CN102295668B - 一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法。从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法中包括以下步骤：a.提取和除杂：甜叶菊干燥叶加水浸提过滤；b.浓缩分离：用树脂进行纯化干燥得甜菊糖苷粗品；c.纯化：甜菊糖苷粗品用中压硅胶层析柱进行分离，得高纯度的甜菊糖苷St和RA。
Description
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法。
背景技术
叶菊糖苷又称甜菊苷、甜菊糖苷、甜菊糖，是从甜叶菊植物中提取，属于天然无热量高倍甜味剂。它们是一类具甜味的萜烯类配糖体，为白色粉末。甜叶菊中主要含有甜菊糖苷St(Stevioside)、RA(Rebaudioside A)、RB(Rebaudioside B)、RC(Rebaudioside C)、RD(RebaudiosideD)和RE(Rebaudioside E)等。其中，甜菊糖苷St成分占糖苷总量的60％～70％，甜度为蔗糖的300倍，其次是RA，约占15％～20％，甜度为蔗糖的450倍，其它组分含量都较少。甜菊糖苷在低浓度的酸、碱性条件下稳定，耐热性强，不易降解，不会产生微生物所需的糖原，而且甜菊糖苷在人体内不参加代谢、不蓄积、无毒性，其安全性已得到国际FAO和WHO等组织的认可。我国卫生部自1985年和1990年分别批准甜菊糖苷为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料。因此，甜菊糖苷有着广泛的应用范围和宽阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法。
本发明一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法，方法，其特征在于从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法中包括以下步骤：
a.提取和除杂：甜叶菊干燥叶加纯水于浸提，过滤后得提取液；在提取液中加入FeSO4·H2O后用Ca(OH)2调节pH到pH在8～9，搅拌，静置后过滤得浅黄色除杂提取液；
b.浓缩分离：除杂提取液用ADS-7大孔吸附树脂进行纯化，除杂提取液减压浓缩至1/3体积后上样，吸附饱和的树脂先用纯水进行冲洗除杂，然后60％的乙醇进行洗脱，收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品；
c.纯化：甜菊糖苷粗品用正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相展开，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液；将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA。
本发明一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法中包括以下步骤：
a.提取和除杂：甜叶菊干燥叶加15倍重量的纯水于60℃浸提2h，过滤后得提取液；
在提取液中加入甜叶菊干燥叶1/20重量的FeSO4·H2O后用Ca(OH)2调节pH到pH在8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液；
b、浓缩分离：除杂提取液用ADS-7大孔吸附树脂进行纯化，除杂提取液减压浓缩至1/3体积后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h，吸附饱和的树脂先用纯水进行冲洗，流速为4BV/h，用量为2BV进行除杂，然后用4BV的60％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h；收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品；
c.纯化：甜菊糖苷粗品用正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相展开，流动相的速度为4BV/h，恒流泵的压力为9.5kgf/cm2，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液；使用5BV的流动相即可把甜菊糖苷洗脱出来，并且和杂质完全分开；将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA。
本发明主要是从甜叶菊的提取液中利用树脂吸附和中压硅胶层析联合技术分离纯化甜菊糖苷St(Stevioside)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A)，以制备98％纯度的甜菊糖苷St和RA。
本发明从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法，用水从甜叶菊叶中提取甜菊糖苷。甜菊糖苷的粗提液中含有大量有机酸、蛋白、鞣质和色素等物质，不能直接进入大孔吸附树脂柱，以免造成树脂柱堵塞，降低树脂的吸附分离性能。需要加入1g～10g的FeSO4·7H2O并且用Ca(OH)2调节pH8～9对上述提取液进行除杂，除杂后的提取液呈浅黄色。为了提高树脂的吸附性能，上述初步除杂后的提取液还需要浓缩，使上样的甜菊糖总苷浓度达到20mg/mL～40mg/mL。树脂采用湿法进行装柱，树脂柱的的径高比为1∶7～1∶10。上样吸附时的流速2BV/h～7BV/h，用HPLC跟踪检测流出液的浓度。当流出液的浓度为上样浓度的4％时，该树脂即达到饱和，并且停止上样。吸附饱和的树脂先用乙醇浓度0～20％的溶液进行冲洗，流速为4BV/h，用量为1BV～3BV，冲洗出来的是不能被该树脂吸附的杂质。然后用40％～70％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱的速度为2BV/h～4BV/h，洗脱体积为3BV～6BV。收集洗脱液，然后回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品，用HPLC检测甜菊糖苷粗品中的St和RA的纯度。
用中压硅胶层析柱制备高纯度的St和RA：称取300～400目经105℃活化后的硅胶用流动相(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5)进行浸泡，并且搅拌，待硅胶中没有气泡时，湿法装入中压色谱柱中。然后用分离式液压起顶机压实，压缩比为70％～90％，压缩后的硅胶柱床径高比为1∶7～1∶9。甜菊糖苷粗品用流动相溶解后湿法上样，上样量为1g～2g甜菊糖苷粗品/100g硅胶。然后用上述的流动相进行洗脱，洗脱速度为3BV/h～6BV/h，压力为7kgf/cm2～10kgf/cm2，210nm紫外检测器进行跟踪检测，分部收集洗脱液。洗脱体积为4BV～8BV即可把St和RA洗脱出来。用TLC法检测所收集的样品以及色谱峰对应的样品，合并相同成份的收集液，浓缩干燥，并用HPLC法测定样品的纯度。
通过本方法制备的St和RA产品经过HPLC检测后的纯度达到97％～98％，可以达到食品添加剂和药用的标准。
本发明中主要使用TLC法定性和HPLC法定量分析检测St和RA。
HPLC定量法：
仪器和色谱条件：Waters 2695分离单元+2696二极管矩阵检测器；Masslynx 4.0色谱工作站；甜菊糖苷和莱鲍迪苷A标准品(Sigma公司)；色谱柱：Kromasil-NH2柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：V(乙腈)∶V(水)＝75∶25；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：210nm。
标准曲线的绘制：配制甜菊糖苷St和RA均为1mg/mL的混合标准溶液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL上述混合标准溶液用水定容至10mL，分别取20μL注入液相色谱仪，以对照品的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
含量测定：取适量的样品进行直接测定，要求样品中的甜菊糖苷的浓度在上述标准曲线的线性范围内。
TLC定性方法：
硅胶板的活化：110℃，30min；展开剂：正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1；显色剂：50％硫酸；显色方式：喷雾后在110℃加热3min～10min即可显色。通过甜菊糖苷St和RA标准品进行对照，即可对样品进行定性。
附图说明
图1是甜菊糖苷的结构式。
图2制备高纯度甜菊糖苷工艺流程图。
图3中压硅胶层析分离甜菊糖苷色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1高纯度甜菊糖苷的新工艺
甜叶菊干燥叶100g，纯水1500mL于60℃提取2h，过滤后得提取液。然后在提取液中加入5g FeSO4·H2O后Ca(OH)2调节pH8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液。该除杂提取液减压浓缩至甜菊糖苷总浓度达到20mg/mL～40mg/mL后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h。吸附饱和的树脂先用纯水进行冲洗，流速为4BV/h，用量为2BV进行除杂。然后用4BV的60％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h。收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品。用HPLC测得St和RA的总纯度为75.3％。甜菊糖苷粗品用流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5)展开，流动相的速度为4BV/h，恒流泵的压力为9.5kgf/cm2，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液。使用5BV的流动相即可把甜菊糖苷洗脱出来，并且和杂质完全分开。将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA，用HPLC测得St和RA的总纯度为97.5％。
实施例2高纯度甜菊糖苷的新工艺
甜叶菊干燥叶100g，纯水1500mL于60℃提取2h，过滤后得提取液。然后在提取液中加入5g FeSO4·H2O后Ca(OH)2调节pH8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液。该除杂提取液减压浓缩至甜菊糖苷总浓度达到20mg/mL～40mg/mL后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h。吸附饱和的树脂先用10％乙醇溶液进行冲洗，流速4BV/h，用量为2BV进行杂质。然后用4BV的60％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h。收集40％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品。用HPLC测得St和RA的总纯度为82.6％。甜菊糖苷粗品用流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5)展开，流动相的速度为4BV/h，恒流泵的压力为9.5kgf/cm2，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液。使用5BV的流动相即可把甜菊糖苷洗脱出来，并且和杂质完全分开。将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA，用HPLC测得St和RA的总纯度为98.2％。
实施例3高纯度甜菊糖苷的新工艺
甜叶菊干燥叶100g，纯水1500mL于60℃提取2h，过滤后得提取液。然后在提取液中加入5g FeSO4·H2O后Ca(OH)2调节pH8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液。该除杂提取液减压浓缩至甜菊糖苷总浓度达到20mg/mL～40mg/mL后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h。吸附饱和的树脂先用20％的乙醇溶液进行冲洗，流速为4BV/h，用量为2BV进行杂质。然后用4BV的60％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h。收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品。用HPLC测得St和RA的总纯度为80.2％。甜菊糖苷粗品用流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶1∶0.5)展开，流动相的速度为4BV/h，恒流泵的压力为9.5kgf/cm2，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液。使用5BV的流动相即可把甜菊糖苷洗脱出来，并且和杂质完全分开。将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA，用HPLC测得St和RA的总纯度为97.8％。
实施例4高纯度甜菊糖苷的新工艺
甜叶菊干燥叶100g，纯水1500mL于60℃提取2h，过滤后得提取液。然后在提取液中加入5g FeSO4·H2O后Ca(OH)2调节pH8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液。该除杂提取液减压浓缩至甜菊糖苷总浓度达到20mg/mL～40mg/mL后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h。吸附饱和的树脂先用10％的乙醇溶液进行冲洗，流速为4BV/h，用量为2BV进行杂质。然后用4BV的60％的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h。收集60％乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品。用HPLC测得St和RA的总纯度为82.2％。
Claims (1)
1.一种从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法，其特征在于从甜叶菊中制备高纯度甜菊糖苷的方法中包括以下步骤：
a.提取和除杂：甜叶菊干燥叶加15倍重量的纯水于60℃浸提2h，过滤后得提取液；在提取液中加入甜叶菊干燥叶1/20重量的FeSO4·H2O后用Ca(OH)2调节pH到pH在8～9，搅拌10min，静置20min后过滤得浅黄色除杂提取液；
b.浓缩分离：除杂提取液用ADS-7大孔吸附树脂进行纯化，除杂提取液减压浓缩至1/3体积后上样，ADS-7树脂吸附时的流速3BV/h，吸附饱和的树脂先用纯水进行冲洗，流速为4BV/h，用量为2BV进行除杂，然后用4BV的60%的乙醇进行洗脱，洗脱的速度为4BV/h；收集60%乙醇的洗脱液，回收溶剂，干燥得甜菊糖苷粗品；
c.纯化：甜菊糖苷粗品用正丁醇:乙醇:水=5:1:0.5流动相溶解后湿法上中压硅胶层析柱进行分离，用流动相展开，流动相的速度为4BV/h，恒流泵的压力为9.5kgf/cm2，用紫外检测器于210nm处进行在线检测，收集色谱峰对应的流出液；使用5BV的流动相即可把甜菊糖苷洗脱出来，并且和杂质完全分开；将色谱峰对应的流出液进行减压干燥，得高纯度的甜菊糖苷St和RA。
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