BR112016002092B1 - Recuperação de glicosídeos de esteviol - Google Patents

Abstract

recuperação de glicosídeos de esteviol a presente invenção refere-se a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, cujo método compreende (a) a provisão de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol e um ou mais componentes de glicosídeo não esteviol; (b) a separação da fase líquida do caldo a partir da fase sólida do caldo; (c) a provisão de uma resina adsorvente; (d) o contato da fase líquida do caldo com a resina adsorvente a fim de separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol a partir dos componentes de glicosídeo não esteviol, de forma a recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação contendo um ou mais glicosídeos de esteviol. a invenção também se refere a uma composição purificada de glicosídeo de esteviol preparada usando tal processo.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol. A invenção também se refere a uma composição obtenível por tal método.

Antecedentes da Invenção

[002] A demanda mundial por adoçantes de alta potência está aumentando e, com a mistura de diferentes adoçantes artificiais, se tornando uma prática comum. No entanto, esapera-se que a demanda por alternativas aumente. As folhas da erva perene, Stevia rebaudiana Bert., acumulam quantidades de compostos intensamente doces conhecidos como glicosídeos de esteviol. Enquanto a função biológica destes compostos está clara, eles têm dignificãncia comercial como adoçantes de alta potência alternativos, com a vantagem adicionada que os adoçantes Stevia são produtos vegetais naturais.

[003] Estes glicosídeos de esteviol doces têm propriedades funcionais e sensoriais qua parecem superiores àquelas dos muitos adoçantes de alta potência. Em adição, os estudos sugerem que o esteviosídeo pode reduzir os níveis de glicose no sangue nos diabéticos do Tipo II e pode reduzir pressão sanguínea em pacientes levemente hipertensos.

[004] Os glicosídeos de esteviol se acumulam nas folhas de Stevia onde eles podem compreender de 10 a 20% do peso seco da folha. O esteviosídeo e rebaudiosídeo A são ambos estáveis em calor e pH e adequados para o uso em bebidas carbonadas e muitos outros alimentos. O esteviosídeo está entre 110 e 270 vezes mais doce do que a sacarose, o rebaudiosídeo A entre 150 e 320 vezes mais doce do que a sacarose. Em adição, o rebaudiosídeo D também é um adoçante de glicosídeo de diterpeno de alta potência que se acumula em folhas de Stevia. Ele pode ser cerca de 200 vezes mais doce do que a sacarose

[005] Atualmente, os glicosídeos de esteviol são extraídos da planta Stevia. Em Stevia, ácido (-)- caurenoico, um intermediário na biossíntese de ácido giberélico (GA), é convertido no esteviol de diterpeno tetracíclico, que então prossegue através de um caminho de glicosilação de múltiplas etapas para formar os vários glicosídeos de esteviol. No entanto, os rendimentos podem ser variáveis e afetados pela agricultura e condições ambientais. Da mesma forma, o cultivo de Stevia requer área terrestre substancial, muito tempo antes da colheita, trabalho intensivo e custos adicionais para a extração e purificação dos glicosídeos.

[006] Exige-se que fontes de glicosídeos novas, mais padronizadas, de composição única pura, sem sabor residual satisfaçam a demanda comercial crescente por adoçantes naturais de alta potência.

Sumário da Invenção

[007] Os glicosídeos de esteviol podem ser produzidos de modo fermentativo em micro-organismos recombinantes como estabelecido no pedido de patente internacional copendente no. WO2013/110673 (PCT/EP2013/051262).

[008] A invenção atual se refere à simplificação e melhoria do processo de separação glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais tais compostos.

[009] A invenção provê, assim, um processo no qual os glicosídeos de esteviol produzidos de modo fermentativo pode ser separado dos outros componentes do caldo de fermentação. Ou seja, a invenção se refere a um método para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais tais compostos. A invenção também se refere a composições preparadas usando tal processo.

[0010] A invenção se refere geralmente à recuperação de glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação usando um processo cromatográfico. Consequentemente, a invenção se refere a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: (a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol e um ou mais componentes de glicosídeo não esteviol; (b) separação da fase líquida do caldo a partir da fase sólida do caldo; (c) provisão de uma resina adsorvente, por exemplo em uma coluna de enchimento; (d) contato da fase líquida do caldo com a resina adsorvente a fim de separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol dos componentes de glicosídeo não esteviol,

[0011] de forma a recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação contendo um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0012] A invenção também se refere a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: (a) provisão de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol; (b) provisão de uma resina adsorvente, por exemplo, em uma coluna de enchimento em um modo de leito expandido; (c) contato da fase líquida do caldo com a resina adsorvente a fim de separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol dos componentes de glicosídeo não esteviol,

[0013] de forma a recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação contendo um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0014] A invenção também se refere a:

[0015] uma solução compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol obteníveis por um processo de acordo com a invenção e;

[0016] uma composição que compreende, em uma base de sólidos secos, pelo menos cerca de 95% de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M produzidos de modo fermentativo.

Breve Descrição dos Desenhos

[0017] A Figura 1 estabelece uma representação esquemática do plasmídeo pUG7-EcoRV.

[0018] A Figura 2 estabelece uma representação esquemática do método pelo qual os cassetes de superexpressão de ERG20, tHMG1 e BTS1 são projetados (A) e integrados (B) no genoma da levedura. (C) mostra a situação final após a remoção do marcador KANMX pela Cre recombinase.

[0019] A Figura 3 estabelece uma representação esquemática do construto de redução de expressão ERG9. Este consistia em uma parte de ERG9 de 500 bp com 3' de largura, 98 bp do promotor de TRP1, o quadro de leitura aberto e terminador TRP1, seguido por uma sequência a jusante de 400 bp de largura de ERG9. Devido à introdução de um sítio de Xbal na extremidade do quadro de leitura aberto de ERG9, as últimas mudanças de aminoácido em Ser e o códon de terminação em Arg. Um novo códon de terminação é localizado no promoter de TPR1, resultando em uma extensão de 18 aminoácidos.

[0020] A Figura 4 estabelece uma representação esquemática de como UGT2 é integrado no genoma. A. diferentes fragmentos usados na transformação; B. situação após a integração; C. situação após a expressão de Cre recombinase.

[0021] A Figura 5 estabelece uma representação esquemática de como o caminho de GGPP para RebA é integrado no genoma. A. diferentes fragmentos usados na transformação; B. situação após a integração.

[0022] A Figura 6 estabelece o padrão de eluição do extrato (1a execução).

[0023] A Figura 7 estabelece o padrão de eluição do extrato (2a execução).

[0024] A Figura 8 estabelece um diagrama esquemático dos caminhos pontenciais que levam à biossíntese de glicosídeos de esteviol.

Descrição da Listagem de Sequência

[0025] Uma descrição das sequências é estabelecida na Tabela 1. As sequências descritas neste documento podem ser definidas com referência à listagem de sequência ou com referência aos números de acesso do banco de dados também estabelecido na Tabela 1.

Descrição Detalhada da Invenção

[0026] Ao longo da presente descrição e das reivindicações em anexo, as palavras "compreendem", "incluem" e "tendo" e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser interpretadas inclusivamente. Isto é, estas palavras são destinadcomo um transmitir a possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não especificamente recitados, onde o contexto permite.

[0027] Os artigos "um" e "uma" são usados aqui para se referirem a um ou a mais do que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais do que um elemento.

[0028] Neste documento, o termo glicosídeo não esteviol significa uma substância que não é um glicosídeo de esteviol.

[0029] A invenção se refere a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: (a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol e um ou mais componentes de glicosídeo não esteviol; (b) separação de uma fase líquida do caldo a partir de uma fase sólida do caldo; (c) contato da fase líquida do caldo com uma resina adsorvente a fim de separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol dos componentes de glicosídeo não esteviol,

[0030] de forma a recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação contendo um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0031] Tipicamente, a resina adsorvente é provida em uma coluna de enchimento.

[0032] A invenção também se refere a um processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, cujo método compreende: (d) provisão de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol; (e) contato do caldo com uma resina adsorvente a fim de separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol dos componentes de glicosídeo não esteviol,

[0033] de forma a recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação contendo um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0034] Tipicamente, a resina adsorvente é provida em uma coluna de enchimento em um modo de leito expandido.

[0035] O caldo de fermentação é um caldo de fermentação obtido da fermentação de um micro-organismo, tipicamente um micro-organismo recombinante, que é capaz de produzir um ou mais glicosídeos de esteviol. Tais microorganismos e sua fermentação são descritos neste documento. Tipicamente, o micro-organismo recombinante é um que é capaz de produção extracelular de um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0036] Tipicamente, o caldo é tratado antes de ser aplicado a uma coluna de cromatografia.

[0037] Em particular, as células podem ser tompidas e o sólido resultante e as fases líquidas separadas. O rompimento da célula pode ser realizado, por exemplo, por choque mecânico e de calor. Tal rompimento da célula que pode, no entanto, não ser necessário do micro-organismo produziu glicosídeo(s) de esteviol extracelular suficiente. A separação de sólido/líquido pode ser realizada, por exemplo, por centrifugação, filtração por membrana ou microfiltração.

[0038] O líquido pode então ser aplicado convenientemente a uma coluna de cromatografia.

[0039] Uma separação alternativa das fases líquidas e sólidas pode compreender secagem por atomização do caldo (por exemplo, um caldo onde as células foram rompidas) e a seguir extração de glicosídeos de esteviol com um solvente adequado, por exemplo, etanol. Em termos desta invenção, este tipo de processo deve ser entendido como constituindo a "separação de uma fase líquida do caldo a partir de uma fase sólida do caldo". O líquido resultante pode ser a seguir aplicado convenientemente a uma coluna de cromatografia.

[0040] O processo da invenção pode ser realizado alternativamente com o caldo total (isto é, incluindo as células) onde o processo é realizado no formato de leito expandido. A adsorção de leito expandido permite a captura de proteínas de matérias-primas contendo partícula sem remoção prévia de particulados, assim, permitindo a clarificação de uma suspensão de células ou homogenato de células e a concentração do produto desejado em uma operação única. Outro aspecto de uso do modo expandido é a possibilidade de remoção in situ de glicosídeos de esteviol do caldo enquanto as células e nutrientes não ligados são devolvidos ao tanque de fermentação.

[0041] No processo da invenção, a resina adsorvente pode ser qualquer resina adequada, por exemplo, é uma resina de poliestireno-divinilbenzeno, uma resina de polimetacrilato, uma resina poliaromática, uma resina de polimetacrilato-divinilbenzeno funcionalizada, uma resina de poliestireno-divinilbenzeno funcionalizada ou uma resina de copolímero de metacrilato/divinilbenzeno ligada por amino (NH2).

[0042] A resina adsorvente pode ser funcionalizada com aminas terciárias ou aminas quaternárias.

[0043] Em um processo da invenção, o adsorvente pode ter uma área de superfície de cerca de 900 m2/grama ou maior.

[0044] O processo de acordo com a invenção pode ser realizado em um formato de cromatografia de adsorção/dessorção. Neste formato, o método compreende: (f) provisão de uma fase líquida (derivada de um caldo de fermentação) ou um caldo de fermentação e um solvente; (g) provisão de uma resina adsorvente; (h) provisão de um solvente de eluição; (i) contato da resina adsorvente com a fase líquida ou caldo e solvente de eluição de modo que pelo menos uma parte dos componentes de glicosídeo não esteviol adsorva sobre o adsorvente enriquecendo a solução de glicosídeo em glicosídeos de esteviol e resultando na formação de uma composição purificada de glicosídeo de esteviol que é eluído do adsorvente juntamente com o solvente de eluição; e (j) opcionalmente, dessorção dos componentes de glicosídeo não esteviol do adsorvente.

[0045] Tipicamente, a resina adsorvente é provida em uma coluna de enchimento.

[0046] Em tal processo, o solvente de eluição pode compreender cerca de 20% em peso ou menos de um álcool e cerca de 80% em peso ou mais de água.

[0047] Em tal processo, o solvente de eluição pode compreender cerca de 50% em peso ou menos de um álcool e cerca de 50% em peso ou mais de água.

[0048] O processo da invenção pode ser realizado em um formato em que o método de separação compreende uma cromatografia de fracionamento. Tal processo por compreender as etapas de: (k) provisão de uma fase líquida (derivada de um caldo de fermentação) ou um caldo de fermentação e um solvente; (l) provisão de uma coluna cheia de um adsorvente; e (m) contato do adsorvente com a fase líquida ou caldo de modo que pelo menos uma parte dos componentes de glicosídeo não esteviol adsorva sobre o adsorvente e de modo que pelo menos uma parte do glicosídeo de esteviol adsorva sobre o adsorvente, em que os glicosídeos de esteviol se propagam através do adsorvente em uma taxa mais rápida do que os glicosídeos não esteviol e; (n) coleta de uma solução contendo glicosídeo de esteviol do adsorvente.

[0049] Em tal processo, o solvente pode compreender cerca de 20% em peso ou mais de um álcool e cerca de 80% em peso ou menos de água.

[0050] Em tal processo, de acordo com a reivindicação 9, em que o solvente compreende cerca de 25% a cerca de 35% em peso de um álcool e cerca de 65% a cerca de 75% de água.

[0051] Em tal processo, o álcool pode ser metanol, etanol, propanol ou butanol.

[0052] Em tal processo, o solvente pode compreender água e o adsorvente pode ser uma resina de troca catiônica fortemente ácida.

[0053] Em qualquer formato da invenção, mais do que um ciclo cromatográfico pode ser realizado, por exemplo, dois, três, quatro, cinco ou mais ciclos cromatográficos.

[0054] Em um processo da invenção onde dois mais ciclos cromatográficos são usados, a cromatografia em pH como tal pode ser seguida pela cromatografia em cerca de pH 8,5 para reduzir a concentração de Reb B. Reb B é um dos poucos rebaudiosídeos que tinham grupo carbóxi livre. Consequentemente, em pH alto, onde este grupo é carregado, RebB terá afinidade muito menor com um adsorvente hidrofílico (por exemplo, HP-20) e, consequentemente, não se ligará a ele em pH 8,5 enquanto outros rebaudiosídeos não carregados ainda se ligarão da mesma forma.

[0055] O processo da invenção permite um esteviol- glicosídeo purificado compreendendo a solução a ser recuperada. A solução contendo glicosídeo de esteviol recuperada tipicamente tem uma pureza que é pelo menos cerca de 10% maior, pelo menos cerca de 20% maior, pelo menos cerca de cerca de 30% quando comparada a uma pureza da fase líquida ou caldo (da qual o pelo menos um glicosídeo de esteviol é recuperado).

[0056] Neste documento, a expressão "separar pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol dos componentes de glicosídeo não esteviol" deve ser entendida como implicando que pelo menos uma parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol é separada de pelo menos uma parte dos componentes de glicosídeo não esteviol. A expressão não é destinada a implicar que a parte dos um ou mais glicosídeos de esteviol recuperados de acordo com o processo da invenção é necessária e totalmente livre de componentes de glicosídeo não esteviol. É possível que os componentes de glicosídeo não esteviol sejam recuperados também. No entanto, os um ou mais glicosídeos de esteviol recuperados devem ser enriquecidos para os um ou mais glicosídeos de esteviol quando comparados com a matéria- prima, por exemplo, um caldo de fermentação. Ou seja, os um ou mais glicosídeos de esteviol recuperados de acordo com a invenção devem compreender menos glicosídeos não esteviol quando comparados com a matéria-prima.

[0057] Em um processo da invenção, a solução contendo glicosídeo de esteviol purificada compreende, em uma base de sólidos secos, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% em peso de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M.

[0058] A solução pode ser ainda processada em uma forma sólida, por exemplo, um granulado ou pó, por exemplo, por secagem por atomização ou cristalização. Tal composição sólida pode compreender pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% em peso de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M.

[0059] A invenção assim provê uma solução compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol obteníveis por um processo de acordo com a invenção . Tal solução pode compreender um ou mais de esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo, esteviosídeo ou rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rubusosídeo, dulcosídeo A ou rebaudiosídeo M.

[0060] Tal solução pode compreender, em uma base de sólidos secos, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% em peso de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M.

[0061] Consequentemente, a invenção provê uma composição que pode compreender, em uma base de sólidos secos, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% em peso de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M produzidos de modo fermentativo.

[0062] Tal composição pode ser um granulado ou pó obtenível por um processo como estabelecido acima que inclui uma etapa de processamento da solução compreendendo esteviol purificada em uma forma sólida. Tal composição sólida pode compreender pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 99% em peso de ebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M produzido de modo fermentativo.

[0063] Na invenção, o caldo pode ser derivado da fermentação de qualquer micro-organismo capaa de produzir um glicosídeo de esteviol.

[0064] Em particular, um caldo pode ser derivado de um micro-organismo recombinante que é capaz de produzir um glicosídeo de esteviol. Os micro-organismos recombinantes adequados são descritos neste documento abaixo. Tal micro-organismo recombinante pode compreender uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo que codificam:

[0065] um polipeptídeo tendo atividade de ent- copalil pirofosfato sintase;

[0066] um polipeptídeo tendo atividade de ent- caureno sintase;

[0067] um polipeptídeo tendo atividade de ent- caureno oxidase;

[0068] um polipeptídeo tendo atividade de ácido caurenoico 13-hidroxilase; e um ou mais polipeptídeos tendo atividade de UDP-glicosiltransferase (UGT), pelo que a expressão(ões) duma sequência de nucleotídeo confer(em) ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos um glicosídeo de esteviol.

[0069] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo tendo ent-copalil pirofosfato sintase (EC 5.5.1.13) é capaz de catalisar a reação química:

[0070] Esta enzima tem um substrato, geranilgeranil pirofosfato, e one produto, ent-copalil pirofosfato. Esta enzima precipita em biossíntese de giberelina. Esta enzima pertence à família de isomerase, especificamente, a classe de liases intramoleculares. O nome sistemático desta classe de enzima é ent-copalil-difosfato liase (desciclização). Outros nomes em uso comum incluem tendo ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase A e ent-caureno sintetase A.

[0071] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo tendo atividade de ent-caureno sintase (EC 4.2.3.19) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar a reação química: ent-copalil difosfato Ent-caureno + difosfato

[0072] Consequentemente, esta enzima tem um substrato, ent-copalil difosfato e dois produtos, ent- caureno e difosfato.

[0073] Esta enzima pertence à família de liases, especificamente, aquelas carbono-oxigênio liases agindo em fosfatos. O nome sistemático desta classe de enzima é ent- copalil-difosfato difosfato-liase (ciclização, formação de ent-caureno). Outros nomes em uso comum incluem ent-caureno sintase B, ent-caureno sintetase B, ent-copalil-difosfato difosfato-liase e (ciclização). Esta enzima participa da biossíntese de diterpenoide.

[0074] ent-copalil difosfato sintases podem ter também uma atividade de ent-caureno sintase distinta associada com a mesma molécula de proteína. A reação catalisada por ent-caureno sintase é a próxima etapa no caminho biossintético para giberelinas. Os dois tipos de atividade enzimática são distintos e a mutagênese sítio- dirigida para suprimir a atividade de ent-caureno sintase da proteína leva ao acúmulo de ent-copalil pirofosfato.

[0075] Consequentemente, uma sequência de nucleotídeo única pode codificar um polipeptídeo tendo atividade de ent-copalil pirofosfato sintase e atividade de ent-caureno sintase. Alternativamente, as duas atividades podem ser codificadas em duas sequências de nucleotídeo separadas distintas.

[0076] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo tendo atividade de ent-caureno oxidase (EC 1.14.13.78) é um polipeptídeo que é capaz de catalisar três oxidações sucessivas do grupo 4-metila de ent-caureno dar ácido caurenoico. Tal atividade requer tipicamente a presença de um citocroma P450.

[0077] Para os propósitos da invenção, um polipeptídeo tendo atividade de ácido caurenoico 13- hidroxilase (EC 1.14.13) é um que é capaz de catalisar a formação de esteviol (ácido ent-caur-16-en-13-ol-19-oico) usando NADPH e O2. Tal atividade também pode ser referida como atividade de ent-ca 13-hidroxilase.

[0078] Um micro-organismo recombinante que pode ser fermentado para produzir um caldo de fermentação para o uso no processo da invenção compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo tendo atividade de UDP-glicosiltransferase (UGT), pelo que a expressão(ões) duma sequência de nucleotídeo confer(em) ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos um dentre esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo, esteviosídeo ou rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rubusosídeo, dulcosídeo A ou rebaudiosídeo M.

[0079] Para os propósitos desta invenção, um polipeptídeo tendo atividade de UGT é um que tem atividade de glicosiltransferase (EC 2.4), isto é, que pode agir como um catalisador para a transferência de uma unidade de monossacarídeo de um açúcar de nucleotídeo ativado (também conhecido como o "doador de glicosila") para uma molécula aceptora de glicosila, geralmente um álcool. O doador de glicosila para um UGT é tipicamente o açúcar de nucleotídeo uridina difosfato glicose (uracil-difosfato glicose, UDP- glicose).

[0080] Os UGTs usados podem ser selecionados de modo a produzir um diterpeno glicosídeo desejado, tal como um glicosídeo de esteviol. Os diagramas esquemáticos de formação de glicosídeo de esteviol são estabelecidos em Humphrey et al, Plant Molecular Biology (2006) 61 : 47-62 e Mohamed et al, J. Plant Physiology 168 (2011) 1136-1141. Em adição, a Figura 8 estabelece um diagrama esquemático de formação de glicosídeo de esteviol.

[0081] A biossíntese de rebaudiosídeo A envolve a glicosilação do aglicona esteviol. Especificamente, o rebaudiosídeo A pode ser formado pela glicosilação do 13-OH de esteviol que forma o 13-O-esteviolmonosídeo, glicosilação do C-2' da 13-O-glicose de esteviolmonosídeo que forma esteviol-1,2-biosídeo, glicosilação da C-19 carboxila de esteviol-1,2-biosídeo que forma esteviosídeo, e glicosilação do C-3' da C-13-O-glicose de esteviosídeo. A ordem na qual cada reação de glicosilação ocorre pode variar - vide a Figura 8. Um UGT pode ser capaz de catalisar mais do que uma conversão como estabelecido neste esquema.

[0082] A conversão de esteviol em rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo D pode ser realizada em um hospedeiro recombinante pela expressão de gene(s) que codificam os seguintes UGTs funcionais: UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1 e UGT2. Assim, um micro-organismo recombinante que expressa estes quatro UGTs pode fazer o rebaudiosídeo A se ele produzir esteviol ou quando alimentar esteviol no meio. Tipicamente, um ou mais destes genes são genes recombinantes que foram transformados em um micro-organismo que não os possui naturalmente. Os exemplos de todas estas enzimas são estabelecidos na Tabela 1. Um micro-organismo recombinante pode compreender qualquer combinação de um UGT74G1, UGT85C2, UGT76G1 e UGT2. Na Tabela 1, as sequências de UGT64G1 são indicadas como sequências de UGT1, sequências de UGT74G1 são indicadas como sequências de UGT3 e sequências de UGT76G1 são indicadas como sequências de UGT4. As sequências de UGT2 são indicadas como sequências de UGT2 na Tabela 1.

[0083] Um micro-organismo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose em esteviol. Ou seja, um micro-organismo recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviol é convertido em esteviolmonosídeo. Consequentemente, a expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos esteviolmonosídeo.

[0084] Tal micro-organismo pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade mostrada pela UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT85C2, pelo que uma sequência de nucleotídeo mediante a transformação do micro-organismo confere à célula a capacidade de converter esteviol em esteviolmonosídeo.

[0085] A atividade de UGT85C2 é transferir de uma unidade de glicose para o 13-OH de esteviol. Assim, um UGT85C2 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosila: esteviol 13-OH transferase e uma uridina 5'- transferase. Um polipeptídeo de UGT85C2 funcional também pode catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol outros que não esteviol e esteviol-19-O-glicosídeo. Tais sequências são indicadas como sequências de UGT1 na Tabela 1.

[0086] Um micro-organismo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose em esteviol ou esteviolmonosídeo. Ou seja, um micro-organismo recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviolmonosídeo é convertido em esteviolbiosídeo. Consequentemente, tal micro-organismo pode ser capaz de converter esteviolmonosídeo em esteviolbiosídeo. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos esteviolbiosídeo.

[0087] Um micro-organismo recombinante adequado pode também compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT74G1, pelo que uma sequência de nucleotídeo mediante a transformação do microorganismo confere à célula a capacidade de converter esteviolmonosídeo em esteviolbiosídeo.

[0088] Um micro-organismo recombinante adequado pode compreender também uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT2, pelo que uma sequência de nucleotídeo mediante a transformação do micro-organismo confere à célula a capacidade de converter esteviolmonosídeo em esteviolbiosídeo.

[0089] Um polipeptídeo UGT2 adequado funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase (também referida como uma esteviol-13- monoglicosídeo 1,2-glicosilase), transferindo uma porção de glicose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula aceptora, esteviol-13-O-glicosídeo. Tipicamente, um polipeptídeo UGT2 adequado também funciona como uma uridina 5'-difosfo glicosil: rubusosídeo transferase transferindo uma porção de glicose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula aceptora, rubusosídeo.

[0090] Os polipeptídeos funcionais UGT2 podem também catalisar as reações que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que não o esteviol-13-O-glicosídeo e rubusosídeo, por exemplo, polipeptídeos funcionais UGT2 podem utilizar esteviosídeo como um substrato, transferindo uma porção de glicose para o C-2' do resíduo 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo E. Um polipeptídeo funcional UGT2 também pode utilizar Rebaudiosídeo A como um substrato, transferindo uma porção de glicose para o C-2' do resíduo de 19-O-glicose para produzir Rebaudiosídeo D. No entanto, um polipeptídeo funcional UGT2 tipicamente não transfere uma porção de glicose para os compostos de esteviol tendo uma 1,3-glicose ligada na posição C-13, isto é, a transferência de uma porção de glicose para esteviol 1,3-biosídeo e 1,3-esteviosídeo não ocorre.

[0091] Os polipeptídeos funcionais UGT2 também podem transferir porções de açúcar de doadores outros que não a uridina difosfato glicose. Por exemplo, um polipeptídeo funcional UGT2 pode agir como uma uridina 5'- difosfo D-xilosil: esteviol-13-O-glicosídeo transferase, transferindo uma porção de xilose para o C-2' da 13-O- glicose da molécula aceptora, esteviol-13-O-glicosídeo. Como outro exemplo, um polipeptídeo funcional UGT2 pode agir como uma uridina 5'-difosfo L-ramnosil: esteviol-13-O- glicosídeo transferase, transferindo uma porção de ramnose para o C-2' da 13-O-glicose da molécula aceptora, esteviol- 13-O-glicosídeo. Tais sequências são indicadas como sequências de UGT2 na Tabela 1.

[0092] Um micro-organismo recombinante que pode ser fermentado para produzir um caldo de fermentação para o uso em um processo da invenção que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de umuma C-19-glicose ao esteviolbiosídeo. Ou seja, um microorganismo recombinante adequado pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviolbiosídeo é convertido em esteviosídeo. Consequentemente, tal microorganismo pode ser capaz de converter o esteviolbiosídeo em esteviosídeo. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos o esteviosídeo.

[0093] Um micro-organismo recombinante adequado pode compreender também uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT74G1, pelo que uma sequência de nucleotídeo mediante a transformação do micro- organismo confere à célula a capacidade de converter esteviolbiosídeo em esteviosídeo.

[0094] Os polipeptídeos de UGT74G1 adequados podem ser capazes de transferir uma unidade de glicose para a 13- OH ou a 19-COOH, respectivamente, de esteviol. Um polipeptídeo de UGT74G1 adequado pode funcionar como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 19-COOH transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-13-O-glicosídeo 19-COOH transferase. Os polipeptídeos de UGT74G1 funcionais também podem catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol outros que não esteviol e esteviol-13-O-glicosídeo ou que transferem porções de açúcar de doadores outros que não uridina difosfato glicose. Tais sequências são indicadas como sequências de UGT1 na Tabela 3.

[0095] Um micro-organismo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a glicosilação do C-3' da glicose na posição C-13 de esteviosídeo. Ou seja, um micro-organismo recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual esteviosídeo em rebaudiosídeo A. Consequentemente, tal micro-organismo pode ser capaz de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao microorganismo a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo A.

[0096] Um micro-organismo recombinante adequado pode compreender também uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a atividade apresentada por UDP-glicosiltransferase (UGT) UGT76G1, pelo que uma sequência de nucleotídeo mediante a transformação do microorganismo confere à célula a capacidade de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo A.

[0097] Um UGT76G1 adequado adiciona uma porção de glicose ao C-3' da C-13-O-glicose da molécula aceptora, um esteviol 1,2 glicosídeo. Assim, UGT76G1 funciona, por exemplo, como uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol 130-1,2 glicosídeo C-3' glicosil transferase e uma uridina 5'-difosfo glicosil: esteviol-19-0-glicose, 13-0-1,2 biosídeo C-3' glicosil transferase. Os polipeptídeos de UGT76G1 funcionais também podem catalisar reações de glicosil transferase que utilizam substratos de glicosídeo de esteviol que contêm açúcares outros que não glicose, por exemplo, esteviol ramnosídeos e esteviol xilosídeos. Tais sequências são indicadas como sequências de UGT4 na Tabela 1.

[0098] Um micro-organismo recombinante pode compreender sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos tendo uma ou mais das quatro atividades de UGT descritas acima. Preferivelmente, um micro-organismo recombinante pode compreender sequências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos tendo todas as quatro das atividades de UGT descritas acima. Um ácido nucleico dado pode codificar um polipeptídeo tendo uma ou mais das atividades acima. Por exemplo, um ácido nucleico codifica um polipeptídeo que tem duas, três ou quatro das atividades estabelecidas acima. Preferivelmente, um micro-organismo recombinante compreende a atividade de UGT1, UGT2 e UGT3. Mais preferivelmente, tal micro-organismo recombinante também compreenderá a atividade de UGT4.

[0099] Um micro-organismo recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a glicosilação de esteviosídeo ou rebaudiosídeo A. Ou seja, um micro-organismo recombinante pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual o esteviosídeo ou rebaudiosídeo A é convertido em rebaudiosídeo D. Consequentemente, tal micro-organismo pode ser capaz de converter esteviosídeo ou rebaudiosídeo A em rebaudiosídeo D. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo D. Mostrou-se que um micro-organismo que expressa uma combinação de polipeptídeos de UGT85C2, UGT2, UGT74G1 e UGT76G1 pode ser capaz de produzir rebaudiosídeo D.

[00100] Um micro-organismo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a glicosilação de esteviosídeo. Ou seja, um micro-organismo pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na esteviosídeo é convertido em rebaudiosídeo E. Consequentemente, tal micro-organismo pode ser capaz de converter esteviosídeo em rebaudiosídeo E. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao microorganismo a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo E.

[00101] Um micro-organismo que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de UGT pode compreender uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a glicosilação de rebaudiosídeo E. Ou seja, um microorganismo pode compreender um UGT que é capaz de catalisar uma reação na qual rebaudiosídeo E é convertido em rebaudiosídeo D. Consequentemente, tal micro-organismo pode ser capaz de converter esteviosídeo ou rebaudiosídeo A em rebaudiosídeo D. A expressão de tal sequência de nucleotídeo pode conferir ao micro-organismo a capacidade de produzir pelo menos rebaudiosídeo D.

[00102] Um micro-organismo recombinante pode ser capaz de expressar uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocroma p450 redutase. Ou seja, um micro-organismo recombinante pode compreender uma sequência que codifica um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocroma p450 redutase.

[00103] Um polipeptídeo tendo atividade de NADPH- citocroma p450 redutase (EC 1.6.2.4; também conhecido como NADPH:ferri-hemoproteína oxidorredutase, NADPH:hemoproteína oxidorredutase, NADPH:P450 oxidorredutase, P450 redutase, POR, CPR, CYPOR) é tipicamente um que é uma enzima ligada por membrana permitindo a transferência de elétrons para citocroma P450 no microssoma da célula eucariótica de uma enzima NADPH:citocroma P450 redutase (POR; EC 1.6.2.4) contendo FAD e FMN.

[00104] Preferivelmente, um micro-organismo recombinante, capaz de ser fermentado para preparar um caldo de fermentação adequado para o uso no processo da invenção, é capaz de expressar um ou mais de: a. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocroma P450 redutase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de NADPH-citocroma p450 redutase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 54, 56, 58 ou 78; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 53, 55, 57 ou 77; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético,

[00105] Preferivelmente, um micro-organismo recombinante é um que é capaz de expressar um ou mais de: a. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-copalil pirofosfato sintase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-copalil pirofosfato sintase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 18, 20, 60 ou 62; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 17, 19, 59 ou 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético, b. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-sintase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-Caureno sintase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 64 ou 66; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético, c. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-caureno oxidase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ent-Caureno oxidase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 22, 24, 26, 68 ou 86; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético; ou d. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ácido caurenoico 13- hidroxilase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de ácido caurenoico 13- hidroxilase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 28, 30, 32, 34, 70, 90, 92, 94, 96 ou 98; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 27, 29, 31 , 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00106] Em um micro-organismo recombinante que é capaz de expressar uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13-glicose em esteviol, o dito nucleotídeo pode compreender: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13- glicose em esteviol, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 36, 38 ou 72; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 35, 37, 71 , 147, 168, 169 ou 189; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00107] Em um micro-organismo recombinante que é capaz de expressar uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma glicose na posição C-13 de esteviolmonosídeo (este tipicamente indica a glicosilação do C-2' da C-13- glicose/13-0-glicose de esteviolmonosídeo), a dituma sequência de nucleotídeo pode compreender: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma C-13- glicose em esteviol ou esteviolmonosídeo, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110 ou 112; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 ou 192; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00108] Em um micro-organismo recombinante que é capaz de expressar uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma glicose na posição C-19 de esteviolbiosídeo, a dituma sequência de nucleotídeo pode compreender: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar a adição de uma glicose na posição C-19 de esteviolbiosídeo, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 40, 42, 44, 46, 48 ou 74; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 73, 148, 170, 171, 172, 173, 174 ou 190; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00109] Em um micro-organismo recombinante que expressa uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar glicosilação do C-3' da glicose na posição C-13 de esteviosídeo, a dituma sequência de nucleotídeo pode compreender: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar glicosilação do C-3' da glicose na posição C-13 de esteviosídeo, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 50, 52 ou 76; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos 20, 25, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 49, 51, 75, 149, 175, 176 ou 191; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00110] Em um micro-organismo recombinante que expressa uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar um ou mais de: a glicosilação de esteviosídeo ou rebaudiosídeo A em rebaudiosídeo D; a glicosilação de esteviosídeo em rebaudiosídeo E; ou a glicosilação de rebaudiosídeo E em rebaudiosídeo D, a dituma sequência de nucleotídeo pode compreender: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo capaz de catalisar um ou mais de: a glicosilação de esteviosídeo ou rebaudiosídeo A em rebaudiosídeo D; a glicosilação de esteviosídeo em rebaudiosídeo E; ou a glicosilação de rebaudiosídeo E em rebaudiosídeo D, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 88, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 ou 192; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00111] Um micro-organismo adequado pode ser um na qual a capacidade do micro-organismo de produzir geranilgeranil pirofosfato (GGPP) é suprarregulado. Suprarregulado no context desta invenção implica que o micro-organismo produz mais GGPP do que uma cepa não transformada equivalente.

[00112] Consequentemente, um micro-organismo recombinante adequado pode compreender uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo que codificam hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase e geranilgeranil difosfato sintase, pelo que uma sequência(s) de nucleotídeo mediante a transformação do micro-organismo confere(m) ao micro-organismo a capacidade de produzir níveis elevados de GGPP.

[00113] Preferivelmente, um micro-organismo recombinante adequado é um que é capaz de expressar um ou mais de: a. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de hidroximetilglutaril-CoA redutase, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de hidroximetilglutaril- CoA redutase, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 80; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 79; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético, b. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo farnesil-pirofosfato sintetase atividade, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo farnesil-pirofosfato sintetase atividade, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 82; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 81 ; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (iii) devido à degeneração do código genético; ou c. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo geranilgeranil difosfato sintase atividade, em que a dituma sequência de nucleotídeo compreende: i. uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo geranilgeranil difosfato sintase atividade, o dito polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido que tem pelo menos cerca de 20% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84; ii. uma sequência de nucleotídeo que tem pelo menos cerca de 15% de identidade de sequência com uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 83; iii. uma sequência de nucleotídeo cujo filamento complementar hibridiza uma molécula de ácido nucleico de sequência de (i) ou (ii); ou iv. uma sequência de nucleotídeo que difere duma sequência de uma molécula de ácido nucleico de (i), (ii) ou (iii) devido à degeneração do código genético.

[00114] Um micro-organismo ou micróbio, para os propósitos desta invenção, é tipicamente um organismo que não é visível ao olho humano (isto é, microscópico). Um micro-organismo pode ser de bactérias, fungos, arquebactérias ou protistas. Tipicamente, um microorganismo será um organismo unicelular ou de célula única.

[00115] Como usado neste documento, um microorganismo recombinante é definido como um micro-organismo que é geneticamente modificado ou transformado/transfectado com uma ou mais das sequências de nucleotídeo como definido neste documento. A presença das uma ou mais tais sequências de nucleotídeo altera a capacidade do micro-organismo de produzir um diterpeno ou diterpeno glicosídeo, em particular esteviol ou glicosídeo de esteviol. Um microorganismo que não é transformado/transfectado ou geneticamente modificado, não é um micro-organismo recombinante e tipicamente não compreende uma ou mais das sequências de nucleotídeo que permitem que a célula produza um diterpeno ou diterpeno glicosídeo. Consequentemente, um micro-organismo não transformado/não transfectado é tipicamente um micro-organismo que não produz naturalmente um diterpeno, embora um micro-organismo que produz naturalmente um diterpeno ou diterpeno glicosídeo e que foi modificado, como descrito neste documento, por exemplo, (e que assim tem uma capacidade alterada de produzir um diterpeno/diterpeno glicosídeo), é considerado um microorganismo recombinante.

[00116] A identidade de sequência é neste documento definida como uma relação entre dois ou mais sequências de aminoácido (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácido nucleico (polinucleotídeo), como determinado pela comparação das sequências. Geralmente, as identidades de sequência ou semelhanças são comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências comparadas. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação duma sequência entre sequências de aminoácido ou ácido nucleico, como o caso pode ser, como determinado pela correspondência entre cadeias de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser prontamente calculadas por vários métodos, conhecidos por aqueles versados na técnica. Os métodos preferidos para determiner a identidade são projetados para dar a maior correspondência entre as sequências testadas. Tipicamente a seguir, as identidades e semelhanças são calculadas ao longo de todo comprimento das sequências sendo comparadas. Os métodos para determiner a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o BestFit, BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), publicamente disponíveis de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Os parâmetros preferidos para a comparação de sequências de aminoácido usando BLASTP são abertura da lacuna 10.0, extensão da lacuna 0,5, matriz Blosum 62. Os parâmetros preferidos para a comparação das sequências de ácido nucleico usando BLASTP são abertura da lacuna 10.0, extensão da lacuna 0,5, matriz completa de DNA (matriz de identidade de DNA).

[00117] As sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas expressas nas células descritas neste documento também podem ser definidas por sua capacidade de hibridizar as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO.'s 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 ou 84 ou qualquer outruma sequência mencionada neste documento, respectivamente, sob condições de hibridização moderadas ou preferivelmente severas. Condições de hibridização severas são neste documento definidas como condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, para hibridizar em uma temperatura de cerca de 65°C em uma solução compreendendo cerca de sal a 0,1 M, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma resistência iônica comparável e lavagem a 65°C em uma solução compreendendo cerca de sal a 0,1 M ou menos, preferivelmente 0,2 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições permitirão geralmente a hibridização de sequências específica tendo cerca de 90% ou mais identidade de sequência.

[00118] Condições moderadas são neste documento definidas como condições que permitem que uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos hibridize em uma temperatura de cerca de 45°C em uma solução compreendendo cerca de sal a 1 M, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma resistência iônica comparável, e a lavagem à temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de sal a 1 M, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução tendo uma resistência iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é realizada durante a noite, isto é, pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é realizada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Estas condições geralmente permitirão a hibridização específica de sequências tendo até 50% de identidade de sequência. A pessoa versada na técnica será capaz de modificar estas condições de hibridização a fim de identificar especificamente as sequências que variam em identidade entre 50% e 90%.

[00119] As sequências de nucleotídeo que codificam uma ent-copalil pirofosfato sintase; ent-caureno sintase; ent-caureno oxidase; ácido caurenoico 13-hidroxilase; UGT; hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase; geranilgeranil difosfato sintase; NADPH- citocroma p450 redutase, podem ser de origem procariótica ou eucariótica.

[00120] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ent-copalil pirofosfato sintase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 151, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184.

[00121] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ent-caureno sintase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184.

[00122] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ent-caureno oxidase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 21, 23, 25, 67, 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186. Um KO prederido é o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico estabelecido em SEQ ID NO: 85.

[00123] Uma sequência de nucleotídeo que codifica um ácido caurenoico 13-hidroxilase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185. Uma sequência de KAH preferida é o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico estabelecido em SEQ ID NO: 33.

[00124] Um micro-organismo recombinante adequado pode expressar uma combinação dos polipeptídeos codificados pelas SEQ ID NO: 85 e SEQ ID NO: 33 ou uma variante das mesmas como descrito neste documento. Um micro-organismo recombinante preferido pode expressar a combinação de sequências estabelecidas na Tabela 8 (em combinação com qualquer UGT2, mas em particular aquela codificada por SEQ ID NO: 87).

[00125] Uma sequência de nucleotídeo que codifica um UGT pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 35, 37 , 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73, 75 , 16 8, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 147, 148, 149, 87, 181, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 189, 190, 191 ou 192.

[00126] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma hidroximetilglutaril-CoA redutase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 79.

[00127] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma farnesil-pirofosfato sintetase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 81.

[00128] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma geranilgeranil difosfato sintase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO:83.

[00129] Uma sequência de nucleotídeo que codifica uma NADPH-citocroma p450 redutase pode, por exemplo, compreender uma sequência como estabelecida em SEQ ID. NO: 53, 55, 57 ou 77.

[00130] No caso das sequências de UGT, combinações de pelo menos um de cada de: (i) SEQ ID NOs: 35, 37, 168, 169, 71, 147 ou 189; (ii) SEQ ID NOs: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 ou 192; (iii) SEQ ID NOs: 39, 41, 43, 45, 47, 170, 171, 172, 173, 174, 73, 148 ou 190; e (iv) SEQ ID NOs: 49, 51, 175, 176, 75, 149 ou 191 podem ser preferidos. Tipicamente, pelo menos um UGT do grupo (i) pode ser usado. Se pelo menos um UGT do grupo (iii) é usado, geralmente pelo menos um UGT do grupo (i) é também usado. Se pelo menos um UGT do grupo (iv) for usado, geralmente pelo menos um UGT do grupo (i) e pelo menos um UGT do grupo (iii) é usado. Tipicamente, pelo menos um UGT do grupo (ii) é usado.

[00131] Uma sequência que tem pelo menos cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, preferivelmente pelo menos cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou cerca de 99% de identidade de sequência com uma sequência como mencionada pode ser usada na invenção.

[00132] Para aumentar a probabilidade de que as enzimas introduzidas sejam expressas na forma ativa em um micro-organismo recombinante, a sequência de nucleotídeo de codificação correspondente pode ser adaptada para otimizar seu uso do códon àquele da célula hospedeira eucariota escolhida. A adaptabilidade das sequências de nucleotídeo que codificam as enzimas ao uso do códon da célula hospedeira escolhida pode ser expressa como índice de adaptação do códon (CAI). O índice de adaptação do códon é neste documento definido como uma medição da adaptabilidade relativa do uso do códon de um gene em direção ao uso do códon de genes altamente expressos. A adaptabilidade relativa (w) de cada códon é a razão do uso de cada codon, àquele do códon mais abundante para o mesmo aminoácido. O índice de CAI é definido como a média geométrica destes valores de adaptabilidade relativa. Os códons não sinônimos e os códons de terminação (dependentes do código genético) são excluídos. Os valores de CAI variam de 0 a 1, com maiores valores indicando uma maior proporção dos códons mais abundantes (vide Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281 - 1295; também vide: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31 (8):2242-51). Uma sequência de nucleotídeo adaptada preferivelmente tem um CAI de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 ou 0,7.

[00133] Em uma modalidade preferida, a recombinante é geneticamente modificada com a (a) sequência(s) de nucleotídeo que é(são) adaptadas ao uso do códon da célula eucariótica usando a tencologia de otimização de par de códons como descrito em PCT/EP2007/05594. A otimização de par de códons é um método para a produção de um polipeptídeo em uma célula hospedeira, em que as sequências de nucleotídeo que codificam o polipeptídeo foram modificadas com relação ao seu uso de códon, em particular os pares de códon que são usados para obter expressão melhorada da sequência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo e/ou produção melhorada do polipeptídeo. Os pares de códon são definidos como um conjunto de dois tripletos subsequentes (códons) em uma sequência de codificação.

[00134] A melhoria adicional da atividade das enzimas in vivo em um micro-organismo recombinante pode ser obtida por métodos bem-conhecidos como PCR sujeita a erros ou evolução dirigida. Um método de evolução dirigida preferido é descrito em WO03010183 e WO03010311.

[00135] Um micro-organismo recombinante adequado pode ser qualquer célula hospedeira adequada de origem microbiana. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma levedura ou um fungo filamentoso. Mais preferivelmente, a célula hospedeira pertence a um dos gêneros Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium, Pichia, Kluyveromyces, Yarrowia, Candida, Hansenula, Humicola, Torulaspora, Trichosporon, Brettanomyces, Pachysolen ou Yamadazyma ou Zygosaccharomyces.

[00136] Um micro-organismo mais preferido pertence às espécies Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Pichia stipidis, Kluyveromyces marxianus, K. lactis, K. thermotolerans, Yarrowia lipolitica, Candida sonorensis, C. glabrata, Hansenula polimorpha, Torulaspora delbrueckii, Brettanomyces bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus ou espécies Saccharomyces cerevisiae. Preferivelmente, a célula eucariótica é um Saccharomyces cerevisiae.

[00137] Uma célula de levedura recombinante pode ser modificada de modo que o gene ERG9 é infrarregulado e/ou os genes ERG5/ERG6 são deletados. Os genes correspondentes podem ser modificados desta maneira em outros microorganismos.

[00138] Tal micro-organismo pode ser transformado, pelo que a sequência(s) de nucleotídeo com a qual o microorganismo é transformado confere(m) à célula a capacidade de produzir um diterpeno ou glicosídeo dos mesmos.

[00139] Um micro-organismo recombinante adequado preferido é uma levedura, tal como uma célula de Saccharomyces cerevisiae ou Yarrowia lipolitica. Um microorganismo recombinante, tal como uma célula recombinante de Saccharomyces cerevisiae ou célula de Yarrowia lipolitica pode compreender uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo de cada um dos seguintes grupos;

[00140] (i) SEQ ID. NO: 1, 3, 5, 7, 17, 19, 59, 61, 141, 142, 152, 153, 154, 159, 160, 182 ou 184.

[00141] (ii) SEQ ID. NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 63, 65, 143, 144, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 183 ou 184.

[00142] (iii) SEQ ID. NO: 21, 23, 25, 67 85, 145, 161, 162, 163, 180 ou 186.

[00143] (iv) SEQ ID. NO: 27, 29, 31, 33, 69, 89, 91, 93, 95, 97, 146, 164, 165, 166, 167 ou 185.

[00144] Tal micro-organismo compreenderá tipicamente também uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo como estabelecida em SEQ ID. NO: 53, 55, 57 ou 77.

[00145] Tal micro-organismo pode compreender também uma ou mais sequências de nucleotídeo como estabelecida em 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 71, 73, 75, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 147, 148, 149, 87, 181, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 189, 190, 191 ou 192. No caso destas sequências, as combinações de pelo menos um de cada de (i) SEQ ID NOs: 35, 37, 168, 169, 71, 147 ou 189; (ii) SEQ ID NOs: 87, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181 ou 192; (iii) SEQ ID NOs: 39, 41 , 43, 45, 47, 170, 171, 172, 173, 174, 73, 148 ou 190; e (iv) SEQ ID NOs: 49, 51, 175, 176, 75, 149 ou 191 podem ser preferidas. Tipicamente, pelo menos um UGT do grupo (i) pode ser usado. Se pelo menos um UGT do grupo (iii) for usado, geralmente pelo menos um UGT do grupo (i) também é usado. Se pelo menos um UGT do grupo (iv) for usado, geralmente pelo menos um UGT do grupo (i) e pelo menos um UGT do grupo (iii) é usado. Tipicamente, pelo menos um UGT do grupo (ii) é usado.

[00146] Tal micro-organismo pode compreender também as seguintes sequências de nucleotídeo: SEQ ID. NO: 79; SEQ ID. NO: 81; e SEQ ID. NO: 83.

[00147] Para cada sequência estabelecida acima (ou qualquer sequência mencionada neste documento), uma variante tendo pelo menos cerca de 15%, preferivelmente pelo menos cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 96, cerca de 97, cerca de 98, ou cerca de 99% de identidade de sequência com a determinada sequência pode ser usada.

[00148] As sequências de nucleotídeo que codificam a ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase, ent- caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase, UGTs, hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase, geranilgeranil difosfato sintase e NADPH- citocroma p450 redutase podem ser ligadas em um ou mais construtos de ácido nucleico para facilitar a transformação do micro-organismo.

[00149] Um construto de ácido nucleico pode ser um plasmídeo que carrega os genes que codificam as enzimas do diterpeno, por exemplo, esteviol/glicosídeo de esteviol, caminho como descrito acima, ou um construto de ácido nucleico pode compreender dois ou três plasmídeos que carregam cada três ou dois genes, respectivamente, codificando as enzimas do caminho de diterpeno distribuídas em qualquer caminho apropriado.

[00150] Qualquer plasmídeo adequado pode ser usado, por exemplo, um plasmídeo com baixo número de cópias ou um plasmídeo com alto número de cópias.

[00151] Pode ser possível que as enzimas selecionadas do grupo que consiste em ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase, ent-caureno oxidase e ácido caurenoico 13-hidroxilase, UGTs, hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase, geranilgeranil difosfato sintase e NADPH- citocroma p450 redutase sejam nativas ao micro-organismo do hospedeiro e que a transformação com uma ou mais das sequências de nucleotídeo que codificam estas enzimas não pode ser solicitada a conferir à célula hospedeira a capacidade de produzir uma diterpeno ou diterpeno glicosidase. A melhoria adicional da produção de diterpeno/diterpeno glicosidase pelo micro-organismo do hospedeiro pode ser obtida pela melhoria da cepa clássica.

[00152] O construto de ácido nucleico pode ser mantido epissomicamente e, assim, compreender uma sequência para a replicação autônoma, tal como uma sequência de replicação autossômica. Se a célula hospedeira for de origem fúngica, um construto de ácido nucleico epissômico adequado pode, por exemplo, ser baseado na levedura 2μ ou plasmídeos de pKD1 (Gleer et al., 1991, Biotechnology 9: 968-975) ou os plasmídeos de AMA (Fierro et al., 1995, Curr Genet. 29:482-489).

[00153] Alternativamente, cada construto de ácido nucleico pode ser integrado em uma ou mais cópias no genoma da célula hospedeira. A integração no genoma da célula hospedeira pode ocorrer aleatoriamente por recombinação não homóloga, mas preferivelmente o construto de ácido nucleico pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação homóloga como é bem-conhecido na técnica (vide, por exemplo, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186).

[00154] Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente no construto de ácido nucleico. Como usado neste documento, o termo "marcador" se refere a um gene que codifica um traço ou um fenótipo que permite a seleção de, ou a triagem para, um micro-organismo contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene com resistência a antibiótico pelo que o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar células transformadas dentre células que não são transformadas. Alternativamente ou da mesma forma, os marcadores sem resistência a antibióticos são usados, tais como marcadores auxotróficos (URA3, TRP1, LEU2). As células hospedeiras transformadas com os construtos de ácido nucleico podem ser livres de marcador de gene. Os métodos para a construção de células hospedeiras microbianas livres de marcador de gene recombinante são descritos em EP-A-0 635 574 e são baseados no uso de marcadores bidirecionais. Alternativamente, um marcador passível de triagem tal como Proteína Verde Fluorescente, lacZ, luciferase, cloranfenicol acetiltransferase, beta-glucuronidase pode ser incorporado nos construtos de ácido nucleico permitindo a triagem das células transformadas. Um método livre de marcador preferido para a introdução de polinucleotídeos heterólogos é descrito em WO0540186.

[00155] Em uma modalidade preferida, as sequências de nucleotídeo que codificam ent-copalil pirofosfato sintase, ent-caureno sintase, ent-caureno oxidase e ácido caurenoico 13-hidroxilase, UGTs, hidroximetilglutaril-CoA redutase, farnesil-pirofosfato sintetase, geranilgeranil difosfato sintase e NADPH-citocroma p450 redutase, são, cada uma, operavelmente ligadas a um promotor que faz com que expressão suficiente das sequências de nucleotídeo correspondentes no micro-organismo recombinante confira à célula a capacidade de produzir um diterpeno ou diterpeno glicosídeo.

[00156] Como usado neste documento, o termo "operavelmente ligado" se refere a uma ligação de elementos de polinucleotídeo (ou sequências de codificação ou sequência de ácido nucleico) em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucleico é "operavelmente ligada" quando ela colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou intensificador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência de codificação.

[00157] Como usado neste documento, o termo "promotor" se refere a um fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizado a montante com relação à direção de transcrição do sítio de iniciação da transcrição do gene e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação da transcrição e quaisquer outras sequências de DNA, incluindo, entre outros sítios de ligação do fator de transcrição, sítios de ligação de proteína repressora e ativadora e quaisquer outras sequências de nucleotídeos conhecidas de alguém versado na técnica para agir direta ou indiretamente para regular a quantidade de transcrição do promotor. Um promotor "constitutivo" é um promotor que é ativo sob condições mais ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" é um promotor que é ativo sob regulação ambiental ou de desenvolvimento.

[00158] O promotor que poderia ser usado para alcançar a expressão das sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima como definida neste documento aacima, pode ser nativo em relação à sequência de nucleotídeo que codifica a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que é heterólogo à sequência de nucleotídeo (sequência de codificação) a qual ele é operavelmente ligado. Preferivelmente, o promotor é homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira.

[00159] Os promotores adequados para o uso em micro-organismos recombinantes podem ser GAL7, GAL10 ou GAL 1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC, GPD1, PGK1, TEF1 e TDH.

[00160] Qualquer terminador, que é functional na célula, pode ser usado. Os terminadores preferidos são obtidos de genes naturais da célula hospedeira. As sequências terminadoras adequadas são bem-conhecidas na técnica. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que impedem decaimento de mRNA mediado por mutação sem sentido na célula hospedeira (vide, por exemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161 :1465-1482).

[00161] As sequências de nucleotídeo usadas podem incluir sequências que as direcionam a compartimentos desejados do micro-organismo. Por exemplo, em um microorganismo recombinante preferido, todas as sequências de nucleotídeo, exceto por ent-caureno oxidase, ácido caurenoico 13-hidroxilase e sequências de codificação de NADPH-citocroma p450 redutase podem ser direcionados ao citosol. Esta abordagem pode ser usada emu ma célula de levedura.

[00162] O termo "homólogo", quando usado para indicar a relação entre um ácido nucleico (recombinante) dado ou molécula de polipeptídeo e um dado organismo hospedeiro ou célula hospedeira, significa que por natureza o ácido nucleico ou a molécula de polipeptídeo é produzida por uma célula hospedeira ou organismos da mesma espécie, preferivelmente da mesma variedade ou cepa.

[00163] O termo "heterólogo" quando usado com relação a um ácido nucleico (DNA ou RNA) ou proteína se refere a um ácido nucleico ou proteína que não ocorre naturalmente como parte do organismo, célula, genoma ou sequência DNA ou RNA na qual ele está presente ou que é encontrado em uma célula ou local ou locais no genoma ou sequência DNA ou RNA que diferem daquele no qual ele é encontrado na natureza. Os ácidos nucleicos ou proteínas heterólogos não são endógenos à célula na qual eles são introduzidos, mas têm sido obtidos de outra célula ou produzidos sintética ou recombinantemente.

[00164] Tipicamente, um micro-organismo recombinante adequado compreenderá sequências de nucleotídeo heterólogas. Alternativamente, um micro-organismo recombinante pode compreender a sequência totalmente homóloga que foi modificada como estabelecido neste documento de modo que o micro-organismo produza quantidades aumentadas de um diterpeno e/ou diterpeno glicosídeo em comparação a uma versão não modificada do mesmo microorganismo.

[00165] Uma ou mais enzimas do caminho do diterpeno como descrito neste documento podem ser superexpressas para alcançar uma produção suficiente de diterpeno pela célula.

[00166] Existem vários meios disponíveis na técnica para a superexpressão de enzimas na célula hospedeira. Em particular, uma enzima pode ser superexpressa aumentando o número de cópias do gene que codifica a enzima na célula hospedeira, por exemplo, pela integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira.

[00167] Um micro-organismo recombinante preferido pode ser um micro-organismo recombinante que é naturalmente capaz de produzir GGPP.

[00168] Um micro-organismo recombinante adequado pode ser capaz de crescer em qualquer fonte de carbono adequada conhecida na técnica e convertê-la a um ou mais glicosídeos de esteviol. O micro-organismo recombinante pode ser capaz de converter diretamente biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose e glicerol. Consequentemente, um organismo hospedeiro preferido expressa enzimas tais como celulases (endocelulases e exocelulases) e hemicelulases (por exemplo, endo- e exo- xilanases, arabinases) necessárias para a conversão de celulose em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, pectinases capazes de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou amilases para converter amido em monômeros de glicose. Preferivelmente, a célula hospedeira é capaz de converter uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em glicose, xilose, arabinose, sacarose, lactose e glicerol. A célula hospedeira pode, por exemplo, ser uma célula hospedeira eucariótica como descrito em WO03/062430, WO06/009434, EP1499708B1, WO2006096130 ou WO04/099381.

[00169] Um micro-organismo recombinante como descrito acima pode ser usado em um processo para a produção de um glicosídeo de esteviol, cujo método compreende a fermentação de um micro-organismo recombinante transformado adequado (como descrito neste documento) em um meio de fermentação adequado e, opcionalmente, a recuperação do diterpeno e/ou diterpeno glicosídeo.

[00170] O meio de fermentação usado no processo para a produção de um diterpeno ou diterpeno glicosídeo pode ser qualquer meio de fermentação adequado que permite o crescimento de uma célula hospedeira eucariótica particular. Os elementos essenciais do meio de fermentação são conhecidos por uma pessoa versada na técnica e podem ser adaptados à célula hospedeira selecionada.

[00171] Preferivelmente, o meio de fermentação compreende uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados de amido, sacarose, lactose, ácido graxos, triglicerídeos e glicerol. Preferivelmente, o meio de fermentação também compreende uma fonte de nitrogênio tal como ureia ou um sal de amônio tal como sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio ou fosfato de amônio.

[00172] Um processo de fermentação adequado pode ser realizado no modo em batelada, descontínuo com alimentação ou contínuo. Um processo de hidrólise e fermentação separado (SHF) ou um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF) também pode ser aplicado. Uma combinação destes modos de processo de fermentação também pode ser possível para a produtividade ideal. Um processo de SSF pode ser particularmente atraente se amido, celulose, hemicelulose ou pectina forem usados como uma fonte de carbono no processo de fermentação, onde ele pode ser necessário para adicionar enzimas hidrolíticas, tais como celulases, hemicelulases ou pectinases para hidrolisar o substrato.

[00173] O micro-organismo recombinante usado no processo para a preparação de um glicosídeo de esteviol pode ser qualquer micro-organismo adequado como definido neste documento acima. Pode ser vantajoso usar um microorganismo eucariótico recombinante como descrito neste documento no processo para a produção de um diterpeno ou diterpeno glicosídeo, porque a maioria das células eucarióticas não requer condições estéreis para a propagação e são insensíveis a infecções por bacteriófago. Em adição, as células hospedeiras eucarióticas podem ser desenvolvidas em baixo pH para impeder a contaminação bacteriana.

[00174] O micro-organismo recombinante pode ser um micro-organismo anaeróbico facultativo. Um micro-organismo anaeróbico facultativo pode ser propagado aerobicamente em uma alta concentração celular. Esta fase anaeróbica pode então ser realizada em alta densidade celular que reduz o volume de fermentação exigido substancialmente e pode minimizar o risco de contaminação com micro-organismos aeróbicos.

[00175] O processo de fermentação para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico.

[00176] Um processo de fermentação anaeróbico pode ser neste documento definido como uma execução do processo de fermentação na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h e em que as moléculas orgânicas servem como ambos os doadores de elétrons e aceptores de elétrons. O processo de fermentação também pode ser primeiro executado sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições anaeróbicas.

[00177] O processo de fermentação também pode ser executado sob condições com limite de oxigênio ou microaeróbicas. Alternativamente, o processo de fermentação pode ser executado primeiro sob condições aeróbicas e subsequentemente sob condições com limite de oxigênio. Um processo de fermentação com limite de oxigênio é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás que entra assim como as propriedades de transferência de massa/mistura atual do equipamento de fermentação usado.

[00178] A produção de um glicosídeo de esteviol no processo de fermentação pode ocorrer durante a fase de crescimento da célula hospedeira, durante a fase estacionária (estado constante) ou durante ambas as fases. Pode ser possível executar o processo de fermentação em diferentes temperaturas.

[00179] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser executado em uma temperatura que é ideal para o micro-organismo recombinante. A temperatura de crescimento ideal pode diferir para cada célula transformada e é conhecida pela pessoa versada na técnica. A temperatura ideal pode ser maior do que a ideal para organismos do tipo selvagem para desenvolver o organismo eficientemente sob condições não estéreis sob sensibilidade à infecção mínima e custo de resfriamento mais baixo. Alternativamente, o processo pode ser realizado em uma temperatura que não é ideal para o crescimento do microorganismo recombinante.

[00180] A temperatura para o crescimento do microorganismo recombinante em um processo para a produção de um diterpeno ou diterpeno glicosídeo pode ser acima de 20°C, 22°C, 25°C, 28°C ou acima de 30°C, 35°C ou acima de 37°C, 40°C, 42°C e, preferivelmente, abaixo de 45°C. Durante a fase de produção de um diterpeno ou diterpeno glicosídeo, no entanto, a temperatura ideal deve ser menor do que a média a fim de otimizar a estabilidade da biomassa. A temperatura durante esta fase pode estar abaixo de 45°C, por exemplo, abaixo de 42°C, 40°C, 37°C, por exemplo, abaixo de 35°C, 30°C ou abaixo de 28°C, 25°C, 22°C ou abaixo de 20°C preferivelmente acima 15°C.

[00181] O processo para a produção de um glicosídeo de esteviol pode ser realizado em qualquer valor de pH adequado. Se o micro-organismo recombinante é levedura, o pH no meio de fermentação preferivelmente tem um valor abaixo de 6, preferivelmente abaixo de 5,5, preferivelmente abaixo de 5, preferivelmente abaixo de 4,5, preferivelmente abaixo de 4, preferivelmente abaixo do pH 3,5 ou abaixo do pH 3,0 ou abaixo do pH 2,5, preferivelmente acima do pH 2. Uma vantagem de realizar a fermentação nestes valores de pH baixos é que o crescimento de basctérias contaminantes no meio de fermentação pode ser evitado.

[00182] Tal processo pode ser realizado em uma escala industrial.

[00183] O produto de tal processo pode ser um ou mais de esteviolmonosídeo, esteviolbiosídeo, esteviosídeo ou rebaudiosídeo A, rebaudiosídeo B, rebaudiosídeo C, rebaudiosídeo D, rebaudiosídeo E, rebaudiosídeo F, rubusosídeo, dulcosídeo A. Preferivelmente, rebaudiosídeo A ou rebaudiosídeo D é produzido.

[00184] A recuperação do diterpeno ou diterpeno glicosídeo do caldo resultante pode ser realizada de acordo com a invenção.

[00185] No processo para a produção fermentativa de um glicosídeo de esteviol, pode ser possível alcançar uma concentração de acima de 5 mg/l do caldo de fermentação, preferivelmente acima de 10 mg/l, preferivelmente acima de 20 mg/l, preferivelmente acima de 30 mg/l de caldo de fermentação, preferivelmente acima de 40 mg/l, mais preferivelmente acima de 50 mg/l, preferivelmente acima de 60 mg/l, preferivelmente acima de 70, preferivelmente acima de 80 mg/l, preferivelmente acima de 100 mg/l, preferivelmente acima de 1 g/l, preferivelmente acima de 5 g/l, preferivelmente acima de 10 g/l, mas geralmente abaixo de 70 g/l no caldo.

[00186] Como descrito acima, no caso de um diterpeno ou diterpeno glicosídeo ser expresso dentro do microorganismo, tais células podem precisar ser tratadas de modo a liberar o glicosídeo de esteviol.

[00187] A solução e/ou composição de acordo com a invenção pode ser usada em qualquer aplicação conhecida para glicosídeos de esteviol. Em particular, eles podem, por exemplo, ser usados como um adoçante, por exemplo, em um alimento ou uma bebida. Por exemplo, glicosídeos de esteviol podem ser formulados em refrigerantes, como um adoçante de mesa, goma de mascar, produto lácteo tal como iogurte (por exemplo, iogurte natural), torta, cereal ou alimentos à base de cereais, produtos nutracêuticos, produtos farmacêuticos, gel comestível, produto de confeitaria, cosméticos, cremes dentais ou outras composições para a cavidade oral, etc. Em adição, um glicosídeo de esteviol pode ser usado como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em alimentação animal e forragem com características melhoradas.

[00188] Durante a fabricação de gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais tais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, aspersão, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[00189] A solução e/ou composição obtida nesta invenção pode ser usada nas formas secas ou líquidas. Ela pode ser adicionada antes ou após o tratamento térmico de produtos alimentares. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. Ele pode ser adicionado sozinho ou na combinação com outros compostos.

[00190] As soluções e composições produzidas de acordo com o método de recuperação da invenção podem ser misturadas com um ou mais adoçantes não caloríficos ou caloríficos adicionais. Tal mistura pode ser usada para melhorar o sabor ou perfil ou estabilidade temporal. Uma ampla faixa de ambos os adoçantes não caloríficos e caloríficos pode ser adequada para a mistura com glicosídeos de esteviol. Por exemplo, adoçantes não caloríficos tais como mogrosídeo, monatin, aspartame, sais de acessulfame, ciclamato, sucralose, sais de sacarina ou eritritol. Adoçantes caloríficos adequados para a mistura com a composição adoçante incluem álcoois de açúcar e carboidratos tais como sacarose, glicose, frutose e HFCS. Os aminoácidos com sabor doce, tais como glicina, alanina ou serina, também podem ser usados.

[00191] O glicosídeo de esteviol pode ser usado na combinação com um supressor de adoçante, tal como um supressor de adoçante natural. Ele pode ser combinado com um intensificador de gosto umami, tal como um aminoácido ou um sal do mesmo.

[00192] Um glicosídeo de esteviol pode ser combinado com um poliol ou álcool de açúcar, um carboidrato, uma substância fisiologicamente ativa ou ingrediente funcional, por exemplo, um carotenoide, fibra dietética, ácido graxo, saponina, antioxidante, nutracêutico, flavonoide, isotiocianato, fenol, esterol de planta ou estanol (fitoesteróis e fitoestanóis), um poliol, um prebiótico, um probiótico, um fitoestrogênio, proteína de soja, sulfetos/tióis, aminoácidos, uma proteína, uma vitamina, um mineral e/ou uma substância classificada com base nos benefícios para a saúde, tais como os benefícios cardiovasculares, de redução de colesterol ou anti- inflamatórios.

[00193] Uma composição ou solução de acordo com a invenção pode incluir um agente flavorizante, um componente de aroma, um nucleotídeo, um ácido orgânico, um sal de ácido orgânico, um ácido inorgânico, um composto amargo, uma proteína ou hidrolisado de proteína, um tensoativo, um flavonoide, um composto adseverae, uma vitamina, uma fibra dietética, um antioxidante, um ácido graxo e/ou um sal.

[00194] Uma composição ou solução da invenção pode ser aplicada como um adoçante de alta intensidade para produzir bebidas com caloria zero, caloria reduzida ou para diabéticos e produtos alimentares com características de sabor melhoradas. Da mesma forma, ela pode ser usada em bebidas, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos e outros produtos nos quais açúcar não pode ser usado.

[00195] Em adição, uma composição ou solução da invenção pode ser usada como um adoçante não apenas para bebidas, gêneros alimentícios e outros produtos dedicados ao consumo humano, mas também em alimentação animal e forragem com características melhoradas.

[00196] Os exemplos de produtos, onde uma composição ou solução da invenção pode ser usada como um composto adoçante, podem ser como bebidas alcoólicas, tais como vodka, vinho, cerveja, licor, saquê, etc, sucos naturais, bebidas refrescantes, refrigerantes carbonados, bebidas dietéticas, bebidas com caloria zero, bebidas e alimentos com calorias reduzidas, bebidas alcoólicas com iogurte, sucos instantâneos, café instantâneo, tipos em pó de bebidas instantâneas, produtos em lata, xaropes, pasta de soja fermentada, molho de soja, vinagre, molhos, maionese, ketchup, curry, sopa, caldo instantâneo, molho de soja em pó, vinagre em pó, tipos de biscoitos, biscoito de arroz, bolachas, pão, chocolates, caramelo, doces, goma de mascar, geleia, pudim, frutas e legumes em conserva, creme de leite fresco, geleia, marmelada, pasta de flores, leite em pó, gelados, sorvetes, frutas e legumes embalados em garrafas, feijões enlatados e cozidos, carnes e alimentos cozidos em molho adocicado, produtos alimentares vegetais agrícolas, frutos do mar, presunto, salsicha, presunto de carne de peixe, linguiça de peixe, pasta de peixe, produtos de peixe fritos em imersão, produtos alimentares do mar fritos, produtos alimentares congelados, algas preservadas, conservas de carne, tabaco, produtos medicinais e muitos outros. No princípio, eles podem ter aplicações ilimitadas.

[00197] A composição adoçada compreende uma bebida, cujos exemplos não limitantes incluem bebidas carbonadas e não carbonadas tais como colas, cervejas de gengibre, cervejas de raiz, cidras, refrigerantes com sabor de frutas (por exemplo, refrigerantes com sabor cítrico tais como lima-limão ou laranja), refrigerantes em pó e os similares; sucos de fruta que se originam de frutas ou vegetais, sucos de fruta incluindo sucos espremidos ou os similares, sucos de fruta contendo partículas de fruta, bebidas de frutas, bebidas de suco de fruta, bebidas contendo suco de frutas, bebidas com sabor de fruta, sucos de vegetais, sucos contendo vegetais e sucos mistos contendo frutas e vegetais; bebidas esportivas, bebidas energéticas, próximas à água e as bebidas similares (por exemplo, água com flavorizantes naturais ou sintéticos); bebidas tipo chá ou de tipo favorito tais como café, cacau, chá preto, chá verde, chá oolong e os similares; bebidas contendo componentes do leite tais como bebidas lácteas, café contendo componentes do leite, café com leite, chá com leite, bebidas com frutas e leite, iogurte para beber, bebidas com bactérias do ácido láctico ou as similares; e produtos lácteos.

[00198] Geralmente, a quantidade de adoçante presente em uma composição adoçada varia amplamente dependendo do tipo particular de composição adoçada e sua doçura desejada. Aqueles versados na técnica podem discernir prontamente sobre a quantidade apropriada de adoçante a colocar na composição adoçada.

[00199] A composição ou solução da invenção obtida como descrito neste documento pode ser usada nas formas secas ou líquidas. Ela pode ser adicionada antes ou após o tratamento térmico de produtos alimentares. A quantidade do adoçante depende do propósito de uso. Ela pode ser adicionada sozinha ou na combinação com outros compostos.

[00200] Durante a fabricação de gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos de mesa, goma de mascar, os métodos convencionais tais como mistura, amassamento, dissolução, decapagem, permeação, percolação, aspersão, atomização, infusão e outros métodos podem ser usados.

[00201] Na forma sólida, uma composição da presente invenção pode ser provida para os consumidores em qualquer forma adequada para a distribuição ao produto comestível a ser adoçado, incluindo sachês, pacotes, sacos ou caixcomo um granel, cubos, comprimidos, névoas ou tiras dissolvíveis. A composição pode ser distribuída como uma dose unitária ou na forma a granel.

[00202] Para os sistemas e composições adoçantes líquidos, faixas convenientes de fluido, semifluido, pasta e formas de creme, embalagem apropriada usando material de embalagem apropriado em qualquer formato ou forma devem ser inventadas que sejam convenientes para carregar ou dispensar ou armazenar ou transportar qualquer combinação contendo quaisquer dos produtos adoçantes acima ou combinação de produtos produzidos acima.

[00203] A composição ou solução da invenção pode incluir vários agentes de volume, ingredientes funcionais, colorantes, flavorizantes.

[00204] Uma referência aqui a um documento de patente ou outra matéria que seja dada como técnica anterior não deve ser considerada uma admissão de que aquele documento ou matéria era conhecido ou que a informação que ele contém fazia parte do conhecimento geral comum como na data de prioridade de qualquer uma das reivindicações.

[00205] A descrição de cada referência estabelecida aqui é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

[00206] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes Exemplos:

Exemplos Geral

[00207] As técnicas genéticas padrão, tais como superexpressão de enzimas nas células hospedeiras, assim como para a modificação genética adicional de células hospedeiras, são métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987). Os métodos para a transformação e modificação genética de células hospedeiras fúngicas são conhecidos de, por exemplo, EP-A-0 635 574, WO 98/46772, WO 99/60102 e WO 00/37671.

[00208] Uma descrição das sequências é estabelecida na Tabela 1. As sequências descritas neste documento podem ser definidas com referência à listagem de sequência ou com referência aos números de acesso do banco de dados também estabelecidos na Tabela 1.

Exemplo 1. Superexpressão de ERG20, BTS1 e tHMG em S. cerevisiae

[00209] Para a superexpressão de ERG20, BTS1 tHMG1, cassetes de expressão foram projetados para serem integrados em um local usando a tecnologia descrita no pedido de patente copendente no. PCT/EP2013/056623. Para amplificar os flancos de integração 5’ e 3’ para o local de integração, iniciadores adequados e DNA genômico de uma cepa de levedura CEN.PK (van Dijken et al. Enzima and Microbial Technology 26 (2000) 706-714) foram usados. Os genes diferentes foram ordenados como cassetes (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0. Os genes nestes cassetes foram flanqueados por promotores e terminadores constitutivos. Vide a Tabela 2. O DNA de plasmídeo de DNA2.0 contendo os cassetes de ERG20, tHMG1 e BTS1 foram dissolvidos em uma concentração de 100 ng/μl. Em uma mistura de 50 μl de PCR, 20 ng do molde foi usado com 20 pmols dos iniciadores. O material foi dissolvido em uma concentração de 0,5 μg/μl. Tabela 2: Composição dos construtos de superexpressão.

Para a amplificação do marcador de seleção, o construto de pUG7-EcoRV (Figura 1) e iniciadores adequados foram usados. O fragmento de KanMX foi purificado de gel usando o kit de recuperação de DNA Zymoclean Gel (ZymoResearch). A cepa de levedura Cen.PK1 13-3C foi transformada com os fragmentos listados na Tabela 3. Tabela 3: fragmentos de DNA usados para a transformação de ERG20, tHMGl e BTS1

[00210] Após a transformação e recuperação por 2,5 horas em YEPhD (extrato de levedura fitona peptona glicose; BBL Fitona Peptona de BD) a 30°C, as células foram plaqueadas em YEPhD ágar com 200 μg/ml G418 (Sigma) . As placas foram incubadcomo um 30°C por 4 dias. A integração correta foi estabelecida com PCR diagnóstica e sequenciamento. A superexpressão foi confirmada com LC/MS nas proteínas. O esquema da montagem de ERG20, tHMG1 e BTS1 é ilustrado na Figura 2. Esta cepa é nomeada STV002.

[00211] A expressão da CRE-recombinase nesta cepa levou à recombinação externa do marcador de KanMX. A recombinação externa correta e a presença de ERG20, tHMG e BTS1 foi estabelecida com PCR diagnóstica.

Exemplo 2. Redução da expressão de Erg9

[00212] Para reduzir a expressão de Erg9, um construto de redução de expressão de Erg9 foi projetado e usado que contém uma extremidade 3’ modificada, que continua dentro do promotor de TRP1 acionando a expressão de TRP1.

[00213] O construto contendo o fragmento Erg9-KD foi transformado em células E. coli TOP10. Os transformantes foram desenvolvidos em 2PY(2 vezes de extrato de levedura fitona peptona), meio sAMP. O DNA de plasmídeo foi isolado com o kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) e digerido com Sall-HF (New England Biolabs). Para concentrar, o DNA foi precipitado com etanol. O fragmento foi transformado em S. cerevisiae e as colônias foram plaqueadas em placas de ágar em meio mineral (Verduyn et al, 1992. Yeast 8:501 -517) sem triptofano. A integração correta do construto de Erg9-KD foi confirmada com PCR diagnóstica e sequenciamento. O esquema de transformação realizada do construto de Erg9-KD é ilustrado na Figura 3. A cepa foi nomeada STV003.

Exemplo 3. Superexpressão de UGT2 1a

[00214] Para a superexpressão de UGT2_1a, a tecnologia foi usada como descrito nos pedidos de patente copendentes nos. PCT/EP2013/056623 e PCT/EP2013/055047. O UGT2_1a foi ordenado como um cassete (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0. para detalhes, vide a Tabela 4. Para obter os fragmentos contendo o marcador e Cre-recombinase, a tecnologia foi usada como descrito no pedido de patente copendente no. PCT/EP2013/055047. O marcador NAT, que confere resistência à nourseotricina foi usado para a seleção. Tabela 4: Composição do construto de superexpressão

[00215] Os iniciadores adequados foram usados para a amplificação. Para amplificar os flancos de integração 5’ e 3’ para o local de integração, os iniciadores adequados e o DNA genômico de uma cepa de levedura CEN.PK foram usados.

[00216] A cepa de levedura de S. cerevisiae STV003 foi transformada com os fragmentos listados na Tabela 5 e a mistura de transformação foi plaqueada em placas de ágar de YEPhD contendo 50 μg/ml de nourseotricina (Lexy NTC de Jena Bioscience). Tabela 5: Fragmentos de DNA usados para a transformação de UGT2_1a

[00217] A expressão da CRE recombinase é ativada pela presença de galactose. Para induzir a expressão da CRE recombinase, os transformantes foram semeados novamente em meio YEPh Galactose. Isto resultou em recombinação externa do(s) marcador(es) localizados entre os locais da lox. A integração correta do UGT2a e a recombinação externa do marcador NAT foi confirmada com PCR diagnóstica. A cepa resultante foi nomeada STV004. O esquema da transformação realizada do construto de UGT2_1a é ilustrado na Figura 4. Exemplo 4. Superexpressão de caminho de produção para RebA: CPS, KS, KO, KAH, CPR, UGT1 , UGT3 e UGT4.

[00218] Todos os genes do caminho que leva à produção de RebA foram projetados para serem integrados em um local usando a tecnologia descrita no pedido de patente copendente no. PCT/EP2013/056623. Para amplificar os flancos de integração 5’ e 3’ para o local de integração, iniciadores adequados e DNA genômico de uma cepa de levedura CEN.PK foram usados. Os genes diferentes foram ordenados como cassetes (contendo sequência homóloga, promotor, gene, terminador, sequência homóloga) em DNA2.0 (vide a Tabela 5 para a visão geral). O DNA de DNA2.0 foi dissolvido em 100 ng/μl. Esta solução estoque foi ainda diluída em 5 ng/μl, da qual 1 μl foi usado em uma mistura de PCR de 50μl. A reação continha 25 pmols de cada iniciador. Após a amplificação, o DNA foi purificado com o kit NucleoSpin 96 PCR Clean-up (Macherey-Nagel) ou alternativamente concentrado usando a precipitação do etanol. Tabela 6. Sequências usadas para o caminho de produção para RebA

[00219] Todos os fragmentos para o caminho para RebA, o marcador e os flancos (vide a visão geral na Tabela 7) foram transformados em cepa de levedura S. cerevisiae STV004. Após a recuperação durante a noite em YEPhD a 20°C, a mistura de transformações foi plaqueada em YEPhD ágar contendo 200 μg/ml de G418. Estas foram incubadas 3 dicomo um 25°C e uma noite à RT. Tabela 7. Fragmentos de DNA usados para a transformação de CPS, KS, KO, KanMX, KAH, CPR, UGT1, UGT3 e UGT4.

[00220] A integração correta foi confirmada com PCR diagnóstica e análise duma sequência (3500 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). As reações duma sequência foram feitas com o kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life Technologies). Cada reação (10 μl) continha 50 ng de molde e 3,2 pmols de iniciador. Os produtos foram purificados por precipitação de etanol/EDTA, dissolvidos em 10 μl de HiDi formamida e aplicados sobre o aparelho. A cepa foi nomeada STV016. O esquema de como o caminho de GGPP para RebA é integrado no genoma é ilustrado na Figura 5.

Exemplo 5: Construção de cepa STV027

[00221] Para remover o marcador KanMX do cromossoma da cepa STV016, esta cepa foi transformada com plasmídeo pSH65, expressando Cre-recombinase (Guldender, 2002). Subsequentemente, o plasmídeo pSH65 foi curado da cepa pelo desenvolvimento no meio não seletivo (YEP 2% de glicose). As cepas livres de KanMX e livres de pSH65 resultantes, como determinado pelo plaqueamento em placas contendo 200 μg de G418/ml ou 20 μg de fleomicina/ml, onde nenhum crescimento deve ocorrer, foram nomeadas STV027. A ausência do marcador de KanMX foi ainda confirmada com PCR diagnóstica.

Exemplo 6: Fermentação de cepa STV027

[00222] A cepa de levedura STV027 construída como descrito acima foi cultivada em frasco de agitação (meio de 500 ml com 50 ml) por 2 dicomo um 30°C e 280 rpm. O meio foi baseado em Verduyn et al. (Verduyn C, Postma E, Scheffers WA, Van Dijken JP. Yeast, 1992 Jul;8(7):501 - 517), com modificações nas fontes de carbono e nitrogênio, como descrito na Tabela 8. Tabela 8. Composição do meio de pré-cultura

Solução de elemento traço 1

bSolução de vitamin

[00223] Subsequentemente, 6 ml do conteúdo do frasco de agitação foram transferidos para dentro de um fermentador (volume inicial de 0,3 L), que continha o meio como estabelecido na Tabela 9. Tabela 9. Meio de fermentação da composição

[00224] O pH foi controlado em 5,0 pela adição de amônia (12,5 % em peso). A temperatura foi controlada a 27°C. pO2 foi controlado a 40% pelo ajuste da velocidade do agitador. A concentração da glicose foi mantida limitada pela alimentação controlada ao fermentador. Tabela 10. Composição do meio de alimentação da fermentação

Exemplo 7: Cromatografia

[00225] O caldo de fermentação de cepa de S. cerevisiae STV027 sofreu um choque de calor (1 h a 90°C) e foi seco por atomização. O Reb A foi extraído com etanol (1a extração: 1 kg de pó com 8 L de EtOH a 90%, 65°C, tempo de contato 3 h; após a filtração, a torta foi extraída novamente com 8 L de EtOH a 90% at 65°C, tempo de contato 2h, 1° e 2° extratos foram combinados) . Este extrato foi submetido a um processo de cromatografia em 2 etapas para remover outros componentes. Na Tabela 11, os parâmetros de execução são exibidos. Tabela 11: Parâmetros de Cromatografia

[00226] A coluna foi carregada com a quantidade de extrato que corresponde a 500 mg de Reb A em uma solução de EtOH a 20%, o pH se manteve como tal. A coluna foi lavada com 20 volumes de coluna (CV) de EtOH a 20% para lavar os componentes não ligados. Subsequentemente, um gradiente de etanol de 20% a 100% de Tampão B em 18,2 CV foi aplicado para eluir o Reb A. O padrão de eluição é conhecido na Figura 6. A Tabela 12 estabelece quantidades relativas (expressas em %) em diferentes frações da execução cromatográfica: lavagem, eluição e frações 1 a 6. A concentração inicial dos compostos respectivos é tomada como 100%. Tabela 12. Ex perimento de Rendimentos de Etapa

[00227] Após a primeira purificação, as frações de eluição foram combinadas e diluídas em 20% de concentração de etanol. O pH desta solução é então ajustado a 8,5 com o uso de NaOH a 0,1 M. Esta solução é usada como alimentação. O padrão de eluição é mostrado na Figura 7. A Tabela 13 então estabelece quantidades relativas (expressas em %) em diferentes frações da execução cromatográfica: lavagem, eluição e frações 1 a 6. A concentração inicial dos compostos respectivos é tomada como 100%. Tabela 13: Experimento de Rendimentos de Etapa

[00228] A Tabela 14 mostra a pureza de RebA como % no material seco total. A matéria-prima continha 2,3 % e as frações de cromatografia finais terminam em cerca de 30 %. Isto é, uma purificação de 15 vezes de rebA. Tabela 14: Purificação de RebA

Tabela 1: Descrição da Listagem de Sequência

Identidades sombreadas são truncadas e assim um fragmento da identidade de UniProt mencionada.

Claims (15)

1. Processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, o processo caracterizado por compreender: (a) provisão de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol e um solvente; (b) provisão de uma resina adsorvente; (c) provisão de um solvente de eluição; (d) contatar a resina adsorvente com a fase líquida ou caldo e solvente de eluição, de modo que uma porção ou todos os componentes de glicosídeos não esteviois adsorva no adsorvente, enriquecendo a solução glicosídica em glicosídeos de esteviol e resultando na formação de uma composição de glicosídeo de esteviol purificada que é eluída do adsorvente junto com o solvente de eluição; e (e) opcionalmente, dessorvendo os componentes de glicosídeo não-esteviol do adsorvente, e dessa forma, para recuperar um ou mais glicosídeos de esteviol do caldo de fermentação que contém um ou mais glicosídeos de esteviol, em que o solvente de eluição compreende 50% em peso ou menos de etanol; e 50% em peso ou mais de água; e em que a resina adsorvente é uma resina de poliestireno-divinilbenzeno.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resina adsorvente é provida em uma coluna de enchimento em um modo de leito expandido.

3. Processo para a recuperação de um ou mais glicosídeos de esteviol de um caldo de fermentação contendo glicosídeo de esteviol, de acordo com a reivindicação 1, o processo caracterizado por compreender: (a) provisão de um caldo de fermentação compreendendo um ou mais glicosídeos de esteviol e um ou mais componentes de glicosídeo não-esteviol e um solvente; (b) separar uma fase líquida do caldo de uma fase sólida do caldo; (c) provisão de uma resina adsorvente; (d) proporcionar um solvente de eluição; (e) contato da resina adsorvente com a fase líquida ou caldo e solvente de eluição, de modo que uma porção ou todos os componentes de glicosídeos não-esteviol adsorva no adsorvente, enriquecendo a solução de glicosídeos em glicosídeos de esteviol e resultando na formação de uma composição purificada de glicosídeo de esteviol que é eluída do adsorvente juntamente com o solvente de eluição; e (f) opcionalmente, dessorção dos componentes glicosídeo não-esteviol do adsorvente.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a resina adsorvente é provida em uma coluna de enchimento.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o solvente de eluição compreende 20% em peso ou menos de etanol; e 80% em peso ou mais de água.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o método de separação compreende a cromatografia de fracionamento.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de fracionamento compreende as etapas de: (a) provisão de uma fase líquida, conforme definido na reivindicação 3(b) ou um caldo, conforme definido na reivindicação 1(a), e um solvente; (b) provisão de um adsorvente e; (c) contato do adsorvente com a fase líquida ou caldo de modo que uma parte ou todos os componentes de glicosídeo não esteviol adsorva sobre o adsorvente e de modo que pelo menos uma parte do glicosídeo de esteviol adsorva sobre o adsorvente, em que os glicosídeos de esteviol propagam através do adsorvente em uma taxa mais rápida do que os glicosídeos não esteviol e; (d) coleta de uma solução contendo glicosídeo de esteviol do adsorvente.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o adsorvente é provido em uma coluna de enchimento.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende 20% em peso ou mais de etanol e 80% em peso ou menos de água.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende 25% a 35% em peso de etanol e 65% a 75% de água.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o solvente compreende água e em que o adsorvente é uma resina de troca catiônica fortemente ácida.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o adsorvente tem uma área de superfície de 900 m2/grama ou maior.

13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a solução contendo glicosídeo de esteviol recuperada tem uma pureza que é 10% ou acima de 10%, maior quando comparado a uma pureza da fase líquida, conforme definido na reivindicação 3(b), ou do caldo, conforme definido na reivindicação 1(a).

14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a solução contendo glicosídeo de esteviol purificada compreende, em uma base de sólidos secos, 95% ou ou acima de 95%, maior em peso de Rebaudiosídeo A, Rebaudiosídeo D ou Rebaudiosídeo M.

15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a solução contendo glicosídeo de esteviol é seca por atomização para prover um pó.

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