CN115678867B - 一种蔗糖合成酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蔗糖合成酶及其应用。其中，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQID NO:11相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：第36位氨基酸为V；第43位氨基酸为E；第179位氨基酸为A；第395位氨基酸为R；第447位氨基酸为P：第455位氨基酸为L；第654位氨基酸为R；并具有不低于如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的蔗糖合成酶活性。本发明联合使用葡萄糖基转移酶与蔗糖合酶催化合成莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M，实现级联反应；解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供原料选择的多种可能性，为进一步实现大规模工业化生产提供更多工艺条件优化的选择，更利于实现大规模工业化。

Description

一种蔗糖合成酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蔗糖合酶及其应用。
背景技术
甜菊糖苷(Steviol glycosides，又称甜菊醇糖苷)是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然甜味剂，是多种糖苷的混和物，不同甜菊糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊糖苷具有纯天然(来自纯天然植物甜叶菊)、高甜度(蔗糖的250～450倍)、低热量(仅为白糖的1/300)、使用成本低(成本仅为蔗糖的三分之一)、稳定性好(耐热、耐酸、耐碱，不易出现分解现象)、安全性高(无毒副作用)等优点，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效。
甜菊糖苷(甜菊糖苷类化合物)的结构式如下：
上述甜菊糖苷，具有共同的糖苷配基：甜菊醇(Steviol)，区别在于C-13和C-19位置连接的糖基的数量和类型，主要包括甜菊苷(Stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A，简称RA)、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D，简称RD)、莱鲍迪苷E、杜克苷、甜菊双糖苷等八种糖苷。甜菊的叶子能够累积多达10-20％(基于干重)甜菊醇糖苷。甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10％)、甜菊苷(2-10％)和莱鲍迪苷C(1-2％)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0-0.2％)。
虽然甜菊糖苷是一种高倍甜味剂，但存在后苦涩味这一缺点，严重限制了其在食品、饮料等对口感要求较高的领域中的应用。而引起甜菊糖苷后苦涩味的本质原因是其内在分子结构引起的，甜菊糖苷中的R1和R2基团上连接糖基数量越多口感越好。通常，发现甜菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪苷A为150至320倍，然而，即使在高度纯化的状态下，甜菊醇糖苷A仍然具有不合需要的味道属性，如苦味、甜的余味、甘草味等。
莱鲍迪苷D是其中最有应用潜力的甜菊糖苷，与其它甜菊糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的300-350倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，没有苦味和甘草异味，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。甜叶菊叶子中莱鲍迪苷D的含量极少(少于5％)，采用提取法生产莱鲍迪苷D需要大量的甜叶菊原料，另外富集莱鲍迪苷D的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。
莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，Reb M，简称RM)具有更好的口感特性，但其占叶子干重的含量小于0.1％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的莱鲍迪苷M已引起了学者的关注。目前报道，来源甜叶菊的重组酶能催化莱鲍迪苷D生成莱鲍迪苷M，但产量较低。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶产率有待进一步优化；(2)用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷D含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D也是亟待解决的难题。
葡萄糖基转移酶是在酶反应中只转移葡萄糖基的酶，该酶的作用机理是催化糖基供体的葡萄糖残基转移到糖基受体分子上，从而调节受体分子的活性。
“核苷(necleoside)”指包含核碱基(即含氮碱基)和5-碳糖(例如核糖或脱氧核糖)的糖基胺(glycosylamines)。核苷的非限制性实例包括胞苷(cytidine)、尿苷(uridine)、腺苷(adenosine)、鸟苷(guanosine)、胸苷(thymidine)和肌苷(inosine)。
“核苷二磷酸(nucleoside diphosphate)”指包含核碱基(即含氮碱基)、5-碳糖(例如核糖或脱氧核糖)和二磷酸(即焦磷酸)部分的糖基胺。“核苷二磷酸”可缩写为“NDP”。核苷二磷酸的非限制性实例包括胞苷二磷酸(CDP)、尿苷二磷酸(UDP)、腺苷二磷酸(ADP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)和肌苷二磷酸(IDP)。
UDP-葡萄糖是二磷酸尿苷葡糖(uridine diphosphate glucose)的简称，又简称为UDP-葡糖或者UDPG，是由尿苷二磷酸和葡萄糖组成的维生素，可看作“活性葡萄糖”，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞内，在蔗糖、淀粉、糖原及其他寡糖和多糖合成中作葡萄糖基的供体，是最常见的一种糖基供体。除UDP-葡萄糖外，ADP-葡萄糖、TDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖(deoxythymidine diphosphate glucose)、CDP-葡萄糖、IDP-葡萄糖或GDP-葡萄糖等也常作为糖供体化合物。这些糖基供体价格昂贵，不利于工业化生产。
蔗糖合成酶(sucrose synthase，SUS，也简称SuSy/SS等，EC2.4.1.13)，其可逆地催化化学反应NDP-葡萄糖+D-果糖到NDP和蔗糖，属于糖基转移酶-4亚家族在小麦(Triticum aestivum)胚芽中首次被鉴定。每个蛋白以四聚体的形式存在。每个亚基分子量在90kDa左右。基因大小一般为5.9kb,cDNA大小为2.7kb左右。编码氨基酸序列全长约800个氨基酸残基(Ross和Davies 1992)。蔗糖合成酶对NDP亲和力不同，亲和力大小依次为UDP>ADP>dTDP>CDP>GDP。
目前生物酶法合成莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M的方法需要外加昂贵的原料UDP-葡萄糖或ADP-葡萄糖，通过UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，简称UGT)的作用，以甜菊苷为起始原料，催化生成莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M；或者以莱鲍迪苷A为起始原料，催化生成莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。但由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷D的可行性，成本较高、缺乏市场竞争力。
如今，随着天然甜味剂甜菊糖的广泛应用，以及生物催化技术的日益发展，糖基转移酶被越来越多地应用在甜菊糖苷的生物催化制备的领域中来。亟待解决原料UDPG昂贵的问题，以提高甜菊糖苷生产效益。UDPG可由蔗糖合酶催化蔗糖和UDP而再生，因此，有必要对蔗糖合成酶进行改造，从而获得酶活更高、稳定性更好的改造酶，以便于更好的实现UDPG的再生，从而实现甜菊糖苷的工业化大生产。
发明内容
发明所要解决的技术问题是现有的蔗糖合成酶被应用于甜菊糖苷的生物催化制备时酶活低、稳定性差因而用于催化甜菊糖苷时转化率不高等缺陷，因此本发明提供一种蔗糖合成酶以及其在制备甜菊糖苷中的应用。本发明的蔗糖合成酶的酶活高、稳定性好；本发明以甜菊苷为原料，联合使用葡萄糖基转移酶(GT)与蔗糖合酶(SUS)催化合成RD或RM，实现级联反应；既可以使用蔗糖和UDP来实现UDPG再生，也可以使用蔗糖和ADP来实现ADPG再生，解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供原料选择的多种可能性，为进一步实现大规模工业化生产提供更多工艺条件优化的选择，更利于实现大规模工业化。
本发明第一方面提供一种蔗糖合成酶，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ IDNO:11相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：
第36位氨基酸为V；
第43位氨基酸为E；
第179位氨基酸为A；
第395位氨基酸为R；
第447位氨基酸为P：
第455位氨基酸为L；
第654位氨基酸为R；并具有不低于如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的蔗糖合成酶活性。
所述差异可以是在SEQ ID NO:11上进行突变，也可以是其它序列上进行突变，只要最终结果体现为其氨基酸序列与SEQ ID NO:11有上述差异即可。
较佳地，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:11相比的氨基酸残基差异为：
第36位氨基酸为V；或，
第43位氨基酸为E；或，
第179位氨基酸为A；或，
第395位氨基酸为R；或，
第447位氨基酸为P；或，
第455位氨基酸为L；或，
第654位氨基酸为R。
本发明第二方面提供一种分离的核酸，所述核酸编码如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶。
本发明第三方面提供一种重组表达载体，其包含如本发明第二方面所述的核酸。
本发明第四方面提供一种转化体，其为包含如本发明第二方面所述的核酸或如本发明第三方面的重组表达载体的宿主细胞。
较佳地，所述宿主细胞为埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)例如E.coli BL21(DE3)。
本发明第五方面提供一种制备如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶的方法，所述方法包括在适于表达所述蔗糖合成酶的条件下培养如本发明第四方面所述的转化体。
本发明第六方面提供一种组合物，其包含如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶中的一种或多种。
优选地，所述组合物包括如SEQ ID NO:9、10和/或SEQ ID NO:11所示序列的酶。
本发明第七方面提供一种糖基供体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
在如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶的存在下，将蔗糖与核苷二磷酸进行反应，即得所述糖基供体；所述核苷二磷酸为UDP、dTDP、TDP、CDP、IDP、GDP或ADP，
较佳地，所述糖基供体的制备方法满足以下一种或多种条件：
所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；
所述蔗糖合酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)，优选3:200；
所述蔗糖与所述核苷二磷酸的质量比为100:0.5～300:0.1；优选为200:0.1；
所述蔗糖的浓度优选为50-300g/L例如200g/L。
本发明一较佳实施例中，上述蔗糖合成酶菌体的制备方法如下：(1)将含有点突变的蔗糖合成酶的基因工程菌培养至OD600达到0.5～1.0例如0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1～0.3mM例如0.1mM，20～28℃例如25℃诱导培养16～26h例如20h。(2)培养结束后，将培养液3000～5000rpm例如4000rpm离心10～30min例如20min，弃上清液，收集菌体。进一步将收集的菌体使用PBS(20～100mM例如50mM、pH 5～7例如6.0)按1:5～20例如1:10(M/V、g/mL)进行悬浮后使用高压均质机进行均质(例如550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经离心例如12000rpm离心2min取上清即获得所述蔗糖合成酶菌体。
本发明第八方面所述一种莱鲍迪苷D的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶、SEQ ID NO:9、10和SEQ ID NO:11中的一种或多种的存在下，将莱鲍迪苷A、糖基转移酶、蔗糖和核苷二磷酸进行反应，即得莱鲍迪苷D；
较佳地：所述莱鲍迪苷D的制备方法满足以下一种或多种条件：
所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；
所述糖基转移酶以糖基转移酶菌体、粗酶液、纯酶、纯酶液或固定化酶的形式存在；
所述莱鲍迪苷A的浓度1-150g/L，优选50g/L、60g/L；
所述蔗糖的浓度优选为50-300g/L例如200g/L；
所述蔗糖合酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)；优选3:200；
更佳地，所述糖基转移酶菌体与所述莱鲍迪苷A的质量比为(0.1-2):1，例如0.24:1、0.3:1；
所述反应的反应溶剂为水，pH为5-8，优选6，所述pH由缓冲溶液控制，优选磷酸缓冲溶液；
所述反应时的转速为500-1000rpm，优选600rpm；
所述反应的反应体系的温度为20-90℃，优选60℃。
较佳地，所述糖基供体与莱鲍迪苷A的摩尔比为1:1～5:1；
所述糖基供体通过如本发明第七方面所述的制备方法获得。
本发明第九方面提供一种莱鲍迪苷M的制备方法，其包括根据如本发明第八方面所述的制备方法制备莱鲍迪苷D的步骤。
本发明第十方面提供一种如本发明第一方面所述的蔗糖合成酶、SEQ ID NO:9、10和/或SEQ ID NO:11中的一种或多种在制备甜菊糖苷中的用途。
较佳地，所述甜菊糖苷为莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的蔗糖合成酶的酶活高、稳定性好；将其用于制备甜菊糖苷(例如莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M)时与蔗糖合成酶亲本相比，在催化活性方面有了明显的提高，转化率显著提升；本发明以甜菊苷为原料，联合使用葡萄糖基转移酶(GT)与蔗糖合酶(SUS)催化合成RD或RM，实现级联反应；本发明的蔗糖合成酶可以以ADP、UDP为底物，其中以ADP为底物时活性最高，即本发明可以使用蔗糖和UDP来实现UDPG再生，也可以使用蔗糖和ADP来实现ADPG再生，解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供原料选择的多种可能性，为进一步实现大规模工业化生产提供更多工艺条件优化的选择，更利于实现大规模工业化。
附图说明
图1为本发明的一个实施方式的由甜菊苷制备莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M的路线示意图。
图2为底物莱鲍迪苷A对照品的图谱，保留时间14.186min。
图3为产物莱鲍迪苷D对照品的图谱，保留时间11.821min。
图4为产物莱鲍迪苷M对照品的图谱，保留时间12.316min。
图5显示了表7中第二轮筛选中亲本酶Enz.8催化合成RD(ADP为底物，反应时间30min)活性的HPLC图。
图6显示了表7中第二轮筛选中突变体Enz.11催化合成RD(ADP为底物，反应时间30min)活性的HPLC图。
图7显示了表8中亲本酶Enz.8催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图。
图8显示了表8中Enz.11催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
表1
所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
表2
KOD Mix酶购自TOYOBO CO.，LTD.，DpnI酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；E.coli Trans10感受态细胞与E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。pGro7质粒购自上海北诺生物科技有限公司。蔗糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司。RebA对照品购自麦克林。RebD和RebM对照品购自青岛思远甜菊国际贸易有限公司。
转化率HPLC检测方法：色谱柱：ZORBAXEclipse plus C18(4.6mm*150mm，3.5um)。流动相：0.1％TFA水溶液为流动相A，0.1％TFA乙腈溶液为流动相B，按下表3进行梯度洗脱。检测波长：210nm；流速：1ml/min；进样体积：20μl；柱温：35℃。如附图2所示，RebA出峰时间：14.186min；如附图3所示，Reb D出峰时间：11.821min。如图4所示，Reb M出峰时间：12.316min。
表3
Time(min) A％ B％
0.00 90 10
15.00 60 40
20.00 0 100
24.00 0 100
24.10 90 10
32.00 90 10
实施例1：第一轮蔗糖合成酶的制备
全基因合成表4中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的编号为Enz.1、Enz.2、Enz.3、Enz.4、Enz.5、Enz.6、Enz.7、Enz.8的蔗糖合成酶酶基因，并分别接入pET28a质粒载体(酶切位点NdeI、HindIII)，得到重组质粒pET28a-Enz.1、pET28a-Enz.2、pET28a-Enz.3、pET28a-Enz.4、pET28a-Enz.5、pET28a-Enz.6、pET28a-Enz.7、pET28a-Enz.8，经过测序验证基因成功连接到相应的载体上。基因合成公司为生工生物工程(上海)股份有限公司(上海市松江区香闵路698号)。
分别将各重组质粒pET28a-Enz.1、pET28a-Enz.2、pET28a-Enz.3、pET28a-Enz.4、pET28a-Enz.5、pET28a-Enz.6、pET28a-Enz.7、pET28a-Enz.8与pGro7质粒(该质粒表达伴侣蛋白，可以增加目标蛋白的溶解性)共转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，分别得到含有各蔗糖合成酶基因的工程菌株。分别将含有蔗糖合成酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素和25μg/mL氯霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素和25μg/mL氯霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。
将收集的菌体使用PBS(50mM、pH 6.0)按1:10(M/V、g/mL)进行悬浮，之后使用高压均质机进行均质(550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经12000rpm离心2min取上清即获得蔗糖合成酶反应酶液。
表4
实施例2：β-1,2-糖基转移酶的制备
根据如核苷酸序列SEQ ID NO:12所示的β-1,2-糖基转移酶(酶编号Enz.9，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列获得该酶的氨基酸序列)的基因，全基因合成一套β-1,2-糖基转移酶基因，该基因连接在pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-1,2GT。基因合成公司：生工生物工程(上海)股份有限公司。
将质粒pET28a-1,2GT转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有β-1,2-糖基转移酶基因的工程菌株。
将含有β-1,2-糖基转移酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至其终浓度为0.1mM，24℃诱导培养22h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
配制50mM、pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将收集的菌体按照1:10(M/V，g/mL)进行悬浮，之后，进行高压均质(550～600Mbar、1min)，经12000rpm离心2min，取上清获得β-1,2-糖基转移酶的粗酶液。
实施例3：第一轮蔗糖合成酶的筛选
以Reb A(含量96％)为底物(购自毕得医药)，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液150μL，Reb A终浓度为50g/L，ADP或UDP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应1h，然后取10μL反应液加入190μL pH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min，取上清液进行HPLC分析Reb D的浓度(详见表5的RD％)。
表5
蔗糖合成酶 RD％(ADP) RD％(UDP)
Enz.1 0.82 2.50
Enz.2 0.53 0.34
Enz.3 15.96 13.98
Enz.4 1.11 0.59
Enz.5 18.97 8.71
Enz.6 10.99 1.66
Enz.7 4.66 0.09
Enz.8 38.70 7.03
表5中结果显示：以ADP为蔗糖合成酶催化底物时，Enz.8酶活最高，其次是Enz.5、Enz.3；以UDP作为蔗糖合成酶催化底物时，Enz.3酶活最高，其次是Enz.5、Enz.8，且Enz.3、Enz.5、Enz.8采用ADP的活性都高于其采用UDP的活性，且Enz.8采用ADP时效果最好。所以，下一轮以ADP为蔗糖合成酶底物，在Enz.8的基础上进行突变和筛选。
实施例4：第二轮蔗糖合成酶突变体的制备
以重组质粒pET28a-Enz.8为模板，采用表6所示的引物序列，分别以Enz.X-F/Km-R和Km-F/Enz.X-R为引物(其中Enz.X为：Enz.10、Enz.11、Enz.12、Enz.13、Enz.14、Enz.15、Enz.16)采用KOD酶进行PCR扩增目标DNA片段和载体片段。
表6
PCR扩增反应体系为：
KOD Mix：25μL
ddH2O：20μL
引物：2μL*2
模板：1μL。
PCR程序：
(1)98℃3min
(2)98℃10s
(3)55℃5s
(4)68℃5s/kbp
(5)68℃5min
(6)12℃保温
(2)～(4)循环34次。
对PCR产物进行DpnI消化并进行跑胶及胶回收得到目标DNA片段。采用购自诺唯赞的两片段同源重组酶(Exnase CE II)进行重组连接，连接后转化至E.coli Trans 10感受态细胞，涂布含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上，于37℃倒置培养过夜；挑取单菌落至LB试管(Km抗性)，培养8～10h，提取质粒进行测序鉴定，得到含有目标突变体基因的重组质粒。
将测序正确的重组质粒转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有点突变的蔗糖合成酶基因工程菌株。将含有蔗糖合成酶基因的工程菌株经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养4h。按2％(v/v)接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液4000rpm离心20min，弃上清液，收集菌体。-20℃保存备用。
将收集的菌体使用PBS(50mM、pH 6.0)按1:10(M/V、g/mL)进行悬浮，之后使用高压均质机进行均质(550Mbar均质1.5min)，将均质后的酶液经12000rpm离心2min取上清即获得反应酶液。
实施例5：第二轮蔗糖合成酶突变体的筛选
以Reb A(含量96％)为底物，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液150μL，Reb A终浓度为50g/L，ADP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，蔗糖合成酶反应酶液30μL，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应30min后，分别取10μL反应液加入190μL pH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min，取上清进行HPLC分析Reb D的浓度(RD％)；分析结果如表7所示。
表7
酶 突变位点 密码子 RD％(30min)
Enz.10 E36V CTA 25.049
Enz.11 S43E GAA 35.652
Enz.12 R179A GCC 23.447
Enz.13 L395R CGG 33.283
Enz.14 R447P CCT 34.315
Enz.15 E455L CTA 22.093
Enz.16 D654R CGT 35.113
Enz.8 / / 31.212
结果显示：反应起始的30min内，Enz.11的反应活性最高，其相较于亲本Enz.8提高了10％，其次是Enz.16、Enz.14、Enz.13，它们的反应活性相对于亲本Enz.8提高了5％-10％。
图5的A显示了表7中第二轮筛选中亲本酶Enz.8催化合成RD(ADP为底物，30min)活性的HPLC图，图5的B为A的峰图信息。
图6的A显示了表7中第二轮筛选中突变体Enz.11催化合成RD(ADP为底物,30min)活性的HPLC图，图6的B为A的峰图信息。
实施例6：β-1,3-糖基转移酶Enz.17的制备
根据如核苷酸序列SEQ ID NO:29所示的β-1,3-糖基转移酶(酶编号Enz.17，本领域技术人员可根据如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列获得该酶的氨基酸序列)的基因，全基因合成一套β-1,3-糖基转移酶基因，该基因已连接在pET28a质粒载体上得到重组质粒pET28a-Enz.17。基因合成公司：生工生物工程(上海)股份有限公司。
将质粒pET28a-Enz.17转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌株。
将含有β-1,3-糖基转移酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，24℃诱导培养22h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
配制50mM pH6.0的磷酸缓冲液(PBS)，将收集的菌体按照1:10(M/V,g/mL)进行悬浮，之后，进行高压均质(550Mbar、1.5min)，经12000rpm离心2min，取上清获得β-1,3-糖基转移酶的反应酶液。
实施例7：RM合成反应
以Reb A 60(Reb A含量为60％，甜菊苷含量约30％，晨光生物，产品规格TSG90/RA60)为底物，1mL反应体系中，加入β-1,2-糖基转移酶的反应酶液120μL，蔗糖合成酶反应酶液30μL，β-1,3-糖基转移酶的反应酶液150μL，RA60终浓度为100g/L，ADP终浓度为0.1g/L，蔗糖终浓度为200g/L，最后加入50mM pH6.0磷酸缓冲液至终体积1mL。将配制好的反应体系置于金属浴中，60℃，600rpm下反应，分别在4h、7h、过夜后取10μL反应液加入190μLpH2.0的盐酸进行涡旋，再加入800μL去离子水，混匀，13000rpm离心10min取上清液进行HPLC分析Reb A、中间产物Reb D和产物Reb M的浓度(RA％、RD％、RM％)，反应结果如表8所示(其中RA％、RD％和RM％分别指底物、中间产物和产物在反应后反应液中的浓度)，该实施例中的反应路线如图1所示。
表8
结果：从反应4h、7h和过夜反应上看：Enz.14的反应效果(RM％)最好，其次是Enz.11，且均优于Enz.8。
图7的A显示了表8中亲本酶Enz.8催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图，图7的B为A的峰图信息。
图8的A显示了表8中Enz.11催化合成RM(反应7H)活性的HPLC图，图8的B为A的峰图信息。
SEQUENCE LISTING
<110> 弈柯莱生物科技（上海）股份有限公司
<120> 一种蔗糖合成酶及其应用
<130> P21015903C
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2427
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.1的核苷酸
<400> 1
atggctaacg ctgaacgtat gatcacccgc gtgcactctc agcgtgaacg tctgaacgaa 60
accctggtga gcgaacgtaa cgaagttctg gctctgctgt ctcgtgttga agctaaaggt 120
aaaggcatcc tgcaacagaa ccagatcatt gcggagttcg aagcgctgcc ggaacagact 180
cgcaaaaaac tggaaggtgg cccgttcttc gatcttctga aaagcaccca ggaagcgatc 240
gtcctgccgc cgtgggtggc gctggcggtt cgtccgcgcc ctggtgtgtg ggaatacctg 300
cgcgtgaacc ttcacgcact ggttgtggaa gaactgcaac cggccgagtt tctgcacttt 360
aaagaagaac tggtggacgg cgttaaaaac ggcaacttta ccctggaact ggatttcgaa 420
ccgttcaacg caagcatccc gcgtccgacc ctgcataaat acatcggcaa cggcgtggac 480
ttcctgaacc gtcacctgag cgcgaaactg ttccatgaca aagaaagcct cctgccgctg 540
ctgaaatttc tgcgtctgca cagccatcaa ggtaaaaacc tgatgctgtc tgaaaaaatc 600
cagaacctga acaccctcca gcacaccctg cgtaaagctg aagaatatct ggcggaactg 660
aaatccgaga ctctgtatga agaatttgaa gcgaaattcg aagaaattgg tctggaacgt 720
ggctggggtg ataacgcgga acgcgtgctc gatatgatcc gcctgctgct ggacctgctg 780
gaggcaccgg acccgtgcac cctggaaacc ttcctcggcc gcgtaccgat ggtttttaat 840
gtagttatcc tgtccccgca cggctacttt gcgcaggaca atgtactggg ttacccggac 900
accggtggcc aggtggtcta cattctggat caggttcgtg cgctggaaat cgaaatgctg 960
caacgtatca aacagcaggg tctgaacatt aaaccgcgca tcctgattct gacccgcctg 1020
ctgccggatg ccgtaggcac cacctgcggc gaacgcctgg aacgcgtgta tgactctgaa 1080
tactgtgaca tcctgcgcgt tccgttccgc accgaaaaag ggatcgtgcg taaatggatc 1140
agccgcttcg aagtttggcc gtacctggaa acttacaccg aagatgcggc agttgaactg 1200
tctaaagaac tgaacggtaa accggacctg atcatcggca actactctga cggcaacttg 1260
gtggcgagcc tgctggctca caaactgggc gttacccagt gcaccattgc acacgcactg 1320
gaaaaaacca aatacccgga ttccgatatt tattggaaaa aactggacga taaataccac 1380
ttcagctgcc agttcaccgc ggacatcttc gctatgaacc acaccgactt catcatcacc 1440
tccacctttc aggaaattgc aggttctaaa gaaaccgtgg gccagtacga atcccacact 1500
gcattcactt taccaggtct gtatcgcgtt gttcacggca tcgatgtttt cgatccgaaa 1560
ttcaacatcg ttagcccagg cgccgatatg agcatctatt tcccgtacac tgaagaaaaa 1620
cgtcgtctga ccaaatttca ctctgaaatt gaagaactgc tgtatagcga cgttgaaaac 1680
aaagaacatc tgtgtgtgct gaaagataag aaaaaaccaa tcctgttcac gatggcccgc 1740
ctggaccgtg tgaaaaacct gtctggcctg gtggaatggt acggtaaaaa cacccgctta 1800
cgtgaactgg cgaacctggt ggttgttggt ggtgaccgcc gtaaagaatc taaagataac 1860
gaagaaaaag cggagatgaa aaagatgtat gatctgattg aagaatataa actgaacggc 1920
cagttccgct ggatttctag ccagatggac cgcgttcgta acggtgaact gtaccgttac 1980
atctgcgaca ccaaaggtgc gtttgttcag ccggctctgt atgaggcatt cggtctgacc 2040
gttgttgaag cgatgacctg cggcctcccg accttcgcga cgtgcaaagg cggtccggcg 2100
gaaatcatcg ttcacggcaa atctggtttc cacattgacc cgtaccacgg cgatcaggcg 2160
gctgataccc tggctgactt ctttaccaaa tgcaaagaag atccgtccca ctgggacgaa 2220
atctctaaag gtggtctgca acgtattgaa gaaaaatata cctggcagat ctatagccag 2280
cgtctgctga ccctgaccgg tgtttacggc ttctggaaac atgtaagcaa cctggatcgc 2340
ctggaagcgc gtcgctacct ggaaatgttc tatgcgctga aatatcgccc gctggcacaa 2400
gcggtgccgc tggcgcagga tgactaa 2427
<210> 2
<211> 2418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.2的核苷酸
<400> 2
atggctgaac gtgtgctgac ccgtgtgcac tccctgcgcg aacgcgttga tgcgaccctg 60
gccgcacacc gtaacgaaat cctgctgttt ctgtctcgca ttgaatccca cggcaaaggc 120
attctgaaac cgcacgaact gctggccgaa tttgacgcga ttcgtcagga tgacaaaaac 180
aaactgaacg aacacgcgtt cgaagaactg ctgaaatcca ctcaggaagc gatcgtgctg 240
ccgccgtggg tagctctggc aattcgtctg cgtccaggcg tgtgggaata cattcgtgtg 300
aacgttaacg ccctggtggt cgaagaactg agcgttccgg aatatttgca gtttaaagaa 360
gaactggttg acggtgcctc caacggcaac ttcgtgctgg aactggactt tgaaccgttc 420
accgcgtctt tcccgaaacc gaccctgacc aaatccatcg gtaacggtgt tgagttcctg 480
aaccgccacc tgtccgcaaa aatgttccac gacaaagaaa gcatgacccc tctgctggaa 540
tttctgcgcg cacatcacta taaaggtaaa accatgatgc tgaacgatcg catccagaac 600
tccaacaccc tccagaacgt tctgcgtaaa gcggaagaat acctgatcat gttgccgccg 660
gaaaccccgt acttcgagtt cgaacacaaa ttccaggaga tcggcctgga gaaaggctgg 720
ggcgacaccg ccgaacgtgt tcttgaaatg gtgtgtatgt tgctggatct gctggaagcg 780
ccggatagct gcaccctcga aaaattcctg ggtcgcatcc cgatggtgtt taacgtcgtt 840
atcctgtctc cgcacggtta ctttgctcag gagaacgtcc tgggctatcc ggataccggc 900
ggccaggttg tatatatcct ggaccaggtt ccggcgctgg aacgtgaaat gctgaaacgt 960
atcaaagaac agggcctgga tattatcccg cgcattctga ttgttacccg tctgctgccg 1020
gacgcggtgg gcaccacctg cggtcagcgt atcgaaaaag tgtacggtgc ggaacactct 1080
cacattctgc gcgtgccatt tcgcaccgaa aaaggcattg tgcgcaaatg gatctcacgc 1140
ttcgaagttt ggccttacat ggaaactttc atcgaagatg tggcgaaaga gatctccgca 1200
gaactccagg cgaaaccgga tctgatcatc ggtaactatt ccgaaggcaa cctggccgct 1260
agcctgctgg cgcataaact gggcgttact cagtgcacta ttgcgcacgc gctggaaaaa 1320
accaaatatc cggattctga catctactgg aaaaaatttg atgaaaaata ccacttctca 1380
agccagttta ccgctgacct gatcgcaatg aaccacactg acttcatcat cacctccacc 1440
ttccaggaaa tcgctggttc aaaagacacc gtcggccagt acgaatccca catggcgttc 1500
accatgccgg gtctgtatcg cgttgttcac ggtattaacg tgttcgaccc gaaatttaat 1560
atcgtgtcgc cgggcgccga tattaacctg tacttcagct acagcgaaac cgaaaaacgc 1620
ctgactgcgt ttcacccgga aatcgacgaa ctgctgtatt ccgacgttga aaacgatgaa 1680
cacctgtgtg tgctgaaaga tcgtaccaaa ccgatcctgt tcactatggc ccgcctggat 1740
cgtgttaaaa acctgaccgg tctggttgaa tggtacgcga aaaacccgcg tctgcgcggc 1800
ctggtgaacc tggttgtggt aggtggtgat cgccgtaaag aatctaaaga tctggaagaa 1860
caggcggaaa tgaagaaaat gtatgaactg atcgaaaccc ataacctgaa cggccagttt 1920
cgttggatct ctagccagat gaaccgcgtt cgtaacggtg aactgtatcg ttacatcgct 1980
gacaccaagg gcgcgttcgt tcagccggca ttctacgaag cattcggcct gaccgttgtg 2040
gaagctatga cctgcggtct gccgactttt gcgactaatc atggcggtcc ggccgagatt 2100
atcgtacatg gtaaatctgg cttccacatt gatccgtacc acggcgaaca ggccgctgat 2160
ctgctggctg atttctttga aaaatgcaaa aaagacccgt cccattggga aaccatttct 2220
atgggcggcc tcaaacgtat cgaagaaaaa tacacctggc agatctactc tgaaagcctg 2280
ctgaccctgg cggctgtgta cggtttctgg aaacatgtgt ctaaactgga tcgtctggaa 2340
atccgtcgct acctggaaat gttctacgcg ctgaaatacc gtaaaatggc ggaagcggtg 2400
ccgctggcgg cggaataa 2418
<210> 3
<211> 2460
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.3的核苷酸
<400> 3
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gtagaaagcg acgaacgtgc cgacctgcgc cagttttcac gcattctgca actgggcgaa 120
aaacgctacc tgctgcgcaa cgacattctg gatgcgtttg cagactattg ccgcgatcaa 180
gaacgcccgg tgccaccacc gagcgaaagc cgtctgagca aactggtctt ctatacccag 240
gaaattatcg tggataacga atcactgtgt tggatcgttc gtccacgtat tgcacagcag 300
gaagtgtgcc gtttactggt cgaagacctg accattgtgc cgatgaccat cccggagctg 360
ctggatctgc gtgaccgctt ggtgaaccat tatcatccga acgaaggcga cgtgtttgag 420
attgatgtgc aaccgtttta tgactatagc ccaatcatcc gtgatgcgaa aaacatcggt 480
aagggcgtcg agttcctgaa ccgctatctt agctcgaagc tgttccagga cccgcgccaa 540
tggcaacaga acctgttcaa cttcctgcgc attcatcgct acaatggcta ccagctgctg 600
attaacgagc gcattcgtag tccgcagcat ctgagcgaac aggtcaaaca agcactggtt 660
gtgctgagcg atcgtccacc aactgaagcc tatagcgagt ttcgcttcga gctgcaaaac 720
ctgggttttg aaccaggttg gggcaatacc gttgcacgtg ttcgtgacac cctggaaatt 780
ctggaccagc tgctggatag cccggaccat caagttctgg aagcgtttgt gagccgcatc 840
ccaatgctgt tccgcattgc actgatttcg ccgcatggtt ggttcggtca ggaaggtgtt 900
ctgggtcgtc cagatacggg tggtcaggtt gtgtatatcc tggaccaggt gaagagtctg 960
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aagatcatcg ttctgacccg cctcattcca aatgcggaag gcaccctgtg taaccaacgt 1080
ctggaaaaga tttacggcac caatgatgcg tggattctgc gcgttccatt tcgcgagttc 1140
aacccgaaag tcacgcagaa ttggattagc cgctttgaga tctggccgta cctggaaacc 1200
tttgcgattg acgccgaacg tgaactgcgt gcagaatttg gtcatgtacc ggatctgatc 1260
atcggcaatt atagcgacgg taatttggtt gcgttcctgt tagcgcgtcg cttaaaggtg 1320
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atgaatgcag cgaatttcat cattagcagt acctaccagg agattgttgg cactccggat 1500
tccatcggtc aatacgagag ctatcaatcc ttcaccatgc cagacctgta ccatgtggtt 1560
aatggcattg aactgttcag tccaaagttt aatgttgttc caccgggcgt taatgaacag 1620
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ttttggaatt ttagcagcca agaaaaccgc gaagatatga tgcgttacat ggaagcactg 2400
ttccatctgc tgtataaacc gcgtgctcag gcactgctgg ccgaacatct tcagcgttaa 2460
<210> 4
<211> 2382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.4的核苷酸
<400> 4
atgtctgatg aactgcgtcg ttacatcagc cagaacagcc actctgtttc cggtctgctg 60
cgtcacctgt tcaacctcca gcgcccgttc ctgctgtaca ccgacctcca gaaagcgttc 120
agccacttcg ctgaagatta cggtaacgat gcagacctgg ttgtgctcca ggagttcttc 180
tctcgtctgc aagaggctgt actggctgaa ccgtggatct gtctggcctg gcgtccaggt 240
ccgggtcgct ggaactacct gcgtctgcat cgtgaacagc tgcacctgga aactctgact 300
cctggcgact acctggcgtt taaagaaaaa caggttctgc cggcgaacga ccaggaaccg 360
gtgctgaccg tggatttcga agatttccgc gcggcgccgt accgtctgcg tgatgaagct 420
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atcaaagccg gccgccaatc tatcttggat ttcctcgcgg ttcacaaact gaacggccag 540
tccctgatgg tgcgtgacca gccgccggat tttgaaaccc tgcgtcaaac cgttcagtac 600
ctgagcaccc tgccgaaaac caaaccgtgg tctgaatttg ctaccgaaat gagccgccgt 660
ggctttgctc cgggctgggg cgacattgct ggccgcgttc gtgaaaccat gcgcctgctg 720
atggatctgc tggacgcgcc gtctgcggaa tctttagaag cgttcattga tcgcatcccg 780
atgatcagcc gcatcctgat cgtgagcatc cacggctggt tcgcccagga caaagttctg 840
ggccgccctg atacgggcgg ccaggtggtg tacatcctgg atcaggcccg tgctttagaa 900
caggaaatgc gtcagcgtct ggcgcatcag ggcgtggata ttgttccgca cattctgatc 960
gctacgcgtc tgattccgga agcagatggc acgacctgtg accagcgcct ggagtctgtg 1020
cacggtgcag acaacgtacg tatcctccgt gtcccgttcc gccatccatc tggtgaaatc 1080
ctgccacact gggtgagccg ttttaacgtt tggccgtggc tggaacacta cgcggaggat 1140
cttgaacgcg aaaccttggc agaatttggt cgtcgcccag atctgattat cggtaattac 1200
tcagacggta atctggtagc ctccatgctg tccgaacgcc tgaacgtgac gcagtgcaat 1260
atcgcgcacg cgctggaaaa aagcaaatat ctgtatagcg atctgtactg gcgtgatcat 1320
gacgcgtccc accacttcgc ttgccagttc accgcagatc tgatcgcgat gaactctgcg 1380
gacatcatcg ttacctctac ctatcaagaa atcgctggca acgatcatga agtaggccaa 1440
tatgaaggtc atcagaacta ctccctgccg ggcttatacc gtgttgaaaa cggcatcgat 1500
gtgttcgata ctaaattcaa catcatcagt ccgggtgcgg atgcgcgtta ctacttcccg 1560
tactctgtta gcgaggaacg tttacgtttc ctgcacccgg acattgatgc actgctgttc 1620
ggtgaggagc cggccgcaga ccgtcgcggt gttctggaag atcgtaacaa accgattatt 1680
ttctctatgg cacgtatgga tcacatcaaa aacctgagcg gtctggctga actcttcggc 1740
gctagcgaac gtctgcgtga actggcaaac ctggtgatca ttggcggtca cgttaaccct 1800
caggattctc aggacgaaga agaacgtggt cagatccacc gtatgcacgg tattatggac 1860
cagtaccaac tcgatggcca gatgcgttgg atcggttccc tgctggacaa aaacgtggct 1920
ggtgaactgt accgcgttgt tggtgatact catggttgct tcgtgcagcc ggcgctgttc 1980
gaagcatttg gtctgaccgt gattgaggcg atgtcgtctg gtctgccggt attcgcaacc 2040
cgttttggcg gcccgctgga aatcatcgag gatggcattt cgggctttca catcgatccg 2100
aacaaccagc aggaaaccgc gacccgcctg gctgacttcc tgggcgcggc ggcggcggac 2160
attggcgttt gggaaaccat ctccgatggc gccctggcac gcgttcgtgc tcattatacc 2220
tggggtcatt acgccacccg tatgatgacc ctggctcgta tcttcggctt ctggcgtttc 2280
atgctgaaaa ccgatcatcg cgcggcgcgt cgctatttgc agatgttcca gcacctgcaa 2340
tggcgcccgc tggcgcacgc ggttccgctg ggtgaatctt aa 2382
<210> 5
<211> 2385
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.5的核苷酸
<400> 5
atgaccacca tcgataccct ggcgacctgc actcagcaga atcgtgatgc agtttatact 60
ctgctgcgtc gttacttcac tgcgaaccgt accctgctgt tacagtctga tctgcgtgaa 120
ggcctgctgc aaaccgaaca ggattgtggt cagtctgata tgctgcgtgc gttcgttttc 180
cgcctgcaag aaggcatctt ctcttccccg tgggcgtacc tggcactgcg tccagaaatc 240
gctaaatggg agttcatgcg catccaccag gaacacctga tcccggaaaa actgaccatt 300
tctgaatttc tgaaattcaa agaaaccgtg gtgaaaggcg aagctaccga atccgtgttg 360
gaagttgact tcggcccatt caaccgcggc ttcccgcgcc tgaaagaaag ccgtagcatc 420
ggtcagggcg ttatctttct gaaccgtaaa ctgtctagtg aaatgttctc ccgcattgaa 480
gcgggccaca cctctctgtt gcacttcctg ggtgttcatg ctatcgaggg ccagcagctg 540
atgttttcta acaacagcca cgacatccac gcggttcgta accagctgcg tcaggcgctg 600
gaaatgctgg aaaccctgga tggcaccacg ccgtggattg aactcgcgcc gaaaatgaac 660
caactgggct tcgcaccggg ctggggccat aatgctaacc gcgttgctga aaccatgaac 720
atgctgatgg acattctgga agccccgtcc ccatccgcac tggaagaatt tctggcgtgc 780
atcccgatga tcagccgtct gctgatcctt tccccacacg gctacttcgg ccaggacaac 840
gttctgggtc tgccagacac cggtggtcag gtggtgtata tcctggatca ggttcgtgcc 900
ctggaaaaag aaatgcatga tcgcctccag cttcagggtg tacaggttga accgaaaatc 960
ctgatcgtga cccgtctgat cccggacgca ggtgatacta cctgtaacca gcgtcttgaa 1020
aaagtgtccg gttgcaccaa cacctggatc ttgcgtgtgc cgttccgcaa acacaacggt 1080
gaaatcatac cgcactggat cagccgcttc gagatttggc cgcacctgga aatttttgca 1140
ggcgacgtcg aacgtgaagc actggcggag ctgggcggcc atccggatct gatcatcggt 1200
aactactccg atggcaacct ggttgccact ctgctgagcc gtcgtctggg tgttacccag 1260
tgcaacattg ctcacgcgct ggaaaaaacc aaatacctgc actctgacat ctactggcag 1320
gaaaatgaag ataaatatca cttctcctgc cagtacaccg ccgatctgct ggcgatgaac 1380
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ggtcagtacg aatcctacca ggctttctcg atgccggacc tgtaccgtgt tattcatggc 1500
atcgacctgt tcgatccgaa attcaatatt gtttctcctg gcgccaacgc agatatttac 1560
ttcccgtaca gcgatccgaa ccgccgcctg cactcactga tcccggagat cgaaagcctg 1620
atttttgatg acgctactaa tctgccggct cgtggttact tgcaggaccc ggacaaaccg 1680
ctgatcttta ctatggcacg tctggatcgt attaaaaaca tcaccggctt agtagaactg 1740
tatgccgcta gcccgcgcct gcgctccctg gcgaacctgg taattgttgg cggtaaaatc 1800
gatccgcagc acagctctga ccacgaagaa caggaacaga ttcatcgtat gcaccaactg 1860
atggacgaac acgaactgga ccagcaggtt cgctggctgg gtatgcgcct ggacaaaaac 1920
cttgctggcg aactgtatcg ttatattgca gataaacgtg gcattttcgt gcagccggcc 1980
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gacccgaacc agggtgcggc aaccgcggac ctgatcgcag atttcttcga gaaaaacctg 2160
gaaaacccgc aggaatggga acgtatttcc caaggtgcgc tggatcgtgt tgccagccgt 2220
tacacctgga aactgtacgc tgaacgtatg atgaccctgt cccgtatcta tggcttttgg 2280
aaattcgtaa gcggtctgga acgtgaagaa accgatcgct acctgaacat gttctaccac 2340
ctccagttcc gtccgctggc taaccgtctg gcgcatgaaa tctaa 2385
<210> 6
<211> 2382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.6的核苷酸
<400> 6
atgatcaaag acatctacaa aaccgcggaa accttccata acgacttcta cgacttcctg 60
aaagccgtta gcactcagcc gaaaaaactg atgattaccg gtgaactgat taacctgtat 120
gttgcgagtg gctatgataa aaactccggc ctgtacgaat ttattgaaaa aattcaagaa 180
accattagcc tggaccatag cgtgattctg gatgtgcgta tcaaaatcgc gtccattaaa 240
ttttaccgca tttccctgga agagttcttg atcgaagaaa tctcatctaa ggaatttctc 300
atttataaag aaaccgttgc gaaaccggat accctgaaca ccaccctgaa cctgaacttc 360
aagccgttct acgacaaatc cccggcggtt cgtgatatta aatacatcgg ctctggtgtt 420
gaatacctga accgttttct gagtagccag atgttcacta acgaagaacg ctggaagaaa 480
aacctgttcg atttcatccg cctgcataac ttcaacggtg agcagctgat tctgaacgat 540
cgcatcaaag acaccaaaca tctgaacaac cagatcaacg cggcgctggc gaaactgggc 600
aaccacccgg ccaatacccc atacgaaaac attaaacaca tcctccagga actgggtttc 660
gaaaaaggcc tgggcaaaga tgcgggtacg atcactcaca acctgaacct gttagaccag 720
ctgctgaact caccggatca caacgccctg gcggagttca tctcctccat cccgatgatc 780
ctgaacatcg ctatcatctc cccgcacggc ttcttcggtc aagaaggtgt tctgggcctg 840
ccggataccg gtggccaggt agtgtacatc ctggatcagg tgaaagcact ggagaaacag 900
ctcattgatt ccctgaagaa aagcggtctg aacctgctgc cgaaaatcat cgtcctgacc 960
cgccttatcc cgaacgctcg tggcaccacc tgcaaccagc gtctggaaaa aatctatggc 1020
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cacgcactcg aaaaatctaa atatctgtac tccgcgctgt actggtacga tctggaaaaa 1320
tattaccact tctctatgca gttcaccgca gatctcctgg cgatcaatag cgccgacttc 1380
ctgattacca gcagcttcca ggaaatcgcg ggcaccgaaa aatctatcgg tcagtacgaa 1440
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gaagaattgc agcagacctc caacctgatt gtggtggctg gtaaaattga tgaaaccatg 1800
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caagaagaaa ccaccgaaaa gattgttcgt ttcctgtctg acagctatat cgatagctct 2160
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aacctggaac atgaggacat taacgcttac ctggacctga tctaccacac catctacaaa 2340
tctcgtgcga aaatcctgct ggaagaacac atgaaacgtt aa 2382
<210> 7
<211> 2361
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.7的核苷酸
<400> 7
atgaacctga gcaacaaaga actggaaggc ctggatgaaa tcatctctga ccatcgtgaa 60
gatttctgcc cgttcctggg ccgtatcgaa gaagaggaca aacagttctt cctgtctagc 120
gaaatgaaag aaatgtacgc gggtgatacc gtgccggact tcatcgcatc tctccaggaa 180
gcggttaaaa tgccgggtca gatctacttc gcgacccgcg cgagcatcgg tgaatgggcg 240
tttgtgaccg tattcaccga caccctggac tacatggaag tttccccgac cgaataccag 300
gaagcaaaag aaaaaaccgt cctgggcgaa aacgcagcgt ggatgccgtc tgttgacctg 360
aaaccgttta accgtgattt cccgaaaccg agcagcgcgg atttcatcgg taaaggtgta 420
gagttcctga accgccatca gtctagtcgt atcttcatga acccggaaaa aggcttaaaa 480
cagctcctgg atttcctgcg cgttcacaaa tatgatggcc gccagctgat gctgaacaac 540
cgtatcgata gcgtggataa actgaaaaaa gcgctgaaaa aagcacaggc cctgctgaaa 600
aataaaagcg acgaaactga atgggaagaa gttgaaagcg atatggccca cctgggcttc 660
gaaccgggct ggggcaaaaa actgggttac gtgaaagaat ttctggcgct gctgtctgac 720
attctggcag cgccggaacc tgttgttctg gaaaaattcc tggatcgcat tccgatgatc 780
ttcagcttag tggtactgag cccgcacggc ttcttcggcc aggccggtgt ttttggtaaa 840
ccggataccg gtggccaggt tgtgtatatc ctggatcagg ttaaagcgct ggaacacgaa 900
ctgaaatcac gtctggacga aaaaggcctg gatattaccc cgaaaatcct ggtggtgacg 960
cgtctgatcc cggaggcgga aggcaccaac tgcgatatgg aagaagaact tatccgtggc 1020
accgataact gccacatcgt ccgtgtgccg ttccgtgatg aatccggcga agtagttcgt 1080
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ggtaacctgg tggcgagcct gattgcccag cgcctgggcg ttacccagtg caccattgcc 1260
cacgcgctgg aaaaaaccaa atacctgtac tccgatctgt actggcagga caacaacgac 1320
aaataccact tcgcttgcca gtacaccgcg gatttgatct ccatgaacta ctctgatttc 1380
atcatcactt ctacctatca ggaaatcgcc ggcaccaacg attccgtcgg ccagtacgaa 1440
tcctatatga actacaccct gccgggcctg taccgtgtgg tgaacggcat tgacgttttt 1500
gatccgaaat ttaacgttgt tagtccgggt gcggcgccag acatcttctt ctcttataaa 1560
agcaaagatc gtttcccgga acacatcgaa gaaatcgaga gcatcctgtt cgaagataac 1620
ctggaaggct ctcgtggttc cctggctgat ccggataaac cactgatctt cacgatggct 1680
cgcctggaca aaattaaaaa cctgaccggc ctggttcgct ggttcggtga aaacgaagaa 1740
ctgcgcaaaa ccgcaaacct gctggtaatc ggcggcttcg ttgatgaaag cctgagcagt 1800
gacgatgaag aacgcgaaca gatccgtatc atgcacagcg tgatcgatga actgggcctg 1860
gatggcagcg tgcgctgggt gggtgcgcac ctgggtaaac gcatgaccgg tgagttctat 1920
cgctatgttg ctgatcgtaa aggtgttttc gtgcagccgg cgctgttcga agcgtttggt 1980
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gctgacccga aagaatacta a 2361
<210> 8
<211> 2425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.8的核苷酸
<400> 8
catatgtccg aacgtgcgcg tagcgatgat ctgattgaac agctgcgcgg cttcctggat 60
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gatggcctgc gccagagccc gctgggtaaa gttattcgtc tgacccagga agccgctgtt 240
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gcgctgcgta aagaagcgaa tctgctggtc atctcaggtc acgtagaccc ggaacgctca 1860
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taccgctatg ttgcggacgg tcgtggcgcg ttcgttcagc cggctctgtt tgaagcattc 2040
ggtctgaccg tgattgaagc gatggcgtct ggcctgccgt gcttcgcaac ctgcttcggc 2100
ggcccgtctg aaatcattga agatggtgtc tctggcttcc acatcgatcc gaaccacggc 2160
gatgcggcag cggaacgtat cgcgcgcttt ttcgaacgta cccgtcaaga tccggaatat 2220
tggaaccgta tctctgaagg cgcgctgaaa cgtgtggccg aacgctacac ctggcagcat 2280
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ctggcgcagg cgatggcgta agctt 2425
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<211> 819
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.3的氨基酸
<400> 9
Met His His His His His His Gly Gly Ser Gly Met Thr Cys Val Leu
1 5 10 15
Leu Lys Ala Val Val Glu Ser Asp Glu Arg Ala Asp Leu Arg Gln Phe
20 25 30
Ser Arg Ile Leu Gln Leu Gly Glu Lys Arg Tyr Leu Leu Arg Asn Asp
35 40 45
Ile Leu Asp Ala Phe Ala Asp Tyr Cys Arg Asp Gln Glu Arg Pro Val
50 55 60
Pro Pro Pro Ser Glu Ser Arg Leu Ser Lys Leu Val Phe Tyr Thr Gln
65 70 75 80
Glu Ile Ile Val Asp Asn Glu Ser Leu Cys Trp Ile Val Arg Pro Arg
85 90 95
Ile Ala Gln Gln Glu Val Cys Arg Leu Leu Val Glu Asp Leu Thr Ile
100 105 110
Val Pro Met Thr Ile Pro Glu Leu Leu Asp Leu Arg Asp Arg Leu Val
115 120 125
Asn His Tyr His Pro Asn Glu Gly Asp Val Phe Glu Ile Asp Val Gln
130 135 140
Pro Phe Tyr Asp Tyr Ser Pro Ile Ile Arg Asp Ala Lys Asn Ile Gly
145 150 155 160
Lys Gly Val Glu Phe Leu Asn Arg Tyr Leu Ser Ser Lys Leu Phe Gln
165 170 175
Asp Pro Arg Gln Trp Gln Gln Asn Leu Phe Asn Phe Leu Arg Ile His
180 185 190
Arg Tyr Asn Gly Tyr Gln Leu Leu Ile Asn Glu Arg Ile Arg Ser Pro
195 200 205
Gln His Leu Ser Glu Gln Val Lys Gln Ala Leu Val Val Leu Ser Asp
210 215 220
Arg Pro Pro Thr Glu Ala Tyr Ser Glu Phe Arg Phe Glu Leu Gln Asn
225 230 235 240
Leu Gly Phe Glu Pro Gly Trp Gly Asn Thr Val Ala Arg Val Arg Asp
245 250 255
Thr Leu Glu Ile Leu Asp Gln Leu Leu Asp Ser Pro Asp His Gln Val
260 265 270
Leu Glu Ala Phe Val Ser Arg Ile Pro Met Leu Phe Arg Ile Ala Leu
275 280 285
Ile Ser Pro His Gly Trp Phe Gly Gln Glu Gly Val Leu Gly Arg Pro
290 295 300
Asp Thr Gly Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Lys Ser Leu
305 310 315 320
Glu Lys Gln Met Arg Glu Asp Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Val Leu
325 330 335
Glu Ala Gln Pro Lys Ile Ile Val Leu Thr Arg Leu Ile Pro Asn Ala
340 345 350
Glu Gly Thr Leu Cys Asn Gln Arg Leu Glu Lys Ile Tyr Gly Thr Asn
355 360 365
Asp Ala Trp Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg Glu Phe Asn Pro Lys Val
370 375 380
Thr Gln Asn Trp Ile Ser Arg Phe Glu Ile Trp Pro Tyr Leu Glu Thr
385 390 395 400
Phe Ala Ile Asp Ala Glu Arg Glu Leu Arg Ala Glu Phe Gly His Val
405 410 415
Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Phe
420 425 430
Leu Leu Ala Arg Arg Leu Lys Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala
435 440 445
Leu Glu Lys Ser Lys Tyr Leu Phe Ser Asn Leu Tyr Trp Gln Asp Leu
450 455 460
Glu Asp Lys Tyr His Phe Ser Leu Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala
465 470 475 480
Met Asn Ala Ala Asn Phe Ile Ile Ser Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Val
485 490 495
Gly Thr Pro Asp Ser Ile Gly Gln Tyr Glu Ser Tyr Gln Ser Phe Thr
500 505 510
Met Pro Asp Leu Tyr His Val Val Asn Gly Ile Glu Leu Phe Ser Pro
515 520 525
Lys Phe Asn Val Val Pro Pro Gly Val Asn Glu Gln Val Tyr Phe Pro
530 535 540
Tyr Tyr His Tyr Thr Glu Arg Leu Glu Gly Asp Arg Gln Arg Leu Glu
545 550 555 560
Glu Leu Leu Phe Thr Leu Glu Asp Pro Gln Gln Ile Tyr Gly Tyr Leu
565 570 575
Glu Ala Pro Glu Lys Arg Pro Leu Phe Ser Met Ala Arg Leu Asp Arg
580 585 590
Ile Lys Asn Leu Thr Gly Leu Ala Glu Ala Phe Gly Arg Ser Lys Ala
595 600 605
Leu Gln Glu Arg Cys Asn Leu Ile Leu Val Ala Gly Lys Leu Arg Thr
610 615 620
Ala Asp Ser Ser Asp Arg Glu Glu Ile Ala Glu Ile Glu Lys Leu Tyr
625 630 635 640
Gln Ile Ile His Gln Tyr Asn Leu His Gly Lys Ile Arg Trp Leu Gly
645 650 655
Ile Arg Leu Pro Lys Ala Asp Ser Gly Glu Ile Tyr Arg Ile Ile Ala
660 665 670
Asp Arg Gln Gly Ile Phe Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly
675 680 685
Leu Thr Ile Leu Glu Ala Met Ile Ser Gly Leu Pro Thr Phe Gly Thr
690 695 700
Arg Phe Gly Gly Pro Leu Glu Ile Ile Gln Asp Gly Val Asn Gly Phe
705 710 715 720
Tyr Ile Asn Pro Thr His Leu Glu Glu Met Ala Glu Thr Ile Val Arg
725 730 735
Phe Leu Glu Ala Cys Asp Arg Asp Pro Gln Glu Trp Gln Arg Ile Ser
740 745 750
Lys Ala Gly Ile Glu Arg Val Tyr Ser Thr Tyr Thr Trp Lys Ile His
755 760 765
Cys Thr Arg Leu Leu Ser Leu Ala Lys Ile Tyr Gly Phe Trp Asn Phe
770 775 780
Ser Ser Gln Glu Asn Arg Glu Asp Met Met Arg Tyr Met Glu Ala Leu
785 790 795 800
Phe His Leu Leu Tyr Lys Pro Arg Ala Gln Ala Leu Leu Ala Glu His
805 810 815
Leu Gln Arg
<210> 10
<211> 794
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.5的氨基酸
<400> 10
Met Thr Thr Ile Asp Thr Leu Ala Thr Cys Thr Gln Gln Asn Arg Asp
1 5 10 15
Ala Val Tyr Thr Leu Leu Arg Arg Tyr Phe Thr Ala Asn Arg Thr Leu
20 25 30
Leu Leu Gln Ser Asp Leu Arg Glu Gly Leu Leu Gln Thr Glu Gln Asp
35 40 45
Cys Gly Gln Ser Asp Met Leu Arg Ala Phe Val Phe Arg Leu Gln Glu
50 55 60
Gly Ile Phe Ser Ser Pro Trp Ala Tyr Leu Ala Leu Arg Pro Glu Ile
65 70 75 80
Ala Lys Trp Glu Phe Met Arg Ile His Gln Glu His Leu Ile Pro Glu
85 90 95
Lys Leu Thr Ile Ser Glu Phe Leu Lys Phe Lys Glu Thr Val Val Lys
100 105 110
Gly Glu Ala Thr Glu Ser Val Leu Glu Val Asp Phe Gly Pro Phe Asn
115 120 125
Arg Gly Phe Pro Arg Leu Lys Glu Ser Arg Ser Ile Gly Gln Gly Val
130 135 140
Ile Phe Leu Asn Arg Lys Leu Ser Ser Glu Met Phe Ser Arg Ile Glu
145 150 155 160
Ala Gly His Thr Ser Leu Leu His Phe Leu Gly Val His Ala Ile Glu
165 170 175
Gly Gln Gln Leu Met Phe Ser Asn Asn Ser His Asp Ile His Ala Val
180 185 190
Arg Asn Gln Leu Arg Gln Ala Leu Glu Met Leu Glu Thr Leu Asp Gly
195 200 205
Thr Thr Pro Trp Ile Glu Leu Ala Pro Lys Met Asn Gln Leu Gly Phe
210 215 220
Ala Pro Gly Trp Gly His Asn Ala Asn Arg Val Ala Glu Thr Met Asn
225 230 235 240
Met Leu Met Asp Ile Leu Glu Ala Pro Ser Pro Ser Ala Leu Glu Glu
245 250 255
Phe Leu Ala Cys Ile Pro Met Ile Ser Arg Leu Leu Ile Leu Ser Pro
260 265 270
His Gly Tyr Phe Gly Gln Asp Asn Val Leu Gly Leu Pro Asp Thr Gly
275 280 285
Gly Gln Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Lys Glu
290 295 300
Met His Asp Arg Leu Gln Leu Gln Gly Val Gln Val Glu Pro Lys Ile
305 310 315 320
Leu Ile Val Thr Arg Leu Ile Pro Asp Ala Gly Asp Thr Thr Cys Asn
325 330 335
Gln Arg Leu Glu Lys Val Ser Gly Cys Thr Asn Thr Trp Ile Leu Arg
340 345 350
Val Pro Phe Arg Lys His Asn Gly Glu Ile Ile Pro His Trp Ile Ser
355 360 365
Arg Phe Glu Ile Trp Pro His Leu Glu Ile Phe Ala Gly Asp Val Glu
370 375 380
Arg Glu Ala Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Pro Asp Leu Ile Ile Gly
385 390 395 400
Asn Tyr Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser Arg Arg Leu
405 410 415
Gly Val Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr
420 425 430
Leu His Ser Asp Ile Tyr Trp Gln Glu Asn Glu Asp Lys Tyr His Phe
435 440 445
Ser Cys Gln Tyr Thr Ala Asp Leu Leu Ala Met Asn Ser Ala Asp Phe
450 455 460
Ile Val Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Thr Arg Glu Ala Glu
465 470 475 480
Gly Gln Tyr Glu Ser Tyr Gln Ala Phe Ser Met Pro Asp Leu Tyr Arg
485 490 495
Val Ile His Gly Ile Asp Leu Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser
500 505 510
Pro Gly Ala Asn Ala Asp Ile Tyr Phe Pro Tyr Ser Asp Pro Asn Arg
515 520 525
Arg Leu His Ser Leu Ile Pro Glu Ile Glu Ser Leu Ile Phe Asp Asp
530 535 540
Ala Thr Asn Leu Pro Ala Arg Gly Tyr Leu Gln Asp Pro Asp Lys Pro
545 550 555 560
Leu Ile Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Thr Gly
565 570 575
Leu Val Glu Leu Tyr Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Ser Leu Ala Asn
580 585 590
Leu Val Ile Val Gly Gly Lys Ile Asp Pro Gln His Ser Ser Asp His
595 600 605
Glu Glu Gln Glu Gln Ile His Arg Met His Gln Leu Met Asp Glu His
610 615 620
Glu Leu Asp Gln Gln Val Arg Trp Leu Gly Met Arg Leu Asp Lys Asn
625 630 635 640
Leu Ala Gly Glu Leu Tyr Arg Tyr Ile Ala Asp Lys Arg Gly Ile Phe
645 650 655
Val Gln Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Ile Ile Glu Ala
660 665 670
Met Ala Ser Gly Leu Pro Thr Phe Ala Thr Arg Tyr Gly Gly Pro Leu
675 680 685
Glu Ile Ile Gln Asn Asn Arg Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn Gln
690 695 700
Gly Ala Ala Thr Ala Asp Leu Ile Ala Asp Phe Phe Glu Lys Asn Leu
705 710 715 720
Glu Asn Pro Gln Glu Trp Glu Arg Ile Ser Gln Gly Ala Leu Asp Arg
725 730 735
Val Ala Ser Arg Tyr Thr Trp Lys Leu Tyr Ala Glu Arg Met Met Thr
740 745 750
Leu Ser Arg Ile Tyr Gly Phe Trp Lys Phe Val Ser Gly Leu Glu Arg
755 760 765
Glu Glu Thr Asp Arg Tyr Leu Asn Met Phe Tyr His Leu Gln Phe Arg
770 775 780
Pro Leu Ala Asn Arg Leu Ala His Glu Ile
785 790
<210> 11
<211> 805
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.8的氨基酸
<400> 11
Met Ser Glu Arg Ala Arg Ser Asp Asp Leu Ile Glu Gln Leu Arg Gly
1 5 10 15
Phe Leu Asp Ala Cys Pro Ser Val Gly His Arg Val Leu His Gln Ile
20 25 30
Lys Lys Leu Glu Arg Ser Phe Leu Gln Arg Ser Glu Leu Cys Asp Ala
35 40 45
Phe Ala Asp Val Cys Ala Ala Glu Asp Val Pro Asp Gly Leu Arg Gln
50 55 60
Ser Pro Leu Gly Lys Val Ile Arg Leu Thr Gln Glu Ala Ala Val Asn
65 70 75 80
Asp Ala Trp Val Tyr Leu Ala Val Arg Val Arg Ile Ala Ser Trp Arg
85 90 95
Tyr Val Arg Ile Ala Leu Glu Gly Met Ala Val Glu Glu Val Thr Val
100 105 110
Arg Asp Phe Leu Arg Phe Lys Glu Cys Leu Ala Leu Gly Gln His Asp
115 120 125
Phe Asp Glu Trp Leu Leu Glu Ile Asp Leu Gly Pro Phe Ser Arg Glu
130 135 140
Phe Pro Lys Leu Leu Glu Ala Arg Ser Ile Gly Arg Gly Val Glu Phe
145 150 155 160
Leu Asn Lys His Leu Ser Leu Gln Leu Phe Asp Glu Leu Gly Glu Gly
165 170 175
Gly Glu Arg Ile Leu Asn Phe Leu Arg Ile His Ser Phe Arg Gly Gln
180 185 190
Thr Leu Met Leu Asn Glu Gln Ile Lys Ser Val Ser Asp Leu Arg Arg
195 200 205
Ala Leu Arg Arg Ala Asp Glu Val Leu Ala Gly His Glu Pro Thr Ala
210 215 220
Thr Trp Glu Asp Val Ala Ala Pro Leu Arg Ala Leu Gly Phe Glu Val
225 230 235 240
Gly Trp Gly Arg Glu Val Ala Arg Ile Arg Asp Thr Met Ser Leu Leu
245 250 255
Arg Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Arg Gly Leu Glu Thr Phe Leu
260 265 270
Ala Arg Leu Pro Met Val Phe Ser Leu Ala Ile Ile Ser Pro His Gly
275 280 285
Tyr Phe Gly Gln Ala Asn Val Leu Gly Arg Pro Asp Thr Gly Gly Gln
290 295 300
Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Thr Glu Met Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Phe Glu Gln Gly Leu Asp Ile Glu Pro Gln Ile Val Val
325 330 335
Leu Thr Arg Leu Ile Pro Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asp Gln Arg
340 345 350
Leu Glu Pro Ile Ser Gly Thr Arg Asn Ala Arg Ile Leu Arg Val Pro
355 360 365
Phe Arg Asn Ala Ser Gly Glu Ile Val Thr His Trp Ile Ser Arg Phe
370 375 380
Glu Val Trp Pro Tyr Leu Glu Arg Tyr Thr Leu Asp Ser Glu Arg Glu
385 390 395 400
Leu Leu Ala Glu Leu Gly Gly Arg Pro Asp Leu Ile Val Gly Asn Tyr
405 410 415
Ser Asp Gly Asn Leu Val Ala Thr Leu Leu Ser Gln Arg Leu Gly Val
420 425 430
Thr Gln Cys Asn Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Arg His
435 440 445
Ala Asp Leu Phe Trp Gln Glu Asn Glu Ala Gln Tyr His Phe Ser Cys
450 455 460
Gln Phe Thr Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn Ala Ala Asp Phe Ile Ile
465 470 475 480
Thr Ser Thr Tyr Gln Glu Ile Ala Gly Thr Arg Glu Ser Val Gly Gln
485 490 495
Tyr Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Met Pro Lys Leu Phe Arg Val Val
500 505 510
Asn Gly Ile Asp Val Tyr Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly
515 520 525
Ala Asp Ala Ala Ala Tyr Phe Pro Tyr Thr Ala Val Glu Arg Arg Leu
530 535 540
Pro His Leu His Thr Glu Ile Glu Gln Leu Val Phe Gly Val Asp Glu
545 550 555 560
Arg Val Asp Ala Arg Gly Val Leu Thr Glu Arg Asp Lys Pro Leu Leu
565 570 575
Phe Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Ile Lys Asn Ile Val Gly Leu Val
580 585 590
Glu Trp Phe Gly Ala Cys Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Asn Leu Leu
595 600 605
Val Ile Ser Gly His Val Asp Pro Glu Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu
610 615 620
Leu Glu Gln Ile Arg Cys Met His Ala Leu Phe Asn Arg Tyr Asp Leu
625 630 635 640
Asp Arg Gln Val Arg Trp Leu Gly Leu Arg Leu Pro Lys Asp Leu Ala
645 650 655
Gly Glu Phe Tyr Arg Tyr Val Ala Asp Gly Arg Gly Ala Phe Val Gln
660 665 670
Pro Ala Leu Phe Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Ile Glu Ala Met Ala
675 680 685
Ser Gly Leu Pro Cys Phe Ala Thr Cys Phe Gly Gly Pro Ser Glu Ile
690 695 700
Ile Glu Asp Gly Val Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Asn His Gly Asp
705 710 715 720
Ala Ala Ala Glu Arg Ile Ala Arg Phe Phe Glu Arg Thr Arg Gln Asp
725 730 735
Pro Glu Tyr Trp Asn Arg Ile Ser Glu Gly Ala Leu Lys Arg Val Ala
740 745 750
Glu Arg Tyr Thr Trp Gln His Tyr Ala Glu Arg Met Met Thr Leu Ser
755 760 765
Arg Val Tyr Gly Phe Trp Arg His Val Thr Asp Leu Glu Arg Arg Glu
770 775 780
Thr Gln Arg Tyr Leu Gln Ala Leu Tyr Ser Leu Gln Phe Arg Arg Leu
785 790 795 800
Ala Gln Ala Met Ala
805
<210> 12
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.9的核苷酸
<400> 12
atgcaccatc atcatgaagg cgtgagcgac cagaccctga gagtaacgat gtttccgtgg 60
cttgggctgg gtcatgttaa cccgtttttg cgtatcgcta aacaactggc cgatcgtggt 120
ttcgttatct atttagttag taccgctatt aacctcgaaa tgatcaaaaa gagaatcccg 180
gagaaataca gtaatagcat ccatctggtt gagctgcgcc tgccagaatt accggaactg 240
ccaccacatt accatactac caacggttta ccaccgcatc tgaacaaaac cctgcacaag 300
gcactgaaga tgagcgctcc caactttagc aagatccttc aaaatattaa gccggacctg 360
gtcctttacg attttctggt tccgtgggca gaaaaagtcg cgcttgaaca gggcatcccg 420
gctgttccat tgctaaccag tggtgcggca ctgttcagct actttttcaa cttcctgaag 480
cgaccgggtg aagagtttcc gtttgaggca atccgcctgt cgaagcgaga acaggataag 540
atgcgcgaga tgtttggaac agagccgcct gaagaagatt ttttagcgcc ggcccaggcc 600
ggtatcatgc tgatgtgcac gagccgcgta attgaggcta agtacctgga ctattgtacc 660
gaactgacca atgtaaaagt tgttccggtt ggtccgccgt ttcaggatcc gctgaccgaa 720
gatattgacg accccgaact gatggattgg ttagatacca aacccgaaca tagtgttgtc 780
tatgtgtcgt ttggcagcga agcgttcctg agccgtgaag atatggaaga agtcgcgttc 840
ggcctggagc tgagcggcgt gaactttatc tgggttgcac gctttccgaa aggcgaagaa 900
cagcgtctgg aagacgttct gccaaaaggc ttcctggaac gcgttggtga tcgtggtcgc 960
gttctggacc atctggtgcc gcaggcccat attctgaacc atccgagcac gggtggcttc 1020
atctctcatt gcggttggaa cagcgtcatg gaaagcattg atttcggcgt tccgatcatt 1080
gcgatgccga tgcagtggga tcagccgatt aacgcgagac tgcttgtgga attaggcgtg 1140
gcagtggaga tcccgcgtga tgaagatggc cgggtccacc gcgccgaaat tgcccgtgtc 1200
ctgaaagatg tgatttcggg cccgactggt gagatactgc gcgcgaaagt acgcgacatt 1260
agcgcacgcc tgagagcgag acgcgaggag gaaatgaacg cagcggcgga agaactgata 1320
cagctgtgtc gcaaccgcaa cgcctacaag 1350
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.10-F
<400> 13
aaaaaactgg tacgctcctt ccttcagcgt 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.10-R
<400> 14
aaggagcgta ccagtttttt aatctggtgc 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.11-F
<400> 15
ttcagcgtga agaactgtgc gacgcgtttg 30
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.11-R
<400> 16
gcacagttct tcacgctgaa ggaaggagcg t 31
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.12-F
<400> 17
ggtggtgaag ccatcctgaa cttcctgcgc 30
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.12-R
<400> 18
gttcaggatg gcttcaccac cttcacccag t 31
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.13-F
<400> 19
gttacactcg ggatagcgaa cgtgaactg 29
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.13-R
<400> 20
gttcgctatc ccgagtgtaa cgttccaggt a 31
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.14-F
<400> 21
accaaatacc ctcacgccga cctgttctgg 30
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.14-R
<400> 22
gtcggcgtga gggtatttgg ttttttccag 30
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.15-F
<400> 23
gttctggcag ctaaacgaag cgcagtatca t 31
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.15-R
<400> 24
gcttcgttta gctgccagaa caggtcggcg 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.16-F
<400> 25
ctgccgaaac gtctggcggg tgaattttac 30
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.16-R
<400> 26
ccgccagacg tttcggcaga cgcagaccc 29
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Km-F
<400> 27
gcccgacatt atcgcgagc 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Km-R
<400> 28
gggtataaat gggctcgcg 19
<210> 29
<211> 1371
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.17的核苷酸
<400> 29
atgccgaaca ctaacccaac taccgtgcgt cgtcgtcgtg ttattatgtt tccggttccg 60
ttcccgggcc acttaaaccc gatgctgcaa ctggcgaacg tgctgtaccg tagaggtttt 120
gaaatcacca ttctgcacac caacttcaac gccccgaaaa ccagccttta tccgcacttc 180
cagtttcgtt ttatcttgga caacgatccg caaccggagt ggttacgcaa cctgccgacg 240
actggtccgg gcgtgggtgc aagaatcccg gtaattaaca aacacggcgc ggatgaattc 300
cgtaaggagc tggaaatctg catgcgggat actccgagtg acgaggaagt tgcttgcgtg 360
attaccgatg cgctgtggta cttcgcgcaa ccggtggcgg acagcctgaa tctgaaacgt 420
ctggttctgc agaccgggag cctgtttaac ttccactgcc tggtgtgtct gccgaaattt 480
ctggagttgg gctacctgga tccggaaact aaacatcgtc cggatgaacc ggtggtaggt 540
ttcccgatgc tgaaggttaa agatatccgt cgcgcgtatt cgcacattca agaatcgaaa 600
ccaattctga tgaagatggt tgaagaaacc cgtgccagca gcggtgtgat ttggaacagc 660
gctaaagagc tggaggaaag cgagctggaa accattcagc gtgaaattcc ggcgccgagc 720
ttcctgcttc cgctgccgaa gcattatagg gcttcgagca ctagcctgct ggatactgat 780
ccgagcaccg cccaatggct ggaccagcag ccgccgagca gcgtgctgta cgttggcttt 840
ggcagccaga gctcgctgga ccccgcagat ttcctggaga ttgcgcgtgg tctggttgcg 900
agcaaacaaa gctttctgtg gctggttcgt ccgggcttcg tgaagggtta tgagtggatt 960
gagctgctgc cggatggttt tctgggtgaa aaaggtcgta tcgtgaagtc tgctccgcaa 1020
caagaagtgc tggcgcacaa ggcgattggt gcgttctgga cccacggcgg ttggaacggc 1080
accatggagg ccgtgtgcga aggcgtgccg atgatcttta gcgatttcgg tctggatcag 1140
ccgctgaacg cgcgttacat gagcgaggtt ctgcatgtgg gcgtttatct ggagaacggc 1200
ttcatccgtg gtgagatcat taatgcggtt aggcgtgtga tggttgaccc tgagggtgag 1260
gttatgcgcc aaaacgcgcg taaattgaag gataagttgg atcgaagcat tgctcccggt 1320
ggcagcagct acgagagcct ggaacgcctg cagagctata ttagcagcct g 1371

Claims (18)

1.一种蔗糖合成酶，其特征在于，所述蔗糖合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 11相比的氨基酸残基差异为：
第43位氨基酸为E；或，
第395位氨基酸为R；或，
第447位氨基酸为P；或，
第654位氨基酸为R。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的蔗糖合成酶。
3.一种重组表达载体，其包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种转化体，其为包含如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的重组表达载体的宿主细胞。
5. 如权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞为埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）。
6. 如权利要求5所述的转化体，其特征在于，所述宿主细胞为E.coli BL21（DE3）。
7.一种制备如权利要求1所述的蔗糖合成酶的方法，其特征在于，所述方法包括在适于表达所述蔗糖合成酶的条件下培养如权利要求4~6任一项所述的转化体。
8.一种组合物，其包含如权利要求1所述的蔗糖合成酶中的一种或多种。
9. 如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO: 9、10和/或SEQ ID NO: 11所示的序列。
10.一种糖基供体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
在如权利要求1所述的蔗糖合成酶的存在下，将蔗糖与核苷二磷酸进行反应，即得所述糖基供体；所述核苷二磷酸为UDP、dTDP、TDP、CDP、IDP、GDP或ADP。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶或固定化酶的形式存在。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足以下一种或多种条件：
所述蔗糖合成酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)；
所述蔗糖与所述核苷二磷酸的质量比为100:0.5~300:0.1；
所述蔗糖的浓度为50-300 g/L。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，
所述蔗糖合成酶菌体与蔗糖的质量比为3:200；和/或，
所述蔗糖与所述核苷二磷酸的质量比为200:0.1；和/或，
所述蔗糖的浓度为200 g/L。
14.一种莱鲍迪苷D或M的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在如权利要求1所述的蔗糖合成酶或如权利要求8或9所述的组合物的存在下，将莱鲍迪苷A、糖基转移酶、蔗糖和核苷二磷酸进行反应，即得莱鲍迪苷D。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足以下一种或多种条件：
所述蔗糖合成酶以蔗糖合成酶菌体、粗酶液、纯酶或固定化酶的形式存在；
所述糖基转移酶以糖基转移酶菌体、粗酶液、纯酶或固定化酶的形式存在；
所述莱鲍迪苷A的浓度为1-150g/L；
所述蔗糖的浓度为50-300 g/L；
所述反应的反应溶剂为水，pH为5-8；
所述反应时的转速为500-1000 rpm；
所述反应的反应体系的温度为20-90℃。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，
所述蔗糖合成酶菌体与蔗糖的质量比为1:(20-200)；和/或，
所述糖基转移酶菌体与所述莱鲍迪苷A的质量比为(0.1-2):1；和/或，
所述pH由缓冲溶液控制。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，
所述莱鲍迪苷A的浓度为50 g/L或60 g/L；和/或，
所述蔗糖的浓度为200 g/L；和/或，
所述蔗糖合成酶菌体与蔗糖的质量比为3:200；和/或，
所述糖基转移酶菌体与所述莱鲍迪苷A的质量比为0.24:1或0.3:1；和/或，
所述反应的pH为6；和/或，
所述pH由磷酸缓冲液控制；和/或，
所述反应时的转速为600 rpm；和/或，
所述反应的反应体系的温度为60℃。
18.一种如权利要求1所述的蔗糖合成酶或如权利要求8或9所述的组合物在制备甜菊糖苷中的用途；所述甜菊糖苷为莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷M。
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