CN116462777B - 一种新型葡萄糖基甜菊糖苷rmm及其应用、合成方法 - Google Patents

一种新型葡萄糖基甜菊糖苷rmm及其应用、合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了葡萄糖基甜菊糖苷RMM及其应用、合成方法，其分子式为C56H90O33。所述葡萄糖基甜菊糖苷RMM是取UDP‑葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达，然后两种工程菌进行共培养至OD600达到80时，破壁取粗酶液，离心，上清液加入含有莱宝迪苷RA、蔗糖和UDP‑葡萄糖的反应混合液体系中，催化RA合成葡萄糖基甜菊糖苷RMM。所述葡萄糖基甜菊糖苷RMM达到了在保证其甜度的同时，水溶性显著提高，从而能够更好地应用于食品制造。本发明还公开了包含所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的糖苷组合物。

Description

一种新型葡萄糖基甜菊糖苷RMM及其应用、合成方法
技术领域
本发明涉及一种新型结构的葡萄糖基甜菊糖苷RMM((4α)-13-[(O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)]-β-D-葡萄糖基)氧基]-葡萄糖-16-en-18-酸,O-β-D-吡喃糖基-(1→3)-O-[β-D吡喃葡萄糖酯-(1)→3)])及其应用、合成方法。
背景技术
甜菊糖苷是一种在食品制造中广泛使用的天然甜味物质，其包含了甜菊苷ST、莱宝迪苷RA、RC、RD及RM等多种糖苷化合物。其中莱宝迪苷RM具有更纯正的甜味感觉，并且无后苦味，是目前甜菊糖苷系列产品中品质最好的单品。
从分子结构上看，RA是在甜菊醇的C19位上连接了一个葡萄糖单元，在C13位上连接了3个葡萄糖单元(Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-)。相比RA，RM在C13位上的葡萄糖单元数量及连接方式与RA相同，但在C19位上又多了两个葡萄糖单元(Glc(β1-2)[Glc(β1-3)]Glc(β1-)。因此，以RA为原料制备RM，需要通过转糖基反应在C19位原来的葡萄糖基的2位和3位羟基上，通过β(1-2)和β(1-3)键连接新的葡萄糖基。
已有公开报道证实，RM的同分异构体同样具有优秀的甜味品质。这些同分异构体，一般是与RM具有相同的葡萄糖基数量，但连接方式有所差异，因此在产品分类上属于葡萄糖基甜菊糖苷。但RM以及目前为止已经公开的RM同分异构体，其在纯水中的溶解度都仅为0.521％(w/v)，溶解度在很大程度上限制了RM及其同分异构体在液态食品中的直接应用，也不利于它们通过溶解来制备糖苷组合物。
发明内容
甜菊糖苷的溶解性取决于其分子结构，取决于分子中葡萄糖基的连接方式和具体位置。因此为了解决目前存在的甜菊糖苷水溶性低、不利于其在食品中均匀快速分散和添加的问题，本发明提供了一种新的葡萄糖基甜菊糖苷RMM，在保证其甜度的同时，水溶性显著提高，从而能够更好地应用于食品制造。
葡萄糖基甜菊糖苷RMM，其分子式为C56H90O33，结构式为：
本发明还提供包含所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的糖苷组合物，包括食品上可接受的固态和液态。
所述的糖苷组合物还含有其他结构的甜菊糖苷、其他结构的葡萄糖基甜菊糖苷、罗汉果苷、甘草酸、糖醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和海藻糖等可食用糖类中的一种或几种。
所述的糖苷组合物还含有食品上可接受的载体、赋形剂和分散剂。
本发明还提供所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM在食品中替代可消化性糖的应用。
本发明还提供所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法。本发明是将筛选的葡萄糖基转移酶基因和蔗糖合成酶基因，通过分子生物学技术重组导入大肠杆菌工程菌株；然后在优化的条件下进行混菌共发酵，并经过细胞破壁得到含有两种酶的粗酶液，两种酶的酶活比例处于最适配比；最后以RA和蔗糖为原料，UDP-葡萄糖为辅料，在两种酶共催化作用下合成目标糖苷RMM。
具体地，葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，取UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达，然后两种工程菌进行共培养至培养至OD600达到80时，破壁取粗酶液，离心，上清液加入含有莱宝迪苷RA、蔗糖和UDP-葡萄糖的反应混合液体系中，催化RA合成目标糖苷。
在一种实施方式中，将分别表达UDP-葡萄糖基转移酶和表达蔗糖基转移酶的两株菌共培养时，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于25237℃摇瓶培养8216h后，再将两种菌液分别以125％和5220％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，25237℃培养至OD600达到40250时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80时，破壁取得粗酶液。
在一种实施方式中，UDP-葡萄糖基转移酶来源于枸杞(Lycium barbarum)，蔗糖合成酶来源于马铃薯(Solanum tuberosum)。
在一种实施方式中，所得粗酶液中，UDP-葡萄糖基转移酶与蔗糖合成酶的酶活力比为1:121:1.5。
在一种实施方式中，莱宝迪苷RA的浓度为10280g/L，蔗糖的浓度为5220g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L。
在一种实施方式中，双酶协同催化RA的优化反应条件是：反应温度为30237℃，pH值为6.527.5，反应时间428h。
本发明的优点：
1.本发明提供的葡萄糖基甜菊糖苷RMM，是天然糖苷莱宝迪苷RM的同分异构体，具有与RM相当的味质口感，但其溶解度显著提高，在常温下的水溶性达到20％(w/v)，水溶性达到了RM及已知的RM同分异构体的20倍，水溶性有显著提升，可显著提高该产品在含水食品中的分散性和应用效果，从而能够更好地应用于食品制造。
2.葡萄糖基甜菊糖苷RMM具有与RM一致甚至更优越的味质口感，其结构和纯度均符合出口标准和国家相关标准，能够广泛用于食品制造。
3.本发明提供的葡萄糖基甜菊糖苷RMM合成方法中，自主筛选出高活力的UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶基因；分别采用两株工程菌进行UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的重组表达，并且以安全无毒的乳糖作为产酶诱导剂，从而可以实现自由调整两种酶的活力配比，用于催化RA转化；在微生物共培养达到OD600为80以上时，进行乳糖诱导产酶，是高密度发酵过程；在催化RA转化的反应中加入少量UDP-葡萄糖来维持整体反应速率保持高水平和UDP-葡萄糖的重复利用。
4.本发明提供的葡萄糖基甜菊糖苷RMM合成方法可以实现3000L规模水平上的微生物高密度发酵，表达合成葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶，并用于目标糖苷生产，并且催化转化反应时间缩短为428小时。最终RA的转化率达到85295％，所得RMM产品的纯度为95％。
附图说明
图1为本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的质谱总离子流图。
图2为本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的二级质谱图。
图3为本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的1H-13C HSQC核磁共振谱图。
图4为本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的1H-13C HMBC核磁共振谱图。
图5为RM与本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的水溶性实验比较，水溶性有明显差异。
具体实施方案
葡萄糖基甜菊糖苷RMM分子量测定：
通过高效液相色谱-质谱联用测定葡萄糖基甜菊糖苷分子量。样品水溶液浓度为0.05mg/mL，液相色谱条件：色谱仪：WATERS ACQUITY UPLC，检测器：WATERS ACQUITY PDA，检测波长：200-400nm，分析柱：BEH C18 2.1X150mm 1.7um，流动相：100％0.1％甲酸---40min----30％乙腈70％0.1％甲酸---45min---80％乙腈20％0.1％甲酸---50min---100％乙腈----55min----100％0.1％甲酸，柱温：45℃，流速：0.3mL/min，进样量：5μL。质谱条件：离子方式:ESI+，毛细管电压:Capillary 3.5kVolts，锥孔电压:Cone 30Volts，离子源温度:Source Block Temp 100℃，脱溶剂气温度:Desolvation Temp 400℃，Desolvation Gas Flow 700lit/hr，Cone Gas Flow(L/Hr)50lit/hr，碰撞能量：CollisionEnergy(eV)6/20Volts，质量范围:20-2000m/z，Detector电压1800Volts。根据二级质谱的分子离子峰确定分子量。
葡萄糖基甜菊糖苷RMM结构测定：
通过二维核磁共振鉴定葡萄糖基甜菊糖苷的结构，测定条件为：1H NMR为500MHz，13C NMR为150MHz，20mg样品溶于氘代吡啶后，在布鲁克AvanceⅢ核磁共振仪上进行检测，光谱参考残余溶剂信号(氘代吡啶δH7.22，δC 150.35)，化学位移单位ppm。
葡萄糖基甜菊糖苷结构测定：
通过二维核磁共振鉴定葡萄糖基甜菊糖苷的结构，测定条件为：1H NMR为500MHz，13C NMR为150MHz，20mg样品溶于氘代吡啶，光谱参考残余溶剂信号(氘代吡啶δH7.22，δC150.35)，化学位移单位ppm。
UDP-葡萄糖基转移酶活力定义：
定义每分钟催化向底物转移接上1mmol的葡萄糖基为1个活力单位(mmol/min)。
蔗糖合成酶活力定义：
定义每分钟催化蔗糖与UDP反应，生成1mmol UDP-葡萄糖，为1个活力单位(μmol/min)。
溶解度测定：
在烧杯中加入100mL纯水，置于200rpm振荡水浴中保温25℃，逐步加入待测糖苷，每次加入0.5g，搅拌溶解30min，用浊度仪进行检测，当浊度达到500NTU即判定为溶解饱和。否则，继续加入0.5g糖苷样品，重复溶解操作直至达到溶解饱和。
味质感官评定：
参考中国国家标准《GB/T 16291.1-2012》中描述的原则进行感官评定员筛选测试，组建由12人组成的评定团队。感官评定标准设置如下表：
实施例1葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法
将来源于枸杞(Lycium barbarum)的UDP-葡萄糖基转移酶和来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达。将两种工程菌在一定条件下进行共培养，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于25℃摇瓶培养16h后，再将两种菌液分别以5％和20％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，35℃培养至OD600达到40时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80，然后破壁取得粗酶液，测得粗酶液中UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的活力比为1:1。
粗酶液离心后取上清液，然后加入RA在反应体系中的浓度达到50g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度达到15g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L，设置反应温度30℃，pH值为6.5，反应时间6h，最终RA的转化率为95％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为95％。
诱导培养基的组成：葡萄糖(山东西王)300份、酵母粉(安琪酵母)10份、蛋白胨(安琪酵母)10份、磷酸盐(连云港中鸿)5份、硫酸镁(连云港中鸿)5份、硫酸胺(连云港中鸿)2份。
葡萄糖基甜菊糖苷RMM结构测定见图1-2。UDP-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白序列如SEQ ID NO:2所示；蔗糖合成酶核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，蛋白序列如SEQ ID NO:4所示。
UDP-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列：
1 atgaaccggg cagagaaacc catattgtcc aagcctcatg cagtatgtat tccatttcca
61 gcacagggcc atataaatcc aatgctcaaa ttggccaaac tcctccatat ccgaggcttt
121 catatcacct ttgttaacac agagttcaat caccgacgat tgctcaaatc gcggggtccc
181 tattccctca atggcctatc ttcctttcgt ttccagtcca tccctgatgg actccctccc
241 tcgaacgagg atgccacaca agatgttccg tctttgtgtg aggcatgtaa gacagtatgt
301 ttggctcctt tcagagacct tgtcacaaga ctaaatgata attccagttt ccctcctatt
361 agttgcataa tttctgatgc tgccatgagc ttcactcttc aagtttctga ggaattgggt
421 attccttatc ttggcttttg gactggtagc ggttgttcct tgtgggcttt aatacaatat
481 cctaaacttg tggaaggagg ttattttcca ctaaaagatg aaagttattt gatcaatggc
541 catttagaca cgattataga ttggatacct ggcatggaag gcattcgtct aaaaaacttg
601 ccaagcttca tcagatccag agtcgatgaa cctagctata ttgtaatgaa atatatagtg
661 gaagaaatcg tggacaaaat tcccaaattc tctgcactca ttttcaacac tatcgacacg
721 ctagagagta acgttttgca acaaatttcg accaagttcc ctgcagttta tactattgga
781 ccgttacatc tccctttgtt gaataatcta actcaagacg atgacttgaa ctcaattgga
841 tcaaatctat ggaaagaaga tactgactgt ctcgaatggc tggacacaaa gaaaccaaat
901 tccgttgttt atgtgaattt cggaagtgtt acagtaatga gcaatgagca gttaattgaa
961 ttcgcatggg gacttgcaaa tatcaagatg aatttcttgt ggatcactag atcagattta
1021 gtcatgggtg attcagccat tttgccacat gaatttctcg cggagactaaggaaagaggt
1081 ttattaggtg gttggtgtcc tcaagaacaa gttctaagtc atccatcaattggaggattt
1141 ataacgcatt gtggatggaa ttcgacttta gaaagcatat catttggtgtgccaatgtta
1201 tgttggccat tttttgcaga tcaacaaaca aattgctggt ttatttgtaatcgttggggt
1261 gtggggatgg aaattgatag caatgtgaag agggaggtga ttgagaaacttgtgagagag
1321 ctgatgattg gagaaaaggg taaagagatg aaagaaaatg cattgaagtggaaaaaatta
1381 gcagaagaaa ctattacttc ttcaaatgga tcttcttata tgaattttgagaagttagtt
1441 agtcatgtgc tattgcgaaa cggtccttca tga
UDP-葡萄糖基转移酶的蛋白序列：
1 mnraekpils kphavcipfp aqghinpmlk lakllhirgf hitfvntefn hrrllksrgp
61 yslnglssfr fqsipdglpp snedatqdvp slceacktvc lapfrdlvtr lndnssfppi
121 sciisdaams ftlqvseelg ipylgfwtgs gcslwaliqy pklveggyfp lkdesyling
181 hldtiidwip gmegirlknl psfirsrvde psyivmkyiv eeivdkipkf salifntidt
241 lesnvlqqis tkfpavytig plhlpllnnl tqdddlnsig snlwkedtdc lewldtkkpn
301 svvyvnfgsv tvmsneqlie fawglanikm nflwitrsdl vmgdsailph eflaetkerg
361 llggwcpqeq vlshpsiggf ithcgwnstl esisfgvpml cwpffadqqt ncwficnrwg
421 vgmeidsnvk revieklvre lmigekgkem kenalkwkkl aeetitssng ssymnfeklv
481 shvllrngps
蔗糖合成酶核苷酸序列：
1 ctgccatggc tgaacgtgtt ttgactcgtg ttcatagcct tcgtgaacgt gttgatgcaa
61 ctttagctgc tcaccgcaat gagatactgc tgtttctttc aaggatcgaa agccacggaa
121 aagggatatt gaaacctcat gagcttttgg ctgagttcga tgcaattcgc caagatgaca
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2281 ggctattgac actggctgct gtttatgggt tctggaaaca tgtttctaaacttgatcgtc
2341 tagaaatccg tcgctatctt gaaatgtttt atgctctcaa gtaccgtaagatggctgaag
2401 ctgttccatt ggctgctgag tgaatgaag
蔗糖合成酶蛋白序列：
1 maervltrvh slrervdatl aahrneillf lsrieshgkg ilkphellae fdairqddkn
61 klnehafeel lkstqeaivl ppwvalairl rpgvweyirv nvnalvveel svpeylqfke
121 elvdgasngn fvleldfepf tasfpkptlt ksigngvefl nrhlsakmfh dkesmtplle
181 flrahhykgk tmmlndriqn sntlqnvlrk aeeylimlsp dtpyfefehk fqeiglekgw
241 gdtaervlem vcmlldllea pdsctlekfl gripmvfnvv ilsphgyfaq envlgypdtg
301 gqvvyildqv paleremlkr ikeqgldiip rilivtrllp davgttcgqr iekvygaehs
361 hilrvpfrte kgivrkwisr fevwpymetf iedvakeisa elqakpdlii gnysegnlaa
421 sllahklgvt qctiahalek tkypdsdiyw kkfdekyhfs sqftadliam nhtdfiitst
481 fqeiagskdt vgqyeshmaf tmpglyrvvh ginvfdpkfn ivspgadinl yfsysetekr
541 ltafhpeide llysdvende hlcvlkdrtk pilftmarld rvknltglve wyaknprlrg
601 lvnlvvvggd rrkeskdlee qaemkkmyel iethnlngqf rwissqmnrv rngelyryia
661 dtkgafvqpa fyeafgltvv eamtcglptf atnhggpaei ivhgksgfhi dpyhgeqaad
721 lladffekck kepshwetis tgglkriqek ytwqiyserl ltlaavygfw khvskldrle
781 irrylemfya lkyrkmaeav plaae
实施例2溶解度测定
在烧杯中加入100mL纯水，置于200rpm振荡水浴中保温25℃，逐步加入待测糖苷，每次加入0.5g，搅拌溶解30min，用浊度仪进行检测，当浊度达到500NTU即判定为溶解饱和。否则，继续加入0.5g糖苷样品，重复溶解操作直至达到溶解饱和。
在进行不同温度溶解度测试时，按照相同的测试方法，但设置水浴温度分别为25℃、35℃、45℃和55℃。
溶解度测试结果如下：
糖苷样品 25℃ 35℃ 45℃ 55℃
甜菊苷STV(95％纯度) 0.521％ 0.521％ 0.521％ 0.521％
莱宝迪苷RA(97％纯度) 0.521％ 0.521％ 121.5％ 121.5％
莱宝迪苷RD(95％纯度) 0.521％ 0.521％ 121.5％ 121.5％
莱宝迪苷RM(95％纯度) 0.521％ 0.521％ 121.5％ 121.5％
葡萄糖基甜菊糖苷RMM 19220％ 25227％ 30233％ 40242％
根据测试结果，本发明的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的水溶解度达到其他糖苷的20倍以上。
实施例3味质测定
各种糖苷的味质通过感官评定进行确定，结果如下：
糖苷样品 甜度 甜味 甜后味 苦味 甘草味
甜菊苷STV(95％纯度) 3002330 9.029.5 7.028.0 6.526.7 4.825.5
莱宝迪苷RA(97％纯度) 2602290 7.828.6 7.528.5 4.524.9 3.223.6
莱宝迪苷RD(95％纯度) 2502310 8.128.5 8.028.5 4.224.5 2.823.0
莱宝迪苷RM(95％纯度) 2802350 8.829.5 9.029.5 3.824.0 2.022.2
葡萄糖基甜菊糖苷RMM 3002370 9.229.6 9.029.5 3.523.6 1.822.2
根据测试结果，本发明技术葡萄糖基甜菊糖苷RMM的感官味质与RM相当，明显高于其他几种糖苷。
实施例4含有RMM的糖苷组合物的制备方法
将RMM与其他结构的甜菊糖苷、其他结构的葡萄糖基甜菊糖苷、罗汉果苷、甘草酸、糖醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和海藻糖中的一种或几种进行混合，组合物中RMM所占比例为0.121％(w/w)。
所用混合方法可包括物理混合方法和包衣方法。物理混合方法是将所有物料在混合容器中进行搅拌或旋转混料直至获得均匀的组合物产品。包衣方法是将RMM糖苷溶解在水中，然后在流化床上通过喷洒方式均匀喷涂在其他糖质颗粒表面，从而形成包衣，由此得到组合成产品。
实施例5通过调整RMM的含量比例调节糖苷组合物的味质
糖苷组合物可通过调整其中RMM的含量来实现与蔗糖等同甜味同时降低蔗糖用量的目标。如下表所示，配置不同比例的白砂糖和RMM的组合物产品，并进行盲测，比较甜度大小。
随机编号 白砂糖/g 白砂糖占比 RMM/g RMM占比 水
146 7.5 1.50％ 0.06 0.01％ 500ml
238 25 5.00％ -- -- 500ml
749 7.5 1.50％ -- -- 500ml
854 7.5 1.50％ 0.12g 0.02％ 500ml
结果编号 1 2 3 4
1 749 238 146 854
2 749 238 146 854
3 749 146 238 854
4 749 146 238 854
5 749 238 146 854
6 749 238 146 854
7 749 238 146 854
通过7人乱序盲测，将样品甜度按从小到大排列，结果如上所示。即1.5％蔗糖溶液中复配0.02％浓度的RMM(RMM:蔗糖＝1:75)可明显提高甜度。而1.5％蔗糖+0.01％RMM(RMM:蔗糖＝1:150)的组合物甜度等同于5％浓度的蔗糖溶液，明显高于1.5％浓度的蔗糖溶液。
实施例6通过调整RMM的含量比例调节糖苷组合物的味质
盲测方法：请20位食品鉴定师，品尝各个样品后(品尝顺序随机)，勾选出觉得最好的2个样本(一共5个样本+2个对比样本，共7个，从中选出2个)。
结果如下：
在仅为糖+水的体系中，10％白砂糖得票最高，为9票；其次是3％白砂糖+0.24％RMM，与9.92％赤藓糖醇+0.08％ RMM混苷并列，均为7票；而当RMM占到0.12％比例时，糖苷味明显，仅得到1票。因此，上述两种组合方案，在适当的RMM用量下，都能取得近似白砂糖的口感和接受性。
实施例7
将来源于枸杞(Lycium barbarum)的UDP-葡萄糖基转移酶和来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达。将两种工程菌在一定条件下进行共培养，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于27℃摇瓶培养12h后，再将两种菌液分别以1％和5％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，30℃培养至OD600达到50时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80，然后破壁取得粗酶液，测得粗酶液中UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的活力比为1:1.5。
粗酶液离心后取上清液，然后加入RA在反应体系中的浓度达到80g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度达到20g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L，设置反应温度37℃，pH值为7.5，反应时间4h，最终RA的转化率为88％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为92％。
实施例8
将来源于枸杞(Lycium barbarum)的UDP-葡萄糖基转移酶和来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达。将两种工程菌在一定条件下进行共培养，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于37℃摇瓶培养8h后，再将两种菌液分别以3％和15％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，37℃培养至OD600达到45时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80，然后破壁取得粗酶液，测得粗酶液中UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的活力比为1:1.2。
粗酶液离心后取上清液，然后加入RA在反应体系中的浓度达到60g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度达到15g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L，设置反应温度35℃，pH值为7.0，反应时间6h，最终RA的转化率为92％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为95％。
对比例1
将来源于枸杞(Lycium barbarum)的UDP-葡萄糖基转移酶和来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达。将两种工程菌在一定条件下进行共培养，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于27℃摇瓶培养12h后，再将两种菌液分别以1％和5％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，30℃培养至OD600达到20时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80，然后破壁取得粗酶液。因诱导产酶过早，诱导时间变长，菌体产生包涵体，测得粗酶液中UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的活力比为1:1.3，但产酶量减少20％左右。
粗酶液离心后取上清液，然后加入RA在反应体系中的浓度达到80g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度达到20g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L，设置反应温度37℃，pH值为7.5，反应时间8h，最终因酶量较少，RA的转化率为50％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为45％。
对比例2
将来源于枸杞(Lycium barbarum)的UDP-葡萄糖基转移酶和来源于马铃薯(Solanum tuberosum)的蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达。将两种工程菌在一定条件下进行共培养，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于25℃摇瓶培养16h后，再将两种菌液分别以5％和20％的比例共接种于诱导培养基中，于200rpm，35℃培养至OD600达到40时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80，然后破壁取得粗酶液，测得粗酶液中UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶的活力比为1:1。
粗酶液离心后取上清液，然后加入RA在反应体系中的浓度达到50g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度达到15g/L，UDP-葡萄糖为0.01g/L，设置反应温度30℃，pH值为6.5，反应时间2h，因反应时间不足，最终RA的转化率为45％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为40％。
其他条件相同，若在催化反应体系中，RA在反应体系中的浓度为50g/L，加入蔗糖在反应体系中的浓度为10g/L，则最终因蔗糖不足，RA的转化率为70％，产物葡萄糖基甜菊糖苷RMM纯度为68％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (11)

1.葡萄糖基甜菊糖苷RMM，其特征是，分子式为C56H90O33，结构式为：
。
2.包含权利要求1所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的糖苷组合物。
3.根据权利要求2所述的糖苷组合物，其特征在于，还含有其他结构的甜菊糖苷、罗汉果苷、甘草酸、糖醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖和海藻糖中的一种或几种。
4.根据权利要求3所述的糖苷组合物，其特征在于，所述其他结构的甜菊糖苷为其他结构的葡萄糖基甜菊糖苷。
5.根据权利要求2所述的糖苷组合物，其特征在于，还含有食品上可接受的载体、赋形剂和分散剂。
6.权利要求1所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM在食品中替代可消化性糖的应用。
7.权利要求1所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，其特征是，取UDP-葡萄糖基转移酶和蔗糖合成酶，分别在工程菌株中进行表达，然后两株重组菌进行共培养至OD600达到80时，破壁取粗酶液，离心，上清液加入含有莱宝迪苷RA、蔗糖和UDP-葡萄糖的反应混合液体系中，催化RA合成目标糖苷；
所述UDP-葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，蛋白序列如SEQID NO:2所示；所述蔗糖合成酶核苷酸序列如SEQID NO:3所示，蛋白序列如SEQID NO:4所示。
8.根据权利要求7所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，其特征是，分别表达UDP-葡萄糖基转移酶和表达蔗糖基转移酶的两株重组菌共培养时，诱导表达条件为：将两株重组菌分别在M9培养基中于25~37℃摇瓶培养8~16 h后，再将两种菌液分别以1~5%和5~20%的比例共接种于诱导培养基中，于200 rpm，25~37℃培养至OD600达到40~50时加入乳糖作为诱导剂，继续培养至OD600达到80时，破壁取得粗酶液。
9.根据权利要求7所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，其特征是，所述粗酶液中，UDP-葡萄糖基转移酶与蔗糖合成酶的酶活力比为1:1~1:1.5。
10.根据权利要求7所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，其特征是，所述莱宝迪苷RA的浓度为10~80 g/L，蔗糖的浓度为5~20 g/L，UDP-葡萄糖为0.01 g/L。
11.根据权利要求7所述的葡萄糖基甜菊糖苷RMM的合成方法，其特征是，所述催化莱宝迪苷RA反应的条件是：反应温度为30~37℃，pH值为6.5~7.5，反应时间4~8 h。
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