WO2022139522A1 - 당전이 효소 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 제조방법 - Google Patents

당전이 효소 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 제조방법 Download PDF

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고혁진
문준호
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Definitions

  • An example of the present invention is a glycosyltransferase protein for transferring glucose to the steviol glycoside, a recombinant microorganism expressing the enzyme protein, the cells of the microorganism, the cell lysate of the microorganism, the culture of the microorganism, and extracts thereof It relates to a composition for the production of steviol glycosides comprising at least one selected from the group consisting of.
  • the enzyme protein according to the present invention does not produce as a by-product or produces a very small amount of a compound having a peak corresponding to an elution time of 14.5 to 15.5 minutes in the HPLC analysis graph. Accordingly, the enzyme protein according to the present invention has a higher conversion rate of Reb D/E than EUGT11 in a mixed substrate containing Reb A and stevioside, and further, has a characteristic that increases as the enzyme reaction time elapses.
  • An example of the present invention is a glycosyltransferase protein for transferring glucose to the steviol glycoside, a recombinant microorganism expressing the enzyme protein, the cells of the microorganism, the cell lysate of the microorganism, the culture of the microorganism, and extracts thereof It relates to a composition for the production of steviol glycosides comprising at least one selected from the group consisting of.
  • the composition for producing steviol glycoside may further include a substrate comprising at least one selected from the group consisting of stevioside and Reb A, for example, stevioside or Reb A alone substrate, or a substrate thereof It may be a mixed substrate.
  • the mixed substrate may be a mixture of stevioside or Reb A, or a stevia extract containing stevioside or Reb A.
  • reaction temperature and reaction pH conditions using the UDP-glucosyltransferase or the enzyme-producing microorganism are as described above in the reaction temperature and reaction pH conditions of the enzyme. It's like a bar.
  • An example of the present invention from the group consisting of the UDP-glucosyltransferase enzyme protein according to the present invention, a recombinant microorganism expressing the enzyme protein, the cells of the microorganism, the lysate of the microorganism, the culture of the microorganism and extracts thereof
  • One or more steviol glycosides selected from the group consisting of Reb D and Reb E comprising reacting at least one selected from the group consisting of stevioside and at least one substrate selected from the group consisting of Reb A in the presence of a glucose donor It relates to a manufacturing method.
  • the second UDP-glucosyltransferase enzyme protein used in the preparation step of Reb M may include UGT76G1.
  • the method of the present invention can be economically used by the food and beverage industry because it can significantly shorten the production cycle, improve the production capacity and provide a lower cost and higher purity product.
  • FIG 3 is a graph showing the HPLC analysis of the reaction product after 20 hours of reaction from a mixed substrate using a glycosacin enzyme according to an example of the present invention.
  • Nucleic acid sequence (5'->3') SEQ ID NO: Forward primer of CYC1 terminator TGATTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTC 7 Reverse primer of the GAL10 promoter catCAATTCttactttttttttggatgg 8 Forward primer of TaUGT linking with the GAL10 promoter catccaaaaaaaagtaaGAATTGATGGACGACGGGTCTTCTAG 9 Reverse primer of TaUGT linked to CYC1 terminator CTAATTACATGATATCGACAATCATTCTTTATAGGACCTTAGCTGttg 10 Forward primer of EUGT11 linking with the GAL10 promoter catccaaaaaaaagtaGAATTGATGGACTCCGGCTACAGTTC 11 Reverse primer of EUGT11 linking with CYC1 terminator CTAATTACATGATATCGACAATTAGTCCTTATAAGAACGTAGCTG 12 Forward primer for HvUGT linking with the GAL10 promoter catccaaaaaaaaa
  • Plasmid-transformed yeast prepared in Example 1 was selected in SC (synthetic complete) medium using URA-drop out mix, and the selected yeast was induced to express the enzyme through liquid culture.
  • colonies selected in SC-Ura solid medium were inoculated into a test tube containing 3 mL SC-Ura liquid medium and cultured overnight.
  • the concentration of the cultured cells was checked by measuring the absorbance of OD 600 , and inoculated so that the absorbance of OD 600 was finally 0.1 (final) in a 250 mL flask containing 25 mL of SC-Ura liquid medium and cultured for 24 hours (30°C, 240 rpm).
  • the same amount of YPG medium was added and the cells were cultured secondarily for 24 hours.
  • the secondary cultured cells were collected by centrifugation (4,000 rpm, 10 min).
  • the conversion rate through the enzymatic reaction showed no activity such as EcUGT and OsiUGT as a result of the initial 3 hour reaction, and TaUGT, an initial putative protein, similarly to EUGT11, reduced Reb A to Reb D conversion by 40-45%. was converted, and it was confirmed that the enzyme had about 30% improvement in activity than HvUGT (30-35% conversion).
  • the order of the conversion rates of the three enzymes showed a similar tendency to the reaction for 3 hours.
  • the result of the enzymatic reaction in FIG. 2 the result of the conversion reaction using RA40 substrate for 5 hours, blue indicates the HPLC chromatogram for the reaction of TaUGT, and in the case of EUGT11, the black indicates the HPLC chromatogram.
  • the RA40 substrate is converted to Reb E and Reb D and no by-products are produced.
  • the HPLC area of by-products corresponding to 15.1 minutes is 16%. Therefore, the overall conversion rate of Reb E and D decreases. This appears to have occurred as a side reaction of the Reb E product.
  • the results of the enzyme reaction in FIG. 3 are the results of the 20-hour conversion reaction using the RA40 substrate.
  • the TaUGT enzyme according to the present invention is superior to HvUGT as it only has a high Reb D conversion rate for Reb A alone substrate, and furthermore, for a mixed substrate containing Reb A and stevioside, the total conversion rate of Reb D/E (%) is not only higher than EUGT11, but also increases as the enzymatic reaction time elapses, so it is very useful because it can produce a high content of Red D/E as a substrate for industrially producing steviol glycosides, for example, Reb M.

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Abstract

본 발명은 당전이 효소 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 생산용 조성물 및제조방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 레바우디오사이드의 당전이 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 및 이들을 이용한 스테비올 배당체인 레바우디오사이드 생산방법에 관한 것이다.

Description

당전이 효소 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 제조방법
본 발명은 당전이 효소 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 생산용 조성물 및제조방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 레바우디오사이드의 당전이 효소, 상기 효소를 발현하는 재조합 균주, 및 이들을 이용한 스테비올 배당체인 레바우디오사이드 생산방법에 관한 것이다.
감미료는 식품, 음료, 또는 과자 산업에서 가장 흔히 이용되는 성분들로 알려져 있다. 감미료는 생산 동안 최종 식품 산물에 통합될 수 있거나 또는 단독 용도로 적절하게 희석시켰을 때, 식탁 감미료 또는 베이킹에서 설탕을 대체하는 가정용 대체물로 이용할 수 있다. 감미료는 예를 들어 수크로오스, 고과당 옥수수 시럽, 당밀, 메이플 시럽, 및 꿀과 같은 천연 감미료들, 그리고 예를 들어 아스파르탐, 사카린 및 수크랄로오스(sucralose)와 같은 인공 감미료를 포함한다.
스테비아(Stevia) 추출물은 다년생 관목, 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출할 수 있는 천연 감미료이다. 다양한 수준으로 정제된 스테비아 추출물은 식품 및 블렌드에서 고감도 조미료 사용되거나 단독으로 식탁 감미료로 시판된다.
스테비아 식물의 추출물들은 레바우디오사이드 및 단맛에 기여하는 기타 스테비올 배당체들을 함유하지만, 기존의 시판 제품들은 주로 레바우디오사이드 A이며, 적은 양의 레바우디오사이드 C, D, 및 F와 같은 기타 글리코사이드들이 있다. 식물에서 추출한 스테비아 추출물은 이취(off-flavors)의 원인이 되는 유도된 화합물과 같은 오염물질을 함유할 수 있다. 이러한 이취는 선택된 식품 시스템 또는 용도에 따라 대체로 문제가 될 수 있다.
그리고, 스테비아 추출물의 조성물은 식물이 성장하는 토양 및 기후에 따라 매우 다양할 수 있다. 원료 식물, 기후 조건, 및 추출 공정에 따라, 상업적 제조 과정에서 레바우디오사이드 A의 양은 총 스테비올 글리코사이드드 함량의 20 내지 97%로 다양하다고 보고된다. 또 다른 스테비올 글리코사이드들이 스테비아 추출물 내에 다양한 양으로 존재한다.
스테비아 식물로부터의 생산된 스테비아 추출물은 여러 스테비올 배당체들과 이취의 원인이 되는 화합물을 함유하고 있으며 회수 및 정제가 노동 집약적이고 비효율적이기 때문에, Reb D 및 Reb M과 같은 고수율로 요망되는 스테비올 글리코사이드를 축적할 수 있는 재조합 생산 시스템이 여전히 요구되고 있다. 이를 위하여 효율성이 좋은 효소의 개발은 여전히 필요한 것이다. 또한, 상업적 용도를 위한 재조합 숙주에서 스테비올 글리코사이드 Reb M의 생산을 위한 Reb D의 개선된 생산에 대한 요구가 여전히 존재한다.
본 발명의 일 예는 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소, 상기 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 상기 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 스테비올 배당체의 생산용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 상기 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 상기 효소의 기질과 반응하는 단계를 포함하는 스테비올 배당체의 생산방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이다.
본 발명의 일 예는 미생물에서 유래되며, 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 UDP-글루코실 전이효소(즉 우리딘 이인산 글루코실 전이효소, UGT로 약칭한다)이다.
상기 UDP-글루코실 전이효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 동일성이 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.3%이상 또는 99.5%이상인 아미노산 서열을 포함하는 효소 단백질에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 아미노산 서열 동일성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 상기 효소 단백질은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열과 서열 동일성이 40% 이상, 50%이상, 60%이상, 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
상기에서 용어 "상동성" 또는 "일치성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성" 또는 "% 동일성"으로 표시된다.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 동일성이 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 효소 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일한 야생형 효소 뿐만 아니라, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 변이형 효소 단백질도 포함한다.
본 발명에 따른 UDP-글루코실 전이효소는, 포도당 공여자의 존재 하에서 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A (Reb A)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 기질로부터 스테비올 배당체, 예를 들면 레바우디오사이드 D (Reb D) 및 레바우디오사이드 E (Reb E)로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상으로 전환하는 활성을 가지며, 더욱 자세하게는 Reb A를 Reb D로 전환하고, 스테비오사이드를 Reb E로 전환할 수 있으며(하기 반응식 1 참조), Reb A 및 스테비오사이드의 단독 기질 또는 혼합 기질에 대해서는 모두 전환활성을 가진다.
Reb A에서 Reb D로 전환하는 것은 Steviol ring에서 beta 1-2 glycosidic bond의 결합을 통하여 Glucose를 전이하는 것으로 주로 steviol ring의 19번 위치에서 일어난다. 스테비올 배당체는 포도당(Glucose)이 베타 결합으로 1개 내지 3개 결합되어 있을 수 있다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2021019767-appb-img-000001
본 발명에 따른 UDP-글루코실 전이효소는, 2 시간 내지 24시간, 보다 구체적으로 3 내지 18시간 효소 반응에서, Reb A의 40중량% 이상이 Reb D로 전환하는 활성을 가지며, 구체적으로 Reb A의 40중량% 이상, 50 중량%이상, 60 중량%이상, 65 중량%이상 또는 70 중량%이상이 Reb D로 전환하는 활성을 가진다. 또한, 본 발명에 따른 효소 단백질은 Reb A 단독기질에 대한 2 시간 내지 24시간, 보다 구체적으로 3시간 내지 18시간 효소 반응에서 EUGT11의 Reb D 전환율 100%를 기준으로 85%이상, 90%이상 또는 93%이상일 수 있으며, 예를 들면 85 내지 110%, 90 내지 110%, 93 내지 110%, 85 내지 100%, 90 내지 100%, 93 내지 100%, 85% 내지 99%, 90 내지 99%, 또는 93 내지 99%일 수 있다. 상기 효소의 전환 활성은 Reb A 단독 기질에 대해 30℃, pH 7.2 및 150 rpm 조건에서 수행된 효소반응에 대해 측정된 것일 수 있으며, 전환율(%)는 HPLC 분석법으로 분석한 peak area값을 하기 수학식 1를 이용하여 계산한 것이다.
[수학식 1]
Reb D 전환율(%)= Reb D의 HPLC peak area / 전체 HPLC peak area
또한, UDP-글루코실 전이효소는, 스테비오사이드 및 Reb A을 포함하는 혼합 기질에서 2시간 내지 24 시간, 더욱 자세하게는 5 내지 20시간 효소 반응에서, Reb A 및 스테비오사이드를 포함하는 혼합기질의 75 중량%이상, 80중량%, 85 중량%, 90중량%, 또는 95 중량%이상이 Reb D 및 Reb E로 전환하는 활성을 가진다. 상기 효소의 전환 활성은 Reb A 및 스테비오사이드를 포함하는 혼합 기질에 대해 30℃, pH 7.2 및 150 rpm 조건에서 수행된 효소반응에 대해 측정된 것일 수 있으며, 전환율(%)는 HPLC 분석법으로 분석한 peak area값을 하기 수학식 2를 이용하여 계산한 것이다.
[수학식 2]
Reb D/E 전환율(%)= Reb D/E의 HPLC peak area / 전체 HPLC peak area
또한, 본 발명에 따른 효소 단백질은 Reb A 및 스테비오사이드를 포함하는 혼합 기질에 대한 2 시간 내지 24시간, 보다 구체적으로 5시간 내지 20시간 효소 반응에서 EUGT11의 Reb D/E 합계 전환율 100%를 기준으로 105%이상, 110%이상, 120%이상, 130%이상, 140%이상, 또는 150%이상일 수 있으며, 예를 들면 105% 내지 200%, 110% 내지 200%, 120% 내지 200%, 130% 내지 200%, 140% 내지 200%, 150% 내지 200%, 105% 내지 190%, 110% 내지 190%, 120% 내지 190%, 130% 내지 190%, 140% 내지 190%, 또는 150% 내지 190%다.
본 발명에 따른 효소 단백질은 HPLC 분석 그래프에서 용출시간 14.5~15.5 분에 해당하는 피크를 갖는 화합물을 부산물로 생성하지 않거나 매우 소량 생성하는 것이다. 이에, 본 발명에 따른 효소 단백질은 Reb A와 스테비오사이드를 포함하는 혼합 기질에서 Reb D/E의 전환율이 EUGT11보다 높으며, 더욱이 효소 반응시간이 경과할 수록 증가하는 특성을 가진다.
본 발명에 따른 UDP-글루코실 전이효소는 식물 유래의 효소를 탐색하여 Triticum aestivum 유래의 효소에 관한 것이다. 유전자 탐색을 통해 찾은 TaUGT의 경우 기존의 putative protein으로 존재하여 기능이 명확히 밝혀지지 않은 단백질이다. 이 단백질의 기능을 밝혀 UGT효소 활성을 확인하였고, 스테비오사이드와 Reb A를 Reb E와 Reb D로 전환하는 효소 활성을 확인하였다.
고감미도를 갖는 Reb D는 스테비아 식물체에 소량 존재하는 당으로 Reb A로에서부터 생성되며, 이 과정에 관여하는 효소는 UGT91D2이다. 이와 유사한 활성을 가진 효소가 쌀에 존재하는 EUGT11효소이다. 스테비아의 UGT91D2의 경우 스테비올 글리코사이드인 Reb A를 Reb D로 전환하는 활성을 가지나 전환 활성이 낮아서 고농도의 Reb M을 생산하기에는 어려움이 있다.
또한, 종래에 알려진 UGT 효소는 스테비아(Stevia rebaudiana)에서 유래하는 UGT, 벼(Oryza sativa)에서 유래하는 UGT (이하, EUGT11라 함), 겉보리 (Hordeum vulgare)에서 유래하는 UGT (이하, HvUGT 라 함)가 있다. 본 발명에 따른 UDP-글루코실 전이효소는, 종래에 알려진 EUGT11에 비해 반응 부산물을 만들지 않는 장점이 있다.
본 발명에 따른 효소는 HvUGT 및 EUGT11와 아미노산 서열 동일성을 분석한 결과, HvUGT와는 91%, EUGT11와는 66%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 폴리뉴클레오타이드 서열 동일성을 분석한 결과 HvUGT와는 36%, EUGT11와는 37%의 폴리뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 것으로 분석되었다.
본 발명에 따른 UDP-글루코실 전이효소는 반응온도 10 내지 50 ℃ 및 pH 5.0 내지 9.0의 수계 중에서 수행하게 할 수 있다. 바람직하게는, 반응을 온도 25 내지 40℃ 및 pH 6.0 내지 8.0의 수계 (aqueous system) 중에서, 더욱 바람직하게는 반응을 온도 30℃ 및 pH 7.2의 수계 중에서 수행할 수 있다. 바람직한 형태에 따르면 반응을 pH 7.2의 인산 완충액 중에서 수행할 수 있다.
본 발명의 일 예는 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터 및 형질전환 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 재조합 미생물 또는 세포는 미생물 세포일 수 있고, 바람직하게는 대장균, 사카로마이세스 속 균주, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시아 또는 피키아 효모 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 암호화하는 핵산 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 핵산이 암호화하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 핵산은 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산은 표적 단백질을 암호화하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 핵산은 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 핵산에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 핵산은 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 암호화하는 핵산의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 예에 따른 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터의 일 예는 도 1의 개열지도에 나타나 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 효소를 암호화하는 핵산 분자와, 상기 핵산분자에 연결되어 작동 가능한 전사 조절서열로서 GAL10 프로모터 및 CYC1터미네이터 등을 포함할 수 있다. 상기 전사 프로모터는 GAL10, GAL1, GAL2, TEF1, GPD1, 및 TDH3 프로모터 등을 포함할 수 있으며, 상기 전사 터미네이터는 CYC1, TEF1 및 PGK1 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환 시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 예는 상기 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 스테비올 배당체의 생산용 조성물에 관한 것이다.
상기 스테비올 배당체의 생산용 조성물은, 스테비오사이드 및 Reb A로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 기질을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 스테비오사이드 또는 Reb A 단독 기질, 또는 이들의 혼합 기질일 수 있다. 상기 혼합 기질은 스테비오사이드 또는 Reb A를 혼합하거나, 스테비오사이드 또는 Reb A를 포함하는 스테비아 추출물일 수 있다.
상기 조성물은, Reb D 또는 Reb E를 Reb M으로 전환하는 효소를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 Reb M으로 전환하는 효소는 제2 UDP-글리코실 전이효소이며, 예를 들면 스테비아 유래의 UGT76G1 등을 포함한다.
상기 조성물은 포도당 공여자를 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면 UDP-포도당 또는 UDP-포도당을 생성할 수 있는 당류를 포함한다. 본 발명에 따른 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질은 포도당 공여자로부터 포도당을 스테비올 배당체로 전이하는 것이다.
상기 배양물은 UDP-글루코실 전이효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태(무세포 형태)일 수 있다. 상기 파쇄물은 UDP-글루코실 전이효소를 생산하는 미생물의 균체를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 UDP-글루코실 전이효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.
상기 균주의 배양물은 상기 UDP-글루코실 전이효소를 생산하는 미생물로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 미생물 균체를 포함하거나 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사용되는 UDP-글루코실 전이효소를 생산하는 미생물은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 상기 균체의 파쇄물, 상기 파쇄물의 상등액, 및 이들의 추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 의미한다.
상기 스테비올 배당체 생산용 조성물을 이용하여 스테비올 배당체를 생산하는 경우 UDP-글루코실 전이효소 또는 효소를 생산하는 미생물을 이용한 반응 온도 및 반응 pH 조건은 상기 효소의 반응온도 및 반응 pH 조건에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 일 예는 상기 스테비올 배당체에 포도당을 전이하는 당전이 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을, 상기 효소의 기질과 반응하는 단계를 포함하는 스테비올 배당체의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는, 본 발명에 따른 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 스테비오사이드 및 Reb A로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 기질을 포도당 공여자의 존재 하에 반응하는 단계를 포함하는, Reb D 및 Reb E로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 스테비올 배당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 일 예는, 본 발명에 따른 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 스테비오사이드 및 Reb A로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 기질을 포도당 공여자의 존재 하에 반응하여 Reb D 및 Reb E로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 스테비올 배당체를 제조하는 단계, 및
상기 제조된 스테비올 배당체, 제2 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 포도당 공여자의 존재하에 반응하는 단계를 포함하는, Reb M의 제조방법에 관한 것이다.
상기 Reb M의 제조단계에서 사용된 제2 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질은 UGT76G1 등이 있을 수 있다.
본 발명 방법은 생산 주기를 현저히 단축하고, 생산 능력을 향상시키고 비용이 낮고 또한 순도의 더욱 높은 제품을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 음료 산업에 의해 경제적으로 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질의 기질은 SINOCHEM(중국)사의 스테비아 추출물로 Reb A를 50% 포함하며 추출물의 스테비올 다당체의 비율은 90%를 차지한 기질을 이용하여 효소 전환을 할 수 있다.
본 발명에 따른 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물을 이용하여 제조된 스테비올 배당체는 고감미도 감미료로서 다양한 식품, 음료 등에 첨가하여 사용되거나 단독으로 식탁 감미료로 시판된다.
본 발명에 따른 UDP-glucosyltransferase 효소 단백질은 종래 알려진 UGT에UGT에 비해 스테비올 배당체의 여러 기질에 작용하는 기질 특이성을 가지며, 반응 부산물을 만들지 않는 장점이 있으며, 상기 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 스테비오사이드 및 Reb A로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 기질을 포도당 공여자의 존재 하에 반응하여 스테비올 배당체를 제조할 수 있으며, 스테비올 배당체는 고감미도 감미료로서 다양한 식품, 음료 등에 첨가하여 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 당전이 효소를 생산하는 효모 균주 제조를 위한 벡터의 개열지도(cleavage map)이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 당전이 효소를 이용하여 혼합 기질로부터 5시간 반응 후 반응생성물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 당전인 효소를 이용하여 혼합 기질로부터 20시간 반응 후 반응생성물의 HPLC 분석 그래프를 나타낸다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 예시적인 실시예 범위로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 효소를 생산하는 재조합 균주 제조
1-1: EUGT(Oryza sativa UGT) 유래의 UGT 탐색
EUGT11(UDP-glycosyltransferase 91C1 [Oryza sativa Japonica Group]의 서열 (ATCC No. AAS07253.1)과 상동성을 가지는 단백질을 탐색 및 선별하기 위해서 Blast 프로그램(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하였다. 탐색하여 선별된 단백질 중에서 XP_044372292.1(putative UDP-rhamnose:rhamnosyltransferase 1 [Triticum aestivum]), TVU45496.1(hypothetical protein EJB05_04985 [Eragrostis curvula]), EAZ00153.1(hypothetical protein OsI_22159 [Oryza sativa Indica Group]), XP_023157255.1(uncharacterized protein of Zea may), RLM584514.1(transferase, Panicum miliaceum, PWZ40097.1 (Soyasaponin III rhamnosyltransferase [Zea mays]), RCV39092.1(hypothetical protein SETIT_8G195800v2 [Setaria italica]) 등의 단백질을 코딩하는 유전자를 합성(Gblock synthesis)하였다.
1-2: 효소 생산 재조합 균주 제작
합성된 유전자는 발현이 가능한 형태를 만들기 위하여 S. cerevisiae 에서 발현되는 plasmid에 subcloning하였다.
명명 핵산서열 (5'->3') 서열번호
CYC1 terminator의 정방향 프라이머 TGATTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTC 7
GAL10 promoter의 역방향 프라이머 catCAATTCttactttttttttggatgg 8
GAL10 promoter와 연결하는 TaUGT의 정방향 프라이머 catccaaaaaaaaagtaaGAATTGATGGACGACGGGTCTTCTAG 9
CYC1 terminator 연결되는 TaUGT의 역방향 프라이머 CTAATTACATGATATCGACAATCATTCTTTATAGGACCTTAGCTGttg 10
GAL10 promoter와 연결하는 EUGT11의 정방향 프라이머 catccaaaaaaaaagtaaGAATTGATGGACTCCGGCTACAGTTC 11
CYC1 terminator와 연결하는 EUGT11의 역방향 프라이머 CTAATTACATGATATCGACAATTAGTCCTTATAAGAACGTAGCTG 12
GAL10 promoter와 연결하는 HvUGT의 정방향 프라이머 catccaaaaaaaaagtaaGAATTGATGGACGGCGACGGAAAC 13
CYC1 terminator와 연결하는 HvUGT의 역방향 프라이머 CTAATTACATGATATCGACAAtcaAGCTTTGTAGGAACGCAGTTG 14
GAL10 promoter의 정방향 프라이머 ggatccatcgcttcgctg 15
CYC1 terminator의 역방향 프라이머 GCAAATTAAAGCCTTCGAGC 16
단백질의 활성을 확인하기 위하여 제조한 vector는 S. cerevisiae 에서 선별이 가능한 Ura auxotrophic marker (선별마커)를 포함한 pRS426 vector를 사용하였고, promoter는 GAL10 promoter를 사용하였으며 terminator는 CYC1을 사용하였다. 이 plasmid에 새로 합성한 유전자를 클로닝하였다. TaUGT유전자의 클로닝을 위해 gal10 promoter(서열번호 7)와 cyc1 terminator(서열번호 8) 와 겹치도록 프라이머 쌍(서열번호 9 및 서열번호 10)를 제작하였고, PCR 증폭을 통하여 효소유전자를 증폭하여 Gibson assembly (HIFi DNA master mix, NEW ENGLAND BIOLABS)를 통하여 유전자를 서브클로닝 하였다. 서브클로닝한 플라스미드 형태의 유전자는 대장균(DH5a)에 형질전환하여 선별 및 증폭하였고, 증폭된 플라스미드의 서열을 분석하여 해당 효소의 발현유전자가 정확하게 서브클로닝된 것을 확인하였다.기존의 활성이 알려진 EUGT11 유전자(서열번호 4)과 HvUGT의 유전자 (서열번호 6) 를 합성(Gblock synthesis)하였고, TaUGT유전자와 동일하게 유전자를 증폭하여, pRS426 vector에 클로닝하였다. 동일한 조건으로 효소 발현을 유도하기 위하여 promoter는 GAL10 promoter를 사용하였으며 terminator는 CYC1을 사용하였다. 구체적으로, GAL10 promoter와 연결하는 EUGT11의 정방향 프라이머 (서열번호 11), CYC1 terminator와 연결하는 EUGT11의 역방향 프라이머 (서열번호 12), GAL10 promoter와 연결하는 HvUGT의 정방향 프라이머 (서열번호 13), 및 CYC1 terminator와 연결하는 HvUGT의 역방향 프라이머 (서열번호 14)를 사용하였다. 상기 생산된 효소 생산 유전자 카세트를 하기 표 2에서 Sc는 Saccharomyces cerevisiae를 의미한다.
S. cerevisiae CENPK2-1c(Euroscarf)에 유전자를 도입하는 형질전환 방법은 LiAc(Lithium Acetate)를 0.1M 처리하여 열충격을 통하여 도입하였다. 도입된 균주는 SC-Ura 배지에서 선별하였고, 선별된 콜로니는 배양을 통하여 효소의 활성을 확인하였다.
프로모터 유전자 terminator 유전자 origin
ScGAL10 EUGT11 ScCYC1 Oryza sativa
ScGAL10 TaUGT ScCYC1 Triticum aestivum
ScGAL10 EcUGT ScCYC1 Eragrostis curvular
ScGAL10 OsiUGT ScCYC1 Oryza sativa indica
ScGAL10 HvUGT ScCYC1 Hordeum vulgare
제조된 위 6종의 재조합 플라스미드를 S. cerevisiae CENPK2-1c(Euroscarf) 균주에 형질전환하였다. SC-Ura 고체배지(SC-Ura 배지 + 2% agar)에서 선별마커를 통해 6종의 유전자 카세트들이 삽입된 재조합 균주들을 선별하였다. SC-Ura 고체배지의 조성은 YNB 6.7 g/L, Drop out mix 0.7 g/L, 글루코오스 D50 g/L 및 아가 20 g/L를 포함하며, pH 6.0으로 맞추었다.
실시예 2. 재조합 균주 배양
실시예 1에서 제조된 Plasmid가 형질전환된 효모를 URA-drop out mix를 이용한 SC(synthetic complete) 배지에서 선별하였고, 선별된 효모는 액체 배양을 통하여 효소 발현을 유도하였다.
구체적으로, SC-Ura 고체배지에서 선별된 콜로니를 3 mL SC-Ura 액체배지가 포함된 시험관에 접종하여 밤새 배양하였다. 배양된 균체의 농도를 OD600 흡광도를 측정하여 확인하고, 25 mL의 SC-Ura 액체배지를 담은 250 mL 플라스크에 OD600 흡광도가 최종적으로 0.1(final)이 되게 접종하여 24시간 배양(30℃, 240 rpm)하였다. 1차 배양한 균체의 효소 발현을 유도하기 위하여 YPG 배지를 동량 첨가하여 24시간 동안 2차로 배양하였다. 상기 2차 배양한 균체는 원심분리(4,000 rpm, 10 min)를 수행하여 모았다. SC-Ura 액체 배지의 조성은 YNB (yeast nitrogene base) 6.7 g/L, Drop-out mix g/L, Glucose g/L 및 MES mM을 포함하고, NaOH를 이용하여 배지 pH를 6.0으로 조정하였다. 상기 YPG 배지 조성은 Bacto peptone 20g/L, Yeast Extract 10g/L, Galactose 20g/L 및 Phosphate buffer (sodium salt) 100 mM을 포함하며, 배지의 pH를 6.0으로 조정하였다.
실시예 3. 효소 활성 평가
실시예 2에서 얻은 재조합 균주의 배양물에서 균체를 원심분리(4,000rpm, 10 min)하여 회수하였다. 상기 회수한 균체를 10mL 모아 동량의 물로 2회 세척하였다. 상기 세척된 균체를 100 mM phosphate buffer (pH 7.2) 에 재현탁하여 OD600 값이 100이 되도록 한 후, 0.4 내지 0.6 mm입경을 갖는 glass bead(Sigma) 을 100 mg 양을 cap tube에 넣고, 100 mM phosphate buffer(pH 7.2)를 1 ml 첨가하였다. 균체를 bead beater에서 30초 동안 5회 반복하여 파쇄하였다. 상기 균체 파쇄액을 냉장상태에서 원심분리(13,000 rpm, 15 min)하여 상등액을 조효소액으로 얻었다.
효소 활성 평가를 위한 반응액은 기질 Reb A(95%, Sinochem), MgCl2 및 UDP-Glucose을 포함하며 여기에 상기 조효소액 0.1mL을 첨가하여 전체 반응 부피 0.5 mL를 제조하고, 상기 최종 반응액에서 기질 Reb A(95%, Sinochem) 2 g/L, MgCl2 3 mM, 및 UDP-Glucose 4 mM 가 되도록 하였다. 상기 제조된 반응액에 대해 온도 30℃, pH 7.2 및 150 rpm 조건에서 효소 반응을 수행하고, 반응 시작 후 3시간과 18시간에 각각 시료를 채취하여 반등시간에 따른 반응 정도를 확인하였다.
상기 효소 반응액을 5 분간 끓여 효소 반응을 종료하고, 원심분리(13,000 rpm, 10 min)하고 얻어진 상등액을 분석하여 효소반응 생성물을 확인하였다. 구체적으로 효소반응 생성물의 분석은 HPLC-Chromatography를 이용하여 분석하여 생성물의 전환 비율을 확인하였다. 상기 재조합 균주의 균체 파쇄물에서 얻은 조효소액은 Reb A 기질을 Reb D로 전환하는 활성을 보이므로 Reb D의 생성 비율을 확인하여 활성을 측정하였다.
구체적으로 전환 생성물의 HPLC 분석에 사용된 column은 UG120 (C18 250 mm X 46 mm, 5 um 110 A particle, Shideido)을 이용하였고, 분석은 210 nm에서 확인하였다. 이동상은 0.01% TFA (Trifluoroacetic acid, Sigma)를 포함한 물과 아세토나이트릴을 각각 이용하여 Gradient로 분석하였으며, 이동상은 1 mL/min으로 흘려주고 총 40분 분석을 통하여 확인하였다. 상기 HPLC 분석 조건을 하기 표 3에 나타냈다. 상기 전환 생성물의 HPLC 분석 그래프는 표 4에 나타낸다. 하기 표 4에 나타난 Reb A 단독 기질로부터 Red D로 전환하는 상기 효소의 Reb D 전환율은 하기 수학식 1에 따라 계산하며, 효소의 Reb D 상대 전환율은 EUGT11의 Reb D 전환율 100%를 기준으로 환산한 TaUGT 또는 HvUGT 효소의 Reb D 전환율을 의미한다.
[수학식 1]
Reb D 전환율(%)= Reb D의 HPLC peak area / 전체 HPLC peak area
Time (min) Eluent A(%) Eluent B(%)
0 80 20
10 80 20
12 65 35
30 0 100
32 80 20
40 80 20
효소명 반응시간(hour) Reb D의 전환율 (%) Reb D의 상대 전환율 (%)
EUGT11 3 45.8 100%
TaUGT 3 43.4 94.8%
HvUGT 3 32.5 71.0%
EUGT11 18 70.6 100%
TaUGT 18 68.0 96.3%
HvUGT 18 62.2 88.1%
표 4에 나타낸 바와 같이, 효소 반응을 통한 전환율은 초기 3시간 반응 결과 EcUGT 및 OsiUGT 등의 활성은 확인되지 않았고, 초기 putative protein인 TaUGT는 EUGT11과 유사하게 Reb A의 Reb D 전환을 40~45% 전환하였고, HvUGT(30~35% 전환) 보다 30% 정도의 활성 향상을 가진 효소임을 확인하였다. 또한, 18시간의 효소 반응액의 생성된 Reb D 함량 분석 결과, 세가지 효소의 전환율 크기 순서가 3 시간 반응과 유사한 경향성을 나타내었다.
실시예 4. 혼합 기질을 이용한 효소 반응
실시예 3과 같이 Reb A를 이용한 효소 활성 평가의 경우, Reb A에서 Reb D로만 전환되어 효소의 활성 확인이 명확하다. 그러나, 실제 산업적 생산에서 혼합 기질을 사용하므로, 혼합 기질을 사용한 산업적 용도에 효소의 사용 가능성을 평가하고자 스테비오사이드 및 Reb A을 포함하는 혼합기질에 대한 전환반응을 수행하였다. 즉, 혼합 기질을 사용하는 경우 스테비오사이드는 Reb E로, Reb A는 Reb D로 전환하는 반응이 수행된다.
혼합 기질에 대한 효소 활성을 평가하고자, 혼합 기질로서 RA40 (SinoChem)를 사용하였다. 상기 사용된 RAD 40에 포함된 Red A와 스테비오사이드의 정확한 함량을 측정하고자 실시예 3에 기재된 방법과 실질적으로 동일한 HPLC 분석법으로 분석하였으며, RebA:STE의 HPLC area 값 비율이 48:52 이었다. 상기 사용된 효소는 실시예 3에서 높은 활성을 나타낸 TaUGT와 EUGT11의 조효소액이었다.
혼합기질을 이용한 효소 활성 평가를 위한, 반응액은 기질 RA40 반응기질 (90중량% 순도), MgCl2 및 UDP-Glucose을 혼합하고, 여기에 실시예 3에 따른 TaUGT와 EUGT11 조효소액을 각각 0.1mL을 첨가하여 전체 반응 부피 0.5 mL를 제조하고, 상기 최종 반응액에서 RA40 반응기질 5 g/L, MgCl2 3 mM, 및 UDP-Glucose 20 mM이 되도록 하였다. 상기 제조된 반응액에 대해 온도 30℃, pH 7.2, 150 rpm 조건에서 효소 반응을 수행하고, 반응 시작 후 5시간과 20시간에 각각 시료를 채취하여 반응시간에 따른 반응 정도를 확인하였다. 실시예 3의 방법과 실질적으로 동일한 방법으로, 상기 전환 생성물은 HPLC 분석법으로 분석하였다.
하기 표 5에 나타난 RA40 혼합 기질에 대한 Reb D/E로 전환하는 상기 효소의 Reb D/E의 전환율은 하기 수학식 2에 따라 계산하며, 효소의 Reb D/E의 상대적 합계 전환율은, EUGT11의 Reb D/E 합계 전환율 100%를 기준으로 환산한 TaUGT 효소의 Reb D/E 합계 전환율을 의미한다. 상기 5시간 효소반응의 분석결과를 도 2에 나타내고, 및 20시간 효소반응의 분석결과를 도 3에 나타냈다.
[수학식 2]
Reb D/E 전환율(%)= Reb D/E의 HPLC peak area / 전체 HPLC peak area
효소 반응시간(hour) Reb D/E의
합계 전환율(%)		 Reb D/E의
상대적 합계 전환율(%)
EUGT11 5 70.0 100
TaUGT 5 92.6 130
EUGT11 20 72.0 100
TaUGT 20 100.0 138
도 2의 효소 반응 결과는, RA40 기질을 이용한 5시간 전환반응 결과 파란색은TaUGT의 반응에 대한 HPLC 결과의 chromatogram이며, EUGT11의 경우 검정색 의 HPLC chromatogram 결과를 나타낸다. 이 결과를 보면 TaUGT의 경우 RA40 기질을 Reb E, Reb D로 전환하고 부산물을 만들지 않는다. 그러나 EUGT11의 경우 15.1분에 해당하는 부산물의 HPLC area가 16% 의 비율을 보인다. 그러므로 전체적인 Reb E와 D의 전환율이 떨어진다. 이것은 Reb E 생성물의 부반응이 일어난 것으로 보인다.도 3의 효소 반응 결과는 RA40 기질을 이용한 20시간 전환반응 결과 파란색은 TaUGT의 반응에 대한 HPLC 결과의 chromatogram이며, EUGT11의 경우 파란색 의 HPLC chromatogram 결과를 나타낸다. 이 결과를 보면 TaUGT의 RA40 기질을 모두 소모하여 전환한 경우 Reb E, Reb D를 생성한다. 그러나 EUGT11의 경우 15.1분에 해당하는 부산물의 HPLC area가 28%의 비율로 높게 차지한다. EUGT11의 경우 스테비오사이드에서 전환되어 생성되는 Reb E의 부반응이 일어나 부산물을 만드는 것이 확인된다.
따라서, 본 발명에 따른 TaUGT 효소는 Reb A 단독 기질에 대한 Reb D 전환율이 높을 뿐아 HvUGT에 비해 우수하며, 더욱이 Reb A와 스테비오사이드를 포함하는 혼합 기질에 대해서는 Reb D/E의 합계 전환율(%)은 EUGT11에 비해 높을 뿐만 아니라 효소반응시간이 경과할수록 증가하여, 산업적으로 스테비올 배당체, 예를 들면 Reb M을 생산하기 위한 기질로서 Red D/E를 높은 함량으로 생산할 수 있어 매우 유용한다.

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열과 92% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가지며, 스테비올 배당체 기질에 글루코스를 전이하는 유리딘 디포스페이트-글리코실트랜스퍼라제 (UDP-glucoslyltransferase)활성을 갖는 효소 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 Triticum aestivum에서 유래된 것인 효소 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스테비올 배당체 기질은 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 효소 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은 2시간 내지 24시간 효소 반응에서 레바우디오사이드 A의 40 중량%이상이 레바우디오사이드 D로 전환하는 활성을 갖는 것인 효소 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효소 단백질은, 레바우디오사이드 A 및 스테비오사이드를 포함하는 혼합 기질에 대한 2 시간 내지 24시간 효소 반응에서 EUGT11의 Reb D/E 합계 전환율 100%를 기준으로, 105%이상 내지 200%의 Reb D/E 합계 전환율 갖는 것인 효소 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질을 암호화하는 유전자를포함하는 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자는, 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열에 의해 암호화되는 것인 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 사카로미세스속 미생물 및 피키아속 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 재조합 미생물.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 효소 단백질, 상기 효소 단백질을 발현하는 재조합 미생물, 상기 미생물의 균체, 상기 미생물의 균체 파쇄물, 상기 미생물의 배양물 및 이들의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상과, 포도당 공여자(glycosyl donor)를 포함하는, 스테비올 배당체의 생산용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은, 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 기질을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A를 포함하는 혼합 기질인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 조성물은, 레바우디오사이드 D 또는 레바우디오사이드 E를 레바우디오사이드 M으로 전환하는 효소를 추가로 포함하는 것인 조성물.
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