KR20160111998A

KR20160111998A - 효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드 m을 제조하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20160111998A
Application number: KR1020167023109A
Authority: KR
Inventors: 준후아 타오; 구오칭 리; 시아오리앙 리앙; 토마스 리; 그레고리 예프; 마오치 호우; 앤드류 타오
Original assignee: 페푸시코인코포레이팃드
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2016-09-27
Also published as: US20170211113A1; CA2937426A1; EP3101139A4; CA2937426C; KR102115640B1; EP3101139A1; EP3508584A1; WO2015113231A1; CN106471128A; JP6541159B2; JP2017504341A

Abstract

효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드(Rebaudioside) M을 제조하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법에서는, 레바우디오사이드 A 또는 레바우디오사이드 D를 기질로서 사용하고, 수크로스 및 UDP의 존재 하에서, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소의 혼합물, 또는 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소를 함유하는 재조합 세포의 촉매작용 하에서 기질의 반응으로 레바우디오사이드 M을 생성한다. 반응은 20 내지 60℃의 온도 및 pH 5.0 내지 9.0에서 수성-상 시스템에서 수행된다. 반응 시스템은 기질의 가용화를 용이하게 하기 위해 부피비에 따라 3% 내지 5%의 농도로 다이메틸 설폭사이드를 추가로 함유한다.

Description

효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드 M을 제조하기 위한 방법{REBAUDIOSIDE M ENZYMATIC PREPARATION METHOD}

본 발명은 레바우디오사이드(Rebaudioside) M을 제조하기 위한 방법, 및 특히 레바우디오사이드 M을 제조하기 위한 생물학적 방법에 관한 것이다.

설탕 대체물(sugar substitute)은 인간 건강에 미치는 상이한 영향에 따라 4가지 부류로 나뉠 수 있다. 제1 부류는 과일 주스, 꿀 및 메이플 시럽과 같은 천연 감미료를 포함하는데, 이들은 칼로리 및 탄수화물 함량 측면에서 설탕과 유사하다. 제2 부류는 아스파탐 및 사카린과 같은 인공 감미료를 포함하는데, 이들은 칼로리를 제공하지 않아서 비영양 감미료로 간주된다. 제3 부류는 자일리톨 및 소르비톨과 같은 당알코올을 포함하는데, 이들은 주로 채소류 및 과일류로부터 유래한다. 제4 부류는 천연 식물로부터 추출된 감미 물질, 예컨대 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 추출된 스테비오사이드(stevioside)를 포함한다. 인공 감미료, 당알코올 및 추출된 감미료 모두는 설탕보다 여러 배 - 수백 배 - 더 단맛이 나므로, 동일한 수준의 감미도(sweetness)를 내는 데 필요한 첨가량은 수크로스보다 상당히 낮다.

스테비아 레바우디아나는 중요한 경제적 가치를 갖는 작물이고, 그의 잎에 매우 높은 함량의 스테비오사이드를 갖고 있다. 현재, 100개 초과의 화합물이 스테비아 레바우디아나에서 확인되어 왔고, 가장 잘 알려진 것은 스테비오사이드이고, 특히 스테비올 글리코사이드 및 레바우디오사이드 A이다 (문헌[J. Agric. Food Chem., 2012, 60, 886-895]). 최근 신규한 스테비오사이드가 잡종 스테비아 레바우디아나 식물 모리타(Morita)에서 발견되었다 (문헌[2010, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209]).

중국 특허 출원 제201310353500.9호는 레바우디오사이드 M을 제조하기 위한 생물학적 방법을 개시하고 있는데, 이 방법에서는 레바우디오사이드 A 또는 레바우디오사이드 D가 기질로서 사용되고, 글루코실 공여자(glucosyl donor)의 존재 하에서, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및/또는 UDP-글루코실 트랜스퍼라제를 함유하는 재조합 세포의 촉매작용 하에서 기질의 반응으로 레바우디오사이드 M이 생성된다. 그러나, 상기 특허 출원의 공정은 많아야 단지 약 80%의 전환율 및 단지 95%의 순도를 가질 뿐만 아니라, 더 낮은 기질 농도 및 더 높은 생산비를 가지면서, 충분히 최적화되어 있지는 않다. 따라서, 이 공정은 산업화된 생산에는 적합하지 않다.

본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 종래 기술의 결점을 극복하기 위해 효소 방법으로 레바우디오사이드 M을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 더 낮은 비용으로 더 높은 순도로 레바우디오사이드 M 생성물을 생산할 수 있다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 기술적 해결방안, 즉 효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드 M를 제조하기 위한 방법을 이용하는데,

본 방법에서는, 레바우디오사이드 A 또는 레바우디오사이드 D를 기질로서 사용하고, 수크로스 및 UDP의 존재 하에서, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소(synthetase) (AtSUS1)의 혼합물, 또는 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소를 함유하는 재조합 세포의 촉매작용 하에서 기질의 반응으로 레바우디오사이드 M을 생성한다. 반응은 20 내지 60℃의 온도 및 pH 5.0 내지 9.0에서 수성-상(aqueous-phase) 시스템에서 수행된다. 반응 시스템은 기질의 가용화를 용이하게 하기 위해 부피비에 따라 3% 내지 5%의 농도로 다이메틸 설폭사이드를 추가로 함유한다. 초기 반응 시스템에서, 레바우디오사이드 A는 10 g/L 이상의 농도를 갖고, 레바우디오사이드 D는 15 g/L 이상의 농도를 갖는다. 반응 후, 반응 용액을 원심분리한 후, 상청액을 취하여 거대다공성 흡착 수지(macroporous adsorbent resin)로 분리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물(crude product)의 용액을 얻고, 이를 에탄올 수용액에서 결정화하여 98% 초과의 순도로 레바우디오사이드 M 생성물을 얻도록 한다.

바람직하게는, UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 및/또는 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 유래한 UGT-B이다.

바람직하게는, 반응은 35℃ 내지 45℃의 온도 및 pH 6.5 내지 8.5에서 수성-상 시스템에서 수행된다.

바람직하게는, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소를 함유하는 재조합 세포는 촉매작용을 수행하기 위해 사용되고, 초기 반응 시스템은 부피비에 따라 1% 내지 3%의 농도로 톨루엔을 추가로 함유한다.

바람직하게는, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 대 수크로스 합성효소의 중량비가 1:0.2 내지 0.4이다.

바람직하게는, 방법은 다음과 같이 구현된다: 반응에 사용되는 모든 원료들을 반응 케틀(reaction kettle)에 넣고, 수성-상 시스템으로 최종 부피에 이르게 하고, 균일하게 혼합한 후, 설정 온도에 두고, 반응을 위해 교반함.

바람직하게는, 재조합 세포는 미생물 세포이다.

더 바람직하게는, 미생물은 대장균(Escherichia coli), 사카로미세스 세레비시아이(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.

바람직하게는, 기질은 레바우디오사이드 A이고, UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 및 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 혼합물이고, 여기서 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A의 아미노산 서열은 서열 2와 80% 이상 일치하고 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 아미노산 서열은 서열 4와 80% 이상 일치한다. 더 바람직하게는, 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 및 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 혼합물에서, 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 대 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 중량비가 3 내지 5:1이다.

바람직하게는, 기질은 레바우디오사이드 D이고, UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A이고, 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A의 아미노산 서열은 서열 2와 80% 이상 일치한다.

바람직하게는, 반응 후 및 원심분리 전의 반응 용액은 먼저 50 내지 60℃에서 가열되고 50 내지 70분 동안 초음파 처리된다.

바람직하게는, 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액은 다음과 같은 특정 단계들에 의해 에탄올 수용액에서 결정화된다: 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 감압에서 증류에 의해 농축한 후 원심분리하고, 상청액을 폐기하는 단계; 침전물을 첨가된 물로 세척한 후 원심분리하고, 상청액을 폐기하는 단계; 침전물을 부피비에 따라 40% 내지 70%의 농도로 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 60 내지 70℃에서 가열하고, 에탄올 수용액이 부피비에 따라 20 내지 30%의 농도를 가질 때까지 여기에 물을 첨가하는 단계; 및 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 결정화 및 고체의 침전을 실시한 후, 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하는 단계.

상기 기술적 해결방안의 구현 결과로서, 본 발명은 종래 기술과 비교하여 하기 이점들을 갖는다.

본 발명에서 제공되는 효소 방법에 의해 레바우디오사이드 M을 제조하기 위한 방법은 중요한 응용 가치를 갖는다. 최적화 및 가용화제, 반응 온도 및 pH의 제어를 통해, 전환율 및 순도가 둘 모두 개선되고, 생산비가 감소된다. 따라서, 이 방법은 산업화된 생산에 적합하다.

도 1은 본 발명의 실시예 7에서 얻어진 생성물의 양성자 자기 스펙트럼 도표이다.

본 발명은 원료로서 레바우디오사이드 A 또는 레바우디오사이드 D를 사용하면서, 효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드 M을 합성하기 위한 공정을 제공한다.

레바우디오사이드 A, 레바우디오사이드 D 및 레바우디오사이드 M은, 각각 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III에 나타낸 구조식을 갖는 스테비오사이드의 4, 5 및 6개의 덱스트로스 단위들을 각각 함유한다.

본 발명은 레바우디오사이드 M을 합성하기 위한 2개의 경로를 제공한다:

경로 1:

경로 2:

본 발명에서, 원료는 정제된다.

본 발명의 특정 일 태양에 따르면, 원료는 스테비올 글리코사이드 기질 레바우디오사이드 A를 포함한다.

본 발명의 특정 다른 태양에 따르면, 원료는 스테비올 글리코사이드 기질 레바우디오사이드 D를 포함한다.

본 발명에 따르면, UDP 글루코실 트랜스퍼라제는 정제되었을 수 있거나 그렇지 않았을 수 있는 동결건조된 효소 분말의 형태로 존재할 수 있거나, 재조합 세포에 존재할 수 있다.

UGT-A, UGT-B 및 AtSUS1 (수크로스 합성효소)을 함유하는 재조합 세포는 하기 방법에 의해 얻어진다.

UGT-A, UGT-B 및 AtSUS1의 재조합 대장균 (또는 다른 미생물 박테리아) 발현 균주를 분자 클로닝 기술 및 유전자 공학 기술을 사용하여 얻는다. 이어서, 재조합 대장균을 발효시키고, 재조합 세포의 후처리 및 수집을 실시한다.

본 발명에 기재된 분자 클로닝 기술 및 유전자 공학 기술은 모두 알려져 있다. 분자 클로닝 기술은 문헌[Molecular Cloing: A Laboratory Manual. 3rd Edition, by J. Shambrook, 2005]에서 찾을 수 있다.

유전자 공학 기술을 사용하여 본 발명의 재조합 균주를 구축하기 위한 발현 단계들은 다음과 같다:

(1) UGT-A 및 AtSUS1의 유전자 단편을 pACYC-Duet-1의 2개의 다중클론 부위 MCS2 (NdeI/XhoI) 및 MCS1 (BamHI/HindIII) 내로 각각 서브클로닝하여 플라스미드 pA-UGTA-SUS1을 얻음;

(2) UGT-B 유전자를 pET30a의 NdeI 부위와 BamHI 부위 사이의 부위 내로 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pE-UGIT-B를 얻음; 및

(3) PA-UGT-A-SLTS1 및 pE-UGT-B를 대장균 BL21 (DE3) 내로 연속적으로 형질전환하여 균주 GQ-ABS를 얻음.

UGT를 함유하는 재조합 세포, 또는 동결건조된 UGT 분말은 UGT를 함유하는 재조합 대장균 발현 균주를 사용하여 다음과 같은 단계들에 의해 제조된다:

재조합 대장균 발현 균주 GQ-ABS를 1%의 비율에 따라 4 mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 하룻밤 배양한다. 하룻밤 배양을 거친 배양물을 1%의 접종물 크기로 50 mL의 액체 LB 배지로 옮긴다. 배양 배지를 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 최대 0.6 내지 0.8의 OD600 값까지 배양한다. 여기에 IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 진탕하면서 하룻밤 배양한다. 유도 완료 후, 원심분리 (8,000 rpm, 10분)에 의해 세포를 수집한다. 5 mL의 2 mmol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 세포를 재현탁하여 재조합 세포를 얻거나, 빙조(ice bath)에서 초음파에 의해 추가로 파괴하여, 파괴된 액체를 원심분리하고 (8,000 rpm, 10분) 상청액을 수집하고 24시간 동안 동결건조시켜 동결건조된 분말을 얻는다.

본 발명은 특정 실시예들과 함께 아래에 더 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1: UGT-A를 함유하는 재조합 대장균 세포의 제조

서열 1 및 서열 2에 따라, UGT-A 유전자 단편을 유전학적으로 합성하고, NdeI 및 BamHI 효소 절단 부위를 양쪽 말단에 각각 부가하고, 여기에 pUC57 벡터 (쑤저우 제네위즈 바이오테크 컴퍼니 리미티드(Suzhou Genewiz Biotech Co., Ltd.))를 연결하였다. UGT 유전자 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamHI로 효소 분해시켰다. 정제된 단편을 회수하였다. 여기에 T4 리가제를 첨가하고, 단편을 pET30a의 상응하는 효소 절단 부위 내로 연결하여, BL21 (DE3) 균주를 형질전환하여, 재조합 균주 GQ-A를 얻도록 하였다.

UGT 균주를 1%의 비율에 따라 4 mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양을 거친 배양물을 1%의 접종물 크기로 50 mL의 액체 LB 배지로 옮겼다. 배양 배지를 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 최대 0.6 내지 0.8의 OD600 값까지 배양하였다. 여기에 IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 진탕하면서 하룻밤 배양하였다. 유도 완료 후, 원심분리 (8,000 rpm, 10분)에 의해 세포를 수집하였다. 5 mL의 2 mmol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 세포를 재현탁하여 촉매작용에 사용하기 위한 UGT-A 함유 재조합 세포를 얻었다.

실시예 2: 동결건조된 UGT-A 분말의 제조

실시예 1에서 제조된 UGT-A의 재조합 세포를 빙조에서 초음파에 의해 파괴하여, 파괴된 액체를 원심분리하고 (8,000 rpm, 10분) 상청액을 수집하고 24시간 동안 동결건조시켜 UGT-A의 동결건조된 분말을 얻었다.

실시예 3: UGT-B를 함유하는 재조합 대장균 세포의 제조

서열 3 및 서열 4에 따라, UGT-B 유전자 단편을 유전학적으로 합성하고, NdeI 및 BamHI 효소 절단 부위를 양쪽 말단에 각각 부가하고, 여기에 pUC57 벡터 (쑤저우 제네위즈 바이오테크 컴퍼니 리미티드)를 연결하였다. UGT 유전자 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamHI로 효소 분해시켰다. 정제된 단편을 회수하였다. 여기에 T4 리가제를 첨가하고, 단편을 pET30a의 상응하는 효소 절단 부위 내로 연결하여, BL21 (DE3) 균주를 형질전환하여, 재조합 균주 GQ-B를 얻도록 하였다.

UGT 균주를 1%의 비율에 따라 4 mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양을 거친 배양물을 1%의 접종물 크기로 50 mL의 액체 LB 배지로 옮겼다. 배양 배지를 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 최대 0.6 내지 0.8의 OD600 값까지 배양하였다. 여기에 IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 진탕하면서 하룻밤 배양하였다. 유도 완료 후, 원심분리 (8,000 rpm, 10분)에 의해 세포를 수집하였다. 5 mL의 2 mmol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 세포를 재현탁하여 촉매작용에 사용하기 위한 UGT-B 함유 재조합 세포를 얻었다.

실시예 4: 동결건조된 UGT-B 분말의 제조

실시예 3에서 제조된 UGT-B의 재조합 세포를 빙조에서 초음파에 의해 파괴하여, 파괴된 액체를 원심분리하고 (8,000 rpm, 10분) 상청액을 수집하고 24시간 동안 동결건조시켜 UGT-B의 동결건조된 분말을 얻었다.

실시예 5: UGT-A 및 AtSUS1을 함유하는 재조합 대장균 세포의 제조

UGT-A 및 AtSUS1의 유전자 단편을 pACYC-Duet-1 플라스미드의 NdeI/XhoI 및 BamHI/HindIII 부위 내로 각각 삽입하여 플라스미드 pA-UGT-A-SUS1을 얻었다. 플라스미드를 BL21 (DE3) 내로 형질전환하여 재조합 균주 GQ-AS를 얻었다.

UGT 균주를 1%의 비율에 따라 4 mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양을 거친 배양물을 1%의 접종물 크기로 50 mL의 액체 LB 배지로 옮겼다. 배양 배지를 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 최대 0.6 내지 0.8의 OD600 값까지 배양하였다. 여기에 IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 진탕하면서 하룻밤 배양하였다. 유도 완료 후, 원심분리 (8,000 rpm, 10분)에 의해 세포를 수집하였다. 5 mL의 2 mmol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 세포를 재현탁하여 촉매작용에 사용하기 위한 UGT-A 및 AtSUS1 함유 재조합 세포를 얻었다.

실시예 6: UGT-A, UGT-B 및 AtSUS1을 함유하는 재조합 대장균 세포의 제조

서열 3 및 서열 4에 따라, UGT-B 유전자 단편을 유전학적으로 합성하고, NdeI 및 BamHI 효소 절단 부위를 양쪽 말단에 각각 부가하고, 여기에 pUC57 벡터 (쑤저우 제네위즈 바이오테크 컴퍼니 리미티드)를 연결하였다. UGT 유전자 단편을 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamHI로 효소 분해시켰다. 정제된 단편을 회수하였다. 여기에 T4 리가제를 첨가하고, 단편을 pET30a의 상응하는 효소 절단 부위 내로 연결하여, GQ-AS 균주를 형질전환하여, 재조합 균주 GQ-ABS를 얻도록 하였다.

UGT 균주를 1%의 비율에 따라 4 mL의 액체 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양을 거친 배양물을 1%의 접종물 크기로 50 mL의 액체 LB 배지로 옮겼다. 배양 배지를 37℃에서 진탕하면서 (200 rpm) 최대 0.6 내지 0.8의 OD600 값까지 배양하였다. 여기에 IPTG를 0.4 mM의 최종 농도로 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 진탕하면서 하룻밤 배양하였다. 유도 완료 후, 원심분리 (8,000 rpm, 10분)에 의해 세포를 수집하였다. 5 mL의 2 mmol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 세포를 재현탁하여 촉매작용에 사용하기 위한 UGT-A, UGT-B 및 AtSUS1 함유 재조합 세포를 얻었다.

실시예 7: 레바우디오사이드 D를 기질로서 사용하는 효소 방법에 의한 레바우디오사이드 M의 합성

0.224 g의 UDP, 34.2 g의 수크로스, 1.6 g의 레바우디오사이드 D, 1 g의 동결건조된 UGT-A 분말, 0.4 g의 동결건조된 AtSUS1 분말, 4 mL의 다이메틸 설폭사이드 및 0.05 mol/L 인산염 완충액 (pH 8.0)을 100 mL의 최종 부피까지 반응 시스템에 연속적으로 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 37℃의 수조에 넣고, 18시간 동안 200 rpm으로 교반하여 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 200 μl의 반응 용액을 취하고 800 μl의 무수 메탄올에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 혼합물을 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하고 여과막을 통과시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출하였다 (크로마토그래피 조건: 크로마토그래피 컬럼: 애질런트 이클립스(Agilent eclipse) sb-C18 4.6 × 150 mm; 검출 파장: 210 nm; 이동상: 메탄올: 물 = 68% : 32%; 유량: 1.0 mL/분; 컬럼 온도: 30℃). 레바우디오사이드 D의 전환율은 90% 초과였다. 반응 완료 후, 300 mL의 탈이온수를 100 mL 반응 용액에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 A였다. 원심분리 후, 100 mL의 물을 침전물에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 0.5시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 B였다. 샘플 A 및 샘플 B를 혼합하여 샘플 C를 얻었고, 샘플 C를 거대다공성 흡착 수지 (AB-8)로 분리하였다. 결과물을 먼저 4 컬럼 부피의 물로 플러싱(flushing)한 후, 3.5 컬럼 부피의 70% 에탄올로 용리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 얻었다. 상기 조 성생물의 용액을, 남아있는 용액이 약 10 mL가 될 때까지 감압에서 증류하고 (40 내지 50℃), 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 4 mL의 첨가된 물로 세척하고, 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 50% 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 65℃로 가열하였다. 여기에 동일 부피의 물을 첨가하여, 에탄올 농도가 25%가 되게 하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 고체 침전 후 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하여 99% 초과의 순도로 1.12 g의 레바우디오사이드 M을 얻었다.

실시예 8: 레바우디오사이드 A를 기질로서 사용하는 효소 방법에 의한 레바우디오사이드 M의 합성

0.18 g의 UDP, 41.04 g의 수크로스, 1 g의 레바우디오사이드 A, 2 g의 동결건조된 UGT-A 분말, 0.5 g의 동결건조된 UGT-B 분말, 0.5 g의 동결건조된 AtSUS1 분말, 4 mL의 다이메틸 설폭사이드 및 0.05 mol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 100 mL의 최종 부피까지 반응 시스템에 연속적으로 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 37℃의 수조에 넣고, 18시간 동안 200 rpm으로 교반하여 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 200 μl의 반응 용액을 취하고 800 μl의 무수 메탄올에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 혼합물을 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하고 여과막을 통과시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출하였다 (크로마토그래피 조건: 크로마토그래피 컬럼: 애질런트 이클립스 sb-C18 4.6 × 150 mm; 검출 파장: 210 nm; 이동상: 메탄올: 물 = 68% : 32%; 유량: 1.0 mL/분; 컬럼 온도: 30℃). 레바우디오사이드 A의 전환율은 90% 초과였다. 반응 완료 후, 300 mL의 탈이온수를 100 mL 반응 용액에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 A였다. 원심분리 후, 100 mL의 물을 침전물에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 0.5시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 B였다. 샘플 A 및 샘플 B를 혼합하여 샘플 C를 얻었고, 샘플 C를 거대다공성 흡착 수지 (AB-8)로 분리하였다. 결과물을 먼저 4 컬럼 부피의 물로 플러싱한 후, 3.5 컬럼 부피의 70% 에탄올로 용리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 얻었다. 상기 조 성생물의 용액을, 남아있는 용액이 약 10 mL가 될 때까지 감압에서 증류하고 (40 내지 50℃), 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 4 mL의 첨가된 물로 세척하고, 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 50% 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 65℃로 가열하였다. 여기에 동일 부피의 물을 첨가하여, 에탄올 농도가 25%가 되게 하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 고체 침전 후 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하여 99% 초과의 순도로 0.69 g의 레바우디오사이드 M을 얻었다.

실시예 9: 레바우디오사이드 D를 기질로서 사용하는 전세포 합성에 의한 레바우디오사이드 M의 합성

이 실시예에서 사용된 GQ-AS 재조합 세포는 UGT-A 및 AtSUS1 둘 모두를 함유하는 재조합 균주였다.

0.045 g의 UDP, 10.26 g의 수크로스, 2 mL의 톨루엔, 0.2 g의 레바우디오사이드 D, 10 g의 GQ-AS 함유 재조합 세포, 4 mL의 다이메틸 설폭사이드 및 0.05 mol/L 인산염 완충액 (pH 8.0)을 100 mL의 최종 부피까지 반응 시스템에 연속적으로 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 37℃의 수조에 넣고, 7시간 동안 200 rpm으로 교반하여 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 200 μl의 반응 용액을 취하고 800 μl의 무수 메탄올에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 혼합물을 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하고 여과막을 통과시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출하였다 (크로마토그래피 조건: 크로마토그래피 컬럼: 애질런트 이클립스 sb-C18 4.6 × 150 mm; 검출 파장: 210 nm; 이동상: 메탄올: 물 = 68% : 32%; 유량: 1.0 mL/분; 컬럼 온도: 30℃). 레바우디오사이드 D의 전환율은 90% 초과였다. 반응 완료 후, 300 mL의 탈이온수를 100 mL 반응 용액에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 A였다. 원심분리 후, 100 mL의 물을 침전물에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 0.5시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 B였다. 샘플 A 및 샘플 B를 혼합하여 샘플 C를 얻었고, 샘플 C를 거대다공성 흡착 수지 (AB-8)로 분리하였다. 결과물을 먼저 4 컬럼 부피의 물로 플러싱한 후, 3.5 컬럼 부피의 70% 에탄올로 용리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 얻었다. 상기 조 성생물의 용액을, 남아있는 용액이 약 10 mL가 될 때까지 감압에서 증류하고 (40 내지 50℃), 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 4 mL의 첨가된 물로 세척하고, 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 50% 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 65℃로 가열하였다. 여기에 동일 부피의 물을 첨가하여, 에탄올 농도가 25%가 되게 하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 고체 침전 후 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하여 99% 초과의 순도로 0.14 g의 레바우디오사이드 M을 얻었다.

실시예 10: 레바우디오사이드 A를 기질로서 사용하는 전세포 합성에 의한 레바우디오사이드 M의 합성

이 실시예에서 사용된 GQ-ABS 재조합 세포는 UGT-A, UGT-B 및 AtSUS1를 동시에 함유하는 재조합 균주였다.

0.045 g의 UDP, 10.26 g의 수크로스, 2 mL의 톨루엔, 0.2 g의 레바우디오사이드 A, 10 g의 GQ-ABS를 또한 함유하는 재조합 세포, 4 mL의 다이메틸 설폭사이드 및 0.05 mol/L 인산염 완충액 (pH 7.0)을 100 mL의 최종 부피까지 반응 시스템에 연속적으로 첨가하고, 균일하게 혼합한 후, 37℃의 수조에 넣고, 7시간 동안 200 rpm으로 교반하여 반응을 수행하였다. 반응 완료 후, 200 μl의 반응 용액을 취하고 800 μl의 무수 메탄올에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 혼합물을 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 취하고 여과막을 통과시킨 후, 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 검출하였다 (크로마토그래피 조건: 크로마토그래피 컬럼: 애질런트 이클립스 sb-C18 4.6 × 150 mm; 검출 파장: 210 nm; 이동상: 메탄올: 물 = 68% : 32%; 유량: 1.0 mL/분; 컬럼 온도: 30℃). 레바우디오사이드 A의 전환율은 40% 초과였다. 반응 완료 후, 300 mL의 탈이온수를 100 mL 반응 용액에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 1시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 A였다. 원심분리 후, 100 mL의 물을 침전물에 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 0.5시간 동안 가열하고, 초음파 처리하고, 6,700 rpm으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액은 샘플 B였다. 샘플 A 및 샘플 B를 혼합하여 샘플 C를 얻었고, 샘플 C를 거대다공성 흡착 수지 (AB-8)로 분리하였다. 결과물을 먼저 4 컬럼 부피의 물로 플러싱한 후, 3.5 컬럼 부피의 70% 에탄올로 용리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 얻었다. 상기 조 성생물의 용액을, 남아있는 용액이 약 10 mL가 될 때까지 감압에서 증류하고 (40 내지 50℃), 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 4 mL의 첨가된 물로 세척하고, 9,900 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 침전물을 50% 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 65℃로 가열하였다. 여기에 동일 부피의 물을 첨가하여, 에탄올 농도가 25%가 되게 하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 고체 침전 후 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하여 99% 초과의 순도로 0.05 g의 레바우디오사이드 M을 얻었다.

상기 실시예들은 그에 의해 본 발명의 보호 범위를 제한하기보다는 당분야에 정통한 사람들이 이해할 수 있게 하여 본 발명의 내용을 구현할 수 있게 하기 위한 목적으로 단지 본 발명의 기술적 개념 및 특징의 설명을 위해 의도된다. 본 발명의 사상 및 본질에 따라 이루어진 임의의 등가의 변경 또는 변형은 본 발명의 보호 범위에 포함되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> PEPSICO, INC. TAO, JUNHUA LI, GUOQING LIANG, XIAOLIANG LEE, THOMAS YEP, GREGORY HOU, MAOQI TAO, ANDREW <120> REBAUDIOSIDE M ENZYMATIC PREPARATION METHOD <130> 3711.819PC00/JMC/MSB <140> PCT/CN2014/071715 <141> 2014-01-28 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized nucleotide sequence <400> 1 atggaaaaca aaaccgaaac cacggtacgc cgtcgtcgtc gtatcatcct cttcccggtt 60 ccgtttcagg gtcacatcaa cccgatcctt cagttggcaa acgtactgta ctctaaaggt 120 tttagcatca ccatttttca cactaacttt aacaaaccga aaacctctaa ctatccgcac 180 ttcactttcc gcttcatcct ggacaacgac ccgcaagatg agcgcattag caacctgccg 240 acccatggcc cgctggcagg catgcgcatc cctatcatca atgaacacgg cgctgacgaa 300 ctgcgtcgtg agctggaact cctgatgctg gcttctgaag aagacgagga agtgtcttgc 360 ctgattacag acgctctctg gtactttgct cagagcgtgg cggactctct gaacctgcgc 420 cgtctggttc ttatgacttc ttccttgttt aatttccatg cgcatgtctc tctgccgcag 480 ttcgacgagc tgggctacct ggacccggat gacaaaactc gcctggagga acaggcatct 540 ggcttcccga tgctgaaagt aaaagatatc aaaagcgcat actccaattg gcagatcctg 600 aaagagattc tgggcaaaat gatcaagcag actaaagcat ccagcggcgt tatctggaac 660 tcctttaaag agctggagga aagcgaactg gaaaccgtga tccgtgaaat cccggcaccg 720 tcgttcctga ttcctctgcc taaacatctg accgcctcct cttcttctct gctggatcac 780 gatcgcaccg ttttccagtg gctggatcag caaccgccga gttctgtgct gtatgtttct 840 ttcggctcga cgagtgaggt tgacgaaaaa gacttcctgg aaatcgcacg cggcctggtt 900 gactctaaac agagctttct gtgggttgta cgtccgggtt tcgtgaaggg cagcacctgg 960 gttgaaccgc tgccggacgg ctttttgggc gaacgcggcc gtatcgtaaa atgggtaccg 1020 cagcaggagg tactggcaca cggcgcaatt ggggcgttct ggactcactc cggctggaac 1080 tccactctgg aatccgtatg cgaaggcgtt cctatgattt tcagcgactt cggcctggat 1140 cagccgctga acgcacgcta tatgtcagac gttctgaaag tcggtgtgta tctggagaac 1200 gggtgggagc gtggcgaaat tgccaacgcg atccgtcgtg ttatggtgga tgaagaaggc 1260 gaatacatcc gtcagaacgc tcgtgtcctt aaacagaaag ctgacgtgag cctgatgaaa 1320 ggtggctcta gctacgaatc gctggagtcc ctggtttctt acatctcgtc gctgtaa 1377 <210> 2 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized protein sequence <400> 2 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 3 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized nucleotide sequence <400> 3 atggacagcg gttactcttc tagctatgct gcggcagccg gtatgcacgt agttatttgt 60 ccgtggctcg ctttcggtca cctcctgccg tgcctggacc tggcgcagcg cctggcatct 120 cgtggtcacc gtgtcagttt cgttagcacg ccgcgtaaca tctcacgtct gccgccggtc 180 cgtccggctc tggccccgct ggttgcgttc gttgcgctac ctctgccgcg cgttgaaggc 240 ttaccggatg gcgcagagtc taccaacgac gtgccgcacg atcgcccgga tatggttgaa 300 ctccaccgcc gtgcatttga cggtctggca gctccgttct ccgaatttct gggtaccgcg 360 tgtgccgact gggtcatcgt agacgtattc caccactggg cagctgcagc ggctttagaa 420 cacaaagtac cgtgcgcaat gatgctgctg ggctctgctc acatgatcgc gtctattgcc 480 gaccgtcgtc tggaacgtgc agagaccgaa tctccagcgg cagccggtca gggccgtcct 540 gcagctgctc cgaccttcga agttgctcgt atgaagctca tccgcactaa aggttcttcc 600 ggtatgtcac tggcagagcg tttctcgctg acgctctccc gtagcagcct ggttgtgggg 660 cgctcctgcg tggaattcga accggaaact gtgccgctac tgtctaccct gcgtggcaag 720 ccgatcactt ttctgggtct catgccgcca ctgcacgaag gtcgccgcga agacggtgaa 780 gatgctacgg ttcgttggtt ggacgcccag ccggctaaaa gcgtcgtgta cgtagctctg 840 ggcagtgaag ttccattggg tgtcgagaaa gtgcatgaac tggctttggg tctggagctg 900 gctggcaccc gtttcctctg ggcactgcgt aagccgactg gtgtgtctga tgctgacctt 960 ctgccggctg gtttcgaaga acgtacccgt ggtcgcggcg tagtggcaac ccgctgggta 1020 ccgcagatgt ccatcctggc acacgctgct gttggcgcgt ttcttaccca ctgcgggtgg 1080 aactctacaa tcgaaggcct gatgttcggc catcctctga ttatgctgcc aatcttcggt 1140 gatcagggtc cgaacgctcg tctgatcgaa gccaaaaacg ccggcttaca agtcgcacgc 1200 aacgacggcg atggttcttt cgatcgtgaa ggtgttgcgg cagctatccg tgcagtggct 1260 gtagaagaag agtcgagcaa agtgttccag gcaaaagcca aaaagctgca ggaaatcgtt 1320 gcggacatgg cgtgccacga acgttacatc gatggcttta tccagcagct gcgctcctac 1380 aaagattaa 1389 <210> 4 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized protein sequence <400> 4 Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His 1 5 10 15 Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu 20 25 30 Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val 35 40 45 Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu 50 55 60 Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro 85 90 95 Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp 115 120 125 Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro 130 135 140 Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala 145 150 155 160 Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly 165 170 175 Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys 180 185 190 Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe 195 200 205 Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val 210 215 220 Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys 225 230 235 240 Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg 245 250 255 Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala 260 265 270 Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val 275 280 285 Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg 290 295 300 Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu 305 310 315 320 Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala 325 330 335 Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly 340 345 350 Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met 355 360 365 Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro 370 375 380 Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg 385 390 395 400 Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile 405 410 415 Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys 420 425 430 Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg 435 440 445 Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp 450 455 460

Claims

효소 방법을 사용하여 레바우디오사이드(Rebaudioside) M을 제조하기 위한 방법으로서, 레바우디오사이드 A 또는 레바우디오사이드 D를 기질로서 사용하고, 수크로스 및 UDP의 존재 하에서, UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소(synthetase)의 혼합물, 또는 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소를 함유하는 재조합 세포의 촉매작용 하에서 기질의 반응으로 레바우디오사이드 M을 생성하고 - 상기 반응은 20 내지 60℃의 온도 및 pH 5.0 내지 9.0에서 수성-상(aqueous-phase) 시스템에서 수행되고, 여기서, 초기 반응 시스템에서, 레바우디오사이드 A는 10 g/L 이상의 농도를 갖고, 레바우디오사이드 D는 15 g/L 이상의 농도를 가짐 -, 반응 후, 반응 용액을 원심분리한 후, 상청액을 거대다공성 흡착 수지(macroporous adsorbent resin)로 분리하여 레바우디오사이드 M의 조 생성물(crude product)의 용액을 얻고, 이를 에탄올 수용액에서 결정화하여 98% 초과의 순도로 레바우디오사이드 M 생성물을 얻도록 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 초기 반응 시스템에서, 상기 레바우디오사이드 A는 10 내지 30 g/L의 농도를 갖고, 상기 레바우디오사이드 D는 15 내지 50 g/L의 농도를 갖는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나(Stevia rebaudiana)로부터 유래한 UGT-A 및/또는 오리자 사티바(Oryza sativa)로부터 유래한 UGT-B인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응은 35℃ 내지 45℃의 온도 및 pH 6.5 내지 8.5에서 수성-상 시스템에서 수행되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 및 수크로스 합성효소를 함유하는 재조합 세포는 촉매작용을 수행하기 위해 상기 반응에 사용되고, 상기 초기 반응 시스템은 부피비에 따라 1% 내지 3%의 농도로 톨루엔 또는 기타 세포 투과제를 추가로 함유하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 UDP-글루코실 트랜스퍼라제 대 상기 수크로스 합성효소의 중량비가 1:0.2 내지 0.4인, 방법.
제1항에 있어서, 다음과 같이 구현되는, 방법:
상기 반응에 사용되는 모든 원료들을 반응 케틀(reaction kettle)에 넣고, 수성-상 시스템으로 최종 부피에 이르게 하고, 균일하게 혼합한 후, 설정 온도에 두고, 반응을 위해 교반함.
제1항에 있어서, 상기 재조합 세포는 미생물 세포인, 방법.
제8항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 사카로미세스 세레비시아이(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 레바우디오사이드 A이고, 상기 UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 및 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 혼합물이고, 여기서 상기 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A의 아미노산 서열은 서열 2와 80% 이상 일치하고 상기 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 아미노산 서열은 서열 4와 80% 이상 일치하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 및 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 혼합물에서, 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A 대 오리자 사티바로부터 유래한 UGT-B의 중량비가 3 내지 5:1인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 레바우디오사이드 D이고, 상기 UDP-글루코실 트랜스퍼라제는 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A이고, 스테비아 레바우디아나로부터 유래한 UGT-A의 아미노산 서열은 서열 2와 80% 이상 일치하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 반응 후 및 상기 원심분리 전의 상기 반응 용액은 먼저 50 내지 60℃에서 가열되고 50 내지 70분 동안 초음파 처리되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액은 다음과 같은 특정 단계들에 의해 에탄올 수용액에서 결정화되는, 방법:
레바우디오사이드 M의 조 생성물의 용액을 감압에서 증류에 의해 농축한 후 원심분리하고, 상청액을 폐기하는 단계; 침전물을 첨가된 물로 세척한 후 원심분리하고, 상청액을 폐기하는 단계; 침전물을 부피비에 따라 40% 내지 70%의 농도로 에탄올 수용액으로 현탁하고, 가용화를 위해 60 내지 70℃에서 가열하고, 에탄올 수용액이 부피비에 따라 20 내지 30%의 농도를 가질 때까지 여기에 물을 첨가하는 단계; 및 혼합물을 서서히 실온으로 냉각하고, 결정화 및 고체의 침전을 실시한 후, 흡인 여과 및 진공 건조를 실시하는 단계.