WO2020251228A1 - 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법 - Google Patents

포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법 Download PDF

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박성희
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추선
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최은정
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Definitions

  • the present application relates to a composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside comprising a glucose-transfer enzyme and a method for preparing a glucose-transferring steviol glycoside using the same.
  • Stevia A natural high-sweetener that has received considerable attention recently is Stevia, which is extracted from the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni.
  • Stevia is a natural material and has 200-300 times the sweetness of sugar, and consists of Stevioside, Rebaudioside A, B, C, D, E, M, etc.
  • stevia does not produce calories, is positive for blood glucose and insulin levels, and is reported to have no side effects on the human body, so it has potential as an alternative sweetener, but there is a disadvantage in that bitter taste is strongly expressed, so its application is limited.
  • One object of the present application is to provide a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside comprising a culture of the microorganism.
  • Another object of the present application is to provide a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a method for preparing a glucose transfer steviol glycoside comprising contacting a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism with a steviol glycoside Is to do.
  • Another object of the present application is to provide a glucose-transferring steviol glycoside prepared by the above manufacturing method.
  • Another object of the present application is to provide a sweetener composition comprising the glucose-transferring steviol glycoside.
  • Another object of the present application is to provide a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a composition for improving sweetness comprising a culture of the microorganism.
  • Another object of the present application is a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or steviol comprising the step of converting a steviol glycoside to a glucose transfer steviol glycoside using a culture of the microorganism It is to provide a method of improving the sweetness of glycosides.
  • composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside of the present application and a method for producing a glucose-transferring steviol glycoside use a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and can specifically produce a glucose-transferring steviol glycoside.
  • the enzyme since the enzyme has a high conversion rate from steviol glycosides to glucose-transferred steviol glycosides, it is possible to very efficiently produce glucose-transferring steviol glycosides.
  • Figure 2 shows the HPLC results before reacting rebaudioside A and sugar with Lactobacillus male coenzyme solution.
  • Figure 4 shows the HPLC results before reacting stevioside and sugar with Lactobacillus male coenzyme solution.
  • Figure 6 shows the HPLC results before reacting rebaudioside A and sugar with an enzyme containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • One aspect of the present application for achieving the above object provides a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside comprising a culture of the microorganism .
  • glucose transfer enzyme refers to an enzyme that transfers glucose from a glucose donor to a glucose acceptor.
  • the glucose transfer enzyme may have a purpose of producing a glucose transfer steviol glycoside by transferring glucose from a glucose donor to a steviol glycoside.
  • the glucose transfer enzyme may be an enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is used in combination with an enzyme having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, an enzyme consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 I can.
  • the glucose transfer enzyme is defined as an enzyme containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, meaningless sequence addition to the front and back of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring mutation, or a latent mutation thereof (silent mutation), including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or having the same or corresponding activity as an enzyme consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 If it is the case, it is apparent to those skilled in the art that it corresponds to the glucose transfer enzyme of the present application.
  • the glucose transfer enzyme of the present application may be a protein composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having 80%, 90%, 95%, or 97% homology or identity thereto.
  • an amino acid sequence having homology or identity and exhibiting efficacy corresponding to the enzyme it is obvious that proteins having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the glucose transfer enzyme of the present application. Do.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 means “polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1" if it has the same or corresponding activity as a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It is self-evident that it can belong.
  • homology refers to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related and may be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and a default gap penalty established by the program used can be used together.
  • Substantially, homologous or identical sequences are generally in moderate or high stringent conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the sequence or full-length. (stringent conditions) can be hybridized. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotide.
  • the homology, similarity or identity of a polynucleotide or polypeptide can be found in, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. As known in Math (1981) 2:482, for example, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443 can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program.
  • the GAP program defines the total number of symbols in the shorter of two sequences, divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a monolithic comparison matrix (contains values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. As disclosed by 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); And (3) no penalty for end gaps.
  • a monolithic comparison matrix (contains values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. As disclosed by 353-358 (1979), Gribskov et al (1986)
  • the glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be an enzyme derived from the genus Lactobacillus , and specifically, an enzyme derived from Lactobacillus mali , but is not limited thereto.
  • the glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may have a conversion rate of steviol glycoside to glucose transfer steviol glycoside of 50% or more, specifically 60% or more, more specifically 70% or more, and more specifically It may be 80% or more, more specifically 90% or more, but is not limited thereto.
  • composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside of the present application may include a microorganism expressing a glucose-transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a culture of the microorganism.
  • the microorganism may be a microorganism of the genus Lactobacillus, more specifically Lactobacillus male, but is not limited thereto as long as it is a microorganism capable of containing or expressing the glucose transfer enzyme of the present application.
  • the culture may be a culture medium containing a microorganism expressing a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a culture medium excluding the microorganism.
  • composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside of the present application may further include a steviol glycoside and a glucose donor.
  • the "steviol glycoside” is one of natural sweeteners and may be represented by the following formula (1).
  • hydrogen (H) may be bonded to R 1 , or 1 to 3 glucose may be bonded to each other through a ⁇ bond, and R 2 may include glucose to xylose to ram One north (Rhamnose) is bound by a ⁇ bond, and glucose (Glucose) may be bound to 0 to 2 by a ⁇ bond, but is not limited thereto.
  • the steviol glycosides are stevioside, rubusoside, dulcoside A, rebaudioside A, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, and It may be one or more selected from the group consisting of baudioside F and rebaudioside M, but is not limited thereto.
  • the glucose donor may be any of an oligomer of glucose, a polymer of glucose, and a cyclic form thereof, which may be reacted in the presence of a glucose transfer enzyme so that one or more glucose is transferred to the steviol glycoside, and specifically may be sugar. It is not limited thereto.
  • the "glucosylated steviol glycoside” may be obtained by adding glucose to the steviol glycoside.
  • the glucose-transferring steviol glycoside may be obtained by adding glucose to the steviol glycoside through ⁇ -(1,6) bonds.
  • the glucose-transferring steviol glycoside may be one in which glucose is added by ⁇ -(1,6) bond to glucose bonded to the 19-OH position of the steviol glycoside.
  • the glucose-transferring steviol glycoside may be obtained by adding 1 to 3 glucose to the steviol glycoside.
  • composition for producing a glucose-transferring steviol glycoside of the present application may additionally include a cofactor capable of enhancing the stability of the composition or to facilitate the transfer activity of glucose to the steviol glycoside, but is not limited thereto.
  • cofactors include metal ions, metal salts, excipients, and preservatives, but are not particularly limited thereto.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object is a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising the step of contacting a microorganism expressing the same or a culture of the microorganism with a steviol glycoside, glucose It provides a method for preparing a transition steviol glycoside.
  • glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • microorganism comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • culture comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • microorganism comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • culture comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • culture glucose-transferring steviol glycoside
  • the method of preparing a glucose-transferring steviol glycoside of the present application comprises a glucose-transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a glucose donor (eg, sugar) and a steviol glycoside in the presence of a culture of the microorganism. It may include a step of reacting. At this time, the "glucose donor" and "steviol glycoside" are as described above.
  • the step of reacting the glucose donor and steviol glycoside may be performed at pH 1 to 10, specifically at pH 2 to 9, more specifically at pH 3 to 8, and even more specifically at pH 5 to 6 However, it is not limited thereto.
  • the step of reacting the glucose donor with the steviol glycoside may be performed at 1 to 80°C, specifically 5 to 70°C, more specifically 25 to 50°C, and even more specifically 35 to 45°C. However, it is not limited thereto.
  • the step of reacting the glucose donor and the steviol glycoside may include pH 1 to 10, pH 2 to 9, pH 3 to 8, or pH 5 to 6, and 1 to 80°C, 5 to 70°C, 25 to 50°C. , Or may be performed at 35 to 45 °C, but is not limited thereto.
  • the method for preparing a glucose-transferred steviol glycoside of the present application may further include the step of recovering the glucose-transferred steviol glycoside, and the recovery may include various methods well known in the art, such as filtration, size exclusion chromatography, Ion exchange chromatography, crystallization, HPLC, and the like may be used, but are not limited thereto.
  • the recovery step may include a purification process.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object provides a glucose-transition steviol glycoside prepared by the method for preparing a glucose-transfer steviol glycoside of the present application.
  • the "glucose-transferred steviol glycoside” is as described above.
  • glucose-transferring steviol glycosides include glucose-transfer stevioside, glucose-transfer rubusoside, glucose-transition dulcoside A, glucose-transition rebaudioside A, glucose-transition rebaudioside C, glucose-transition rebaudioside D.
  • Glucose transfer rebaudioside E, glucose transfer rebaudioside F, and glucose transfer rebaudioside M may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object provides a sweetener composition comprising the glucose-transferred steviol glycoside of the present application.
  • the sweetener composition of the present application may have improved bitter taste and improved solubility compared to a sweetener composition containing a steviol glycoside.
  • the bitter taste improvement may be a bitter taste reduction.
  • the solubility improvement may increase the solubility.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object is to provide a composition for improving steviol glycoside sweetness, comprising a glucose transferase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a culture of the microorganism do.
  • glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • microorganism comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • culture comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • steviol glycoside are as described above.
  • the sweetness improvement may be that bitter taste is improved by reducing bitter taste.
  • Another aspect of the present application for achieving the above object is a glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a microorganism expressing the same, or a steviol glycoside to a glucose transfer steviol glycoside using a culture of the microorganism. It provides a method for improving the sweetness of steviol glycosides comprising the step of converting.
  • glucose transfer enzyme comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • microorganism comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • culture comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • steviol glycoside comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the converting step may be performed at pH 1 to 10, specifically pH 2 to 9, more specifically pH 3 to 8, and more specifically pH 5 to 6, but is not limited thereto.
  • the converting step may be performed at 1 to 80°C, specifically 5 to 70°C, more specifically 25 to 50°C, and even more specifically 35 to 45°C, but is not limited thereto.
  • the converting step is at pH 1 to 10, pH 2 to 9, pH 3 to 8, or pH 5 to 6, and 1 to 80°C, 5 to 70°C, 25 to 50°C, or 35 to 45°C It may be performed, but is not limited thereto.
  • the sweetness improvement may be that bitter taste is improved by reducing bitter taste.
  • MRS broth BD Difco
  • Lactobacillus mali was inoculated thereto, followed by incubation at 30° C. and 180 rpm for 15 hours.
  • MRS broth 100 mL was filled in a 250 mL flask, and the culture solution was inoculated with 5% (v/v) and incubated at 30° C. and 180 rpm for 15 hours.
  • Modified MRS broth 1L was filled in a 3L fermenter, and the culture solution was inoculated at 5% (v/v), and cultured at 30°C and 300rpm for 24 hours. At this time, the composition of the Modified MRS broth is shown in Table 1 below.
  • Composition Unit (g/L) content manufacturer Sucrose g 20 SIGMA polypeptone g 10 DAEJUNG Yeast extract g 5 BD Difco beef extract g 10 BD Difco Ammonium citrate g 2 DAEJUNG sodium acteate g 5 DAEJUNG K 2 HPO 4 g 2 DAEJUNG MgSO 4 7H 2 O g 0.1 JUNSEI MnSO 4 H 2 O g 0.05 JUNSEI Tween 80 g One DAEJUNG
  • the culture solution was centrifuged at 13000 rpm for 15 minutes to recover the supernatant.
  • the supernatant was dialysis with 20 mM Tris-HCl pH 7.4 buffer, followed by protein purification.
  • the first purification was performed using anion exchange chromatography, and the column used was Hitrap TM DEAE FF (GE healthcare). A sample was loaded onto the column at a flow rate of 1 mL/min, and elution was performed with a 20 mM Tris-HCl pH 7.4 buffer containing 1 M NaCl.
  • a 200mM aqueous sugar solution and each of the fractions were mixed 1:1 in a 50mM sodium acetate buffer, and then reacted for 10 minutes in a 40°C water bath, and then inactivated at 100°C.
  • DNS reagent was added in a ratio of 1:3, mixed and reacted at 100°C for 5 minutes, and then the DNS reaction was immediately stopped on ice. Thereafter, the absorbance (OD) of the DNS reagent was measured at 575 nm, and the activity was confirmed by substituting it into the prepared fructose standard curve equation.
  • the definition of 1 unit represents the amount (mL) of an enzyme that increases 1 ⁇ mole of fructose per minute.
  • the 75kDa protein was identified by LC-MS.
  • Example 3-1 Sample preparation (In gel trypsin digestion)
  • MS mass spectrometer
  • trypsin solution (Sequencing-grade modified porcine trypsin, Thermofisher, Madison, WI, USA) was added to the bleached In-gel piece sample and reacted at 37°C for 16 hours. 200 ⁇ l of 50% CH 3 CN (H 2 O) solvent was added to recover the hydrolyzed peptide through gel dehydration, and this was dried using a rotary dryer (SpeedDry Vacuum Concentrator). To remove salt and other impurities, desalting was performed using C18 Ziptip (Millipore).
  • Example 3-2 Liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)
  • Liquid chromatography mass spectrometry was performed with Ultimate 3000 RS UHPLC, Q-Exactive Orbitrap (Thermo Scientific) mass spectrometer, and analysis conditions were as follows.
  • amino acid sequence thus identified is the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • FIGS. 2 and 4 are HPLC analysis results before enzymatic reaction
  • Figs. 3 and 5 are HPLC analysis results after enzymatic reaction.
  • glucose-transferring stevioside (Stevidoside-G1) and glucose-transferring rebaudioside A-G1 are ⁇ -(1) to glucose bound to the 19-OH position of stevioside and rebaudioside A, respectively. ,6) It was confirmed through NMR that one glucose was transferred by binding.
  • Example 5 Confirmation of the activity of transferring glucose to the steviol glycoside of an enzyme containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • Example 5-1 Preparation of microorganism containing enzyme and purification of enzyme
  • the polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared by the polynucleotide synthesis method (Bionia Inc.), and the obtained polynucleotide was inserted into the pBT7-N-His vector, and then transformed into E. coli BL21 (DE3). .
  • the transformed E. coli was plated on a plate medium containing ampicillin to obtain a recombinant strain (microorganism).
  • the recombinant E. coli strain was inoculated into 5 ml of LB medium containing ampicillin, and seed culture was performed at 37°C until the absorbance at 600 nm became 2.0. This culture was performed by adding the seed cultured culture solution to 500 ml of LB medium containing ampicillin. Thereafter, when the absorbance at 600 nm was 0.4, 0.1 mM IPTG (isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside) was added to induce mass expression of the enzyme containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. During the above process, the stirring speed was kept at 180 rpm and the culture temperature was maintained at 37°C, and after the addition of IPTG, the stirring speed was 120 rpm and the culture temperature was at 16°C.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the culture solution was centrifuged at 4° C. for 20 minutes at 10000 g to obtain a cell pellet, and a 50 mM tris-hydrochloric acid buffer was added to the pellet, followed by resuspending in a cell solution.
  • the cell solution was crushed with an ultrasonic disruptor (sonicator).
  • the cell lysate was centrifuged again at 13000 g at 4° C. for 20 minutes to take only the supernatant. Thereafter, the enzyme was purified using a Ni-NTA superflow column.
  • Example 5-1 After dissolving 6% rebaudioside A (purecircle) and 6% white sugar (CJ CheilJedang) in 50mM sodium acetate buffer (pH 5.0), the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 obtained in Example 5-1 was dissolved therein. The containing enzyme was added and reacted at 40° C. for 24 hours. Thereafter, it was confirmed by HPLC whether or not glucose-transferring rebaudioside A was generated, and the results are shown in FIGS. 6 to 7.
  • FIG. 6 is an HPLC analysis result before the enzyme reaction
  • FIG. 7 is an HPLC analysis result after the enzyme reaction.
  • the glucose transfer rebaudioside A (Rebaudioside A-G1) is an NMR that one glucose is transferred by ⁇ -(1,6) binding to glucose bound to the 19-OH position of rebaudioside A. It was confirmed through.
  • the enzyme containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the same activity as the Lactobacillus male coenzyme solution of Example 4.
  • Rebaudioside A, Stevioside, Glucose Transition Rebaudioside A, and Glucose Transition Stevioside 6 g each were mixed in 10 ml and dissolved by sonication at 50° C. for 60 minutes. This is incubated for 1 week in a 5, 15, 25, 35, 45, or 55°C water bath. Thereafter, the solution was centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes, 1 ml of the supernatant was taken and dried in an oven at 105°C, and the solubility was measured and shown in Table 4.
  • Example 7 Evaluation of Sweetness and Sweetness of ⁇ -(1,6) Glucose Transfer Rebaudioside A

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Abstract

본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 상기 효소를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법에 관한 것이다.

Description

포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법
본 출원은 포도당 전이 효소를 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 이를 이용한 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)의 당 섭취에 따른 질병(비만) 우려에 의해 일일 당 섭취량을 낮출 것을 권고함에 따라, 선진국을 중심으로 정부 주도하에 다양한 당류 섭취량을 줄이기 위한 정책이 활발히 논의 중이다. 이에 시장에서는 다양한 대체 감미료 소재에 대한 필요가 증가하고 있어, 대체 감미료 소재가 지속적으로 개발, 상용화 되고 있다. 대체 감미료로는 합성 고감미료(Saccharin, Aspartame, Sucralose 등), 합성 당알콜류(Maltitol, Xylitol), 고감미료(Rebaudioside A, Liquorice)로 지속적으로 변화되고 있다. 그러나 지속적인 합성감미료의 안전성에 대한 우려로 천연감미료에 대한 고객의 니즈가 지속적으로 커지고 있으나, 천연감미료 특유의 이미·이취의 맛 속성 한계로 기존의 합성감미료 중심의 저칼로리제로칼로리 제품을 본격적으로 대체하지 못하고 있는 실정이다.
최근 상당한 주목을 받고 있는 천연의 고감미료는 스테비아 리바우디아나 베르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 추출한 스테비아(Stevia)이다. 스테비아는 천연소재이면서 설탕의 200-300 배의 감미도를 가지고 있으며, 스테비오사이드(Stevioside), 리바우디오사이드 (Rebaudioside) A, B, C, D, E, M 등으로 이뤄져 있다. 또한 스테비아는 열량을 내지 않고 혈중 포도당과 인슐린 수준에 긍정적이며, 인체에 부작용이 없는 것으로 보고되어 대체 감미료로서 잠재력이 있지만, 쓴맛이 강하게 발현되는 단점이 있어 적용에 한계가 있다.
스테비아의 감미질 개선 방법으로 효소를 이용하여 당 전이 시키는 방법이 있으며, 상기 방법으로 CGTase를 이용하여 스테비올 배당체에 포도당(1-12개)을 전이시키는 방법이 현재 널리 사용된다(한국특허출원 제10-1991-0020769호). 하지만, 스테비올 배당체에 전이된 포도당 구조가 α-(1,4)로 장내 미생물에 의해 모두 분해되어, 칼로리를 상승시키는 단점이 있다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 유래의 효소가 스테비올 배당체에 포도당을 α-(1,6) 결합으로 전이시켜 난소화성 포도당 전이 스테비올 배당체를 생성하는 것을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 포도당 전이 스테비올 배당체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 포도당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 감미 개선용 조성물 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 이용하여 스테비올 배당체를 포도당 전이 스테비올 배당체로 변환하는 단계를 포함하는 스테비올 배당체의 감미 개선방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물 및 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 이용한 것으로서, 포도당 전이 스테비올 배당체를 특이적으로 생산할 수 있다.
또한, 상기 효소는 스테비올 배당체로부터 포도당 전이 스테비올 배당체로의 전환율이 높으므로, 매우 효율적으로 포도당 전이 스테비올 배당체를 생산할 수 있다.
도 1은 락토바실러스 말리 배양액으로부터 정제한 4 종 분획(fraction) 속 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 리바우디오사이드 A와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 리바우디오사이드 A와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 스테비오사이드와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 스테비오사이드와 설탕을 락토바실러스 말리 조효소액과 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 리바우디오사이드 A와 설탕을 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소와 반응 시키기 전의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 리바우디오사이드 A와 설탕을 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소와 반응시킨 후의 HPLC 결과를 나타낸 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물을 제공한다.
본 출원에서 "포도당 전이 효소"는 포도당 공여체(donor)에서 포도당 수용체(acceptor)로 포도당을 전이시키는 효소를 의미한다.
상기 포도당 전이 효소는 포도당 공여체에서 스테비올 배당체로 포도당을 전이시켜, 포도당 전이 스테비올 배당체를 생산하는 용도를 갖는 것 일 수 있다.
상기 포도당 전이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 효소, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는 효소, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 효소와 혼용되어 사용될 수 있다.
또한, 본 출원에서 포도당 전이 효소는 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소라고 정의하였지만, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되거나, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 효소와 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 포도당 전이 효소에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 포도당 전이 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 90%, 95%, 또는 97% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 포도당 전이 효소의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
즉, 본 출원에서 "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소 또는 단백질", "특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 효소 또는 단백질"이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, "서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드"는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드"에 속할 수 있음은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 %를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다 (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던(Southern) 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소는 락토바실러스(Lactobacillus) 속 유래의 효소일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali) 유래의 효소일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소는 스테비올 배당체로부터 포도당 전이 스테비올 배당체로의 전환율이 50% 이상일 수 있으며, 구체적으로 60% 이상, 더 구체적으로 70% 이상, 보다 더 구체적으로 80% 이상, 보다 더 구체적으로 90% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 락토바실러스 속 미생물, 보다 구체적으로 락토바실러스 말리 일 수 있으나, 본 출원의 포도당 전이 효소를 포함 또는 발현할 수 있는 미생물인 한, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 배양물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소를 발현하는 미생물을 포함하는 배양액 또는 상기 미생물을 제외한 배양액일 수 있다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 스테비올 배당체 및 포도당 공여체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스테비올 배당체(steviol glycoside)"는 천연 감미료의 하나로서, 하기의 화학식 1로 표시되는 것 일 수 있다.
Figure PCTKR2020007396-appb-C000001
상기 화학식 1에서 R1에는 수소(H)가 결합되어 있거나, 포도당(Glucose)이 β 결합으로 1개 내지 3개 결합되어 있을 수 있으며, R2에는 포도당(Glucose) 내지 자일로스(Xylose) 내지 람노스(Rhamnose)가 β 결합으로 1개 결합하고 여기에 포도당(Glucose)이 β 결합으로 0개 내지 2개 결합되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드(stevioside), 루부소사이드, 둘코사이드(dulcoside) A, 리바우디오사이드(rebaudioside) A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F, 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 포도당 공여체는 하나 이상의 포도당이 스테비올 배당체에 전이되도록 포도당 전이 효소의 존재 하에 반응될 수 있는, 포도당의 올리고머, 포도당의 중합체 및 이의 사이클릭 형태 중 임의의 것일 수 있으며, 구체적으로 설탕일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "포도당 전이 스테비올 배당체(glucosylated steviol glycoside)"는 상기 스테비올 배당체에 포도당(glucose)이 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3개 부가된 것일 수 있다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물은 포도당의 스테비올 배당체로의 전이 활성을 유리하게 하거나, 상기 조성물의 안정성을 높일 수 있는 보조인자를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 보조인자의 예로는 금속 이온, 금속 염, 부형제, 보존제 등이 있으나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법을 제공한다.
상기 "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소", "미생물", "배양물" 및 "포도당 전이 스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 존재 하에 포도당 공여체(예를 들어, 설탕)와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 "포도당 공여체" 및 "스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10 에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 pH 2 내지 9, 보다 구체적으로 pH 3 내지 8, 보다 더 구체적으로 pH 5 내지 6에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는 1 내지 80℃에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 5 내지 70℃, 보다 구체적으로 25 내지 50℃, 보다 더 구체적으로 35 내지 45℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10, pH 2 내지 9, pH 3 내지 8, 또는 pH 5 내지 6, 및 1 내지 80℃, 5 내지 70 ℃, 25 내지 50℃, 또는 35 내지 45℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법은 포도당 전이 스테비올 배당체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 상기 회수는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 여과, 크기배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 회수　단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법으로 제조된 포도당 전이 스테비올 배당체를 제공한다.
상기 "포도당 전이 스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 포도당 전이 스테비오사이드, 포도당 전이 루부소사이드, 포도당 전이 둘코사이드 A, 포도당 전이 리바우디오사이드 A, 포도당 전이 리바우디오사이드 C, 포도당 전이 리바우디오사이드 D, 포도당 전이 리바우디오사이드 E, 포도당 전이 리바우디오사이드 F, 및 포도당 전이 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 포도당 전이 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물을 제공한다.
본 출원의 감미료 조성물은 스테비올 배당체를 포함하는 감미료 조성물에 비해 쓴맛이 개선되고 용해도가 개선된 것일 수 있다.
상기 쓴맛 개선은 쓴맛이 감소한 것일 수 있다.
상기 용해도 개선은 용해도가 증가할 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 스테비올 배당체 감미 개선용 조성물을 제공한다.
상기 "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소", "미생물", "배양물" 및 "스테비올 배당체" 는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 감미개선은 쓴맛이 감소하여 쓴맛이 개선된 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 이용하여 스테비올 배당체를 포도당 전이 스테비올 배당체로 변환하는 단계를 포함하는, 스테비올 배당체의 감미 개선방법을 제공한다.
상기 "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소", "미생물", "배양물", "스테비올 배당체" 및 "포도당 전이 스테비올 배당체"는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 변환하는 단계는 pH 1 내지 10 에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 pH 2 내지 9, 보다 구체적으로 pH 3 내지 8, 보다 더 구체적으로 pH 5 내지 6에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변환하는 단계는 1 내지 80℃에서 수행될 수 있으며, 구체적으로 5 내지 70℃, 보다 구체적으로 25 내지 50℃, 보다 더 구체적으로 35 내지 45℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변환하는 단계는 pH 1 내지 10, pH 2 내지 9, pH 3 내지 8, 또는 pH 5 내지 6, 및 1 내지 80℃, 5 내지 70℃, 25 내지 50℃, 또는 35 내지 45℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 감미개선은 쓴맛이 감소하여 쓴맛이 개선된 것일 수 있다.
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 효소 정제
시험관(test tube)에 MRS broth(BD Difco)를 5mL 채운 후 여기에 락토바실러스 말리(Lactobacillus mali)를 접종하고 30℃, 180rpm에서 15시간 동안 배양하였다.
그 후, 250mL 플라스크에 MRS broth를 100mL 채운 후 상기 배양액을 5%(v/v)로 접종하고 30℃, 180 rpm에서 15시간 동안 배양하였다.
그 후, 3L 발효조에 Modified MRS broth 1L를 채운 후 상기 배양액을 5%(v/v)로 접종하고, 30℃, 300rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 Modified MRS broth의 조성은 하기 표 1과 같다.
조성물 단위(g/L) 함량 제조사
Sucrose g 20 SIGMA
polypeptone g 10 DAEJUNG
Yeast extract g 5 BD Difco
beef extract g 10 BD Difco
Ammonium citrate g 2 DAEJUNG
sodium acteate g 5 DAEJUNG
K2HPO4 g 2 DAEJUNG
MgSO4·7H2O g 0.1 JUNSEI
MnSO4·H2O g 0.05 JUNSEI
Tween 80 g 1 DAEJUNG
상기 배양액을 13000rpm에서 15분 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 상등액을 20mM Tris-HCl pH 7.4 버퍼로 투석(dialysis) 후, 단백질 정제를 실시하였다.
1차 정제는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하였고, 사용한 컬럼은 HitrapTM DEAE FF(GE healthcare)이다. 시료를 1mL/min의 유속으로 상기 컬럼에 로딩하고, 1M NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl pH 7.4 버퍼로 용출(elution)하였다.
2차 정제는 젤 여과 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)를 이용하였고, 사용한 컬럼은 HiloadTM 16/60 Superdex 200pg(GE healthcare)이다. 150mM NaCl을 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼로 정제하였다.
상기 정제로 4종의 분획(fraction)을 수득하였고, 각 분획의 SDS-PAGE 결과는 도 1에 나타내었다.
실시예 2: 효소의 활성 확인
목적 효소의 존재를 확인하기 위해, 각 분획의 설탕 가수분해 활성을 환원당 정량법(DNS 법)으로 확인하였다.
50mM 소듐 아세테이트 버퍼(sodium acetate buffer)에 200mM의 설탕 수용액과 상기 각 분획을 1:1로 혼합한 후, 40℃ 수조(water bath)에서 10분간 반응 시킨 후, 100℃에서 실활시켰다. DNS 시약을 1:3 비율로 첨가하고 혼합하여 100℃에서 5분간 반응시킨 후, 바로 얼음에서 DNS 반응을 중지시켰다. 그 후, DNS 시약의 흡광도(OD)를 575nm에서 측정한 후, 작성한 과당 표준 곡선식에 대입하여 활성을 확인하였다. 이때, 1Unit의 정의는 1분당 1μmole의 과당을 증가시키는 효소의 양(mL)을 나타낸다.
그 결과, 2번 분획(Fraction No.2)의 75kDa 단백질이 설탕을 가수분해하는 활성이 있음을 확인하였다.
실시예 3: 효소의 동정
LC-MS로 상기 75kDa 단백질을 동정하였다.
실시예 3-1: 시료 전처리 (In gel trypsin digestion)
질량분석기(MS)를 이용한 단백질 동정을 위해서는 분석하고자 하는 단백질을 펩타이드로 절편화할 필요가 있다.
이에, 도 1의 fraction #2의 75kDa 겔을 잘라낸 후, In-gel piece 시료에 50% CH3CN(H2O) 용매를 넣은 후, 15분간 반응시켜 탈색하였다. 이 후, 50mM ABC(ammonium bicarbonate, SIGMA) 버퍼에 녹인 1M DTT(Dithiothreitol, GE)를 2㎕ 첨가하고 상온에서 1시간 보관하였다. 그 후, 50mM ABC(ammonium bicarbonate, SIGMA) 버퍼에 녹인 1M IAA(iodoacetamide, SIGMA)를 4㎕ 첨가하고 빛이 차단된 상온에서 1시간 보관하였다. 탈색된 In-gel piece 시료에 1㎍의 트립신(trypsin) 용액(Sequencing-grade modified porcine trypsin, Thermofisher, Madison, WI, USA)을 넣고 37℃에서 16시간 반응시켰다. 50% CH3CN(H2O) 용매 200㎕를 첨가하여 gel 탈수반응을 통해 가수분해된 펩타이드를 회수하였고, 이를 회전건조기(SpeedDry Vacuum Concentrator)를 이용하여 건조시켰다. 염과 기타 불순물 제거를 위해 C18 Ziptip(Millipore)를 이용하여 제염(desalting)하였다.
실시예 3-2: 액체 크로마토그래피- 질량분석(LC-MS)
액체 크로마토그래피 질량 분석은 Ultimate 3000 RS UHPLC, Q-Exactive Orbitrap (Thermo Scientific) 질량 분석기로 수행하였고, 분석 조건은 다음과 같다.
(1) 크로마토그래피: Thermo (Dionex) UHPLC Ultimate 3000
(2) 컬럼: Acclaim prepMapTM RSLC 50㎛ X 15㎝, nanoviper C18, 2㎛, 100A
(3) 용매: A=증류수(0.1 % 포름산 포함), B=아세토니트릴(0.1 % 포름산 포함)
(4) 용출 조건
시간(분) A (%) B (%)
0 95 5
5 95 5
63 70 30
68 50 50
70 20 80
73 20 80
75 95 5
88 95 5
89 95 5
(5) 유속: 0.2 ㎕/min
(6) 시료 주입: 1 ㎕
이후, de novo peptide sequencing으로 아미노산 서열을 확인하였으며, 이때 분석 프로그램으로 Proteome Discoverer 2.1 (Thermo)을 사용하였다.
이렇게 확인된 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열이다.
실시예 4: 조효소액의 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성 확인
50mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 6% 리바우디오사이드 A(purecircle) 또는 6% 스테비오사이드(carbosynth) 및 6% 백설탕(CJ 제일제당)을 녹인 후, 여기에 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함하는, 락토바실러스 말리 조효소액을 첨가하고 40℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 후, 포도당 전이 리바우디오사이드 A 또는 포도당 전이 스테비오사이드가 생성되었는지 여부를 HPLC로 확인하여 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 한편, HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
이동상 아세토니트릴(30 %): 증류수(70 %)
컬럼 250 X 4.6 mm Capcell pak C18 MG II (Shiseido)
유속 0.6ml/min
온도 30 ℃
주입량 20㎕
검출기 DAD (210nm)
도 2 및 도 4는 효소반응 전의 HPLC 분석결과이고, 도 3 및 도 5는 효소반응 후의 HPLC 분석결과이다.
도 2 및 도 3을 비교하면, 상기 효소반응에 의해 리바우디오사이드 A가 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90%로 확인된다.
또한, 도 4 및 도 5를 비교하면, 상기 효소반응에 의해 스테비오사이드가 포도당 전이 스테비오사이드(Stevidoside-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90%로 확인된다.
한편, 상기 포도당 전이 스테비오사이드(Stevidoside-G1) 및 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)는 각각 스테비오사이드 및 리바우디오사이드 A의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 1개 전이된 것임을 NMR을 통해 확인하였다.
실시예 5. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성 확인
상기 실시예 3에서 확인된, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 활성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 효소가 스테비올 배당체에 포도당을 전이시키는 활성이 있는지 확인하였다.
실시예 5-1: 효소를 포함하는 미생물의 제조 및 효소 정제
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 합성 방법(㈜ 바이오니아)으로 제작하였으며, 획득한 폴리뉴클레오티드를 pBT7-N-His 벡터에 삽입한 후, 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환된 대장균은 암피실린(Ampicillin)이 포함된 평판배지에 도말하여 재조합 균주(미생물)를 획득하였다.
한편, 상기 미생물을 2019년 6월 11일 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12561P로 기탁하였다.
재조합 대장균 균주를 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지 5ml에 접종하고 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃에서 종균 배양을 실시하였다. 종균 배양된 배양액을 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지 500ml에 첨가하여 본 배양을 실시하였다. 이후, 600nm에서의 흡광도가 0.4일 때, 0.1mM IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소의 대량발현을 유도하였다. 상기 과정 중의 교반 속도는 180rpm, 배양온도는 37℃가 유지되도록 하고, IPTG 첨가 후에는 교반속도는 120rpm, 배양온도는 16℃로 배양하였다.
상기 배양액을 10000ｘg로 4℃에서 20분간 원심분리하여 세포 펠릿(cell pellet)을 수득하고, 상기 펠릿에 50mM 트리스 염산 완충용액을 첨가하여 세포 용액으로 재현탁시켰다. 상기 세포 용액을 초음파 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 다시 13000ｘg로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 이후, Ni-NTA superflow 컬럼을 사용하여 상기 효소를 정제하였다.
실시예 5-2: 효소의 활성 확인
50mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 5.0)에 6% 리바우디오사이드 A(purecircle) 및 6% 백설탕(CJ 제일제당)을 녹인 후, 여기에 상기 실시예 5-1에서 수득한 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 첨가하고 40℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 그 후, 포도당 전이 리바우디오사이드 A가 생성되었는지 여부를 HPLC로 확인하여 그 결과를 도 6 내지 도 7에 나타내었다.
도 6 은 효소반응 전의 HPLC 분석결과이고, 도 7 은 효소반응 후의 HPLC 분석결과이다.
도 6 및 도 7을 비교하면, 상기 효소반응에 의해 리바우디오사이드 A가 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)로 전환된 것을 알 수 있다. 이때, 전환율은 약 90%로 확인된다.
한편, 상기 포도당 전이 리바우디오사이드 A(Rebaudioside A-G1)는 리바우디오사이드 A의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 1개 전이된 것임을 NMR을 통해 확인하였다.
즉, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 효소는 실시예 4의 락토바실러스 말리 조효소액과 동일한 활성이 있음을 확인하였다.
실시예 6: 포도당 전이 스테비올 배당체의 용해도 평가
스테비올 배당체 및 포도당 전이 스테비올 배당체의 용해도를 측정하였다.
구체적으로, 리바우디오사이드 A(RA), 스테비오사이드(STV), 실시예 4의 포도당 전이 리바우디오사이드 A(RA-Glu), 실시예 4의 포도당 전이 스테비오사이드(STV-Glu) 각각의 용해도를 측정하였다.
리바우디오사이드 A, 스테비오사이드, 포도당 전이 리바우디오사이드 A, 포도당 전이 스테비오사이드 각각 6g을 10ml에 혼합한 다음 50℃에서 60분간 sonication을 통해 용해하였다. 이를 5, 15, 25, 35, 45, 또는 55℃ 수조(water bath)에서 1주일 동안 인큐베이션(incubation)한다. 그 후, 용액을 12000rpm, 10분간 원심분리하고 상층액 1ml을 취하여 105℃ 오븐(oven)에서 건조시켜, 용해도를 측정하여 표 4에 나타내었다.
온도 (℃) 용해도 (%)
STV RA STV-Glu RA-Glu
5 6.3 1.1 40↑ 40↑
15 6.2 0.6 40↑ 40↑
25 5.3 0.3 40↑ 40↑
35 9.2 0.5 40↑ 40↑
45 13.7 1.1 40↑ 40↑
55 39.7 1.6 40↑ 40↑
표 4의 결과에 의하면, 포도당 전이 스테비오사이드 및 포도당 전이 리바우디오사이드 A는 스테비오사이드, 리바우디오사이드 A에 비하여 현저하게 용해도가 증가한 것을 알 수 있다.
실시예 7: α-(1,6)포도당 전이 리바우디오사이드 A의 감미도 및 감미질 평가
종래 물질로 알려진 α-(1,4) 포도당 전이 리바우디오사이드 A와 상기 실시예 4의 α-(1,6) 포도당 전이 리바우디오사이드 A를 각각 물에 용해 시킨 후, 패널들에게 제공하여 이들의 실측 감미도와 감미질을 평가하였다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
시료 실측감미도 감미질 평가
α-(1,4) 포도당 전이 리바우디오사이드 A 19 단맛보다 쓴맛이 강하며 후미의 물엿과 같은 느끼한 단맛이 있음. 이취는 α-(1,6) 포도당 전이 리바우디오사이드 A보다 약하나 이미가 강함.
α-(1,6) 포도당 전이 리바우디오사이드 A 26 초미에 단맛이 느껴지며, 쓴맛이 있는 편이나　맛은 깔끔한 편임. 이취(알코올취 등)가 있음.
표 5를 보면, α-(1,6) 포도당 전이 리바우디오사이드 A는 α-(1,4) 포도당 전이 리바우디오사이드 A와 비교하여 감미도가 높으며, 감미질 평가에서 우위임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2020007396-appb-I000001

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 생산용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스테비올 배당체 및 포도당 공여체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 포도당 공여체는 포도당의 올리고머, 포도당의 중합체 또는 이의 사이클릭 형태인 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3개 부가된 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 조성물.
  8. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물을 스테비올 배당체와 접촉하는 단계를 포함하는, 포도당 전이 스테비올 배당체 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 포도당 전이 효소, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물 존재 하에 포도당 공여체와 스테비올 배당체를 반응시키는 단계를 포함하는, 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 pH 1 내지 10에서 수행되는 것인, 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 반응시키는 단계는 1 내지 80℃에서 수행되는 것인, 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 α-(1,6) 결합으로 부가된 것인, 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체의 19-OH 위치에 결합된 포도당에 α-(1,6) 결합으로 포도당이 부가된 것인, 제조방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 포도당 전이 스테비올 배당체는 스테비올 배당체에 포도당이 1 내지 3개 부가된 것인, 제조방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드, 루부소사이드, 둘코사이드 A, 리바우디오사이드 A, 리바우디오사이드 C, 리바우디오사이드 D, 리바우디오사이드 E, 리바우디오사이드 F 및 리바우디오사이드 M으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 제조방법.
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