JP2022532627A

JP2022532627A - グルコース転移酵素を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物及びそれを用いたグルコース転移ステビオール配糖体製造方法

Info

Publication number: JP2022532627A
Application number: JP2021568034A
Authority: JP
Inventors: キム，ジョンウン; パク，ソンヒ; ヤン，テジュ; チュ，ソン; キム，ソンボ; チェ，ウンジョン
Original assignee: シージェイチェイルジェダンコーポレイション
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2020-06-08
Publication date: 2022-07-15
Anticipated expiration: 2040-06-08
Also published as: KR20200143612A; CN114521215B; US20220220523A1; CN114521215A; WO2020251228A1; EP3954780A4; EP3954780A1; JP7375046B2; KR102303661B1

Abstract

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物及び前記酵素を用いたグルコース転移ステビオール配糖体製造方法に関する。

Description

本出願は、グルコース転移酵素を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物及びそれを用いたグルコース転移ステビオール配糖体製造方法に関する。

糖摂取による疾病（肥満）の恐れから１日当たりの糖摂取量を低減することを世界保健機関（ＷＨＯ）が勧告しており、先進国を中心に政府主導の下で糖類摂取量を低減するための様々な政策が盛んに論議されている。また、市場においては様々な代替甘味料素材に対するニーズが増加しており、代替甘味料素材の開発、製品化が続けられている。代替甘味料は、合成高甘味料（Saccharin、Aspartame、Sucraloseなど）、合成糖アルコール類（Maltitol, Xylitol）、高甘味料（Rebaudioside A, Liquorice）と変化を続けている。しかし、持続的な合成甘味料の安全性についての懸念から天然甘味料に対する消費者のニーズが大きくなってきているものの、天然甘味料特有の異味・異臭を有する味質の限界により、従来の合成甘味料中心の低カロリー・ゼロカロリー製品を本格的に代替することができていない現状である。

近年、多くの注目を集めている天然の高甘味料は、ステビアレバウディアナベルトニー（Stevia rebaudiana Bertoni）の葉から抽出したステビア（Stevia）である。ステビアは、天然素材であり、砂糖の２００～３００倍の甘味度を有し、ステビオシド（Stevioside）、レバウジオシド（Rebaudioside）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｍなどからなる。また、ステビアは、カロリーがなく、血中グルコース及びインスリンレベルに有益な効果をもたらし、人体に副作用がないことが報告されており、代替甘味料としての潜在力を有しているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、使用に制限がある。

ステビアの甘味質改善方法としては、酵素を用いた糖転移方法が挙げられ、酵素を用いた糖転移方法としては、ＣＧＴａｓｅを用いてステビオール配糖体にグルコース（１～１２個）を転移する方法が現在広く用いられている（特許文献１）。しかし、ステビオール配糖体に転移したグルコース構造がα－（１，４）であり、腸内微生物により全て分解されるので、カロリーを上昇させるという欠点がある。

韓国特許出願第１０－１９９１－００２０７６９号

Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277 Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453 Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984) Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990) Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York

こうした背景の下、本発明者らは、ラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）由来の酵素がステビオール配糖体にグルコースをα－（１，６）結合により転移して難消化性グルコース転移ステビオール配糖体を生成することを確認し、本出願を完成するに至った。

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物を提供することを目的とする。

また、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物をステビオール配糖体に接触させるステップを含むグルコース転移ステビオール配糖体製造方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記製造方法で製造したグルコース転移ステビオール配糖体を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記グルコース転移ステビオール配糖体を含む甘味料組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含む甘味改善用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を用いてステビオール配糖体をグルコース転移ステビオール配糖体に変換するステップを含む、ステビオール配糖体の甘味改善方法を提供することを目的とする。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物及びグルコース転移ステビオール配糖体製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素を用いるものであり、グルコース転移ステビオール配糖体を特異的に生産することができる。

また、前記酵素は、ステビオール配糖体からグルコース転移ステビオール配糖体への変換率が高いので、非常に効率的にグルコース転移ステビオール配糖体を生産することができる。

ラクトバチルス・マリ培養液から精製した４種の画分（fraction）中のタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レバウジオシドＡと砂糖をラクトバチルス・マリ粗酵素液と反応させる前のＨＰＬＣ結果を示す図である。レバウジオシドＡと砂糖をラクトバチルス・マリ粗酵素液と反応させた後のＨＰＬＣ結果を示す図である。ステビオシドと砂糖をラクトバチルス・マリ粗酵素液と反応させる前のＨＰＬＣ結果を示す図である。ステビオシドと砂糖をラクトバチルス・マリ粗酵素液と反応させた後のＨＰＬＣ結果を示す図である。レバウジオシドＡと砂糖を配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素と反応させる前のＨＰＬＣ結果を示す図である。レバウジオシドＡと砂糖を配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素と反応させた後のＨＰＬＣ結果を示す図である。

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

前記目的を達成するための本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物を提供する。

本出願における「グルコース転移酵素」とは、グルコース供与体（donor）からグルコース受容体（acceptor）にグルコースを転移する酵素を意味する。

前記グルコース転移酵素は、グルコース供与体からステビオール配糖体にグルコースを転移し、グルコース転移ステビオール配糖体を生産する用途を有するものであってもよい。

前記グルコース転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素であってもよい。配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素、配列番号１のアミノ酸配列から必須に構成される酵素、又は配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素と混用される。

また、本出願におけるグルコース転移酵素は、たとえ配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素であると定義したとしても、配列番号１のアミノ酸配列の前後の無意味な配列付加、自然発生する突然変異、又はその非表現突然変異（silent mutation）を除外するものではなく、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、配列番号１のアミノ酸配列から必須に構成されるか、又は配列番号１のアミノ酸配列からなる酵素と同一又は相当する活性を有するものであれば、本出願のグルコース転移酵素に含まれることは当業者にとって自明である。具体的には、本出願のグルコース転移酵素は、配列番号１のアミノ酸配列であってもよく、それと８０％、９０％、９５％又は９７％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、前記酵素に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願のグルコース転移酵素に含まれることは言うまでもない。

すなわち、本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有する酵素又はタンパク質」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなる酵素又はタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、「配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド」に属することは言うまでもない。

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５，６，７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）一進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザン（Southern）ハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１１、１２）で決定される。

配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属由来の酵素であり、具体的にはラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）由来の酵素であってもよいが、これらに限定されるものではない。

配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素は、ステビオール配糖体からグルコース転移ステビオール配糖体への変換率が５０％以上であり、具体的には６０％以上、より具体的には７０％以上、さらに具体的には８０％以上、一層具体的には９０％以上であるが、これらに限定されるものではない。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素を発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含んでもよい。

具体的には、前記微生物は、ラクトバチルス属微生物、より具体的にはラクトバチルス・マリであってもよいが、本出願のグルコース転移酵素を含むか又は発現する微生物であれば、これらに限定されるものではない。

具体的には、前記培養物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素を発現する微生物を含む培養液であってもよく、前記微生物を除いた培養液であってもよい。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物は、ステビオール配糖体及びグルコース供与体をさらに含んでもよい。

前記「ステビオール配糖体（steviol glycoside）」は、天然甘味料の一つであり、次の化学式１で表されるものである。

化学式１において、Ｒ_１には水素（Ｈ）が結合されるか、グルコース（Glucose）がβ結合により１個～３個結合され、Ｒ_２にはグルコース（Glucose）、キシロース（Xylose）又はラムノース（Rhamnose）がβ結合により１個結合され、そこにグルコース（Glucose）がβ結合により０個～２個結合されてもよいが、これらに限定されるものではない。

前記ステビオール配糖体は、ステビオシド（stevioside）、ルブソシド、ズルコシド（dulcoside）Ａ、レバウジオシド（rebaudioside）Ａ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びレバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記グルコース供与体は、少なくとも１つのグルコースがステビオール配糖体に転移するようにグルコース転移酵素の存在下で反応し得る、グルコースのオリゴマー、グルコースの重合体及びその環状形態のいずれか任意のものであり、具体的には砂糖であってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記「グルコース転移ステビオール配糖体（glucosylated steviol glycoside）」とは、前記ステビオール配糖体にグルコース（glucose）が付加されたものを意味する。

具体的には、前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースがα－（１，６）結合により付加されたものであってもよい。

具体的には、前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の１９－ＯＨ位置に結合されたグルコースにα－（１，６）結合によりグルコースが付加されたものであってもよい。

具体的には、前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースが１～３個付加されたものであってもよい。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物は、グルコースのステビオール配糖体への転移活性を有利にしたり、前記組成物の安定性を向上させる補因子をさらに含んでもよいが、これらに限定されるものではない。前記補因子の例としては、金属イオン、金属塩、賦形剤、保存剤などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。

前記目的を達成するための本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物をステビオール配糖体に接触させるステップを含むグルコース転移ステビオール配糖体製造方法を提供する。

前記「配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素」、「微生物」、「培養物」及び「グルコース転移ステビオール配糖体」については前述した通りである。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物の存在下でグルコース供与体（例えば、砂糖）とステビオール配糖体を反応させるステップを含んでもよい。ここで、前記「グルコース供与体」及び「ステビオール配糖体」については前述した通りである。

前記グルコース供与体とステビオール配糖体を反応させるステップは、ｐＨ１～１０で行われ、具体的にはｐＨ２～９、より具体的にはｐＨ３～８、さらに具体的にはｐＨ５～６で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

前記グルコース供与体とステビオール配糖体を反応させるステップは、１～８０℃で行われ、具体的には５～７０℃、より具体的には２５～５０℃、さらに具体的には３５～４５℃で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

また、前記グルコース供与体とステビオール配糖体を反応させるステップは、ｐＨ１～１０、ｐＨ２～９、ｐＨ３～８又はｐＨ５～６、及び１～８０℃、５～７０℃、２５～５０℃又は３５～４５℃で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のグルコース転移ステビオール配糖体製造方法は、グルコース転移ステビオール配糖体を回収するステップをさらに含んでもよく、前記回収には、当該技術分野で周知の様々な方法、例えば濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられるが、これらに限定されるものではない。また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよい。

前記目的を達成するための本出願のさらに他の態様は、本出願のグルコース転移ステビオール配糖体製造方法で製造したグルコース転移ステビオール配糖体を提供する。

前記「グルコース転移ステビオール配糖体」については前述した通りである。

具体的には、前記グルコース転移ステビオール配糖体は、グルコース転移ステビオシド、グルコース転移ルブソシド、グルコース転移ズルコシドＡ、グルコース転移レバウジオシドＡ、グルコース転移レバウジオシドＣ、グルコース転移レバウジオシドＤ、グルコース転移レバウジオシドＥ、グルコース転移レバウジオシドＦ及びグルコース転移レバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。

前記目的を達成するための本出願のさらに他の態様は、本出願のグルコース転移ステビオール配糖体を含む甘味料組成物を提供する。

本出願の甘味料組成物は、ステビオール配糖体を含む甘味料組成物に比べて、苦味が改善され、溶解度が改善されたものであってもよい。

前記苦味の改善は、苦味の減少であってもよい。

前記溶解度の改善は、溶解度の増加であってもよい。

前記目的を達成するための本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むステビオール配糖体甘味改善用組成物を提供する。

前記「配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素」、「微生物」、「培養物」及び「ステビオール配糖体」については前述した通りである。

前記甘味の改善は、苦味の減少による苦味の改善であってもよい。

前記目的を達成するための本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を用いてステビオール配糖体をグルコース転移ステビオール配糖体に変換するステップを含む、ステビオール配糖体の甘味改善方法を提供する。

前記「配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素」、「微生物」、「培養物」、「ステビオール配糖体」及び「グルコース転移ステビオール配糖体」については前述した通りである。

前記変換するステップは、ｐＨ１～１０で行われ、具体的にはｐＨ２～９、より具体的にはｐＨ３～８、さらに具体的にはｐＨ５～６で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

前記変換するステップは、１～８０℃で行われ、具体的には５～７０℃、より具体的には２５～５０℃、さらに具体的には３５～４５℃で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

また、前記変換するステップは、ｐＨ１～１０、ｐＨ２～９、ｐＨ３～８又はｐＨ５～６、及び１～８０℃、５～７０℃、２５～５０℃又は３５～４５℃で行われてもよいが、これらに限定されるものではない。

以下、実施例及び実験例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

酵素の精製
試験管（test tube）にＭＲＳｂｒｏｔｈ（BD Difco）を５ｍＬ充填し、その後それにラクトバチルス・マリ（Lactobacillus mali）を接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで１５時間培養した。

その後、２５０ｍＬフラスコにＭＲＳｂｒｏｔｈを１００ｍＬ充填し、次いで前記培養液を５％（ｖ／ｖ）で接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで１５時間培養した。

その後、３Ｌ発酵槽にＭｏｄｉｆｉｅｄＭＲＳｂｒｏｔｈ１Ｌを充填し、次いで前記培養液を５％（ｖ／ｖ）で接種し、３０℃、３００ｒｐｍで２４時間培養した。その際の前記ＭｏｄｉｆｉｅｄＭＲＳｂｒｏｔｈの組成を表１に示す。

前記培養液を１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。上清を２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．４バッファで透析（dialysis）し、その後タンパク質精製を行った。

１次精製には陰イオン交換クロマトグラフィー（anion exchange chromatography）を用いた。用いたカラムはＨｉｔｒａｐ^ＴＭＤＥＡＥＦＦ（GE healthcare)である。試料を１ｍＬ／ｍｉｎの流速で前記カラムにローディングし、１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．４バッファで溶出（elution）した。

２次精製にはゲル濾過クロマトグラフィー（Gel filtration chromatography）を用いた。用いたカラムはＨｉｌｏａｄ^ＴＭ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（GE healthcare）である。１５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファで精製した。

前記精製により４種の画分（fraction）を得た。各画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１に示す。

酵素の活性の確認
標的酵素の存在を確認するために、各画分の砂糖加水分解活性を還元糖の定量法（ＤＮＳ法）により確認した。

５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（sodium acetate buffer）に２００ｍＭの砂糖水溶液と前記各画分を１：１で混合し、その後４０℃の水槽（water bath）で１０分間反応させ、次いで１００℃で失活させた。ＤＮＳ試薬を１：３の比で添加して混合し、１００℃で５分間反応させ、その後直ちに氷でＤＮＳ反応を停止させた。その後、ＤＮＳ試薬の吸光度（ＯＤ）を５７５ｎｍで測定し、次いで作成したフルクトース標準曲線式に代入して活性を確認した。ここで、１Ｕｎｉｔとは、１分間当たり１μｍｏｌｅのフルクトースを増加させる酵素の量（ｍＬ）を意味するものと定義する。

その結果、２番の画分（Fraction No.2）の７５ｋＤａタンパク質に砂糖を加水分解する活性があることが確認された。

酵素の同定
ＬＣ－ＭＳにより前記７５ｋＤａタンパク質を同定した。

実施例３－１：試料の前処理（In gel trypsin digestion）
質量分析器（ＭＳ）を用いたタンパク質同定のためには、分析するタンパク質をペプチドに断片化する必要がある。

よって、図１のｆｒａｃｔｉｏｎ＃２の７５ｋＤａゲルを切り出し、その後Ｉｎ－ｇｅｌｐｉｅｃｅ試料に５０％ＣＨ_３ＣＮ（Ｈ_２Ｏ）溶媒を入れ、次いで１５分間反応させて脱色した。その後、５０ｍＭＡＢＣ（ammonium bicarbonate, SIGMA）バッファに溶解した１ＭＤＴＴ（Dithiothreitol, GE）を２μｌ添加し、常温で１時間保管した。その後、５０ｍＭＡＢＣ（ammonium bicarbonate, SIGMA）バッファに溶解した１ＭＩＡＡ（iodoacetamide, SIGMA）を４μｌ添加し、光を遮断して常温で１時間保管した。脱色したＩｎ－ｇｅｌｐｉｅｃｅ試料に１μｇのトリプシン（trypsin）溶液（Sequencing-grade modified porcine trypsin, Thermofisher, Madison, WI, USA）を入れ、３７℃で１６時間反応させた。５０％ＣＨ_３ＣＮ（Ｈ_２Ｏ）溶媒２００μｌを添加し、ｇｅｌ脱水反応により加水分解されたペプチドを回収し、それを回転乾燥機（SpeedDry Vacuum Concentrator）で乾燥させた。塩とその他の不純物の除去のために、Ｃ１８Ｚｉｐｔｉｐ（Millipore）を用いて脱塩（desalting）した。

実施例３－２：液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）
液体クロマトグラフィー質量分析は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＲＳＵＨＰＬＣ，Ｑ－ＥｘａｃｔｉｖｅＯｒｂｉｔｒａｐ（Thermo Scientific）質量分析器で行った。分析条件は次の通りである。

（１）クロマトグラフィー：Ｔｈｅｒｍｏ（Ｄｉｏｎｅｘ）ＵＨＰＬＣＵｌｔｉｍａｔｅ３０００
（２）カラム：ＡｃｃｌａｉｍｐｒｅｐＭａｐ^ＴＭＲＳＬＣ５０μｍ×１５ｃｍ，ｎａｎｏｖｉｐｅｒＣ１８，２μｍ，１００Ａ
（３）溶媒：Ａ＝蒸留水（０．１％ギ酸を含む），Ｂ＝アセトニトリル（０．１％ギ酸を含む）
（４）溶出条件

（５）流速：０．２μｌ／ｍｉｎ
（６）試料注入：１μｌ

その後、ｄｅｎｏｖｏｐｅｐｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによりアミノ酸配列を確認した。その際に、分析プログラムとしてＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ２．１（Thermo）を用いた。

このようにして確認したアミノ酸配列は、配列番号１の配列である。

粗酵素液のステビオール配糖体にグルコースを転移する活性の確認
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に６％レバウジオシドＡ（purecircle）又は６％ステビオシド（carbosynth）及び６％白砂糖（ＣＪ第一製糖）を溶解し、その後それに配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素を含むラクトバチルス・マリ粗酵素液を添加し、４０℃で２４時間反応させた。その後、グルコース転移レバウジオシドＡ又はグルコース転移ステビオシドが生成されたか否かをＨＰＬＣで確認した。その結果を図２～図５に示す。一方、ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。

図２及び図４は酵素反応前のＨＰＬＣ分析結果であり、図３及び図５は酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果である。

図２と図３を比較すると、前記酵素反応によりレバウジオシドＡがグルコース転移レバウジオシドＡ（Rebaudioside A-G1）に変換されたことが分かる。ここで、確認された変換率は約９０％であった。

また、図４と図５を比較すると、前記酵素反応によりステビオシドがグルコース転移ステビオシド（Stevidoside-G1）に変換されたことが分かる。ここで、確認された変換率は約９０％であった。

一方、前記グルコース転移ステビオシド（Stevidoside-G1）及びグルコース転移レバウジオシドＡ（Rebaudioside A-G1）は、それぞれステビオシド及びレバウジオシドＡの１９－ＯＨ位置に結合されたグルコースにα－（１，６）結合によりグルコースが１個転移したものであることをＮＭＲで確認した。

配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素のステビオール配糖体にグルコースを転移する活性の確認
実施例３で確認した、配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素の活性を確認した。具体的には、前記酵素がステビオール配糖体にグルコースを転移する活性を有するか否かを確認した。

実施例５－１：酵素を含む微生物の作製及び酵素の精製
配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをポリヌクレオチド合成方法（（株）バイオニア）により作製し、得られたポリヌクレオチドをｐＢＴ７－Ｎ－Ｈｉｓベクターに挿入し、その後それを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。アンピシリン（Ampicillin）を含む平板培地に形質転換した大腸菌を塗抹し、組換え菌株（微生物）を得た。

一方、前記微生物を２０１９年６月１１日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms）に寄託番号ＫＣＣＭ１２５６１Ｐとして寄託した。

アンピシリン（Ampicillin）を含むＬＢ培地５ｍｌに、組換え大腸菌菌株を接種し、６００ｎｍでの吸光度が２．０になるまで３７℃で種菌培養を行った。アンピシリン（Ampicillin）を含むＬＢ培地５００ｍｌに、種菌培養した培養液を添加し、本培養を行った。その後、６００ｎｍでの吸光度が０．４になったとき、０．１ｍＭＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド）を添加し、配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素の大量発現を誘導した。前記過程中は、攪拌速度１８０ｒｐｍ、培養温度３７℃が保持されるようにし、ＩＰＴＧ添加後は、攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度１６℃で培養した。

前記培養液を１００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞ペレット（cell pellet）を得て、前記ペレットに５０ｍＭトリス塩酸緩衝液を添加して細胞溶液に再懸濁した。前記細胞溶液を超音波破砕機（sonicator）で破砕した。細胞破砕物を再び１３０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、上清のみ採取した。その後、Ｎｉ－ＮＴＡｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムを用いて前記酵素を精製した。

実施例５－２：酵素の活性の確認
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５．０）に６％レバウジオシドＡ（purecircle）及び６％白砂糖（ＣＪ第一製糖）を溶解し、その後それに実施例５－１で得られた配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素を添加し、４０℃で２４時間反応させた。その後、グルコース転移レバウジオシドＡが生成されたか否かをＨＰＬＣで確認した。その結果を図６及び図７に示す。

図６は酵素反応前のＨＰＬＣ分析結果であり、図７は酵素反応後のＨＰＬＣ分析結果である。

図６と図７を比較すると、前記酵素反応によりレバウジオシドＡがグルコース転移レバウジオシドＡ（Rebaudioside A-G1）に変換されたことが分かる。ここで、確認された変換率は約９０％であった。

一方、前記グルコース転移レバウジオシドＡ（Rebaudioside A-G1）は、レバウジオシドＡの１９－ＯＨ位置に結合されたグルコースにα－（１，６）結合によりグルコースが１個転移したものであることをＮＭＲで確認した。

すなわち、配列番号１のアミノ酸配列を含む酵素は、実施例４のラクトバチルス・マリ粗酵素液と同じ活性を有することが確認された。

グルコース転移ステビオール配糖体の溶解度の評価
ステビオール配糖体及びグルコース転移ステビオール配糖体の溶解度を測定した。

具体的には、レバウジオシドＡ（ＲＡ）、ステビオシド（ＳＴＶ）、実施例４のグルコース転移レバウジオシドＡ（ＲＡ－Ｇｌｕ）、実施例４のグルコース転移ステビオシド（ＳＴＶ－Ｇｌｕ）のそれぞれの溶解度を測定した。

レバウジオシドＡ、ステビオシド、グルコース転移レバウジオシドＡ、グルコース転移ステビオシド、それぞれ６ｇを１０ｍｌに混合し、その後ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎにより５０℃で６０分間溶解した。それを５、１５、２５、３５、４５又は５５℃の水槽（water bath）で１週間インキュベーション（incubation）した。その後、溶液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清１ｍｌを採取し、１０５℃のオーブン（oven）で乾燥させ、溶解度を測定した。それを表４に示す。

表４の結果から、グルコース転移ステビオシド及びグルコース転移レバウジオシドＡは、ステビオシド、レバウジオシドＡに比べて溶解度が著しく増加したことが分かる。

α－（１，６）グルコース転移レバウジオシドＡの甘味度及び甘味質の評価
従来の物質として知られるα－（１，４）グルコース転移レバウジオシドＡと実施例４のα－（１，６）グルコース転移レバウジオシドＡをそれぞれ水に溶解し、パネルに提供して実測甘味度と甘味質を評価した。その結果を表５に示す。

表５に示すように、α－（１，６）グルコース転移レバウジオシドＡは、α－（１，４）グルコース転移レバウジオシドＡと比較して甘味度が高く、甘味質の評価に優れることが確認された。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

Claims

配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物を含むグルコース転移ステビオール配糖体生産用組成物。
前記組成物は、ステビオール配糖体及びグルコース供与体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
前記グルコース供与体は、グルコースのオリゴマー、グルコースの重合体又はその環状形態である、請求項２に記載の組成物。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースがα－（１，６）結合により付加されたものである、請求項１に記載の組成物。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の１９－ＯＨ位置に結合されたグルコースにα－（１，６）結合によりグルコースが付加されたものである、請求項４に記載の組成物。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースが１～３個付加されたものである、請求項１に記載の組成物。
前記ステビオール配糖体は、ステビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びレバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の組成物。
配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物をステビオール配糖体に接触させるステップを含むグルコース転移ステビオール配糖体製造方法。
前記方法は、
配列番号１のアミノ酸配列を含むグルコース転移酵素、それを発現する微生物、又は前記微生物の培養物の存在下でグルコース供与体とステビオール配糖体を反応させるステップを含む、請求項８に記載の製造方法。
前記反応させるステップは、ｐＨ１～１０で行われるものである、請求項９に記載の製造方法。
前記反応させるステップは、１～８０℃で行われるものである、請求項９に記載の製造方法。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースがα－（１，６）結合により付加されたものである、請求項８に記載の製造方法。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体の１９－ＯＨ位置に結合されたグルコースにα－（１，６）結合によりグルコースが付加されたものである、請求項１２に記載の製造方法。
前記グルコース転移ステビオール配糖体は、ステビオール配糖体にグルコースが１～３個付加されたものである、請求項８に記載の製造方法。
前記ステビオール配糖体は、ステビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ及びレバウジオシドＭからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の製造方法。