CN108064226A - 甜菊糖苷的回收 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从含甜菊糖苷的发酵液中回收一种或多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:(a)提供包含一种或多种甜菊糖苷和一种或多种非甜菊糖苷组分的发酵液;(b)将发酵液的液相与发酵液的固相分离;(c)提供吸附树脂;(d)使发酵液的液相与吸附树脂接触以将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,从而从含一种或多种甜菊糖苷的发酵液中回收一种或多种甜菊糖苷。本发明还涉及利用所述方法制备的经纯化的甜菊糖苷组合物。
Description
发明领域
本发明涉及从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法。本发明还涉及通过这种方法能够得到的组合物。
发明背景
世界各地对高效甜味剂的需求不断增长,而且混合不同的人工甜味剂正在逐渐变成一种常规做法。然而,对甜味剂替代品的需求预计将会增加。多年生草本植物—甜叶菊(Stevia rebaudiana Bert.)—的叶子中积聚了大量极甜的化合物,它们被称为甜菊糖苷。虽然这些化合物的生物学功能还不明确,但由于甜叶菊甜味剂是天然植物产品这一附加优势,它们作为备选的高效甜味剂具有商业意义。
这些甜的甜菊糖苷显示出优于许多高效甜味剂的功能特性和感官性状。此外,研究表明甜菊苷(stevioside)能降低Ⅱ型糖尿病人的血糖水平和中度高血压患者的血压。
甜菊糖苷积聚于甜菊叶中,它们可以占甜菊叶干重的10-20%。甜菊苷和莱鲍迪甙(rebaudioside)A都具有热稳定性和pH稳定性,因此适合用于碳酸饮料和许多其它食物中。甜菊苷比蔗糖甜110-270倍,莱鲍迪甙A比蔗糖甜150-320倍。此外,莱鲍迪甙D也是积聚于甜菊叶的高效二萜糖苷甜味剂,它可能比蔗糖甜约200倍。
目前,甜菊糖苷是从甜菊植物中提取的。在甜菊中,(-)-贝壳杉烯酸(kaurenoicacid,赤霉素(GA)生物合成的中间物)被转换为四环的二萜—甜菊醇,然后甜菊醇继续通过多步骤的葡糖基化途径形成各种甜菊糖苷。然而,产率是可变的并受农业和环境条件的影响。而且,种植甜菊需要大量陆地面积、收获前的长久时间、密集的劳动力以及提取和纯化糖苷的额外费用。
为了满足对高效、天然甜味剂日益增长的商业需求,需要新的、更标准的、完全单一成分的、没有后味的糖苷来源。
发明概述
可以如共同待决国际专利申请号WO2013/110673(PCT/EP2013/051262)中所述在重组微生物中发酵生产甜菊糖苷。
本发明涉及从包含一种或多种甜菊糖苷的发酵液中分离和回收甜菊糖苷的方法的简化和改进。
因此,本发明提供可将发酵产生的甜菊糖苷与发酵液的其它组分分开的方法。也就是说,本发明涉及从包含一种或多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法。本发明还涉及使用这种方法制备的组合物。
本发明一般地涉及使用色谱法从发酵液回收甜菊糖苷。因此,本发明涉及从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供包含一种或多种甜菊糖苷和一种或多种非甜菊糖苷组分的发酵液;
(b)将发酵液的液相与发酵液的固相分离;
(c)提供吸附树脂,例如在填充柱中;
(d)使发酵液的液相与吸附树脂接触以将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,
从而从含一种或多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷。
本发明还涉及从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供含甜菊糖苷的发酵液;
(b)提供吸附树脂,例如以膨胀床模式在填充柱中;
(c)使发酵液的液相与吸附树脂接触以将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,
从而从含一种或多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷。
本发明还涉及:
通过根据本发明所述的方法能够得到的包含一种或多种甜菊糖苷的溶液;和
组合物,其包含基于干燥固体至少约95%的发酵产生的莱鲍迪甙(Rebaudioside)A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
附图说明
图1展示了质粒pUG7-EcoRV的示意图。
图2展示了设计ERG20、tHMG1和BTS1过表达盒(A),并将其整合至酵母基因组(B)的方法的示意图。(C)显示了利用Cre重组酶移除KANMX标记后的最终状态。
图3展示了ERG9敲除构建体的示意图。所述构建体由500bp ERG9的3’部分、98bpTRP1的启动子、TRP1的开放阅读框和终止子以及之后的400bp ERG9的下游序列组成。由于在ERG9的开放阅读框的终点引入了Xbal位点,因此最后的氨基酸变成了丝氨酸,终止密码子变成了精氨酸。新的终止密码子位于TRP1的启动子中,这导致延长了18个氨基酸。
图4展示了将UGT2整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段;B.整合后的状态;C.Cre重组酶表达后的状态。
图5展示了将GGPP到RebA的途径整合至基因组的示意图。A.转化中使用的不同片段;B.整合后的状态。
图6展示了提取物的洗脱图(第一次运行)。
图7展示了提取物的洗脱图(第二次运行)。
图8展示了生物合成甜菊糖苷的潜在途径的示意图。
序列表说明
表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号(同样展示于表1)来定义。
发明详述
在本说明书和附属的权利要求书的各个部分,词语“包括”、“包含”和“具有”及其变形应被理解为包含性的。也就是说,在语境允许的情况下,这些词语意图传达的意思是:可以包括其它没有明确列举的元素或整体。
本文中不使用数量词修饰时指的是一个或多于一个(即一个或至少一个)对象。例如,“要素”可意味着一个要素或多于一个要素。
在本文中,术语非甜菊糖苷应被视为表示不是甜菊糖苷的物质。
本发明涉及从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供包含一种或多种甜菊糖苷和一种或多种非甜菊糖苷组分的发酵液;
(b)将发酵液的液相与发酵液的固相分离;
(c)使发酵液的液相与吸附树脂接触以将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,
从而从含一种或多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷。
通常,吸附树脂被提供在填充柱(packed column)中。
本发明还涉及从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供含甜菊糖苷的发酵液;
(b)使发酵液与吸附树脂接触以将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,
从而从包含一种或多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或多种甜菊糖苷。
通常,吸附树脂以膨胀床(expanded bed)模式被提供在填充柱中。
发酵液是从能够产生一种或多种甜菊糖苷的微生物(通常是重组微生物)的发酵获得的发酵液。这种微生物及其发酵在本文中描述。通常,重组微生物是能够在细胞外产生一种或多种甜菊糖苷的重组微生物。
通常,在将发酵液施加至色谱柱之前处理发酵液。
特别地,可破裂(disrupt)细胞并分离产生的固相和液相。可例如通过机械冲击或热激来进行细胞破裂。然而,这种细胞破裂对产生足够的细胞外甜菊糖苷的微生物可以是非必要的。可例如通过离心、膜过滤或微滤来进行固/液分离。
然后,可方便地将液体施加至色谱柱。
一种替代性的固相和液相的分离可包括:喷雾干燥发酵液(例如细胞已破裂的发酵液),然后利用合适的溶剂(例如,乙醇)提取甜菊糖苷。就本发明而言,这种类型的方法应被理解为构成“将发酵液的液相与发酵液的固相分离”。然后,可方便地将产生的液体施加至色谱柱。
或者,可利用全发酵液(即,包括细胞)进行本发明的方法,其中所述方法以膨胀床方式进行。膨胀床吸附允许从含颗粒的原料中捕获蛋白质而无需之前除去微粒,从而使得能够在单一操作中澄清细胞悬浮物或细胞匀浆和浓缩期望的产物。使用膨胀模式的另一方面是原位从发酵液除去甜菊糖苷同时将细胞和非结合的营养物返回到发酵罐的可行性。
在本发明的方法中,吸附树脂可以是任何合适的树脂,例如是聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂、多环芳族树脂(polyaromatic resin)、官能化的聚甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯树脂、官能化的聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂或氨(NH2)结合的甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯共聚物树脂。
吸附树脂可以用叔胺或季胺官能化。
在本发明的方法中,吸附的表面积可以为约900m2/克或者更大。
根据本发明所述的方法可以以吸附/脱附色谱方式进行。以这种方式,所述方法包括:
(a)提供液相(来源于发酵液)或发酵液和溶剂;
(b)提供吸附树脂;
(c)提供洗脱溶剂;
(d)使吸附树脂与液相或发酵液和洗脱溶剂接触,以将至少部分非甜菊糖苷组分吸附到吸附剂上,从而使糖苷溶液中的甜菊糖苷富集并导致形成伴随洗脱溶剂从吸附剂洗脱的经纯化的甜菊糖苷组合物;和
(e)任选地,使非甜菊糖苷组分与吸附剂脱附。
通常,吸附树脂被提供在填充柱中。
在这种方法中,洗脱溶剂可包含约20重量%或更少的醇和约80重量%或更多的水。
在这种方法中,洗脱溶剂可包含约50重量%或更少的醇和约50重量%或更多的水。
本发明所述的方法可以以如下方式进行,其中分离方法包括分级色谱(fractionation chromatography)。这种方法可包括如下步骤:
(a)提供液相(来源于发酵液)或发酵液和溶剂;
(b)提供填充有吸附剂的柱;和
(c)使吸附剂与液相或发酵液接触,以使得至少部分非甜菊糖苷组分吸附到吸附剂上并使得至少部分甜菊糖苷吸附到吸附剂上,其中甜菊糖苷以比非甜菊糖苷更快的速率通过吸附剂传送;和
(d)从吸附剂收集含甜菊糖苷的溶液。
在这种方法中,溶剂可包含约20重量%或更多的醇和约80重量%或更少的水。
在根据权利要求9所述的方法中,其中溶剂包含约25重量%-约35重量%的醇和约65重量%-约75重量%的水。
在这种方法中,醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。
在这种方法中,溶剂可包含水且吸附剂可以是强酸性阳离子交换树脂。
在本发明的任何方式中,可进行多于一个色谱循环,例如2个、3个、4个、5个或更多个色谱循环。
在使用2个或更多个色谱循环的本发明所述方法中,在色谱本身pH之后可以是在pH约为8.5下的色谱以降低Reb B的浓度。Reb B是为数不多的具有自由羧基的莱鲍迪甙之一。因而,在该基团带电的高pH下,Reb B对疏水性吸附剂(例如,HP-20)的亲和力要低得多,因此在pH 8.5下不会与疏水性吸附剂结合,但其它非带电的莱鲍迪甙仍将良好地结合。
本发明的方法允许经纯化的包含甜菊糖苷的溶液被回收。回收的含甜菊糖苷的溶液的纯度通常比液相或发酵液(从其中回收至少一种甜菊糖苷)的纯度高至少约10%、至少约20%、至少约30%。
在本文中,短语“将一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离”应被理解为表示:一种或多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分的至少一部分分离。该短语并非旨在表示:根据本发明的方法所回收的一种或多种甜菊糖苷的一部分必定完全不含非甜菊糖苷组分。非甜菊糖苷组分可能也被回收。然而,相较于起始材料(例如,发酵液),所回收的一种或多种甜菊糖苷应该针对一种或多种甜菊糖苷被富集。也就是说,相较于起始材料,根据本发明的方法所回收的一种或多种甜菊糖苷应该包含更少的非甜菊糖苷。
在本发明的方法中,经纯化的含甜菊糖苷的溶液包含基于干燥固体至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约99重量%的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
溶液可例如通过喷雾干燥或结晶被进一步处理为固体形式,例如,颗粒或粉末。这种固体组合物可包含至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约99重量%的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
因此,本发明提供通过本发明所述方法能够得到的包含一种或多种甜菊糖苷的溶液。这种溶液可包含甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A或莱鲍迪甙M中的一种或多种。
这种溶液可包含基于干燥固体至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约99重量%的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
因此,本发明提供这样的组合物,其可包含基于干燥固体至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约99重量%的发酵产生的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
这种组合物可以是通过上述方法能够得到的颗粒或粉末,所述方法包括将经纯化的包含甜菊醇的溶液加工为固体形式的步骤。这种固体组合物可包含至少约60重量%、至少约70重量%、至少约80重量%、至少约90重量%、至少约95重量%、至少约99重量%的发酵产生的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
在本发明中,发酵液可来源于能够产生甜菊糖苷的任何微生物的发酵。
特别地,发酵液可来源于能够产生甜菊糖苷的重组微生物。合适的重组微生物如下文所述。所述重组微生物可包含一种或多种核苷酸序列,所述核苷酸序列编码:
具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽;
具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽;
具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽;
具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽,和
一种或多种具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽,
通过所述核苷酸序列的表达使所述微生物具有至少生产一种甜菊糖苷的能力。
为了本发明的目的,具有内根-柯巴基焦磷酸合酶(EC5.5.1.13)活性的多肽能够催化如下化学反应:
该酶有一种底物(香叶基香叶基焦磷酸)和一种产物(内根-柯巴基焦磷酸)。该酶参与赤霉素的生物合成。该酶属于异构酶家族,具体是分子内的裂解酶类。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸裂解酶(去环化)。其它的常用名包括内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶A和内根-贝壳杉烯合成酶A。
为了本发明的目的,具有内根-贝壳杉烯合酶(EC4.2.3.19)活性的多肽能够催化下述化学反应:
因此,该酶有一种底物(内根-柯巴基二磷酸)和两种产物(内根-贝壳杉烯和二磷酸盐)。
该酶属于裂解酶家族,具体是作用于磷酸酯的碳-氧裂解酶。这种酶类的系统名称是内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶(环化,形成内根-贝壳杉烯)。其它的常用名包括内根-贝壳杉烯合酶B、内根-贝壳杉烯合成酶B、内根-柯巴基-二磷酸二磷酸酯-裂解酶和(环化)。该酶参与二萜类化合物的生物合成。
具有内根-柯巴基二磷酸合酶活性的蛋白质还可以有截然不同的内根-贝壳杉烯合酶的活性。内根-贝壳杉烯合酶催化的反应是赤霉素生物合成途径中的下一个步骤。这两种类型的酶活性是截然不同的,抑制蛋白质的内根-贝壳杉烯合酶活性的定点突变导致内根-柯巴基焦磷酸的积累。
因此,单个核苷酸序列可编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性和内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽。或者,可以用两段截然不同的、分开的核苷酸序列编码这两种活性。
为了本发明的目的,具有内根-贝壳杉烯氧化酶(EC1.14.13.78)活性的多肽能够催化内根-贝壳杉烯的4-甲基的连续三次氧化以产生贝壳杉烯酸。这种活性通常需要细胞色素P450的存在。
为了本发明的目的,具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性(EC1.14.13)活性的多肽能够催化利用NADPH和O2形成甜菊醇(对映-贝壳杉-16-烯-13-醇-19-羧酸)的反应。这种活性也可被称为内根-贝壳杉烯13-羟化酶活性。
可被发酵以产生用于本发明方法中的发酵液的重组微生物包括一种或多种核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码具有UDP-葡糖基转移酶(UGT)活性的多肽,通过所述核苷酸序列的表达使重组微生物能够生产甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A或莱鲍迪甙M中的至少一种。
为了本发明的目的,具有UGT活性的多肽具有糖基转移酶(EC 2.4)活性,即作为催化剂能够催化单糖基团从有活性的的核苷酸糖(又称“糖基供体”)转移至糖基受体分子(通常是醇)。UGT的糖基供体通常是核苷酸糖尿苷二磷酸葡萄糖(尿嘧啶-二磷酸葡萄糖,UDP-葡萄糖)。
可以选择所使用的UGTs以产生期望的二萜糖苷,例如甜菊糖苷。Humphrey等人,Plant Molecular Biology(2006)61:47-62和Mohamed等人,J.Plant Physiology 168(2011)1136-1141中展示了甜菊糖苷形成的示意图。此外,图8展示了甜菊糖苷形成的示意图。
莱鲍迪甙A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体而言,莱鲍迪甙A可通过以下步骤形成:首先葡糖基化甜菊醇的13-OH形成13-O-甜菊单糖苷,然后葡糖基化甜菊单糖苷的13-O-葡萄糖的C-2'形成甜菊醇-1,2二糖苷,接着葡糖基化甜菊醇-1,2二糖苷的C-19羟基形成甜菊糖苷,以及葡糖基化甜菊糖苷的C-13-O-葡萄糖的C-3'形成莱鲍迪甙A。各个葡糖基化反应发生的顺序可以变化—参见图8。如该示意图中所示,一种UGT可以催化不止一种转换。
通过在重组宿主中表达编码功能UGTs(UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2)的基因,可以实现从甜菊醇到莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D的转换。因此,当表达这四种UGTs的重组微生物产生甜菊醇或向培养基中补加甜菊醇时,该微生物能够制造莱鲍迪甙A。通常,这些基因中的一个或多个是重组基因,它们被转化到天生不具有这些基因的微生物中。所有这些酶的实例都展示在表1中。重组微生物可包括UGT74G1、UGT85C2、UGT76G1和UGT2的任意组合。在表1中,序列UGT64G1被表示为序列UGT1,序列UGT74G1被表示为序列UGT3,序列UGT76G1被表示为序列UGT4,序列UGT2被表示为序列UGT2。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可以包括一种核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说,重组微生物可包含能够催化将甜菊醇转换为甜菊单糖苷的UGT。因此,这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊单糖苷。
这种微生物可包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT85C2所显示的活性的多肽的核苷酸序列,通过将所述核苷酸序列转化至微生物中,使细胞能够将甜菊醇转换为甜菊单糖苷。
UGT85C2的活性是向甜菊醇的13-OH转移一个葡萄糖单元。因此,合适的UGT85C2可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-葡糖苷13-OH转移酶的作用。功能UGT85C2多肽还可以催化葡糖基转移酶反应,该反应利用甜菊糖苷,而非甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡糖苷作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT1。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽。也就是说,重组微生物可包括能够催化将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊双糖苷。
合适的重组微生物还可以包含编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列,通过将所述核苷酸序列转化至微生物中,使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。
合适的重组微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT2所显示的活性的多肽的核苷酸序列,通过将所述核苷酸序列转化至微生物中,使细胞能够将甜菊单糖苷转换为甜菊双糖苷。
合适的UGT2多肽起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶(也被称为甜菊醇-13-单葡糖苷1,2-转葡糖基酶)的作用,它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。通常,合适的UGT2多肽还起着尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜茶苷转移酶的作用,它将葡萄糖部分转移至受体分子(甜茶苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。
功能UGT2多肽还可以催化利用甜菊糖苷,而非甜菊醇-13-O-葡糖苷和甜茶苷作为底物的反应,例如功能UGT2多肽可以利用甜菊苷作为底物,将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙E。功能UGT2多肽还可以利用莱鲍迪甙A作为底物,将葡萄糖部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'以产生莱鲍迪甙D。但是功能UGT2多肽通常不能将葡萄糖部分转移至C-13位有1,3-键葡萄糖的甜菊醇化合物,即不能将葡萄糖部分转移至甜菊醇1,3-二苷和1,3-甜菊苷。
功能UGT2多肽还可以从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的其他供体转移糖部分。例如,功能UGT2多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸D-木糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用,将木糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。又例如,功能UGT2多肽能够起尿嘧啶5'-二磷酸L-鼠李糖基:甜菊醇-13-O-葡糖苷转移酶的作用,将鼠李糖部分转移至受体分子(甜菊醇-13-O-葡糖苷)的13-O-葡萄糖的C-2'。这种序列在表1中被表示为序列UGT2。
可被发酵以产生用于本发明方法中的发酵液的包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物还可以包括一种核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化向甜菊双糖苷添加C-19-葡萄糖的多肽。也就是说,合适的重组微生物可包括能够催化将甜菊双糖苷转换为甜菊苷的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生甜菊苷。
合适的重组微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT74G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列,通过将所述核苷酸序列转化至微生物中,使细胞能够将甜菊双糖苷转换为甜菊苷。
合适的UGT74G1多肽可以将葡萄糖单元分别转移至甜菊醇的13-OH或19-COOH。合适的UGT74G1多肽可以起尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-O-葡糖苷19-COOH转移酶的作用。功能UGT74G1多肽还可以催化糖基转移酶反应,该反应利用甜菊糖苷,而非甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡糖苷作为底物,或者该反应从不同于尿嘧啶二磷酸葡萄糖的供体转移糖部分。这种序列在表3中被表示为序列UGT1。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包括一种核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的C-13位葡萄糖的C-3’的糖基化的多肽。也就是说,重组微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙A。
合适的重组微生物还可以包括编码具有UDP-糖基转移酶(UGT)UGT76G1所显示的活性的多肽的核苷酸序列,通过将所述核苷酸序列转化至微生物中,使细胞能够将甜菊苷转换为莱鲍迪甙A。
合适的UGT76G1将葡萄糖部分添加到受体分子(甜菊醇1,2-糖苷)的C-13-O-葡萄糖的C-3’。因此,UGT76G1起着例如,尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-O-1,2葡糖苷C-3’葡糖基转移酶和尿嘧啶5'-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-O-葡萄糖,13-O-1,2二苷C-3’葡糖基转移酶的作用。功能UGT76G1多肽还可以催化葡糖基转移酶反应,该反应利用含糖(除葡萄糖外)的甜菊糖苷(例如甜菊鼠李糖苷和甜菊木糖苷)作为底物。这种序列在表1中被表示为序列UGT4。
重组微生物可以包括编码具有上述四种UGT活性中的一种或多种的多肽的核苷酸序列。优选地,重组微生物可以包括编码具有全部上述四种UGT活性的多肽的核苷酸序列。给出的核酸可以编码具有一种或多种上述活性的多肽。例如,编码具有2种、3种或4种上述活性的多肽的核酸。优选地,重组微生物包括UGT1活性、UGT2活性和UGT3活性。更优选地,这种重组微生物还包括UGT4活性。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包含核苷酸序列,所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷或莱鲍迪甙A的葡糖基化。也就是说,重组微生物可包括能够催化将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙D。我们已经证明:表达UGT85C2、UGT2、UGT74G1和UGT76G1多肽组合物的微生物可以产生莱鲍迪甙D。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包含核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化甜菊苷的糖基化的多肽。也就是说,微生物可包括能够催化将甜菊苷转换为莱鲍迪甙E的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊苷转换为莱鲍迪甙E。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙E。
包含编码具有UGT活性的多肽的核苷酸序列的重组微生物可包含核苷酸序列,其中所述核苷酸序列编码能够催化莱鲍迪甙E的糖基化的多肽。也就是说,微生物可包括能够催化将莱鲍迪甙E转换为莱鲍迪甙D的UGT。因此,这种微生物可以将甜菊苷或莱鲍迪甙A转换为莱鲍迪甙D。这种核苷酸序列的表达可以使重组微生物至少能产生莱鲍迪甙D。
重组微生物可表达编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列。也就是说,重组微生物可包括编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的序列。
具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性(EC 1.6.2.4;又名NADPH:高铁血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:血红素蛋白氧化还原酶、NADPH:P450氧化还原酶、P450氧化还原酶、POR、CPR、CYPOR)的多肽通常是膜结合型的酶,它使电子从含有FAD和FMN的酶—NADPH:细胞色素P450还原酶(POR;EC 1.6.2.4)转移至真核细胞微粒体中的细胞色素P450。
优选地,能够被发酵来制备适用于本发明方法的发酵液的重组微生物能够表达以下中的一种或多种:
a.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有NADPH-细胞色素p450还原酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO(SEQ ID NO):54、56、58或78的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:53、55、57或77的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列,
优选地,重组微生物能够表达以下核苷酸序列中的一种或多种:
a.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列,
其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有内根-柯巴基焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:2、4、6、8、18、20、60或62的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:1、3、5、7、17、19、59或61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列,
b.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中
所述核苷酸序列包括:
i.编码具有内根-贝壳杉烯合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、64或66的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列,
c.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有内根-贝壳杉烯氧化酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:22、24、26、68或86的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列;或者
d.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有贝壳杉烯酸13-羟化酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:28、30、32、34、70、90、92、94、96或98的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
在能够表达编码可催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中,其中所述核苷酸序列可包括:
i.编码能够催化向甜菊醇添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:36、38或72的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:35、37、71、147、168、169或189的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
在能够表达编码可催化在甜菊单糖苷C-13位添加葡萄糖(这通常表示甜菊单糖苷的C-13-葡萄糖/13-O-葡萄糖的C-2’的糖基化)的多肽的核苷酸序列的重组微生物中,其中所述核苷酸序列可包括:
i.编码能够催化向甜菊醇或甜菊单糖苷添加C-13-葡萄糖的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:88、100、102、104、106、108、110或112的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
在能够表达编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列的重组微生物中,其中所述核苷酸序列可包括:
i.编码可催化在甜菊双糖苷C-19位添加葡萄糖的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:40、42、44、46、48或74的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:39、41、43、45、47、73、148、170、171、172、173、174或190的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
在表达编码可催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列的重组微生物中,其中所述核苷酸序列可包括:
i.编码能够催化在甜菊苷C-13位的葡萄糖的C-3’的葡糖基化的多肽的核苷酸序列,所述多肽包括与SEQ ID NO:50、52或76的氨基酸序列的序列同一性至少约20%,优选地至少25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:49、51、75、149、175、176或191的核苷酸序列的序列同一性至少约15%,优选地至少20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
在表达编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列的重组微生物中,其中所述反应为:将甜菊苷或莱鲍迪甙A葡糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷葡糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E葡糖基化为莱鲍迪甙D,其中所述核苷酸序列可包括:
i.编码能够催化下述反应中的一个或多个的多肽的核苷酸序列,其中所述反应为:将甜菊苷或莱鲍迪甙A糖基化为莱鲍迪甙D、将甜菊苷糖基化为莱鲍迪甙E或者将莱鲍迪甙E糖基化为莱鲍迪甙D,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:88、100、102、104、106、108、110、112的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
合适的微生物产生香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的能力可能会被上调。在本发明的语境中,上调意味着:较同等但未被转化的菌株,本发明的微生物产生更多GGPP。
因此,合适的重组微生物可包括编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶和香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列中的一种或多种,通过将所述核苷酸序列转化至微生物使其生产GGPP的水平提高。
优选地,合适的重组微生物能够表达以下序列中的一种或多种:
a.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:80的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:79的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列,
b.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中
所述核苷酸序列包括:
i.编码具有法尼基-焦磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:82的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:81的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列;或者
c.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序
列,其中所述核苷酸序列包括:
i.编码具有香叶基香叶基二磷酸合酶活性的多肽的核苷酸序列,其中所述多肽包括与SEQ ID NO:84的氨基酸序列的序列同一性至少约20%的氨基酸序列;
ii.与SEQ ID NO:83的核苷酸序列的序列同一性至少约15%的核苷酸序列;
iii.其互补链与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列;或者
iv.由于遗传密码的简并性而不同于(i)、(ii)或(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。
为了本发明的目的,微生物通常指人类肉眼不可见的(即显微镜可见的)生物体。所述微生物可以来自细菌、真菌、古生菌或原生生物。所述微生物通常是单细胞生物。
本文中使用的重组微生物被定义为:被遗传修饰或者被一种或多种核苷酸序列(如在本文中所定义的)转化/转染的微生物。一种或多种这类核苷酸序列的存在改变了微生物产生二萜或二萜糖苷(特别是甜菊醇或甜菊糖苷)的能力。未被转化/转染或遗传修饰的微生物不是重组微生物,其通常不包括能使细胞产生二萜或二萜糖苷的一种或多种核苷酸序列。因此,未被转化/转染的微生物在自然条件下通常不能产生二萜,然而天生能够产生二萜或二萜糖苷并且例如本文所述经修饰的微生物(以及产生二萜/二萜糖苷的能力改变的微生物)被认为是重组微生物。
序列同一性在本文中被定义为:两种或多种氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两种或多种核酸(多聚核苷酸)序列之间的关系。通常,序列同一性或相似性是对被比较序列的全长进行比较。在本领域,“同一性”还意味着氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度,其由这些序列串之间的匹配程度所决定(视情况而定)。利用本领域的技术人员已知的各种方法易于计算出“同一性”和“相似性”。判断同一性的优选方法被设计成可以给出被检验的序列之间最大程度的匹配。然后,通常在被比较序列的全长范围计算同一性和相似性。判断同一性和相似性的方法被编码成了一些可通过公开途径获得的计算机程序。优选的判断两段序列之间的同一性和相似性的计算机程序方法包括,例如BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990),在NCBI和其它来源(BLASTManual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)中公开可用)。使用BLASTP对比氨基酸序列时,优选的参数是:空位开放10.0、空位扩展0.5、Blosum62矩阵。使用BLASTP对比核酸序列时,优选的参数是:空位开放10.0、空位扩展0.5、DNA全矩阵(DNA单位矩阵)。
还可以用下述方法定义编码表达于本文所述细胞中的酶的核苷酸序列:在温和杂交条件下,或者优选地在严格杂交条件下,将所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81或84的核苷酸序列或者本文中提到的任何其它序列分别杂交,然后根据它们的杂交性能定义。“严格杂交条件”在本文中被定义为下述条件:在约65℃下,在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中,允许包括至少约25个核苷酸,优选的约50、75或100个核苷酸,最优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交,然后在65℃下,在含有约0.1M盐(优选的是0.2×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地,杂交持续过夜,即至少10小时;优选地,洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许具有约90%或更高序列同一性的序列特异性杂交。
温和杂交条件在本文中被定义为:在约45℃下,在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中,允许包括至少约50个核苷酸,优选的约200或更多核苷酸的核酸序列杂交,然后在室温下,在含有约1M盐(优选的是6×SSC或具有类似离子强度的任何其它溶液)的溶液中洗涤。优选地,杂交持续过夜,即至少10小时;优选地,洗涤持续至少1小时并至少更换2次洗涤液。这些条件通常允许序列同一性最高为50%的序列特异性杂交。本领域的技术人员可以调整这些杂交条件以确切鉴定同一性在50%-90%之间变化的序列。
编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以是原核来源或真核来源。
编码内根-柯巴基焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、151、152、153、154、159、160、182或184中展示的序列。
编码内根-贝壳杉烯合酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184中展示的序列。
编码内根-贝壳杉烯氧化酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:21、23、25、67、85、145、161、162、163、180或186中展示的序列。优选的KO是由在SEQ ID NO:85中展示的核酸编码的多肽。
编码贝壳杉烯酸13-羟化酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185中展示的序列。优选的KAH是由在SEQID NO:33中展示的核酸编码的多肽。
合适的重组微生物可以表达由SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:33或上述二者之一的变体(如本文所述)编码的多肽的组合物。一种优选的重组微生物可以表达表8中展示的序列组合(与任意UGT2组合,但尤其是与由SEQ ID NO:87编码的UGT2组合)。
编码UGT的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中展示的序列。
编码羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:79中展示的序列。
编码法尼基-焦磷酸合酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:81中展示的序列。
编码香叶基香叶基二磷酸合酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:83中展示的序列。
编码NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列可以包括,例如在SEQ ID NO:53、55、57或77中展示的序列。
对于UGT序列,选自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的,其中所述组是:(i)SEQ ID NO:35、37、168、169、71、147或189;(ii)SEQ ID NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192;(iii)SEQ ID NO:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190;和(iv)SEQ ID NO:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT,那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT,那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。
本发明可使用与上述序列的序列同一性至少约10%、约15%、约20%,优选地至少约25%、约30%、约40%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的序列。
为了增加被引入的酶在重组微生物中以活性形式表达的可能性,可修改相应的编码核苷酸序列以将其密码子使用(codon usage)优化为所选真核宿主细胞的密码子使用。编码酶的核苷酸序列相对于所选宿主细胞的密码子使用的适应性可被表示为密码子适应指数(CAI)。“密码子适应指数”在本文中被定义为:一个基因的密码子使用相对高表达基因的密码子使用的相对适应性的度量值。每种密码子的相对适应度(w)指的是对于同一个氨基酸,该密码子相对于最高丰度密码子的使用率。CAI被定义为这些相对适应性数值的几何平均数。非同义密码子和终止密码子(取决于遗传密码)被排除在外。CAI值在0-1之间,较高的值表示最高丰度的密码子的比例较高(参见Sharp和Li,1987,Nucleic Acids Research15:1281-1295;亦可参见:Jansen等人,2003,Nucleic Acids Res.31(8):2242-51)。优选地,经修改的核苷酸序列的CAI值至少为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6或0.7。
在一个优选的实施方式中,用核苷酸序列遗传修饰重组微生物,其中使用密码对优化技术(如在PCT/EP2007/05594中所公开的)修改所述核苷酸序列的密码子使用为真核细胞的密码子使用。密码对优化技术是用于在宿主细胞中产生多肽的方法,其中就编码多肽的核苷酸序列的密码子使用(尤其是被使用的密码对)对核苷酸序列进行修饰,以改善编码多肽的核苷酸序列的表达和/或提高多肽的产量。密码对被定义为:编码序列中的一组2个连续的三联体(密码子)。
可利用公知的方法(例如易错PCR或定向进化)进一步提高重组微生物体内酶的活性。WO03010183和WO03010311中描述了定向进化的优选方法。
合适的重组微生物可以是微生物来源的任何合适的宿主细胞。优选地,所述宿主细胞是酵母或丝状真菌。更优选地,所述宿主细胞属于下述属之一:Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces、Yarrowia、Candida、Hansenula、Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、Pachysolen或Yamadazyma或Zygosaccharomyces。
更优选的微生物属于下述物种:Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K.lactis、K.thermotolerans、Yarrowialipolytica、Candida sonorensis、C.glabrata、Hansenula polymorpha、Torulasporadelbrueckii、Brettanomyces bruxellensis、Zygosaccharomyces bailii、Saccharomycesuvarum、Saccharomyces bayanus或Saccharomyces cerevisiae。优选的真核细胞是Saccharomyces cerevisiae。
可修饰所述的重组酵母细胞以使ERG9基因被下调和/或ERG5/ERG6基因被删除。在其它微生物中,可用相同的方法修饰相应的基因。
可以转化这种微生物,通过将核苷酸序列转化至所述微生物使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。
一种优选的合适重组微生物是酵母,例如Saccharomyces cerevisiae或Yarrowialipolytica细胞。重组微生物(例如重组的Saccharomyces cerevisiae细胞或Yarrowialipolytica细胞)可包括以下每组中的一种或多种核苷酸序列:
(i)SEQ ID NO:1、3、5、7、17、19、59、61、141、142、152、153、154、159、160、182或184。
(ii)SEQ ID NO:9、11、13、15、17、19、63、65、143、144、155、156、157、158、159、160、183或184。
(iii)SEQ ID NO:21、23、25、6785、145、161、162、163、180或186。
(iv)SEQ ID NO:27、29、31、33、69、89、91、93、95、97、146、164、165、166、167或185。
这种微生物通常还包括一种或多种如SEQ ID NO:53、55、57或77中所示的核苷酸序列。
这种微生物还可以包括一种或多种如SEQ ID NO:35、37、39、41、43、45、47、49、51、71、73、75、168、169、170、171、172、173、174、175、176、147、148、149、87、181、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、189、190、191或192中所示的核苷酸序列。对于这些序列,来自以下每组中至少一种序列的组合可能是优选的,其中所述组是:(i)SEQ ID NO:35、37、168、169、71、147或189;(ii)SEQ ID NO:87、99、101、103、105、107、109、111、181或192;(iii)SEQ ID NO:39、41、43、45、47、170、171、172、173、174、73、148或190;和(iv)SEQ ID NO:49、51、175、176、75、149或191。通常可以使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iii)的UGT,那么通常也使用至少一种组(i)的UGT。如果使用了至少一种组(iv)的UGT,那么通常使用至少一种组(i)的UGT和至少一种组(iii)的UGT。通常使用至少一种组(ii)的UGT。
这种微生物还可以包括下述核苷酸序列:SEQ ID NO:79、81和83。
对于上述每种序列(或本文提及的任何序列),可以使用与所述序列的序列同一性至少约15%,优选地至少约20%、25%、约30%、约40%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的变体。
可将编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶、NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列连接至一个或多个核酸构建体以促进微生物的转化。
核酸构建体可以是质粒,所述质粒带有编码上述二萜(例如甜菊醇/甜菊糖苷)途径中的酶的基因;或者核酸构建体可包括两个或三个质粒,其中每个质粒分别带有3个或2个基因,这些基因以任意恰当的方式分布并编码二萜途径中的酶。
可以使用任何合适的质粒,例如低拷贝质粒或高拷贝质粒。
选自内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的酶可以源于宿主微生物,这样就可以不需要用一种或多种编码这些酶的核苷酸序列转化而使宿主细胞产生二萜或二萜糖苷酶。可以通过经典的菌株改良方法,进一步提高利用宿主微生物生产二萜/二萜糖苷酶的产量。
核酸构建体可以维持附加体状态,因此其包括自主复制的序列,例如常染色体复制序列。如果宿主细胞是真菌来源,那么合适的游离核酸构建体可以,例如基于酵母2μ或pKD1质粒(Gleer等人,1991,Biotechnology 9:968-975)或者AMA质粒(Fierro等人,1995,Curr Genet.29:482-489)。
或者,可以将每种核酸构建体以单拷贝或多拷贝整合至宿主细胞的基因组。可以通过非同源重组将核酸构建体随机整合至宿主细胞的基因组,但优选地通过本领域公知的同源重组(参见例如WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574和US 6,265,186)实现。
任选地,核酸构建体中可存在选择标记。本文中使用的术语“标记”涉及编码允许选择或筛选含有此标记的微生物的性状或表型的基因。标记基因可以是抗生素抗性基因,能够通过使用恰当的抗生素从未被转化的细胞中选出被转化的细胞。或者还可以使用非抗生素抗性标记,例如营养缺陷型标记(URA3、TRP1、LEU2),被这种核酸构建体转化过的宿主细胞可以不含有标记基因。EP-A-0635574中公开了构建不含重组标记基因的微生物宿主细胞的方法,该方法基于双向标记的使用。或者,可以使可筛选的标记(例如绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、β-葡糖醛酸酶)成为核酸构建体的一部分以筛选被转化的细胞。WO0540186中描述了引入异源多聚核苷酸的优选的无标记方法。
在一个优选的实施方式中,编码内根-柯巴基焦磷酸合酶、内根-贝壳杉烯合酶、内根-贝壳杉烯氧化酶和贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGTs、羟甲基戊二酸-辅酶A还原酶、法尼基-焦磷酸合酶、香叶基香叶基二磷酸合酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的核苷酸序列各自与启动子操作性连接,所述启动子能够使重组微生物中相应核苷酸序列充分表达,从而使细胞能够产生二萜或二萜糖苷。
本文中使用的术语“操作性连接”指的是多聚核苷酸元件(或编码序列,或核酸序列)以功能关系连接。当一种核酸序列与另一种核酸序列存在功能关系时,则该核酸序列被与另一种核酸序列“操作性连接”。例如,如果一个启动子或增强子影响编码序列的转录,那么它与编码序列操作性连接。
本文中使用的术语“启动子”涉及控制一个或多个基因转录的核酸片段,其位于基因转录起始位点的上游(相对于转录方向),在结构上可以根据依赖DNA的RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其它的DNA序列(包括但不局限于转录因子结合位点、阻遏蛋白和激活蛋白结合位点以及本领域技术人员已知的直接或间接地从启动子调控转录量的任何其它核苷酸序列)的存在来鉴定。“组成型”启动子指的是在大部分环境和发育条件下活跃的启动子。“诱导型”启动子指的是在环境或发育调控下活跃的启动子。
能够被用来表达编码上文所定义的酶的核苷酸序列的启动子可以不源于编码要表达的酶的核苷酸序列,即启动子和与其操作性连接的核苷酸序列(编码序列)是异源的。优选地,启动子是同源的,即相对于宿主细胞是內源的。
用于重组微生物中的合适的启动子可以是GAL7、GAL10或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI和AOX1。其它合适的启动子包括PDC、GPD1、PGK1、TEF1和TDH。
可以使用任何在细胞中有功能的终止子。优选的终止子是从宿主细胞的天然基因中获得的。合适的终止子序列是本领域公知的。优选地,在宿主细胞中,这种终止子与阻止无义介导的mRNA降解的突变体结合(参见例如:Shirley等人,2002,Genetics 161:1465-1482)。
使用的核苷酸序列可以包括将其锚定至微生物的期望隔室的序列。例如,在一种优选的重组微生物中,除内根-贝壳杉烯氧化酶、贝壳杉烯酸13-羟化酶和NADPH-细胞色素p450还原酶的编码序列外的所有核苷酸序列都可被锚定至细胞溶质。可以在酵母细胞中使用这种方法。
当使用术语“同源”表示给出的(重组)核酸或多肽分子与给出的宿主生物体或宿主细胞之间的关系时,可以理解为:本质上,核酸或多肽分子由一种宿主细胞或相同物种(优选的是相同变体或菌株)的生物体产生。
当使用术语“异源”表示核酸(DNA或RNA)或蛋白质时,其中所涉及的核酸或蛋白质在自然条件下并不作为其存在的生物体、细胞、基因组或者DNA或RNA序列的一部分出现,或者是与在自然界发现的不同的细胞、位置、基因组或者DNA或RNA序列中发现的核酸或蛋白质。异源的核酸或蛋白质相对于其被引入的细胞不是內源的,但它是从另外一种细胞或者合成或重组生产获得的。
合适的重组微生物通常包括异源的核苷酸序列。或者重组微生物可包括被修饰(如本文所述)的完全同源的序列,以便所述微生物比同种但未被修饰的微生物产生更大量的二萜和/或二萜糖苷。
可过表达一种或多种本文所述的二萜途径中的酶以利用细胞产生充足的二萜。
本领域存在多种用以在宿主细胞中过表达酶的有效方法。特别地,可以通过增加宿主细胞中编码酶的基因的拷贝数以过表达该酶,例如通过将基因的额外拷贝整合至宿主细胞的基因组中。
优选的重组微生物可以是天然能够产生GGPP的重组微生物。
合适的重组微生物可以在本领域已知的任意合适的碳源上生长并将其转换为一种或更多种甜菊糖苷。所述重组微生物可直接转换植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此,一种优选的宿主生物体表达酶,例如将纤维素转换为葡萄糖单体所需的纤维素酶(内纤维素酶和外纤维素酶)、将半纤维素转换为木糖和阿拉伯糖单体所需的半纤维素酶(例如内木聚糖酶、外木聚糖酶、阿拉伯糖酶)、能够将果胶转换为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的果胶酶或者能够将淀粉转换为葡萄糖单体的淀粉酶。优选地,所述宿主细胞能够转换的碳源选自葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖和甘油。所述宿主细胞可以是,例如如在WO03/062430、WO06/009434、EP1499708B1、WO2006096130或WO04/099381中描述的真核宿主细胞。
如上所述的重组微生物可被用在生产甜菊糖苷的方法中,所述方法包括:在合适的发酵培养基中发酵经转化的合适的重组微生物(如上文所述);以及任选地回收二萜和/或二萜糖苷。
在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中使用的发酵培养基可以是任何能使特定真核宿主细胞生长的适合的培养基。发酵培养基的基本元素是本领域的技术人员已知的,并可针对所选宿主细胞进行修改。
优选地,发酵培养基包括选自植物生物质、纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、海藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油的碳源。优选地,发酵培养基还包括氮源,例如尿素或者铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵)。
可以以分批、补料分批或连续的模式实施合适的发酵方法。也可采用分步水解发酵(SHF)法或同时糖化发酵(SSF)法。为了达到最佳生产力,还可以将这些发酵方法的模式结合。在发酵方法中,如果使用淀粉、纤维素、半纤维素或果胶作为碳源,那么SSF方法可能特别有吸引力,该方法中可能需要加入水解酶,例如纤维素酶、半纤维素酶或果胶酶以水解底物。
在制备甜菊糖苷的方法中使用的重组微生物可以是任何如上文所定义的适合的微生物。在生产二萜和/或二萜糖苷的方法中,使用本文所述重组真核微生物可能是有利的,因为大部分真核细胞不需要无菌条件来增殖而且对噬菌体感染不敏感。此外,真核宿主细胞可以在低pH条件下生长以避免细菌污染。
重组微生物可以是兼性厌氧微生物。在有氧条件下,兼性厌氧微生物能够增殖至高细胞浓度。然后可以在高细胞密度时进行厌氧阶段,高细胞密度不仅大幅度减少了需要的发酵体积,而且可以最小化好氧微生物污染的风险。
生产甜菊糖苷的发酵方法可以是有氧的或厌氧的发酵方法。
厌氧发酵方法在本文中可被定义为:在没有氧气或实质上没有氧气可用(优选的少于5、2.5或1mmol/L/h)的条件下运行的发酵方法,其中有机分子起着电子供体和电子受体的作用。发酵方法还可以首先在有氧条件下运行,然后在无氧条件下运行。
还可以在氧限制(oxygen-limited)或微有氧(micro-aerobical)条件下运行所述发酵方法。或者,可以先在有氧条件下、然后在氧限制条件下运行所述发酵方法。氧限制发酵方法指的是耗氧量受到从气体输送至液体的氧气的限制。氧限制的程度取决于进入气流的量和组分以及所使用的发酵设备的实际混合/传质性能。
发酵方法中可以在宿主细胞的生长期或静止(稳态)期生产甜菊糖苷,或者在这两个阶段均生产甜菊糖苷。可以在不同的温度下运行所述发酵方法。
可以在最适合重组微生物的温度下生产甜菊糖苷。最适宜的生长温度可因各种被转化的细胞而异,这是本领域的技术人员已知的。所述最适宜的温度可能比最适合野生型生物体的温度高,以便生物体在非无菌条件下,在感染敏感性最小和冷却成本最低时高效生长。或者,可以在并非最适合重组微生物生长的温度下实施该方法。
在生产二萜或二萜糖苷的方法中,重组微生物的生长温度可以高于20℃、22℃、25℃、28℃或高于30℃、35℃或高于37℃、40℃、42℃,优选地低于45℃。然而在二萜或二萜糖苷的产生阶段,最适宜的温度可能低于平均温度以优化生物质的稳定性。这个阶段的温度可以低于45℃,例如低于42℃、40℃、37℃,例如低于35℃、30℃或者低于28℃、25℃、22℃或者低于20℃,优选地高于15℃。
可以在任意合适的pH值下实施生产甜菊糖苷的方法。如果重组微生物是酵母,那么发酵培养基优选的pH值低于6,优选地低于5.5,优选地低于5,优选地低于4.5,优选地低于4,优选地低于3.5或低于3.0或低于2.5,优选地高于2。在这些低pH值下实施发酵过程的一个优势在于,可以防止发酵培养基中污染细菌的生长。
可以以工业规模实施这种方法。
这种方法的产物可以是甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A中的一种或多种。优选地,产生莱鲍迪甙A或莱鲍迪甙D。
可以根据本发明从产生的发酵液中回收二萜或二萜糖苷。
根据发酵生产甜菊糖苷的方法中,获得的发酵液的浓度可超过5mg/l发酵液,优选地在发酵液中超过10mg/l,优选地超过20mg/l,优选地超过30mg/l,优选地超过40mg/l,更优选地超过50mg/l,优选地超过60mg/l,优选地超过70mg/l的发酵,优选地超过80mg/l,优选地超过100mg/l,优选地超过1g/l,优选地超过5g/l,优选地超过10g/l的,但通常低于70g/l。
如上所述,如果二萜或二萜糖苷表达于微生物中,那么可需要处理这种细胞以释放甜菊糖苷。
根据本发明的溶液和/或组合物可用于甜菊糖苷已知的任何应用中。特别地,它们可以在例如食品或饮料中例如被用作甜味剂。例如,甜菊糖苷可以被调配在软饮料中,可以用于桌面甜味剂(tabletop sweetener)、口香糖、乳制品(例如酸奶(例如原味酸奶))、蛋糕、谷物或基于谷物的食品、营养食品、药物、食用胶、糖果食品、化妆品、牙膏或者其它口腔组合物等。此外,甜菊糖苷可作为甜味剂不仅用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品,而且还用于具有改良特性的动物饲料和料草。
在生产食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖时,可使用常规方法,例如混合、揉捏、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。
在本发明中得到的溶液和/或组合物可以以干燥形式或液体形式使用。可以在食品热处理之前或之后加入。甜味剂的量取决于使用目的。可以单独加入或者与其它化合物组合加入。
根据本发明的回收方法生产的溶液和组合物可以与一种或多种其它无热量或有热量的甜味剂混合。这种混合物可被用于改善风味或时间变化形廓或稳定性。大范围无热量和有热量的甜味剂可适合与甜菊糖苷混合。例如,无热量的甜味剂,例如罗汉果苷、莫那甜、阿斯巴甜、乙酰舒泛盐、环磺酸盐、三氯蔗糖、邻磺苯甲酰亚胺盐或赤藓糖醇。适合与甜菊糖苷混合的有热量的甜味剂包括糖醇和碳水化合物(例如蔗糖、葡萄糖、果糖和果葡糖浆)。也可以使用有甜味的氨基酸,例如甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸。
甜菊糖苷可以与甜味抑制剂(例如天然甜味抑制剂)组合使用。它可以与鲜味增强剂(例如氨基酸或其盐)组合。
甜菊糖苷可以与多元醇或糖醇、碳水化合物、生理活性物质或功能成分(例如类胡萝卜素、膳食纤维、脂肪酸、皂素、抗氧化剂、营养食品、类黄酮、异硫氰酸酯、苯酚、植物甾醇或植物固醇、多元醇类、益生质、益生素、植物雌激素、大豆蛋白、硫化物/硫醇、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和/或被归为有益健康类的例如有益心血管的、降低胆固醇的或抗炎的物质)组合。
根据本发明的组合物或溶液可包括增味剂、芳香剂、核苷酸、有机酸、有机酸盐、无机酸、苦味剂、蛋白质或蛋白质水解物、表面活性剂、类黄酮、收敛剂、维生素、膳食纤维、抗氧化剂、脂肪酸和/或脂肪酸盐。
本发明的组合物或溶液可作为高强度甜味剂被使用以产生具有改良味道特征的零卡路里、低卡路里或糖尿病人的饮料和食品。它也能用于不能使用糖的食品、药品和其它产品中。
此外,本发明的组合物或溶液作为甜味剂,不仅可以用于饮料、食品和其它专供人类消费的产品,而且可以用于具有改良特征的动物饲料。
使用本发明的组合物或溶液作为甜味剂的产品实例有:含酒精的饮料(例如伏特加酒、红酒、啤酒、烈酒、日本清酒等)、天然果汁、清凉饮料、碳酸软饮料、低糖饮料、零卡路里饮料、低卡路里饮料和食物、酸奶饮料、速溶果汁、速溶咖啡、粉末型速溶饮料、罐装食品、糖浆剂、发酵豆酱、酱油、醋、调味品、蛋黄酱、番茄酱、咖喱粉、汤、速食汤、酱油粉、醋粉、饼干类、米饼、咸饼干、面包、巧克力、焦糖、糖果、口香糖、果冻、布丁、果脯、榨菜、鲜奶油、果酱、橘子酱、花酱、奶粉、冰激凌、果汁冰糕、瓶装蔬菜、瓶装水果、罐装煮豆、糖酱煮肉和食物、农业蔬菜食品、海鲜、火腿、香肠、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼酱、油炸鱼制品、干海鲜制品、冷冻食品、腌海藻、腊肉、烟草、药品和许多其它产品。原则上,其应用可以不受限制。
甜味组合物包括饮料,其中非限制性的实例包括:非碳酸和碳酸饮料(例如可乐、姜汁汽水、沙士、苹果酒、果味软饮料(例如柑橘类(例如柠檬-酸橙或橘子)风味软饮料)、软饮料粉等);源于水果或蔬菜的果汁、含有压榨汁或其类似物的果汁、含有水果颗粒的果汁、水果饮料、水果汁饮料、含有水果汁的饮料、果味饮料、蔬菜汁、含有蔬菜的果汁以及含有水果和蔬菜的混合果汁;运动饮料、能量饮料、近似水及其类似物的饮料(例如含有天然或合成调味剂的水);茶类或最受欢迎类饮料(例如咖啡、可可饮料、红茶、绿茶、乌龙茶等);含有牛奶成分的饮料(例如牛奶饮料、含有牛奶成分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果乳饮料、饮用酸奶、乳酸菌饮料等)和乳制品。
通常,甜味组合物中的甜味剂的量变化很大,这取决于甜味组合物的具体类型和期望甜味。本领域的普通技术人员能够易于分辨出待放入甜味组合物中的甜味剂的合适量。
如本文所述得到的本发明所述的组合物或溶液可以干燥形式或液体形式被使用。它可以在热处理食品之前或之后被加入。甜味剂的量取决于使用目的。它能够被单独加入或者与其它化合物组合加入。
在制造食品、饮料、药品、化妆品、桌面产品、口香糖的过程中可以使用常规方法,例如混合、捏合、溶解、酸洗、渗透、过滤、喷洒、雾化、浸泡和其它方法。
可以以任何适合配送至待加糖食品的形式向消费者提供固体的组合物,其中所述形式包括小袋、小包、散装袋或盒、立方块、片、喷雾或者可溶性的条。可以以单位剂量或大批量配送所述组合物。
对于液体甜味剂系列和方便的液体、半液体、膏状和乳状形式的组合物,应该发明一种便于携带或分配或贮存或运输含有任何上述甜味剂产品或上述产品的组合物的合适的包装,其中所述包装使用合适的任意形状或形式的包装材料。
本发明所述的组合物或溶液可包括各种填充剂、功能成分、色素和香料。
不能认为本文参考的专利文件或者作为现有技术给出的其它材料承认:截止任意权利要求的优先权日,所述文件或材料是已知的或者其所包含的信息是公众常识的一部分。
本文提及的每个参考文献的公开内容均通过引用的方式被全部并入本文。
通过以下实施例进一步阐释本发明。
实施例
概述
标准的遗传技术(例如在宿主细胞中过表达酶以及宿主细胞的额外遗传修饰)是本领域已知的方法,例如在Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第三版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor LaboratoryPress或者F.Ausubel等人,eds.,"Current protocols in molecular biology",GreenPublishing and Wiley Interscience,New York(1987)中所描述的。真菌宿主细胞的转化和遗传修饰的方法可以从,例如EP-A-0 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和WO 00/37671中了解。
表1展示了序列说明。本文描述的序列可以引用序列表或数据库访问号(同样展示于表1)来定义。
实施例1.在S.cerevisiae中过表达ERG20、BTS1和tHMG
使用如共同待决专利申请PCT/EP2013/056623中描述的技术将表达盒整合至一个位点以过表达ERG20、BTS1和tHMG1。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株(van Dijken等人Enzyme and Microbial Technology 26(2000)706-714)的基因组DNA扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0,不同的基因被整理为盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。这些盒子中的基因的侧翼是组成型启动子和终止子。参见表2。溶解来源于DNA2.0的含有ERG20、tHMG1和BTS1盒子的质粒DNA至浓度为100ng/μl。在50μl PCR混合物中,使用20ng模板和20pmol引物。材料被溶解至浓度为0.5μg/μl。
表2:过表达构建体的组分
启动子 | 开放阅读框 | 终止子 |
Eno2(SEQ ID NO:201) | Erg20(SEQ ID NO:81) | Adh1(SEQ ID NO:212) |
Fba1(SEQ ID NO:202) | tHMG1(SEQ ID NO:79) | Adh2(SEQ ID NO:213) |
Tef1(SEQ ID NO:203) | Bts1(SEQ ID NO:83) | Gmp1(SEQ ID NO:214) |
使用pUG7-EcoRV构建体(图1)和合适的引物来扩增选择标记。使用Zymoclean GelDNA Recovery试剂盒(ZymoResearch)从凝胶中纯化KanMX片段。使用在表3中列出的片段转化酵母菌株Cen.PK113-3C。
表3:用于ERG20、tHMG1和BTS1的转化的DNA片段
片段 |
5’YPRcTau3 |
ERG20盒 |
tHMG1盒 |
KanMX盒 |
BTS1盒 |
3’YPRcTau3 |
转化后,在30℃下于YEPhD(酵母膏植物蛋白胨葡萄糖;BBL植物蛋白胨来源于BD)中复苏2.5小时,然后将细胞涂布在含200μg/ml G418(Sigma)的YEPhD琼脂上。在30℃下培养平板4天。利用诊断PCR和测序技术确定正确的整合。通过对蛋白质进行LC/MS证实过表达。图2阐释了组装ERG20、tHMG1和BTS1的原理图。该菌株被命名为STV002。
该菌株中CRE重组酶的表达导致KanMX标记的向外重组。利用诊断PCR确定正确的向外重组以及ERG20、tHMG1和BTS1的存在。
实施例2.敲低Erg9
为了降低Erg9的表达,设计并使用含有修饰的3’末端的Erg9敲低构建体,其中所述3’末端延续至驱动TRP1表达的TRP1启动子。
转化含有Erg9-KD片段的构建体至E.coli TOP10细胞。转化株生长于2PY(2倍的植物蛋白胨和酵母膏)-sAMP培养基中。使用QIAprep Spin Miniprep kit(Qiagen)分离质粒DNA,然后用SalI-HF(New England Biolabs)消化。用乙醇沉淀DNA以浓缩。转化所述片段至S.cerevisiae,然后将菌落涂布到不含色氨酸的矿质培养基(Verduyn等人,1992.Yeast 8:501-517)琼脂板上。利用诊断PCR和测序技术确定正确整合的Erg9-KD构建体。图2阐释了执行Erg9-KD构建体的转化的原理图。该菌株被命名为STV003。
实施例3.过表达UGT2_1a
使用如共同待决专利申请PCT/EP2013/056623和PCT/EP2013/055047中描述的技术过表达UGT2_1a。在DNA2.0,UGT2_1a被整理为一个盒子(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)。细节请参见表4。使用如共同待决专利申请PCT/EP2013/055047中描述的技术以获得含有标记和Cre重组酶的片段。用具有诺尔丝菌素抗性的NAT标记进行筛选。
表4:过表达构建体的组分
使用合适的引物进行扩增。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。
使用表5中列出的片段转化S.cerevisiae酵母菌株STV003,然后将转化混合物涂布在含有50μg/ml诺尔丝菌素(Lexy NTC来源于Jena Bioscience)的YEPhD琼脂板上。
表5:用于UGT2_1a的转化的DNA片段
半乳糖能够激活CRE重组酶的表达。为了诱导CRE重组酶的表达,将转化株再次划线至YEPh半乳糖培养基上。这导致了位于lox位置之间的标记的向外重组。利用诊断PCR证实UGT2a的正确整合和NAT标记的向外重组。由此产生的菌株被命名为STV004。图4阐释了执行UGT2_1a构建体的转化的原理图。
实施例4.过表达RebA产生通路:CPS、KS、KO、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4
使用如共同待决专利申请PCT/EP2013/056623中描述的技术将所有导致RebA产生的通路基因设计整合至一个位点。使用合适的引物和源于CEN.PK酵母菌株的基因组DNA以扩增整合位点的5’和3’整合侧翼。在DNA2.0,不同的基因被整理为盒(包含同源序列、启动子、基因、终止子、同源序列)(概述请参见表5)。溶解来源于DNA2.0的DNA至100ng/μl。将该原液进一步稀释至5ng/μl,然后取1μl用于50μl-PCR混合物中。反应包含25pmol每种引物。扩增后,使用NucleoSpin 96PCR Clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)纯化DNA或者利用乙醇沉淀以浓缩DNA。
表6.用于RebA产生通路的序列
将所有RebA通路、标记和侧翼(概述请参见表7)转化至S.cerevisiae酵母菌株STV004。在20℃下于YEPhD中过夜恢复后,将转化混合物涂布至含有200μg/ml G418的YEPhD琼脂上。在25℃下培养3天并在室温下培养一夜。
表7.用于CPS、KS、KO、KanMX、KAH、CPR、UGT1、UGT3和UGT4的转化的DNA片段
片段 |
5’INT1 |
CPS盒 |
KS盒 |
KO盒 |
KanMX盒 |
KAH盒 |
CPR盒 |
UGT1盒 |
UGT3盒 |
UGT4盒 |
3’INT1 |
利用诊断PCR和序列分析(3500基因分析仪,Applied Biosystems)证实正确的整合。使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒(Life Technologies)完成测序反应。每个反应(10μl)包含50ng模板和3.2pmol引物。通过用乙醇/EDTA沉淀来纯化产物,然后将其溶解在10μl HiDi甲酰胺中并应用于仪器。该菌株被命名为STV016。图5阐释了将GGPP到RebA的通路整合至基因组的示意图。
实施例5:构建菌株STV027
为了从菌株STV016的染色体中除去KanMX标记,用表达Cre重组酶(Güldender,2002)的质粒pSH65转化该菌株。随后,通过在非选择性培养基(2%葡萄糖的YEP)上生长来去除(cured)菌株中的质粒pSH65。所产生的不含KanMX且不含pSH65的菌株(通过涂布在含200μg G418/ml或20μg腐草霉素/ml的平板上来确定,此时不应发生生长)被命名为STV027。利用诊断PCR进一步证实KanMX标记不存在。
实施例6:发酵菌株STV027
如上所述构建的酵母菌株STV027在30℃和280rpm下在摇瓶中(500ml,含50ml培养基)培养2天。如表8所述,培养基根据Verduyn等人(Verduyn C,Postma E,Scheffers WA,Van Dijken JP.Yeast,1992Jul;8(7):501-517),在碳源和氮源上有修改。
表8.预培养基组成
原材料 | 式 | 浓度(g/kg) |
半乳糖 | C6H12O6 | 20.0 |
尿素 | (NH2)2CO | 2.3 |
磷酸二氢钾 | KH2PO4 | 3.0 |
硫酸镁 | MgSO4.7H2O | 0.5 |
微量元素溶液 | 1 | |
维生素溶液 | 1 |
a微量元素溶液
b维生素溶液
组分 | 式 | 浓度(g/kg) |
生物素(D-) | C10H16N2O3S | 0.05 |
泛酸钙D(+) | C18H32CaN2O10 | 1.00 |
烟酸 | C6H5NO2 | 1.00 |
肌醇 | C6H12O6 | 25.00 |
盐酸氯化硫胺 | C12H18Cl2N4OS.xH2O | 1.00 |
盐酸吡哆醇 | C8H12ClNO3 | 1.00 |
对氨基苯甲酸 | C7H7NO2 | 0.20 |
随后,将6ml摇瓶内容物转移到发酵罐中(起始体积0.3L),发酵罐装有如表9中展示的培养基。
表9.发酵培养基组成
原材料 | 最终浓度(g/kg) | |
硫酸铵 | (NH4)2SO4 | 1 |
磷酸二氢钾 | KH2PO4 | 10 |
硫酸镁 | MgSO4.7H2O | 5 |
微量元素溶液 | - | 8 |
维生素溶液 | - | 8 |
通过添加氨(12.5重量%)将pH控制在5.0。温度控制在27℃下。通过调节搅拌器速度将pO2控制在40%。保持葡萄糖浓度受进入发酵罐的受控进料所限制。
表10.发酵进料培养基的组成
实施例7:色谱
热激(在90℃下1小时)S.cerevisiae菌株STV027的发酵液并喷雾干燥。利用乙醇提取Reb A(第一次提取:1kg粉末利用8L 90%EtOH,65℃,接触时间为3小时;过滤之后,在65℃下利用8L 90%EtOH再次提取滤饼,接触时间为2小时,合并第一次和第二次提取物)。使这种提取物经受两步色谱法以除去其它组分。表11中展示了运行参数。
表11:色谱参数
用对应于20%EtOH溶液中500mg Reb A的提取物的量装载柱,为本身的pH。用20柱体积(CV)的20%EtOH清洗柱以洗掉未结合的组分。随后,施用18.2CV的乙醇梯度为20%-100%的缓冲液B以洗脱Reb A。图6中显示了洗脱图。表12展示了色谱运行的不同级分中的相对量(以%表示):清洗、洗脱和级分1-6。各化合物的初始浓度被视为100%。
表12.步骤产率实验(Step yields experiment)
第一次纯化之后,合并洗脱级分并将它们稀释至20%乙醇浓度。然后使用0.1MNaOH将该溶液的pH调节为8.5。该溶液被用作进料。图7中显示了洗脱图。表13展示了色谱运行的不同级分中的相对量(以%表示):清洗、洗脱和级分1-6。各化合物的初始浓度被视为100%。
表13.步骤产率实验
表14显示了总干物质中RebA的纯度(以%计)。起始材料包含2.3%且最终的色谱级分以约30%结束。也就是说,rebA被纯化了15倍。
表14:RebA的纯化
级分 | 基于总干重的Reb A% |
进料:稀释5倍的提取物13101 | 2.30% |
在本身pH下色谱之后的级分5+6 | 20.30% |
表1:序列表说明
灰色的id是截短的,因此它们是所提及的UniProt id的片段。
Claims (26)
1.一种用于从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或更多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供包含一种或更多种甜菊糖苷和一种或更多种非甜菊糖苷组分的发酵液;
(b)将所述发酵液的液相与所述发酵液的固相分离;
(c)提供吸附树脂;
(d)使所述发酵液的液相与所述吸附树脂接触,以将所述一种或更多种甜菊糖苷的至少一部分与所述非甜菊糖苷组分分离,
从而从含一种或更多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或更多种甜菊糖苷。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述吸附树脂被提供在填充柱中。
3.一种用于从含甜菊糖苷的发酵液回收一种或更多种甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
(a)提供含甜菊糖苷的发酵液;
(b)提供吸附树脂;
(c)使所述发酵液与所述吸附树脂接触,以将所述一种或更多种甜菊糖苷的至少一部分与非甜菊糖苷组分分离,
从而从含一种或更多种甜菊糖苷的发酵液回收一种或更多种甜菊糖苷。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述吸附树脂以膨胀床模式被提供在填充柱中。
5.根据权利要求2或4所述的方法,其中所述吸附树脂是聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂、聚甲基丙烯酸酯树脂、多环芳族树脂、官能化的聚甲基丙烯酸酯-二乙烯基苯树脂、官能化的聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂或氨(NH2)结合的甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯共聚物树脂。
6.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中分离的方法包括吸附/脱附色谱。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述吸附/脱附色谱包括以下步骤:
(a)提供根据权利要求1(b)的液相或根据权利要求2(a)的发酵液和溶剂;
(b)提供吸附树脂;
(c)提供洗脱溶剂;
(d)使所述吸附树脂与所述液相或发酵液和洗脱溶剂接触,以使得至少部分非甜菊糖苷组分吸附到所述吸附剂上,使得糖苷溶液的甜菊糖苷富集并导致形成伴随所述洗脱溶剂从所述吸附剂洗脱的经纯化的甜菊糖苷组合物;和
(e)任选地,使所述非甜菊糖苷组分从所述吸附剂脱附。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述吸附树脂被提供在所述填充柱中。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述洗脱溶剂包含约20重量%或更少的醇例如乙醇;以及约80重量%或更多的水。
10.根据权利要求7或8所述的方法,其中所述洗脱溶剂包含约50重量%或更少的醇例如乙醇;以及约50重量%或更多的水。
11.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中分离的方法包括分级色谱。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述分级色谱包括以下步骤:
(a)提供根据权利要求1(b)的液相或根据权利要求2(a)的发酵液和溶剂;
(b)提供吸附剂;和
(c)使所述吸附剂与所述液相或发酵液接触,以使得至少部分非甜菊糖苷组分吸附到所述吸附剂上并使得至少部分甜菊糖苷吸附到所述吸附剂上,其中所述甜菊糖苷以比所述非甜菊糖苷更快的速率通过所述吸附剂传送;和
(d)从所述吸附剂收集含甜菊糖苷的溶液。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述吸附剂被提供在填充柱中。
14.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述溶剂包含约20重量%或更多的醇例如乙醇;以及约80重量%或更少的水。
15.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述溶剂包含约25重量%-约35重量%的醇例如乙醇;以及约65重量%-约75重量%的水。
16.根据权利要求12或13所述的方法,其中所述溶剂包含水,且其中所述吸附剂是强酸性阳离子交换树脂。
17.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中所述吸附剂的表面积为约900m2/克或者更大。
18.根据权利要求5-17中的任一项所述的方法,其中所述吸附剂被叔胺或季胺官能化。
19.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中回收的含甜菊糖苷的溶液的纯度比权利要求1(b)的液相或权利要求2(a)的发酵液的纯度高至少约10%。
20.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中经纯化的含甜菊糖苷的溶液包含基于干燥固体至少约95重量%的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
21.根据在前的权利要求中的任一项所述的方法,其中所述含甜菊糖苷的溶液被喷雾干燥以提供粉末。
22.通过根据权利要求1-21中的任一项所述的方法能够得到的包含一种或更多种甜菊糖苷的溶液。
23.根据权利要求22所述的溶液,其包含甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷或莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙B、莱鲍迪甙C、莱鲍迪甙D、莱鲍迪甙E、莱鲍迪甙F、甜茶苷、杜克甙A或莱鲍迪甙M中的一种或更多种。
24.根据权利要求22或23所述的溶液,其包含基于干燥固体至少约95重量%的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
25.一种组合物,其包含至少约基于干燥固体至少约95%的发酵产生的莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙D或莱鲍迪甙M。
26.根据权利要求25所述的组合物,其是通过根据权利要求21所述的方法能够得到的粉末。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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