KR102303661B1

KR102303661B1 - 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법

Info

Publication number: KR102303661B1
Application number: KR1020190070925A
Authority: KR
Inventors: 김정은; 박성희; 양태주; 추선; 김성보; 최은정
Original assignee: 씨제이제일제당 주식회사
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-09-23
Also published as: CN114521215A; EP3954780A4; EP3954780A1; JP7375046B2; KR20200143612A; CN114521215B; WO2020251228A1; JP2022532627A; US20220220523A1

Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 상기 효소를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법에 관한 것이다.

Description

포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법{Compositions comprising glucose transferase for producing glucosylated steviol glycosides and method for producing glucosylated steviol glycosides using the same}

본 출원은 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO)의 당 섭취에 따른 질병(비만) 우려에 의해 일일 당 섭취량을 낮출 것을 권고함에 따라, 선진국을 중심으로 정부 주도하에 다양한 당류 섭취량을 줄이기 위한 정책이 활발히 논의 중이다. 이에 시장에서는 다양한 대체 감미료 소재에 대한 필요가 증가하고 있어, 대체 감미료 소재가 지속적으로 개발, 상용화 되고 있다. 대체 감미료로는 합성 고감미료(Saccharin, Aspartame, Sucralose 등), 합성 당알콜류(Maltitol, Xylitol), 고감미료(Rebaudioside A, Liquorice)로 지속적으로 변화되고 있다. 그러나 지속적인 합성감미료의 안전성에 대한 우려로 천연감미료에 대한 고객의 니즈가 지속적으로 커지고 있으나, 천연감미료 특유의 이미·이취의 맛 속성 한계로 기존의 합성감미료 중심의 저칼로리제로칼로리 제품을 본격적으로 대체하지 못하고 있는 실정이다.

최근 상당한 주목을 받고 있는 천연의 고감미료는 스테비아 리바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 추출한 스테비아(Stevia)이다. 스테비아는 천연소재이면서 설탕의 200-300 배의 감미도를 가지고 있으며, 스테비오사이드(Stevioside), 리바우디오사이드 (Rebaudioside) A, B, C, D, E, M 등으로 이뤄져 있다. 또한 스테비아는 열량을 내지 않고 혈중 포도당과 인슐린 수준에 긍정적이며, 인체에 부작용이 없는 것으로 보고되어 대체 감미료로서 잠재력이 있지만, 쓴맛이 강하게 발현되는 단점이 있어 적용에 한계가 있다.

스테비아의 감미질 개선 방법으로 효소를 이용하여 당 전이 시키는 방법이 있으며, 상기 방법으로 CGTase를 이용하여 스테비올 배당체에 포도당(1-12개)을 전이시키는 방법이 현재 널리 사용된다(한국특허출원 제10-1991-0020769호). 하지만, 스테비올 배당체에 전이된 포도당 구조가 α-(1,4)로 장내 미생물에 의해 모두 분해되어, 칼로리를 상승시키는 단점이 있다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 유래의 효소가 스테비올 배당체에 포도당을 α-(1,6) 결합으로 전이시켜 난소화성 포도당 전이 스테비올 배당체를 생성하는 것을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 포도당 전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 상기 포도당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물을 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 감미 개선용 조성물 제공하는 것이다.

본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 이용하여 스테비올 배당체를 포도당 전이 스테비올 배당체로 변환하는 단계를 포함하는 스테비올 배당체의 감미 개선방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공한다.

본 출원에서 "포도당 전이 효소"는 포도당 공여체(donor)에서 포도당 수용체(acceptor)로 포도당을 전이시키는 효소를 의미한다.

상기 포도당 전이 효소는 포도당 공여체에서 스테비올 배당체로 포도당을 전이시켜, 포도당 전이 스테비올 배당체를 생산하는 용도를 갖는것 일 수 있다.

상기 포도당 전이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 효소, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 효소, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 효소와 혼용되어 사용될 수 있다.

또한, 본 출원에서 포도당 전이 효소는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소라고 정의하였지만, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 효소와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 포도당 전이 효소에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 포도당 전이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80 %, 90 %, 95 %, 또는 97 % 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 포도당 전이 효소의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

즉, 본 출원에서 "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질", "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 효소 또는 단백질"이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, "서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드"는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 "서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드"에 속할 수 있음은 자명하다..

본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소는 스테비올 배당체로부터 포도당 전이 스테비올 배당체로의 전환율이 50 % 이상일 수 있으며, 구체적으로 60 % 이상, 더 구체적으로 70 % 이상, 보다 더 구체적으로 80 % 이상, 보다 더 구체적으로 90 % 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 미생물은 락토바실러스 속 미생물, 보다 구체적으로 락토바실러스 말리 일 수 있으나, 본 출원의 포도당 전이 효소를 포함 또는 발현할 수 있는 미생물인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 배양물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 발현하는 미생물을 포함하는 배양액 또는 상기 미생물을 제외한 배양액일 수 있다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 스테비올 배당체 및 포도당 공여체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 "스테비올 배당체(steviol glycoside)"는 천연 감미료의 하나로서, 하기의 화학식 1로 표시되는 것 일 수 있다.

상기 화학식 1에서 R₁에는 수소(H)가 결합되어 있거나, 포도당(Glucose)이 β 결합으로 1 개 내지 3 개 결합되어 있을 수 있으며, R₂에는 포도당(Glucose) 내지 자일로스(Xylose) 내지 람노스(Rhamnose)가 β 결합으로 1 개 결합하고 여기에 포도당(Glucose)이 ß 결합으로 0 개 내지 2 개 결합되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드(stevioside), 루부소사이드, 둘코사이드(dulcoside) A, 리바우디오사이드(rebaudioside) A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 포도당 공여체는 하나 이상의 포도당이 스테비올 배당체에 전이되도록 포도당 전이 효소의 존재 하에 반응될 수 있는, 포도당의 올리고머, 포도당의 중합체 및 이의 사이클릭 형태 중 임의의 것일 수 있으며, 구체적으로 설탕일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "포도당 전이 스테비올 배당체(glucosylated steviol glycoside)"는 상기 스테비올 배당체에 포도당(glucose)이 부가된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3 개 부가된 것일 수 있다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 포도당의 스테비올 배당체로의 전이 활성을 유리하게 하거나, 상기 조성물의 안정성을 높일 수 있는 보조인자를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 보조인자의 예로는 금속 이온, 금속 염, 부형제, 보존제 등이 있으나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공한다.

상기 "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소", "미생물", "배양물" 및 "포도당 전이 스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 존재 하에 포도당 공여체(예를 들어, 설탕)와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 "포도당 공여체" 및 "스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10 에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 pH 2 내지 9, 보다 구체적으로 pH 3 내지 8, 보다 더 구체적으로 pH 5 내지 6에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는, 1 내지 80 ℃에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 5 내지 70 ℃, 보다 구체적으로 25 내지 50 ℃, 보다 더 구체적으로 35 내지 45 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10, pH 2 내지 9, pH 3 내지 8, 또는 pH 5 내지 6, 및 1 내지 80 ℃, 5 내지 70 ℃, 25 내지 50 ℃ 또는 35 내지 45 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 포도당 전이 스테비올 배당체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 회수는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 여과, 크기배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 회수　단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법으로 제조된 포도당 전이 스테비올 배당체를 제공한다.

상기 "포도당 전이 스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.

구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 포도당 전이 스테비오사이드, 포도당 전이 루부소사이드, 포도당 전이 둘코사이드 A, 포도당 전이 리바우디오사이드 A, 포도당 전이 리바우디오사이드 C, 포도당 전이 리바우디오사이드 D, 포도당 전이 리바우디오사이드 E, 포도당 전이 리바우디오사이드 F, 및 포도당 전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물을 제공한다.

본 출원의 감미료 조성물은 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물에 비해 쓴맛이 개선되고 용해도가 개선된 것일 수 있다.

상기 쓴맛 개선은 쓴맛이 감소한 것일 수 있다.

상기 용해도 개선은 용해도가 증가할 것일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 스테비올 배당체 감미 개선용 조성물을 제공한다.

상기 “서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소”, “미생물”, “배양물” 및 “스테비올 배당체” 는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 감미개선은 쓴맛이 감소하여 쓴맛이 개선된 것일 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 이용하여 스테비올 배당체를 포도당 전이 스테비올 배당체로 변환하는 단계를 포함하는, 스테비올 배당체의 감미 개선방법을 제공한다.

상기 “서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소”, “미생물”, “배양물”, “스테비올 배당체” 및 “포도당 전이 스테비올 배당체”는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 변환하는 단계는 pH 1 내지 10 에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 pH 2 내지 9, 보다 구체적으로 pH 3 내지 8, 보다 더 구체적으로 pH 5 내지 6에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 변환하는 단계는 1 내지 80 ℃에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 5 내지 70 ℃, 보다 구체적으로 25 내지 50 ℃, 보다 더 구체적으로 35 내지 45 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 변환하는 단계는 pH 1 내지 10, pH 2 내지 9, pH 3 내지 8, 또는 pH 5 내지 6, 및 1 내지 80 ℃, 5 내지 70 ℃, 25 내지 50 ℃ 또는 35 내지 45 ℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 이용한 것으로서, 포도당 전이 스테비올 배당체를 특이적으로 생산할 수 있다.

또한, 상기 효소는 스테비올 배당체로부터 포도당 전이 스테비올 배당체로의 전환율이 높으므로, 매우 효율적으로 포도당 전이 스테비올 배당체를 생산할 수 있다.

도 1은 락토바실러스 말리 배양액으로부터 정제한 4 종 분획(fraction) 속 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 리바우디오사이드 A와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 리바우디오사이드 A와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 스테비오사이드와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 스테비오사이드와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 리바우디오사이드 A와 설탕을 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소와 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 리바우디오사이드 A와 설탕을 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소와 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효소 정제

시험관(test tube)에 MRS broth(BD Difco)를 5 mL 채운 후 여기에 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali)를 접종하고 30 ℃, 180 rpm에서 15 시간 동안 배양하였다.

그 후, 250 mL 플라스크에 MRS broth를 100 mL 채운 후 상기 배양액을 5 %(v/v)로 접종하고 30 ℃, 180 rpm에서 15 시간 동안 배양하였다.

그 후, 3 L 발효조에 Modified MRS broth 1 L를 채운 후 상기 배양액을 5 %(v/v)로 접종하고, 30 ℃, 300 rpm에서 24 시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 Modified MRS broth의 조성은 하기 표 1과 같다.

조성물	단위(g/L)	함량	제조사
Sucrose	g	20	SIGMA
polypeptone	g	10	DAEJUNG
Yeast extract	g	5	BD Difco
beef extract	g	10	BD Difco
Ammonium citrate	g	2	DAEJUNG
sodium acteate	g	5	DAEJUNG
K₂HPO₄	g	2	DAEJUNG
MgSO₄-7H₂O	g	0.1	JUNSEI
MnSO₄-H₂O	g	0.05	JUNSEI
Tween 80	g	1	DAEJUNG

상기 배양액을 13000 rpm에서 15 분 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액을 20 mM Tris-HCl pH 7.4 버퍼로 투석(dialysis) 후, 단백질 정제를 실시하였다.

1 차 정제는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하였고, 사용한 컬럼은 Hitrap^TM DEAE FF (GE healthcare)이다. 시료를 1 mL/min의 유속으로 상기 컬럼에 로딩하고, 1 M NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl pH 7.4 버퍼로 용출(elution)하였다.

2 차 정제는 젤 여과 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)를 이용하였고, 사용한 컬럼은 Hiload^TM 16/60 Superdex 200pg(GE healthcare)이다. 150 mM NaCl을 포함하는 20 mM Tris-HCl 버퍼로 정제하였다.

상기 정제로 4 종의 분획(fraction)을 수득하였고, 각 분획의 SDS-PAGE 결과는 도 1에 나타내었다.

실시예 2: 효소의 활성 확인

목적 효소의 존재를 확인하기 위해, 각 분획의 설탕 가수분해 활성을 환원당 정량법(DNS 법)으로 확인하였다.

50 mM 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)에 200 mM의 설탕 수용액과 상기 각 분획을 1:1로 혼합한 후, 40 ℃ 수조(water bath)에서 10 분간 반응 시킨 후, 100 ℃ 에서 실활시켰다. DNS 시약을 1:3 비율로 첨가하고 혼합하여 100 ℃에서 5 분간 반응시킨 후, 바로 얼음에서 DNS 반응을 중지시켰다. 그 후, DNS 시약의 흡광도(OD)를 575 nm에서 측정한 후, 작성한 과당 표준 곡선식에 대입하여 활성을 확인하였다. 이때, 1 Unit의 정의는 1 분당 1 μmole의 과당을 증가시키는 효소의 양(mL)을 나타낸다.

그 결과, 2 번 분획(Fraction No.2)의 75 kDa 단백질이 설탕을 가수분해하는 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 3: 효소의 동정

LC-MS로 상기 75 kDa 단백질을 동정하였다.

실시예 3-1: 시료 전처리 (In gel trypsin digestion)

질량분석기(MS)를 이용한 단백질 동정을 위해서는 분석하고자 하는 단백질을 펩타이드로 절편화할 필요가 있다.

이에, 도 1의 fraction #2의 75 kDa 겔을 잘라낸 후, In-gel piece 시료에 50 % CH₃CN(H₂O) 용매를 넣은 후, 15 분간 반응시켜 탈색하였다. 이 후, 50mM ABC(ammonium bicarbonate, SIGMA) 버퍼에 녹인 1 M DTT(Dithiothreitol, GE)를 2 ㎕ 첨가하고 상온에서 1 시간 보관하였다. 그 후, 50 mM ABC(ammonium bicarbonate, SIGMA) 버퍼에 녹인 1 M IAA(iodoacetamide, SIGMA)를 4 ㎕ 첨가하고 빛이 차단된 상온에서 1 시간 보관하였다. 탈색된 In-gel piece 시료에 1 ㎍의 트립신(trypsin) 용액(Sequencing-grade modified porcine trypsin, Thermofisher, Madison, WI, USA)을 넣고 37 ℃에서 16 시간 반응시켰다. 50 % CH₃CN(H₂O) 용매 200 ㎕를 첨가하여 gel 탈수반응을 통해 가수분해된 펩타이드를 회수하였고, 이를 회전건조기(SpeedDry Vacuum Concentrator)를 이용하여 건조시켰다. 염과 기타 불순물 제거를 위해 C18 Ziptip(Millipore)를 이용하여 제염(desalting)하였다.

실시예 3-2: 액체 크로마토그래피- 질량분석(LC-MS)

액체 크로마토그래피 질량 분석은 Ultimate 3000 RS UHPLC, Q-Exactive Orbitrap (Thermo Scientific) 질량 분석기로 수행하였고, 분석 조건은 다음과 같다.

(1) 크로마토그래피: Thermo (Dionex) UHPLC Ultimate 3000

(2) 컬럼: Acclaim prepMap^TM RSLC 50 ㎛ X 15 ㎝, nanoviper C18, 2㎛, 100A

(3) 용매: A=증류수(0.1 % 포름산 포함), B=아세토니트릴(0.1 % 포름산 포함)

(4) 용출 조건

시간(분)	A (%)	B (%)
0	95	5
5	95	5
63	70	30
68	50	50
70	20	80
73	20	80
75	95	5
88	95	5
89	95	5

(5) 유속: 0.2 ㎕/min

(6) 시료 주입: 1 ㎕

이후, de novo peptide sequencing으로 아미노산 서열을 확인하였으며, 이때 분석 프로그램으로 Proteome Discoverer 2.1 (Thermo)을 사용하였다.

이렇게 확인된 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열이다.

실시예 4: 조효소액의 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성 확인

50 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 6 % 리바우디오사이드 A(purecircle) 또는 6 % 스테비오사이드(carbosynth) 및 6 % 백설탕(CJ 제일제당)을 녹인 후, 여기에 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함하는, 락토바실러스 말리 조효소액을 첨가하고 40 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 포도당 전이 리바우디오사이드 A 또는 포도당 전이 스테비오사이드가 생성되었는지 여부를 HPLC로 확인하여 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 한편, HPLC 분석 조건은 다음과 같다.

이동상	아세토니트릴(30 %): 증류수(70 %)
컬럼	250 X 4.6 mm Capcell pak C18 MG II (Shiseido)
유속	0.6 ml/min
온도	30 ℃
주입량	20 ㎕
검출기	DAD (210nm)

도 2 및 도 4는 효소반응 전의 HPLC 분석결과이고, 도 3 및 도 5는 효소반응 후의 HPLC 분석결과이다.

도 2 및 도 3을 비교하면, 상기 효소반응에 의해 리바우디오사이드 A가 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90 %로 확인된다.

또한, 도 4 및 도 5를 비교하면, 상기 효소반응에 의해 스테비오사이드가 포도당 전이 스테비오사이드(Stevidoside-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90 %로 확인된다.

한편, 상기 포도당 전이 스테비오사이드(Stevidoside-G1) 및 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)는 각각 스테비오사이드 및 리바우디오사이드 A의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-1,6 결합으로 포도당이 1 개 전이된 것임을 NMR을 통해 확인하였다.

실시예 5. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성 확인

상기 실시예 3에서 확인된, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 활성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 효소가 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성이 있는지 확인하였다.

실시예 5-1: 효소를 포함하는 미생물의 제조 및 효소 정제

서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 합성 방법(㈜ 바이오니아)으로 제작하였으며, 획득한 폴리뉴클레오티드를 pBT7-N-His 벡터에 삽입한 후, 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균은 암피실린(Ampicillin)이 포함된 평판배지에 도말하여 재조합 균주(미생물)를 획득하였다.

한편, 상기 미생물을 2019년 6월 11일 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12561P로 기탁하였다.

재조합 대장균 균주를 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지 5 ml에 접종하고 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃에서 종균 배양을 실시하였다. 종균 배양된 배양액을 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지 500 ml에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 이후, 600 nm에서의 흡광도가 0.4일 때, 0.1 mM IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 대량발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 180 rpm, 배양온도는 37 ℃가 유지되도록 하고, IPTG 첨가 후에는 교반속도는 120 rpm, 배양온도는 16 ℃로 배양하였다.

상기 배양액을 10000ｘg로 4 ℃에서 20 분간 원심분리하여 세포 펠릿(cell pellet)을 수득하고, 상기 펠릿에 50 mM 트리스 염산 완충용액을 첨가하여 세포 용액으로 재현탁시켰다. 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 다시 13000ｘg로 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 이후, Ni-NTA superflow 컬럼을 사용하여 상기 효소를 정제하였다.

실시예 5-2: 효소의 활성 확인

50 mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 6 % 리바우디오사이드 A(purecircle) 및 6 % 백설탕(CJ 제일제당)을 녹인 후, 여기에 상기 실시예 5-1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 첨가하고 40 ℃에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 포도당 전이 리바우디오사이드 A가 생성되었는지 여부를 HPLC로 확인하여 그 결과를 도 6 내지 도 7에 나타내었다.

도 6 은 효소반응 전의 HPLC 분석결과이고, 도 7 은 효소반응 후의 HPLC 분석결과이다.

도 6 및 도 7을 비교하면, 상기 효소반응에 의해 리바우디오사이드 A가 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90 %로 확인된다.

한편, 상기 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)는 리바우디오사이드 A의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 1 개 전이된 것임을 NMR을 통해 확인하였다.

즉, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소는 실시예 4의 락토바실러스 말리 조효소액과 동일한 활성이 있음을 확인하였다.

실시예 6: 포도당 전이 스테비올 배당체의 용해도 평가

스테비올 배당체 및 포도당 전이 스테비올 배당체의 용해도를 측정하였다.

구체적으로, 리바우디오사이드 A(RA), 스테비오사이드(STV), 실시예 4의 포도당 전이 리바우디오사이드 A(RA-Glu), 실시예 4의 포도당 전이 스테비오사이드(STV-Glu) 각각의 용해도를 측정하였다.

리바우디오사이드 A, 스테비오사이드, 포도당 전이 리바우디오사이드 A, 포도당 전이 스테비오사이드 각각 6 g을 10 ml에 혼합한 다음 50 ℃에서 60 분간 sonication을 통해 용해하였다. 이를 5, 15, 25, 35, 45, 55 ℃ 수조(water bath)에서 1 주일 동안 인큐베이션(incubation)한다. 그 후, 용액을 12000 rpm, 10 분간 원심분리하고 상층액 1 ml을 취하여 105 ℃ 오븐(oven)에서 건조시켜, 용해도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

온도 (℃)	용해도 (%)
온도 (℃)	STV	RA	STV-Glu	RA-Glu
5	6.3	1.1	40↑	40↑
15	6.2	0.6	40↑	40↑
25	5.3	0.3	40↑	40↑
35	9.2	0.5	40↑	40↑
45	13.7	1.1	40↑	40↑
55	39.7	1.6	40↑	40↑

표 4의 결과에 의하면, 포도당 전이 스테비오사이드 및 포도당 전이 리바우디오사이드 A는 스테비오사이드, 리바우디오사이드 A에 비하여 현저하게 용해도가 증가한 것을 알 수 있다.

실시예 7: α-1,6 포도당 전이 리바우디오사이드 A의 감미도 및 감미질 평가

종래 물질로 알려진 α-1,4 포도당 전이 리바우디오사이드 A와 상기 실시예 4의 α-1,6 포도당 전이 리바우디오사이드 A를 각각 물에 용해 시킨 후, 패널들에게 제공하여 이들의 실측 감미도와 감미질을 평가하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

시료	실측 감미도	감미질 평가
α-1,4 포도당 전이 리바우디오사이드 A	19	단맛보다 쓴맛이 강하며 후미의 물엿과 같은 느끼한 단맛이 있음 이취는 α-1,6 포도당 전이 리바우디오사이드 A보다 약하나 이미가 강함
α-1,6 포도당 전이 리바우디오사이드 A	26	초미에 단맛이 느껴지며, 쓴맛이 있는 편이나　맛은 깔끔한 편임 이취(알코올취 등)가 있음

표 5를 보면, α-1,6 포도당 전이 리바우디오사이드 A는 α-1,4 포도당 전이 리바우디오사이드 A와 비교하여 감미도가 높으며, 감미질 평가에서 우위임을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12561P

20190611

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Compositions comprising glucose transferase for producing glucosylated steviol glycosides and method for producing glucosylated steviol glycosides using the same <130> KPA190568-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 734 <212> PRT <213> Lactobacillus mali <400> 1 Met Asp Gln Met Val Leu Glu Thr Gln Gln Trp Leu Asn Lys Thr Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Ser Val Thr Glu Asp Gly Leu Thr Gly 20 25 30 Trp Gly Thr Val Tyr Gly Leu Thr Arg Ala Leu Gln His Glu Leu Gly 35 40 45 Ile Thr Gly Leu Val Asn Asn Phe Gly Pro Thr Ser Lys Gln Lys Phe 50 55 60 Asn Asn Ile Ala Lys Thr Ile Val Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ile Ala 65 70 75 80 Tyr Ile Ile Gln Gly Gly Phe Trp Cys Lys Gly Ile Thr Pro Gly Glu 85 90 95 Phe Asp Gly Lys Phe Ser Ala Asp Thr Ala Ser Ala Val Thr Thr Met 100 105 110 Lys Thr Lys Ala Gly Leu Ala Asp Thr Ser Ser Ser Val Asp Gly Asn 115 120 125 Phe Met Ala Ala Leu Leu Asn Met Ser Ser Phe Asp Leu Leu Thr Gly 130 135 140 Gly Asp Ser Lys Val Arg Glu Met Gln Gln Gln Leu Asn His Asp Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Tyr Thr Gly Ile Leu Pro Cys Asp Gly Ile Tyr Gln Arg Asp 165 170 175 Thr Asn Ser Ala Leu Ile Tyr Ala Leu Gln Ala Glu Glu Lys Ile Ser 180 185 190 Thr Ser Val Ala Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Thr Thr Lys Lys Asp Thr 195 200 205 Pro Thr Val Lys Glu Gly Thr Thr Asn Asn Phe Val Arg Ile Leu Gln 210 215 220 Trp Gly Leu Tyr Val Asn Asn Lys Ala Tyr Thr Gly Ala Phe Asp Gly 225 230 235 240 Val Tyr Asp Ser Ala Val Val Ala Ala Val Lys Glu Phe Glu Glu Thr 245 250 255 Met Ala Leu Asp Ser Thr Asp Gly Thr Ser Ala Gly Val Asp Ile Phe 260 265 270 Met Ser Leu Leu Thr Ser Ala Gly Asn Pro Asp Arg Ser Ala Ile Ala 275 280 285 Cys Asp Thr Ser Tyr Gln Leu Asn Ala Thr Arg Val Ala Thr Leu Lys 290 295 300 Asn Ala Gly Tyr Ser Ile Val Gly Arg Tyr Leu Thr Gly Thr Val Gly 305 310 315 320 Ser Gly Thr Ser Glu Arg Ala Lys Asn Leu Thr Thr Asp Glu Ile Thr 325 330 335 Ala Ile Thr Thr Gly Gly Leu Lys Ile Phe Pro Ile Tyr Gln Asp Gly 340 345 350 Ala Ser Asp Lys Glu Ala Tyr Phe Thr Ala Ala Gln Gly Lys Thr Asp 355 360 365 Gly Thr Lys Ala Val Tyr Ala Ala Gln Asp Leu Gly Phe Lys Glu Gly 370 375 380 Val Val Ile Tyr Phe Ala Val Asp Ala Asp Ile Gln Ala Gly Asp Ile 385 390 395 400 Ala Gly Ser Ala Lys Val Tyr Phe Glu Ala Leu Tyr Asp Ile Val Thr 405 410 415 Ser Tyr Gly Tyr Glu Val Gly Ile Tyr Gly Thr Arg Asn Val Ser Ala 420 425 430 Thr Ile Ile Ser Ala Gly Leu Ala Thr Lys Ala Phe Ile Ser Asp Met 435 440 445 Ser Thr Gly Tyr Ser Gly Asn Leu Gly Tyr Ser Ile Pro Asp Glu Trp 450 455 460 Ala Phe Asp Gln Phe Ser Glu Ile Ser Ile Gly Asp Phe Ala Ile Asp 465 470 475 480 Lys Asp Ala Thr Thr Ser Ala Arg Glu Thr Ala Thr Gly Ser Phe Gly 485 490 495 Val Gly Gly Glu Ser Gly Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Leu Ala Lys Ile 500 505 510 Asn Thr Ile Ile Asp Ala Leu Ser Gln Lys Lys Asn Phe Ser Tyr Leu 515 520 525 Ser Gly Leu Lys Ile Glu Lys Thr Ser Lys Glu Tyr Glu Ile Pro Gly 530 535 540 Phe Ala Val Asp Phe Tyr Val Gln Val Lys Phe Glu Ala Ser Val Ser 545 550 555 560 Glu Pro Gly Asp Asn Val Gly Val Val Tyr Asn Val Ser Asn Gly Lys 565 570 575 Phe Glu Ser Asp Phe Thr Asp Thr Ile Ala Gly Val Val Ala Leu Ser 580 585 590 Asp Glu Ile Asn Lys Glu Asp Ile Asn Ser Ala Leu Thr Glu Leu Ser 595 600 605 Ser Leu Ile Asn Asn Gly Gln Ile Trp Val Glu Pro Val Thr Lys Gly 610 615 620 Ser Asp Ala Gly Ile Ala Leu His Ile Lys Ser Thr Phe Asp His Thr 625 630 635 640 Leu Asp Ser Gly Glu Thr Ile Glu Leu Glu Tyr Glu Ile Ile Ile Asp 645 650 655 Glu Ile Phe His Lys Ile Glu Val Val Pro Thr Gly Val Pro Asn Thr 660 665 670 Thr Ala Asn Asp Tyr Asn Ser Leu Phe Pro Asn Gly Ile Lys Glu Phe 675 680 685 Val Gly Phe Ser Ile Val Ala Gly Leu Ala Thr Gly Gly Ile Tyr Tyr 690 695 700 Val Val Thr Ala Val Gly Ala Thr Ala Ala Val Val Thr Thr Ser Ile 705 710 715 720 Leu Ala Leu Ile Ala Leu Leu Lys Asn Asn Asp Thr Gly Val 725 730

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물로서,
상기 스테비올 배당체가 스테비오사이드 또는 리바우디오사이드 A인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 스테비올 배당체 및 포도당 공여체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
제2항에 있어서, 상기 포도당 공여체는 포도당의 올리고머, 포도당의 중합체 또는 이의 사이클릭 형태인 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것인, 조성물.
제4항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3 개 부가된 것인, 조성물.
삭제
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법으로서,
상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드 또는 리바우디오사이드 A인 것인, 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 방법은
서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 존재 하에 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함하는, 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10에서 수행되는 것인, 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 1 내지 80 ℃에서 수행되는 것인, 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것인, 제조방법.
제12항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것인, 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3 개 부가된 것인, 제조방법.
삭제