KR101559478B1

KR101559478B1 - 효소전환법을 이용한 천연 고감미료의 제조방법

Info

Publication number: KR101559478B1
Application number: KR1020130072485A
Authority: KR
Inventors: 김중수; 김영민; 김차영; 이상준; 우미희; 이우송
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-10-13
Also published as: KR20150000258A

Abstract

본 발명은 스테비아 추출물에 다량 함유된 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 말토덱스트린(maltodextrin),UMP, ATP, 스테비오사이드, 인산화합물, 말토덱스트린 포스포릴레이즈, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈, 무기 피로포스파타아제, 아세테이트 키나아제, 유리딜레이트 카이네이즈 및 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응액을 반응시켜 레바우디오사이드 A를 생성시키는 것을 특징으로 하는 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.
발명에 따르면, 고가의 UDP 글루코오스를 사용하지 않고, 경제적으로 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조할 수 있어, 스테비아 감미료 생산 단가를 낮출 수 있다.

Description

효소전환법을 이용한 천연 고감미료의 제조방법{Method for Preparing Natural High Intensity Sweetener Rebaudiside A by Using Enzymatic Conversion}

본 발명은 스테비아 추출물에 다량 함유된 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 말토덱스트린(maltodextrin),UMP, ATP, 스테비오사이드, 인산화합물, 말토덱스트린 포스포릴레이즈, 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈, 무기 피로포스파타아제, 아세테이트 키나아제, 유리딜레이트 카이네이즈 및 UDP-글리코실트랜스퍼라제를 포함하는 반응액을 반응시켜 레바우디오사이드 A를 생성시키는 것을 특징으로 하는 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조하는 방법에 관한 것이다.

설탕(자당)은 가장 많이 알려지고 범용하게 사용되고 있는 감미료로서, 인스탄트 커피를 비롯한 커피 음료, 쥬스류나 탄산 음료 등의 청량 음료수에 다량으로 사용되고 있다. 그러나 웰빙을 추구하는 사회적 기류에 따라 비만 당뇨등 성인병과 충치의 원인이 되는 설탕을 줄이거나 설탕을 대신할 수 있는 고감미도의 감미료를 사용하는 경향이 증가하고 있으나, 사카린, 아프파르탐과 같은 인공감미료는 독성, 알러지 유발 등의 유해성과 안정성의 문제로 인하여 사용이 점차 규제되는 추세에 있어 새로운 기능성 당전이 당질 소재에 대한 필요성이 대두되고 있다.

스테비아 감미료는 남미 파라과이를 원산지로 하는 국화과의 다년생식물인 스테비아에서 추출한 고감미 물질이다. 스테비아 감미료의 세계적인 소비처는 한국이 약 30%, 일본 27%, 중국이 30% 나머지 13%가 기타 나라로 되어있다. 그리고 한국에서 식품으로서의 소비 형태는 거의 효소를 이용하여 포도당을 부가해 감미질을 개량한 제품, 즉, 효소처리 스테비아(식품첨가물 공전상의 공식명칭) 제품이 전체의 약 80% 이상을 차지하고 있다. 스테비아 감미료 중에서 효소처리 스테비아가 가지는 장점은 ① 감미질이 설탕에 가깝고, 쓴 맛이 없으며, 감미도가 설탕의 100∼250배로 높으나 실질적으로 무칼로리이다. ② 열과 산에 안정하여 가공, 보존중의 감미 변화가 적다. ③ 미생물의 영양원이 되기 어렵고, 구강에서는 실질적으로 비우식성이다. ④ 메일라드 반응을 일으키지 않고, 식품가공으로 갈변되기 어렵다. ⑤ 젓갈의 맛을 완화시킨다. ⑥ 산미를 완화시킨다. ⑦ 빙점 강하가 작다. ⑧ 침투압을 올리지 않는다. ⑨ 다른 감미료와의 상승효과가 있어서 감미 코스트의 저감에 유효하다. ⑩ 산뜻한 감미질이며 당질 감미료의 걸죽한 맛을 완화한다는 것이다. 그러나 상기와 같은 장점과 스테비아 잎 추출물에서의 정제공정 및 효소반응에 의한 감미질 보완에도 불구하고 효소처리 스테비아는 타 당질감미료(설탕, 과당 등)와 비교하여 감미의 상승이 느리고, 뒷맛(後味)의 감미가 비교적 오래 남아, 이른바 감미의 마무리가 나쁘다는 특징이 있다. 또 상기 스테비아 감미료에 다량 포함되는 스테비오사이드에는 감미와는 별도로 뒷맛에 독특한 떫은맛이나 쓴맛을 수반하므로, 커피 음료, 청량 음료수, 알콜 음료에 이용하면 명확히 위화감을 주는 단점이 있다 (대한민국 등록특허 제0,888,694호).

스테비아의 감미성분 중 미질이 설탕에 가깝고 감미도가 높은 성분은 레바우디오사이드 A (rebaudioside A)이다. 레바우디오사이드 A는 최근에 FDA에 의해서 식품으로의 사용이 허가됨에 따라 코카콜라와 펩시에서 감미료로서 사용이 되고 있다. 스테비아의 추출물 중 레바우디오사이드 A가 차지하는 함량은 30%정도이며, 스테비오사이드가 약 50%를 차지하고 있다 (대한민국 공개특허공보 제2001-0111560호). 따라서 감미가 우수한 레바우디오사이드 A를 고동도로 함유하는 제품의 수요가 증가하고 있으나, 고(高) 레바우디오사이드 A만을 분리할 경우 필연적으로 부산물인 스테비오사이드가 발생할 수 밖에 없는 실정이며, 레바우디오사이드 A 수요가 증가함에 따라 레바우디오사이드 A 보다 감미질이 좋지 않은 스테비오사이드를 처리하는 문제가 제품화에 있어서 과제로 대두되고 있다.

이러한 문제들을 해결하기 위해 많은 업체들이 스테비오사이드를 이용한 감미료 개발을 진행하여 왔다. 이와 관련된 연구는 스테비오사이드를 주성분으로 한 스테비아추출물과 β-1,4-갈락토실 당화합물을 포함하는 수용액상에서 β-1,4-갈락토실 전이효소를 작용시켜 스테비오사이드에 갈락토실기를 주성분으로 하는 제조방법 (일본특허공개 제58-94367호), 스테비오사이드와 설탕을 포함하는 수용액상에서 덱스트란수크라아제를 작용시켜 스테비오사이드 올리고 배당체를 합성하는 방법(한국 등록특허10-1199821호), 레바우디오사이드 A의 생산공정에서 나오는 부산물인 스테비오사이드 함유 스테비올을 효소전환법(-1,3-글루카나제)으로 레바우디오사이드 A로 전환하는 방법(한국 공개특허 제 10-2011-0115699호), 스테비오사이드의 미질 개선방법으로 물과 소수성 유기용매를 혼합한 반응계에서 스테비오사이드를 효소반응에 의하여 당전이 스테비오사이드로 전환하여 스테비오사이드의 미질을 개선하는 방법(한국등록특허 특1994-528호), 스테비오사이드와 레바우디오사이드 A 혼합물로부터 스테비오사이드와 레바우디오사이드 A의 알코올과 물에 대한 용해도 차이를 이용하여 각각을 결정형으로 분리하는 방법(일본공개특허 제56-121453호, 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0102322호), 스테비아 식물에 감마광선을 조사하여 레바우디오사이드 A를 다량 함유케 하는 식물로 유전적 변형을 유발시키는 방법(일본특허공개 제2002-34502호) 등이 개시되어 있다. 또한 감미질이 우수한 특정 성분인 ST-G1, ST-G2를 분리하기 위한 연구로는 스테비아추출물과 α-글루코실당 화합물을 함유한 수용액에 사이클로덱스트린글루카노트랜스페라제(cyclodextrin glucanotransferase, 이하 "CGTase"라 칭함)를 가하여 α-글루코실화 스테비아추출물을 수득하는 단계를 포함하는 고감미당 부가 스테비아감미료의 제조방법(한국공개특허 제1992-252호), 스테비아추출물에 CGTase와 β-아밀라아제를 처리한 미질이 좋은 고감미당 부가 스테비아 감미료 및 제조방법(일본특허등록 제2798433호) 등이 있으나, 이들 고감미당부가 스테비아 감미료의 제조방법의 경우 총 스테비올 배당체 함량에 대해 고감미질 성분인 ST-G1, ST-G2, RA-G1, RA-G2 총 함량이 40~60% 정도 수준으로 낮아서 만족할 만한 감미질을 발휘하지 못하게 되어 결과적으로 상기 방법들로부터 얻은 효소처리 스테비아가 여전히 쓴맛 또는 불쾌감을 가지고 있어, 커피나 음료에 사용하는데 어려운 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 스테비아 추출물에서 스테비오사이드를 저감하는 효율적인 처리법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 스테비아추출물에 포함된 스테비오사이드를 효소처리를 통하여 경제적으로 레바우디오사이드 A로 전환시킬 수 있는 공정을 개발하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A로 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 UDP-글리코실트랜스퍼라제의 존재 하에 스테비오사이드(stevioside) 및 UDP-glucose로부터 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법에 있어서,

말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase)로 구성된 효소와 아세틸포스페이트(acetylphosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), UMP 및 ATP로 구성된 기질을 첨가하여 UDP-glucose를 재생하는 것을 특징으로 하는 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법을 제공한다.

발명에 따르면, 고가의 UDP 글루코오스를 사용하지 않고, 경제적으로 스테비오사이드로부터 레바우디오사이드 A를 제조할 수 있어, 스테비아 감미료 생산 단가를 낮출 수 있다.

도 1은 Stevioside 로부터 Rebaudioside A를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 스테비아 유래 UDP-glucosyltransferase의 정제결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 3은 효소반응에 의해 생성된 Rebaudioside A를 HPLC로 확인한 것이다.
도 4는 UDP-glucosyltransferase 활성의 온도에 대한 영향 (A)과 pH에 대한 영향 (B)을 나타낸 것이다.
도 5는 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 유전자들의 발현을 SDS-PAGE로 확인한 것이다(1 : total protein without induction, 2 : total protein with induction, 3 : souble protein, 4 : purified protein)
도 6은 표준물질 UDP-glucose (A)와 반응액 (B)의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 효소 양에 따른 UDP-Glucose 생성량(A)과 rebaudiosideA 생성의 상대적 활성(B)을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 효소를 이용한 반응액의 반응시간에 따른 stevioside와 rebaudiosideA의 농도를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 UDP-글리코실트랜스퍼라제의 존재 하에 스테비오사이드(stevioside) 및 UDP-glucose로부터 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법에 있어서,

말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase)로 구성된 효소와 아세틸포스페이트(acetylphosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), UMP 및 ATP로 구성된 기질을 첨가하여 UDP-glucose를 재생하는 것을 특징으로 하는 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법에 관한 것이다.

스테비아 추출물에 포함된 스테비오사이드를 효소처리를 통하여 고감미를 가지는 레바우디오사이드 A로 전환시키는 반응을 도 1에 나타내었다.

그러나, 기존의 효소처리를 통한 전환반응에서는 당 공여체로서 고가의 UDP-glucose 를 사용하게 되어, 산업적으로 이용하는데 있어 경제력이 떨어졌다.

이러한 단점을 보완하기 위하여 본 발명에서는 저가의 maltodextrin, UTP, phosphate를 이용하여 UDP-glucose를 합성하는 시스템을 도입하였다. 상기 UDP-glucose 합성 시스템에는 maltodextrin phosphorylase, glucose-1-phophate thymidylytrasferase, inorganic pyrophosphatase, acetate kinase 및 uridylate kinase의 여러 효소들이 관여하므로(도 1), 본 발명에서는 이들 효소를 클로닝하여 형질전환제를 구축하고 발현시킨 후, 상기 효소들을 정제하여 UDP-glucose 합성에 적용하였다.

본 발명의 일양태에서는 스테비오사이드를 레바우디오사이드 A로 전환하는 효소로 Stevia rebaudiana 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UDP-glycosyltransferase)를 사용하였으며, UDP-글리코실트랜스퍼라제(UDP-glycosyltransferase)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 제작하고 이를 대장균 BL21에 클로닝하여, 효소를 대량발현시킨 후, 정제하여 사용하였다.

따라서, 본 발명의 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UDP-glycosyltransferase)는 Stevia rebaudiana 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼레라제(UDP-glycosyltransferase)는 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는 상기 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase) 으로 구성된 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자로 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래의 유전자를 사용하여, 상기 각각의 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 제작하고 이를 대장균 BL21에 클로닝하여, 효소를 대량발현시킨 후, 정제하여 사용하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase) 는 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 반응조건은 5% maltodextrin, 2 mM UMP, 2 mM ATP, 1 mM MgCl₂, 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 0.1 mg/ml Stevioside, 2 mM acetyl phosphate에 malP 80 mU, galU 100 mU, ppa 50 mU, UGT76G1 100 mU, ackA 50 mU, pyrH 100 ㎍을 넣고 총 1ml 이 되도록 한 후 30℃에서 8시간 반응시킨 결과, 90% 이상의 수율로 레바우디오사이드 A가 생성되는 것을 확인하였다(도 8).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Stevia rebaudiana 유래의 UDP - glycosyltransferase 형질전환제 구축 및 발현

Stevia rebaudiana 유래의 UDP-glycosyltransferase (accession number; AY345974) (UGT76G1)를 pET41a 벡터(novagen, 미국)의 NcoI/BamHI 사이트에 클로닝함으로써 pET41a/UGT76G1 재조합 플라스미드를 구축하였다. 효소 활성을 측정하기 위하여 재조합 플라스미드를 E. coli BL21에 도입하여 형질전환체를 구축하였다.

형질전환체를 50 ㎍/㎖ kanamycin이 첨가된 LB 액체배지에 37℃에서 OD₆₀₀의 값이 0.5가 될 때까지 진탕배양하여 0.1 mM의 IPTG를 첨가하고 25℃에서 12시간 동안 180rpm으로 진탕 배양함으로써 효소의 과발현을 유도하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1 mM PMSF, 1x protease inhibitor cocktail 이 첨가된 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)를 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 회수한 상등액을 반응에 사용하였다. Hisp-tag을 이용한 정제를 위해 상등액을 Ni-NTA agarose 담체를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 효소의 용출시 250 mM imidazole, 300 mM NaCl, 20 mM Tris-Cl (pH 8.0)을 포함하는 용출액으로 효소활성 분획을 취하여 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다(도 2). 정제된 효소는 Amicon Ultra-15 (Millipore, 5K NMWL device)으로 농축 및 염을 제거하였다.

UGT76G1의 활성을 측정하기 위하여 stevioside를 기질로 하여 반응시켰다. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM UDP-glucose, 1 mM MgCl₂, 1 mg/ml Stevioside, 효소 상등액 100 ㎍을 합하여 최종 1 ml이 되도록 하여 30에서 1시간 반응시켰다. 반응물은 ZORBAX NH₂ (4.6 x 250 5μm, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이동상으로는 30% 물과 70% acetonitrile을 유속 1㎖/min로 흘려주고, 컬럼 온도 30℃의 조건에서 분석하였으며 210nm에서 흡광도를 측정하였으며, 효소반응을 통해 stevioside로부터 rebaudioside A가 생성된 것을 확인할 수 있었다(도 3).

효소의 유닛(U)은 단위시간 당 (1min) 1 μmol의 rebaudioside A를 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다.

UGT76G1의 정제단계에 따른 활성 및 회수율

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purification (Fold)	Yield (%)
Crude extract	3	4.48	3.17	0.71	1.0	100
Ni-NTA affinity chromatography	0.5	0.61	0.54	0.89	1.26	17.03

실시예 2: Stevia rebaudiana 유래의 UDP - glycosyltransferase 의 특성 조사

실시예 1에서 분리 정제한 UGT76G1 효소의 Stevioside를 기질로한 최적반응조건을 알아보기 위해 반응온도, 반응 pH에 대한 조사를 하였다.

과발현 후 파쇄한 효소를 사용하여 20 ~ 80℃에서 10℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였으며, 37℃가 반응 최적온도인 것을 알 수 있었다(도 3의 A). 또한 재조합 효소의 최적 pH를 조사하기 위해 50 mM　Citrate-NaOH 버퍼 (pH 3.0-6.0), 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 5.0-8.5), 50 mM Sodium phosphate 버퍼 (pH 5.0-8.0), 50 mM Glycine-NaOH 버퍼 (pH 8.0-11.0)의 완충용액을 사용하였다. 각 완충용엑에서 반응시킨 후 상대적인 활성을 조사한 결과 50mM Sodium phosphate 버퍼 pH 7.5에서 최대 활성을 나타내었다(도 4의 B).

실시예 3: UDP - glucose regeneration system 에 관여하는 Escherichia coli K-12 subst . MG1655 균주 유래 효소들의 특성 조사

경제적인 공정을 위하여 UDP-glucose를 생산하는 시스템을 적용하는데 필요한 효소들은 Escherichia coli K-12 substr. MG1655로부터 PCR을 이용하여 증폭한 후 발현 벡터에 클로닝하였다. 그리하여 maltodextrin phosphorylase (accession NO. EG10560)의 활성을 가진 pET41a/malP, glucose-1-phophate thymidylytrasferase (accession NO. EG11319) 활성을 가진 pET302/galU, inorganic pyrophosphatase (accession NO. EG10755) 활성을 가진 pET302/ppa, acetate kinase (accession NO. EG10027) 활성을 가진 pET302/ackA, uridylate kinase (accession NO. EG11539) 활성을 가진 pET302/pyrH 재조합 플라스미드를 각각 구축하였다.

상기 재조합 플라스미드들을 대장균 [BL21(DE3)]에 도입하여 형질전환체를 구축하였다. 항생제가 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 1시간 30분 동안 진탕 배양하여, 600nm에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.5 mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 효소의 과발현을 유도하여 20℃에서 16시간 동안 180rpm으로 진탕 배양하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 0.85% NaCl로 두 번 세척하였다. 회수된 균체에 1 mM PMSF, 1x protease inhibitor cocktail 이 첨가된 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)를 가하여 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 효소 상등액의 발현유무를 SDS-PAGE를 통해 확인한 후(도 5), 효소반응 실험에 사용하였다.

상기 정제한 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 효소들(maltodextrin phosphorylase, glucose-1-phophate thymidylytrasferase, inorganic pyrophosphatase, acetate kinase 및 uridylate kinase)의 각각의 활성을 알아보기 위해 다음과 같은 표준반응실험을 하였다.

(ⅰ) malP : malP 의 활성은 maltodextrin을 기질로 하여 반응시켜 생성된 UDP-glucose 양으로 나타낼 수 있다. 반응조건은 100 mM phosphate (pH 7.5), 5% maltodextrin, 5 mM MgCl₂, 5 mM UTP, 0.25 U galU, 1 U ppa를 넣고 1㎎의 malP protein 을 넣어 최종 1 ml이 되도록 한 후 30℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 생성물인 UDP-glucose는 NH₂ column (5um, 4.6x250mm, aglient사) 이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다. 이동상으로는 67 mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄ (pH 5.3)를 1.5 ml/min의 속도로 흘려주면서 260nm에서 측정하였다. 효소의 유닛은 1분당 1 μmol의 기질을 변화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다(표 2).

Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 malP의 정제단계에 따른 활성 및 회수율

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purification (Fold)	Yield (%)
Crude extract	1	8.04	2.17	0.27	1.0	100
Ni-NTA affinity chromatography	0.1	0.64	0.29	0.46	1.70	13.56

(ⅱ) galU : galU의 표준반응액은 50 mM phosphate (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 5 mM glucose-1-phosphate, 2 mM UTP, 1 ㎎의 galU protein 을 넣어 최종 1 ml이 되도록 한 후 30℃에서 1분간 반응시켰다. 생성물인 UDP-glucose는 NH₂ column 이 장착된 HPLC를 이용하여 분석하였다 (표 3).

Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 galU의 정제단계에 따른 활성 및 회수율

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purification (Fold)	Yield (%)
Crude extract	1	10.19	68.27	6.70	1.0	100
Ni-NTA affinity chromatography	0.1	2.80	27.38	9.77	1.46	40.10

(ⅲ) ppa : ppa의 표준반응액은 50 mM Tris-HCl (pH ７.5), 5 mM MgCl₂, 10 mM Na₄P₂O₇, 1 mg 의 ppa protein 을 넣어 최종 1 ml이 되도록 한 후 30℃에서 1분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응액 중 20 ㎕를 500 ㎕의 phosphorus-determining reagent solution(17% H₂SO₄ : 2.5% Na₂MoO₄-(NH₄)₂SO₄ : 10% L-ascortbic acid : H2O = 1:1:1:2)에 넣고 480 ㎕ H₂O를 넣어 45℃에서 10분간 반응시켰다. 생성물은 660nm에서의 흡광도로 확인하였다(표 4).

Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 ppa의 정제단계에 따른 활성 및 회수율

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purification (Fold)	Yield (%)
Crude extract	1	14.02	56.08	4.00	1.0	100
Ni-NTA affinity chromatography	0.1	4.91	28.53	5.81	1.45	50.87

(ⅳ) ackA : 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 10mM ATP, 800 mM potassium acetate, 700 mM neutralized hydroxylamine 1 ㎎의 ackA protein 을 넣어 최종 1 ml이 되도록 한 후 30℃에서 5분간 반응시켰다. 반응종료 후에는 10% trichloroacetic acid 1 ml과 1 N HCl에 녹인 1.25% FeCl₃ 1 ml을 넣어준 후 30℃에서 5분간 반응시킨다. 540nm의 흡광도에서 hydroxamate acetate생성을 측정하였다 (표 5).

Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 ackA의 정제단계에 따른 활성 및 회수율

	Total vol. (ml)	Total protein (mg)	Total activity (U)	Specific activity (U/mg)	Purification (Fold)	Yield (%)
Crude extract	1	12.35	1808.66	146.45	1.0	100
Ni-NTA affinity chromatography	0.1	3.89	869.61	223.55	1.53

실시예 4: UDP - glucose 의 생합성

실시예 3에서 제조한 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래 효소들을 Maltodextrin, UTP와 반응시켜 UDP-glucose의 생산여부를 확인하였다. 실험방법은 5% maltodextrin, 2mM UMP, 2 mM ATP, 5 mM acetyl phosphate, 1 mM MgCl₂, 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)에 malP 효소액 10ug, galU 50ug, ppa 15ug, pyrH 50 ug을 넣고 총 1ml이 되도록 한 후 30℃에서 6시간 반응시켰다. 반응생성물의 분석은 NH₂ column (5um, 4.6x250mm, aglient사) 을 이용하여 67mM Na₂HPO₄-KH₂PO₄ (pH 5.3)를 30℃에서 1.5ml/min의 속도로 흘려주고 260nm에서 측정한다. 그 결과 99.9%의 수율로 UDP-glucose를 얻을 수 있었다 (도 6).

실시예 5: UDP - glucose regeneration system 을 이용한 Stevioside 당전이 반응

UDP-glucose regeneration system의 효율적인 작용을 위하여 각각의 효소들의 최적 반응 유닛(U)을 구하는 실험을 하였다. 실험방법은 5% maltodextrin, 2 mM UMP, 2 mM ATP, 1 mM MgCl₂, 0.1 mg/ml Stevioside, 5 mM acetyl phosphate, 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5)에 malP, galU, ppa, ackA, pyrH, UGT76G1 효소의 양을 달리하여 넣고 총 1 ml이 되도록 한 후 30에서 3시간 반응시켰다. 반응물은 ZORBAX NH₂ (4.6x250 5um, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이동상으로는 30% 물과 70% acetonitrile을 유속 1 /min 로 흘려주고, 칼럼온도 30의 조건에서 분석하였으며 210nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 malP, galU, ppa의 경우 UDP-glucose를 생성함에 있어 가장 효율적인 효소의 최적 반응 유닛(U)으로 malP 80 mU, galU 100 mU, ppa 50 mU로 정하였고, ackA와 pyrH의 경우 rebaudiosideA를 생성함에 있어 상대적인 활성을 측정하였을 때 가장 효율적인 효소의 최적 반응 유닛(U)으로 ackA 50 mU, pyrH 100 으로 정하였다(도 7).

구축한 UDP-glucose regeneration system을 stevioside 당전이 반응에 도입하였을 때 rebaudioside A를 생성하는지 알아보았다. 반응조건은 5% maltodextrin, 2 mM UMP, 2 mM ATP, 1 mM MgCl₂, 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), 0.1 mg/ml Stevioside, 2 mM acetyl phosphate에 malP 80 mU, galU 100 mU, ppa 50 mU, UGT76G1 100 mU, ackA 50 mU, pyrH 100 ㎍을 넣고 총 1ml 이 되도록 한 후 30℃에서 반응시켰다. 반응물의 분석은 ZORBAX NH₂ (4.6 x 250 5um, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이동상으로는 30% 물과 70% acetonitrile을 유속 1㎖/min 로 흘려주고, column 온도 30℃의 조건에서 분석하였으며 210nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 8시간이면 90% 이상의 수율로 rebaudioside A가 생성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시의 일예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for Preparing Natural High Intensity Sweetener Rebaudiside A by Using Enzymatic Conversion <130> p13-b139 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Stevia rebaudiana UDP glycosyltransferase <400> 1 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455

Claims

UDP-글리코실트랜스퍼라제의 존재하에 스테비오사이드(stevioside) 및 UDP-glucose로부터 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법에 있어서,
말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase)로 구성된 효소와 아세틸포스페이트(acetylphosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), UMP 및 ATP로 구성된 기질을 첨가하여 UDP-glucose를 재생하는 것을 특징으로 하는 레바우디오사이드 A(rebaoudioside A)를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, UDP-글리코실트랜스퍼라제(UDP-glycosyltransferase)는 Stevia rebaudiana 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼라제 (UDP-glycosyltransferase E)는 서열번호 1의 염기서열에 의해 코딩되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 말토덱스트린 포스포릴레이즈(maltodextrin phosphorylase), 글루코오스-1-포스페이트 티미딜트랜스퍼레이즈(glucose-1-phophate thymidylytrasferase), 무기 피로포스파타아제(inorganic pyrophosphatase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase) 및 유리딜레이트 카이네이즈(uridylate kinase) 는 Escherichia coli K-12 substr. MG1655 유래인 것을 특징으로 하는 방법.