キシラナーゼ、アラビナーゼ)、ならびにペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に変換することができるペクチナーゼ、またはデンプンをグルコースモノマーに変換することができるアミラーゼなどの酵素を発現する。好ましくは、宿主は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラクトース、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を変換することができる。宿主細胞は、例えば、国際公開第03/062430号パンフレット、同第06/009434号パンフレット、欧州特許第1499708B1号明細書、国際公開第2006096130号パンフレット、または同第04/099381号パンフレットに記載されているような真核宿主細胞であり得る。
したがって、さらなる態様では、本開示は、ステビオール配糖体を調製するためのプロセスも提供し、このプロセスは、適切な発酵培地中で少なくとも1つのステビオール配糖体を産生することができる本開示の組換え宿主を発酵させる工程、および任意選択による、ステビオール配糖体を回収する工程を含む。
ステビオール配糖体は、例えば、ステビオール−13−モノシド、ステビオール−19−モノシド、13−[(β−D−グルコピラノシル)オキシ)カウル−16−エン−18−酸2−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−19−ジシド、ステビオールビオシド、rebA、レバウジオシドB、レバウジオシドC、レバウジオシドE、レバウジオシドD、またはレバウジオシドMであり得る。
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスで使用される発酵培地は、特定の宿主細胞の増殖を可能にする任意の適切な発酵培地であり得る。発酵培地の必須要素は、当業者に公知であり、選択された宿主細胞に適合させることができる。
好ましくは、発酵培地は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、グルコース、スクロース、ラクトース、脂肪酸、トリグリセリド、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を含む。好ましくは、発酵培地はまた、尿素などの窒素源、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、もしくはリン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩も含む。
本開示による発酵プロセスは、バッチ式、流加式、または連続式で行うことができる。別個の加水分解および発酵(SHF)プロセスまたは同時糖化発酵(SSF)プロセスもまた適用することができる。これらの発酵プロセス方式の組み合わせもまた、最適な生産性のために可能であり得る。SSFプロセスは、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、またはペクチンが発酵プロセスにおいて炭素源として使用される場合、特に魅力的であり得、このプロセスでは、基質を加水分解するためにセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはペクチナーゼなどの加水分解酵素を添加することが必要であり得る。
ステビオール配糖体の調製のためのプロセスで使用される組換え宿主は、本明細書で上記定義された任意の適切な組換え宿主であり得る。ほとんどの真核細胞は、増殖のために無菌条件を必要とせず、かつバクテリオファージ感染に対して非感受性であるため、本開示による組換え真核宿主をこのプロセスで使用することは有利であり得る。さらに、真核宿主細胞は、細菌汚染を防止するために低pHで増殖させることができる。
本開示による組換え宿主は、通性嫌気性微生物であり得る。通性嫌気性組換え宿主は、好気的に高い細胞濃度まで増殖させることができる。次いで、この嫌気性相は、高い細胞密度で実施することができ、このことが、実質的に必要とされる発酵量を減少させ、そして好気性微生物による汚染のリスクを最小限にすることができる。
本開示によるステビオール配糖体の産生のための発酵プロセスは、好気性発酵プロセスでも嫌気性発酵プロセスでもよい。
嫌気性発酵プロセスは、本明細書では、酸素の非存在下、または実質的に酸素が消費されずに、好ましくは5mmol/L/h未満、2.5mmol/L/h未満、または1mmol/L/h未満の消費で行われ、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスとして定義することができる。本開示による発酵プロセスはまた、最初に好気的条件下で、続いて嫌気的条件下で行うこともできる。
発酵プロセスはまた、酸素制限、または微好気的条件下で行うこともできる。あるいは、発酵プロセスは、最初に好気的条件下で行い、続いて酸素制限条件下で行うことができる。酸素制限発酵プロセスは、酸素の気体から液体への移動によって酸素の消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガス流の量および組成、ならびに使用される発酵装置の実際の混合/物質移動特性によって決定される。
本開示によるプロセスでのステビオール配糖体の産生は、宿主細胞の増殖期の間、定常(定常状態)期の間、または両期の間に起こり得る。発酵工程を異なる温度で行うことが可能であり得る。
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、組換え宿主にとって最適な温度で行うことができる。最適増殖温度は、各形質転換組換え宿主ごとに異なり得、そして当業者に公知である。最小の感染感受性および最低の冷却費用の下で、非無菌条件下で生物を効率的に成長させるための最適温度は、野生型生物にとって最適温度よりも高い可能性がある。あるいは、このプロセスは、組換え宿主の増殖には最適ではない温度で行うことができる。
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、任意の適切なpH値で行うことができる。組換え宿主が酵母である場合、発酵培地中のpHは、好ましくは6未満、好ましくは5.5未満、好ましくは5未満、好ましくは4.5未満、好ましくは4未満、好ましくはpH3.5未満、またはpH3.0未満、またはpH2.5未満、好ましくはpH2超の値を有する。これらの低いpH値で発酵を行うことの利点は、発酵培地中の汚染細菌の増殖を防止できることである。
このようなプロセスは、工業的規模で行うことができる。そのようなプロセスの産物は、例えば、ステビオール−13−モノシド、ステビオール−19−モノシド、13−[(β−D−グルコピラノシル)オキシ)カウル−16−エン−18−酸2−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−19−ジシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドE、レバウジオシドD、またはレバウジオシドMの1つまたは複数などの、1つまたは複数のステビオール配糖体である。
発酵培地からのステビオール配糖体の回収は、当技術分野で公知の方法、例えば蒸留、真空抽出、溶媒抽出、または蒸発によって行うことができる。
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスでは、5mg/l超の発酵ブロス、好ましくは10mg/l超、好ましくは20mg/l超、好ましくは30mg/l超の発酵ブロス、好ましくは40mg/l超、より好ましくは50mg/l超、好ましくは60mg/l超、好ましくは70超、好ましくは80mg/l超、好ましくは100mg/l超、好ましくは1g/l超、好ましくは5g/l超、好ましくは10g/l超の濃度を達成することが可能であり得るが、通常は70g/l未満である。
本開示は、ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロスをさらに提供する。
本開示によるブロスは、本開示の組換え宿主細胞を含み得る。あるいは、本開示のブロスは、本開示のすべての宿主細胞が存在しない、または実質的に存在しないブロス、例えば上清であり得る。
1つまたは複数のステビオール配糖体が微生物内で発現される事象では、そのような細胞は、それらを放出するように処理する必要があり得る。優先的には、少なくとも1つのステビオール配糖体、例えばrebA、rebD、またはrebMが細胞外で産生される。
本開示によるブロスは、本開示のポリペプチドの代わりに参照ポリペプチドが発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して多い、少なくとも1つのステビオール配糖体、例えばrebA、rebD、またはrebMを含み得る。
本開示によるブロスは、参照ポリペプチドが本開示のポリペプチドの代わりに発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して少ない、少なくとも1つの非ステビオール配糖体、例えば、1つまたは複数のカウレン酸配糖体を含み得る。
本開示はまた、ステビオール配糖体の調製のための本開示によるプロセスによって得られるか、または本開示の発酵ブロスから得ることができるステビオール配糖体を提供する。そのようなステビオール配糖体は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができる、または本開示の発酵ブロスから得ることができる、1つまたは複数、例えば2つ以上のステビオール配糖体を含む組成物も提供される。そのような組成物において、1つまたは複数のステビオール配糖体は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
さらに、本開示は、ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換するための方法を提供し、この方法は:
・前記ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を、本開示の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程;
・それにより、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程、を含む。
・前記ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を、本開示の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程;
・それにより、第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程、を含む。
第1のステビオール配糖体は、図1に例示されるステビオール配糖体などの任意のステビオール配糖体であり得る。第2のステビオール配糖体は、第1のステビオール配糖体(例えば、図1に例示される任意のステビオール配糖体)に対するUGT酵素の作用によって産生される任意のステビオール配糖体であり得る。
そのような方法では、第2のステビオール配糖体は、例えば、rebA、rebE、rebD、またはRebMであり得る。
そのような方法では、第1のステビオール配糖体は、ステビオシド、rebB、rebA、rebE、またはrebDであり得、そして第2のステビオール配糖体は、rebA、rebD、またはrebMであり得る。
好ましくは、第1のステビオール配糖体がrebAであり、かつ第2のステビオール配糖体がrebDであるか、または第1のステビオール配糖体がrebDであり、かつ第2のステビオール配糖体がrebMである。
すなわち、本開示は、生物変換または生体内変換の方法に関する。
本開示による発酵プロセスによって産生されるステビオール配糖体または組成物は、そのような化合物に公知の任意の用途で使用することができる。特に、それらのステビオール配糖体または組成物は、例えば食品または飲料に甘味料として使用することができる。したがって、本開示にしたがって、本開示のステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料が提供される。
例えば、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ソフトドリンク、卓上甘味料、チューインガム、ヨーグルトなどの乳製品(例えば、プレーンヨーグルト)、ケーキ、シリアルもしくはシリアルベースの食品、栄養補助食品、医薬品、食用ゲル、菓子製品、化粧品、練り歯磨き、または他の口腔用組成物などに配合することができる。さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料として使用することができる。
したがって、本開示は、とりわけ、本開示のプロセスにしたがって調製されたステビオール配糖体を含む食品、飼料、または飲料を提供する。
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
本開示の方法にしたがって製造される化合物は、1つまたは複数のさらなるノンカロリー甘味料またはカロリー甘味料と混合することができる。そのような混合は、風味または時間的プロファイルまたは安定性を改善するために使用することができる。広範囲のノンカロリー甘味料およびカロリー甘味料の両方が、ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適し得る。例えば、モグロシド、モナチン、アスパルテーム、アセスルファム塩、シクラメート、スクラロース、サッカリン塩、またはエリトリトールなどのノンカロリー甘味料。ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適したカロリー甘味料には、糖アルコールおよび炭水化物、例えばスクロース、グルコース、フルクトース、およびHFCSが含まれる。グリシン、アラニン、またはセリンなどの甘味アミノ酸も使用することができる。
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、天然甘味抑制剤などの甘味抑制剤と組み合わせて使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、アミノ酸またはその塩などの旨味増強剤と組み合わせてもよい。
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ポリオールまたは糖アルコール、炭水化物、生理活性物質、または機能性成分(例えば、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化剤、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物ステロールまたはスタノール(フィトステロールおよびフィトスタノール)、ポリオール、プレバイオティック、プロバイオティック、フィトエストロゲン、大豆タンパク質、硫化物/チオール、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ミネラル、および/または心血管、コレステロール低下、もしくは抗炎症などの健康上の利点に基づいて分類される物質と組み合わせることができる。
ステビオール配糖体を含む組成物または本開示の組成物は、香味剤、芳香成分、ヌクレオチド、有機酸、有機酸塩、無機酸、苦味化合物、タンパク質もしくはタンパク質加水分解物、界面活性剤、フラボノイド、収斂性化合物、ビタミン、食物繊維、抗酸化剤、脂肪酸、および/または塩を含み得る。
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ゼロカロリー、低カロリー、または糖尿病用飲料、および改善された味覚特性を有する食品を製造するための高強度甘味料として適用することができる。また、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、医薬品、および砂糖が使用できないその他の製品にも使用できる。
さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食料、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料としても使用することができる。
ステビオール配糖体または本開示の組成物を甘味化合物として使用できる製品の例は、ウォッカ、ワイン、ビール、酒、日本酒などのアルコール飲料;天然ジュース、清涼飲料、炭酸ソフトドリンク、ダイエット飲料、ゼロカロリー飲料、低カロリー飲料および食品、ヨーグルト飲料、即席ジュース、インスタントコーヒー、インスタント飲料の粉末タイプ、缶詰製品、シロップ、発酵大豆ペースト、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタントブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケット類、煎餅、クラッカー、パン、チョコレート、キャラメル、キャンディ、チューインガム、ゼリー、プリン、保存加工された果物および野菜、生クリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉ミルク、アイスクリーム、シャーベット、野菜や果物の瓶詰め、缶詰されたゆで豆、肉および食品の甘煮、野菜農産物、シーフード、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉ペースト、魚のフライ、乾燥シーフード、冷凍食品、保存加工された海藻、保存加工された肉、タバコ、医薬品、ならびにその他多くの製品であり得る。原則として、ステビオール配糖体または本開示の組成物は無制限の用途を有し得る。
甘味組成物は、飲料を含み、飲料の非限定的な例としては、非炭酸飲料および炭酸飲料、例えば、コーラ、ジンジャーエール、ルートビア、サイダー、フルーツ風味のソフトドリンク(例えば、レモンライムまたはオレンジのようなシトラス風味のソフトドリンク)、および粉末ソフトドリンクなど;果物または野菜から生産されたフルーツジュース、絞り汁などを含むフルーツジュース、果物の粒子を含むフルーツジュース、フルーツ飲料、フルーツジュース飲料、フルーツジュースを含む飲料、フルーツフレーバーの飲料、野菜ジュース、野菜を含むジュース、および果物や野菜を含むミックスジュース;スポーツ飲料、エネルギー飲料、ニアウォーター、および同様の飲料(例えば、天然または合成風味剤を含む水);茶または好みのタイプの飲料、例えば、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、およびウーロン茶など;乳成分含有飲料、例えば、ミルク飲料、乳成分含有コーヒー、カフェオレ、ミルクティー、フルーツミルク飲料、飲料ヨーグルト、または乳酸菌飲料など;ならびに乳製品が挙げられる。
一般に、甘味組成物中に存在する甘味料の量は、甘味組成物の特定の種類およびその所望の甘味に応じて大幅に異なる。当業者は、甘味組成物に入れるための適切な甘味料の量を容易に見きわめることができる。
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
したがって、本開示の組成物は、成分の均一で一様なまたは均一な混合物を提供する、当業者に公知の任意の方法によって生産することができる。これらの方法としては、乾式混合、噴霧乾燥、凝集、湿式造粒、圧縮、および共結晶化などが挙げられる。
固体形態では、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、小袋、パケット、大きなバッグまたは箱、立方体、錠剤、ミスト、または溶解可能なストリップを含む、甘味を付けるべき食料品への送達に適した任意の形態で消費者に提供することができる。本組成物は、単位用量としてまたはバルク形態で送達することができる。
液体甘味料系ならびに液体、半流動体、ペースト、およびクリームの形態の好都合の範囲の組成物のために、上記の甘味料製品のいずれかを含む任意の組み合わせまたは上記生産された製品の組み合わせを携行する、またはディスペンスする、または保存する、または輸送するのに便利な、任意の形状または形態の適切な包装材料を使用する適切な包装が発明されるものとする。
本組成物は、種々の増量剤、機能性成分、着色剤、香料を含み得る。
「配列相同性」または「配列同一性」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本開示の目的のために、本明細書では、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の配列相同性または配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較目的でこれらの配列が整列されると定義される。2つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される2つの配列のいずれかにギャップを導入することができる。そのようなアラインメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さにわたって、例えば約20、約50、約100、またはそれ以上の核酸/塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。配列同一性は、報告される整列領域にわたる2つの配列間の完全な一致のパーセンテージである。
2つの配列間の配列の比較および配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。当業者は、2つの配列を整列させ、そして2つの配列間の同一性を決定するための何種類かのコンピュータープログラムが利用可能であるという事実を承知しているであろう(Kruskal,J.B.(1983)An overview of sequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal,(ed.),Time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,pp.1−44 Addison Wesley)。2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間のパーセント配列同一性は、2つの配列のアラインメントのためのNeedlemanおよびWunschアルゴリズムを使用して決定することができる(Needleman,S.B.and Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443−453)。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方をアルゴリズムによって整列させることができる。Needleman−Wunschアルゴリズムは、コンピュータープログラムNEEDLEに実装されている。本開示の目的のために、EMBOSSパッケージからのNEEDLEプログラムを使用した(version2.8.0 or higher,EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2000)Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)pp276−277,http://emboss.bioinformatics.nl/)。タンパク質配列については、EBLOSUM62を置換マトリックスに使用する。ヌクレオチド配列については、EDNAFULLを使用する。使用される任意のパラメータは、10のギャップオープンペナルティーおよび0.5のギャップ伸長ペナルティーである。当業者は、すべてのこれらの異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用するときに2つの配列の全体的なパーセンテージ同一性が有意に変化しないことを理解するであろう。
上記のプログラムNEEDLEによるアラインメント後、クエリー配列と本開示の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、以下のように計算される:両方の配列において同一のアミノ酸または同一のヌクレオチドを示すアライメントにおける対応する位置の数を、アラインメントのギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除す。本明細書で定義される同一性は、NOBRIEFオプションを使用することによってNEEDLEから得ることができ、プログラムの出力に「最長同一性」としてラベル付けされる。
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公共のデータベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(version2.0)を用いて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行うことができる。BLASTタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップ挿入アライメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389−3402に記載されているように利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/にある国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)のホームページを参照されたい。
[本開示の実施形態:]
1.配列番号1または配列番号3に示される配列を含むカウレン酸13−ヒドロキシラーゼと整列された場合に、
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
1.配列番号1または配列番号3に示される配列を含むカウレン酸13−ヒドロキシラーゼと整列された場合に、
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
2.配列番号1または配列番号3を基準に定義される136位、248位、336位、または403位の任意のアミノ酸に対応する、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドにおける位置が、10のギャップオープンペナルティーおよび0.5のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてEBLOSUM62を使用するEMBOSS Needleアラインメント法を用いて、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号1または配列番号3に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される、実施形態1に記載のポリペプチド。
3.改変された特性が、改変されたカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性である、実施形態1に記載のポリペプチド。
4.参照ポリペプチドが、配列番号1または配列番号3のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼを含む、実施形態1または2に記載のポリペプチド。
5.i.メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、グルタミン(Q)、ヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)が136位に対応する位置に存在し;かつ/または
ii.アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)が248位に対応する位置に存在し;かつ/または
iii.セリン(S)、アラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
iv.グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、メチオニン(M)、もしくはセリン(S)が403位に対応する位置に存在し、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のポリペプチド。
ii.アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、トレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、イソロイシン(I)、バリン(V)、フェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)が248位に対応する位置に存在し;かつ/または
iii.セリン(S)、アラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)が336位に対応する位置に存在し;かつ/または
iv.グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、アラニン(A)、メチオニン(M)、もしくはセリン(S)が403位に対応する位置に存在し、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜4のいずれか1つに記載のポリペプチド。
6.(i)メチオニンもしくはバリンが136位に存在し;
(ii)アスパラギンが248位に存在し;
(iii)セリンが336位に存在し;かつ/または
(iv)グリシンが403位に存在し、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のポリペプチド。
(ii)アスパラギンが248位に存在し;
(iii)セリンが336位に存在し;かつ/または
(iv)グリシンが403位に存在し、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜5のいずれか1つに記載のポリペプチド。
7.配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換:
136位および248位
136位および336位
136位および403位
248位および336位
248位および403位
336位および403位
136位、248位、および403位
136位、336位、および403位
136位、248位、および336位
248位、336位、および403位、または
136位、248位、336位、および403位
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のポリペプチド。
136位および248位
136位および336位
136位および403位
248位および336位
248位および403位
336位および403位
136位、248位、および403位
136位、336位、および403位
136位、248位、および336位
248位、336位、および403位、または
136位、248位、336位、および403位
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のポリペプチド。
8.配列番号1または配列番号3に示される配列を含むKAHと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換:
(a)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P);
(b)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(c)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(d)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(e)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(f)336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(g)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(h)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(i)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(j)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、または
(k)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜7のいずれか1つの記載のポリペプチド。
(a)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P);
(b)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(c)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(d)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(e)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(f)336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(g)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(h)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S);
(i)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、および336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I);
(j)248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、または
(k)136位に対応する位置に存在するメチオニン(M)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、フェニルアラニン(F)、もしくはトリプトファン(W)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはヒスチジン(H)、もしくはトレオニン(T)、248位に対応する位置に存在するアスパラギン(N)、もしくはグルタミン(Q)、もしくはトレオニン(T)、もしくはグリシン(G)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、もしくはバリン(V)、もしくはフェニルアラニン(F)、もしくはプロリン(P)、336位に対応する位置に存在するセリン(S)、もしくはアラニン(A)、もしくはイソロイシン(I)、および403位に対応する位置に存在するグリシン(G)、もしくはロイシン(L)、もしくはバリン(V)、もしくはアラニン(A)、もしくはメチオニン(M)、もしくはセリン(S)、
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、実施形態1〜7のいずれか1つの記載のポリペプチド。
9.天然に存在しないポリペプチドである、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のポリペプチド。
10.実施形態の1〜9のいずれか1つで定義された置換以外のさらなる置換を含む、実施形態1〜9のいずれか1つに記載のポリペプチド。
11.配列番号1または配列番号3と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のポリペプチド。
12.配列番号5、7、9、11、または13のいずれか1つに対して少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
13.実施形態1〜12のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
14.適切な発現宿主においてカウレン酸13−ヒドロキシラーゼの発現を誘導することができる1つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている、実施形態13に記載の核酸配列を含む核酸構築物。
15.実施形態14に記載の核酸または実施形態13に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
16.実施形態13に記載の核酸、実施形態14に記載の核酸構築物、または実施形態15に記載の発現ベクターを含む組換え宿主。
17.ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる、実施形態16に記載の組換え宿主。
18.ent−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド;および
ent−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド;および、任意選択による、
実施形態1〜12のいずれか1つに記載のポリペプチドとは異なる、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする1つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む、実施形態16または17に記載の組換え宿主。
ent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド;および
ent−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド;および、任意選択による、
実施形態1〜12のいずれか1つに記載のポリペプチドとは異なる、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする1つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む、実施形態16または17に記載の組換え宿主。
19.NADPH−チトクロームp450レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、実施形態16〜18のいずれか1つに記載の組換え宿主。
20.(i)UGT74G1活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT2活性を有するポリペプチド;
(iii)UGT85C2活性を有するポリペプチド;および
(iv)UGT76G1活性を有するポリペプチド
のうちの1つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、実施形態16〜19のいずれか1つに記載の組換え宿主。
(ii)UGT2活性を有するポリペプチド;
(iii)UGT85C2活性を有するポリペプチド;および
(iv)UGT76G1活性を有するポリペプチド
のうちの1つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、実施形態16〜19のいずれか1つに記載の組換え宿主。
21.宿主がサッカロミセス(Saccharomyces)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ピチア(Pichia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、カンジダ(Candida)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、フミコーラ(Humicola)属、イサチェンキア(Issatchenkia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ブレタノミセス(Brettanomyces)属、パキソレン(Pachysolen)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、ヤマダザイマ(Yamadazyma)属、またはエシェリキア(Escherichia)属のうちの1つに属する、実施形態16〜20のいずれか1つに記載の組換え宿主。
22.組換え宿主がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)細胞、イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)細胞、または大腸菌(Escherichia coli)細胞である、実施形態21に記載の組換え宿主。
23.宿主のゲラニルゲラニル二リン酸(GGPP)を産生する能力が上方制御されている、実施形態16〜22のいずれか1つに記載の組換え宿主。
24.ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ活性を有するポリペプチド;
ファルネシル−ピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、実施形態16〜23のいずれか1つに記載の組換え宿主。
ファルネシル−ピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
の1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、実施形態16〜23のいずれか1つに記載の組換え宿主。
25.実施形態1〜12のいずれか1つに記載のKAHポリペプチドを生産するための方法であって:
(a)参照KAHポリペプチド(例えば、配列番号1または配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有する参照ポリペプチド)を選択する工程;
(b)136位、248位、336位、または403位
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、工程;
(c)任意選択による、(b)で定義された1つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程;
(d)工程(a)〜(c)から得られるKAHを調製する工程;
(e)例えば実施例に記載されるようにKAHの特性を決定する工程;および
(f)参照KAHポリペプチドと比較して改変された特性を有するKAHを選択する工程、
を含む、方法。
(a)参照KAHポリペプチド(例えば、配列番号1または配列番号3に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有する参照ポリペプチド)を選択する工程;
(b)136位、248位、336位、または403位
のいずれかに対応する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、工程;
(c)任意選択による、(b)で定義された1つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程;
(d)工程(a)〜(c)から得られるKAHを調製する工程;
(e)例えば実施例に記載されるようにKAHの特性を決定する工程;および
(f)参照KAHポリペプチドと比較して改変された特性を有するKAHを選択する工程、
を含む、方法。
26.実施形態16〜24のいずれか1つに記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させる工程、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収する工程を含む、ステビオールまたはステビオール配糖体を調製するためのプロセス。
27.工業的規模で行われる、ステビオール配糖体の調製のための実施形態26に記載のプロセス。
28.実施形態26または27に記載のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス。
29.実施形態26または27に記載のプロセスによって得られるか、または実施形態28に記載の発酵ブロスから得られるステビオール配糖体。
30.実施形態29に記載の1つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物。
31.実施形態29に記載のステビオール配糖体または実施形態30に記載の組成物を含む食品、飼料、または飲料。
32.ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換するための方法であって:
・前記ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を、実施形態16〜24のいずれか1つに記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程;
・それにより、ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
・前記ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を、実施形態16〜24のいずれか1つに記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程;
・それにより、ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
33.第2のステビオール配糖体が:rebA、rebE、rebD、またはRebMである、実施形態32に記載の方法。
34.第1のステビオール配糖体が、ステビオシド、rebB、rebA、rebE、またはrebDであり、第2のステビオール配糖体が、rebA、rebD、またはrebMである、実施形態33に記載の方法。
35.実施形態1〜12のいずれか1つに記載のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼを生産するための方法であって、実施形態16〜24のいずれか1つに記載の組換え宿主細胞を、この宿主細胞がカウレン酸13−ヒドロキシラーゼを産生するのに適した条件下で培養する工程、および任意選択による、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼを回収する工程、を含む方法。
先行技術として与えられる特許文献または他の資料への本明細書での言及は、その文献または資料が既知であること、またはそれらに含まれる情報が任意の特許請求の範囲の優先日現在の一般的な知識の一部であることの承認と見なされるべきではない。
本明細書に記載の各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。
[実施例]
[概要]
宿主細胞における酵素の過剰発現などの標準的な遺伝学的技術、ならびに宿主細胞のさらなる遺伝子改変は、Sambrook and Russel(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press、またはF.Ausubel et al,eds.,“Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)に記載されているような当技術分野において公知の方法である。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば、欧州特許出願公開第A−0635574号明細書、国際公開第98/46772号パンフレット、同第99/60102号パンフレット、および同第00/37671号パンフレットから知られている。
[概要]
宿主細胞における酵素の過剰発現などの標準的な遺伝学的技術、ならびに宿主細胞のさらなる遺伝子改変は、Sambrook and Russel(2001)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd edition),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press、またはF.Ausubel et al,eds.,“Current protocols in molecular biology”,Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)に記載されているような当技術分野において公知の方法である。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば、欧州特許出願公開第A−0635574号明細書、国際公開第98/46772号パンフレット、同第99/60102号パンフレット、および同第00/37671号パンフレットから知られている。
[実施例1.ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)におけるKAHの発現]
異なるカウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)をコードする遺伝子(以下の表1を参照)をDNA2.0のベクター中のクローン化遺伝子として注文し、この遺伝子は、INT3組み込みフランク(Y.リポリティカ(Y.lipolytica)における相同組換えを可能にする)ならびにKAHおよびHygBのプロモーター−orf−ターミネーター(ハイグロマイシンに対する耐性をコードする)を含んでいた。プラスミドマップについては図2を参照されたい。
異なるカウレン酸ヒドロキシラーゼ(KAH)をコードする遺伝子(以下の表1を参照)をDNA2.0のベクター中のクローン化遺伝子として注文し、この遺伝子は、INT3組み込みフランク(Y.リポリティカ(Y.lipolytica)における相同組換えを可能にする)ならびにKAHおよびHygBのプロモーター−orf−ターミネーター(ハイグロマイシンに対する耐性をコードする)を含んでいた。プラスミドマップについては図2を参照されたい。
組込みフランク、KAH、およびHygB発現カセットを含む発現経路をプラスミドからPCR増幅した。精製したPCR産物を、Y.リポリティカ(Y.lipolytica)株STV2226に形質転換し、そしてハイグロマイシン耐性コロニーを選択した。STV2226株は、KAHを除き、ステビオール配糖体を生産するためにステビオール配糖体の産生に必要とされるすべての遺伝子を既に発現している。この株の遺伝子含有量を以下の表2に示す。類似の株の構築は、国際公開第2013/110673号パンフレットおよび同第2015/007748号パンフレットにさらに詳細に記載されている。STV2226株は、標的組み込みの効率を高めるために、ku70遺伝子中に1658bpの内部欠失を含む。
[実施例2.KAH遺伝子を発現する株におけるグリコシル化カウレン酸およびステビオール配糖体の産生]
異なるKAH遺伝子で形質転換されたSTV2226を、ハイグロマイシンを含むYPhDプレートに播種し、単一コロニー分離株を得て産生試験を行った:前培養として、グルコースを含む200μlのYEPに、ハイグロマイシンを含むYEPh−D寒天プレートからのコロニー材料を接種した。前培養物を、Inforsインキュベーター内で30℃、750rpm、および湿度80%で72時間インキュベートした。40μlの前培養物を使用して、炭素源としてグルコースを含む2.5mlのミネラル培地に接種した。これらの産生培養物を、Inforsインキュベーター内で30℃、550rpm、湿度80%で120時間インキュベートした。この産生培養物を、3000gでの10分間の遠心分離によりペレット化した。遠心分離後、上清を移して33%アセトニトリルで希釈し、LC/MSを使用して、ステビオール、ステビオール配糖体、カウレン酸(KA)、およびグリコシル化カウレン酸(KA−配糖体)について分析した。データを示すために、ステビオール配糖体力価(mM)およびKA−配糖体力価(mM)を、KAH4_m4(配列番号2)で形質転換したSTV2226で得られた力価に対して正規化した。結果の概要については、表3を参照されたい。
異なるKAH遺伝子で形質転換されたSTV2226を、ハイグロマイシンを含むYPhDプレートに播種し、単一コロニー分離株を得て産生試験を行った:前培養として、グルコースを含む200μlのYEPに、ハイグロマイシンを含むYEPh−D寒天プレートからのコロニー材料を接種した。前培養物を、Inforsインキュベーター内で30℃、750rpm、および湿度80%で72時間インキュベートした。40μlの前培養物を使用して、炭素源としてグルコースを含む2.5mlのミネラル培地に接種した。これらの産生培養物を、Inforsインキュベーター内で30℃、550rpm、湿度80%で120時間インキュベートした。この産生培養物を、3000gでの10分間の遠心分離によりペレット化した。遠心分離後、上清を移して33%アセトニトリルで希釈し、LC/MSを使用して、ステビオール、ステビオール配糖体、カウレン酸(KA)、およびグリコシル化カウレン酸(KA−配糖体)について分析した。データを示すために、ステビオール配糖体力価(mM)およびKA−配糖体力価(mM)を、KAH4_m4(配列番号2)で形質転換したSTV2226で得られた力価に対して正規化した。結果の概要については、表3を参照されたい。
ステビオール配糖体の合計には、ステビオール−13−モノシド、ステビオール−19−モノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、レバウジオシドB、ステビオシド、レバウジオシドA、レバウジオシドE、レボウジオシドD、およびレバウジオシドMが含まれる。KA−配糖体の合計には、KA、KA−19−モノグルコシド、KA−19−ジグルコシド、およびKA−19−トリグルコシドが含まれる。
KAH遺伝子KAH4_p19、KAH4_p20、KAH4_p21、およびKAH4_p22を発現した株は、より高い力価のステビオール配糖体を産生した。これらの遺伝子のうちのいくつかの発現により、KAH4_m4と比較して総ステビオール配糖体産生において30%以上の改善がもたらされた。不所望のKA−配糖体の生成は、遺伝子KAH4_p18、KAH4_p20、KAH4_p21、およびKAH4_p22で大幅に減少した。所望の産物(ステビオール配糖体)の不所望の副産物(KA−配糖体)に対する比率が、いくつかのKAH遺伝子では、KAH4_m4を発現する株と比較して、遺伝子KAH4_p18〜KAH4_p22を発現するすべての株で実に2倍を超えて増加した。これらの結果は、KAH4_p18〜KAH4_p22酵素がステビオール配糖体の産生に有益であることを例示する。
[実施例3.バイオリアクターにおけるグリコシル化カウレン酸およびステビオール配糖体の産生]
上記のように構築された、KAH4_m4(参照)、KAH4_p20、およびKAH4_p21を発現する3つの株を、50mlのミネラル培地を含む500mLの振盪フラスコ中、30℃および280rpmで3日間培養した。続いて、振盪フラスコの内容物6mlを、出発容量0.3Lの発酵槽に移した。アンモニア(12.5重量%)を添加することによってpHを5.0に制御した。温度は30℃に制御した。グルコース濃度は、発酵槽に供給されるグルコースの制御により制限し続けた。振盪フラスコのミネラル培地および発酵は、Verduyn et al.(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992 Jul;8(7):501−517)に基づいた。ブロス試料を水および33%アセトニトリルで希釈し、LC/MSで分析した。
上記のように構築された、KAH4_m4(参照)、KAH4_p20、およびKAH4_p21を発現する3つの株を、50mlのミネラル培地を含む500mLの振盪フラスコ中、30℃および280rpmで3日間培養した。続いて、振盪フラスコの内容物6mlを、出発容量0.3Lの発酵槽に移した。アンモニア(12.5重量%)を添加することによってpHを5.0に制御した。温度は30℃に制御した。グルコース濃度は、発酵槽に供給されるグルコースの制御により制限し続けた。振盪フラスコのミネラル培地および発酵は、Verduyn et al.(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992 Jul;8(7):501−517)に基づいた。ブロス試料を水および33%アセトニトリルで希釈し、LC/MSで分析した。
ステビオール配糖体の合計には、ステビオール、ステビオール−13−モノシド、ステビオール−19−モノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、レバウジオシドB、ステビオシド、レボウジオシドA、レボウジオシドE、レボウジオシドD、およびレボウジオシドMが含まれる。KA−配糖体の合計には、KA、KA−19−モノグルコシド、KA−19−ジグルコシド、およびKA−19−トリグルコシドが含まれる。
本発明者らは、KAH4_p20が発現されると、ステビオール配糖体の量が増加し、総ステビオール配糖体の生産量が20%増加することを観察した。さらに、KA−配糖体の量は35%を超えて減少する。KAH4_p21が発現されると、KA−配糖体の減少はさらに大きく、60%を超える減少である。結果として、KAH4_p20の発現またはKAH4_p21の発現では、ステビオール配糖体のKA−配糖体に対する比率は、KAH4_m4を発現する株と比較して劇的に増加する。KAH4_p20またはKAH4_p21の使用は、ステビオール配糖体の生産および精製に良い効果をもたらすであろう。
Claims (18)
- 配列番号1または配列番号3に示される配列を含むカウレン酸13−ヒドロキシラーゼと整列された場合に:
136位、248位、336位、または403位
の任意のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義され、前記ポリペプチドが、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された1つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。 - 配列番号1または配列番号3を基準に定義される136位、248位、336位、または403位の任意のアミノ酸に対応する、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドにおける位置が、10のギャップオープンペナルティーおよび0.5のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてEBLOSUM62を使用するEMBOSS Needleアラインメント法を用いて、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号1または配列番号3に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記改変された特性が、改変されたカウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性である、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- 前記参照ポリペプチドが、配列番号1または配列番号3のカウレン酸13−ヒドロキシラーゼを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- (i)メチオニンもしくはバリンが136位に存在し;
(ii)アスパラギンが248位に存在し;
(iii)セリンが336位に存在し;かつ/または
(iv)グリシンが403位に存在し、
前記位置が、配列番号1または配列番号3を基準に定義される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。 - 配列番号1または配列番号3と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 配列番号5、7、9、11、または13のいずれか1つに対して少なくとも約95%の配列同一性、少なくとも96%の配列同一性、少なくとも97%の配列同一性、少なくとも98%の配列同一性、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
- 任意選択により、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる、請求項8に記載の核酸を含む組換え宿主。
- ent−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド;
ent−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド;および
ent−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド;および、任意選択による、
請求項1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドとは異なる、カウレン酸13−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする1つまたは複数の組換えヌクレオチド配列(複数可)を含む、請求項9に記載の組換え宿主。 - NADPH−チトクロームp450レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、請求項9または10に記載の組換え宿主。
- (i)UGT74G1活性を有するポリペプチド;
(ii)UGT2活性を有するポリペプチド;
(iii)UGT85C2活性を有するポリペプチド;および
(iv)UGT76G1活性を有するポリペプチド;
のうちの1つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の組換え宿主。 - サッカロミセス(Saccharomyces)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、ピチア(Pichia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、カンジダ(Candida)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、フミコーラ(Humicola)属、イサチェンキア(Issatchenkia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ブレタノミセス(Brettanomyces)属、パキソレン(Pachysolen)属、ヤロウィア(Yarrowia)属、ヤマダザイマ(Yamadazyma)属、またはエシェリキア(Escherichia)属のうちの1つに属する、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)細胞、イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)細胞、または大腸菌(Escherichia coli)細胞の1つに属する、請求項9〜12のいずれか一項に記載の組換え宿主。
- 請求項9〜13のいずれか一項に記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス。
- 請求項14に記載のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス。
- 請求項14に記載のプロセスによって得られるか、または請求項15に記載の発酵ブロスから得られる1つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物。
- 請求項16に記載の組成物を含む食品、飼料、または飲料。
- ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を第2のステビオール配糖体に変換するための方法であって:
・ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を、請求項9〜13のいずれか一項に記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程;
・それにより、前記ステビオールまたは第1のステビオール配糖体を前記第2のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
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