CN113429444B - 一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，步骤包括：(1)取甜叶菊母液糖，用水溶解成水溶液，经过树脂吸附，不同浓度乙醇水溶液进行梯度洗脱，分段收集，洗脱液浓缩干燥成干粉，合并甜茶苷含量较高的收集段，得到产物A；(2)将步骤(1)中得到的产物A用低浓度的乙醇水溶液溶解，再过树脂进行吸附，吸附完成后用乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到产物B；(3)将步骤(2)中得到的产物B加入溶剂打浆洗涤2～3次，即得到高纯度的甜茶苷。本申请的方案不需要引入外源的微生物或酶源进行生物转化，不会改变甜菊苷的结构，能够安全有效的从甜叶菊母液糖中分离纯化获得高纯度的甜茶苷。

Description

一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法
技术领域
本发明涉及植物提取纯化技术领域，特别是涉及一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法。本发明开发出来的产品可广泛应用于糕点、饮料、罐头、医药、烟草、牙膏、啤酒、酱制品等方面。
背景技术
目前市面上所售的甜茶苷主要是从甜茶中提取纯化出来的，广西甜茶(RubusSuavissimus S.Lee)，属蔷薇科悬钩子属植物，是广西特有的一种野生甜味植物，由于其叶味甜，具有保健作用，广西民间常作茶饮用，故名“甜茶”，亦称之“神茶”；甜茶具有清热、润肺、祛痰止咳等功效。甜茶与罗汉果、甜叶菊并称广西三大甜味植物，它们均可提取甜味素，其中又以甜茶的甜味素口感最佳。
生产甜茶苷的传统工艺通常为：甜茶叶原料→粉碎→提取→粗过滤→精密过滤→脱杂→树脂吸附→溶剂洗脱→脱色→浓缩→干燥→混合→重结晶→干燥→成品。此工艺是用水作为溶剂，经过高温提取，所得的提取液，加硫酸亚铁或者石灰或者碱式氯化铝等絮凝剂，通过絮凝除杂，将其离心分离后上清液用吸附甜茶苷的树脂吸附，然后再用一定浓度洗脱液将其从树脂上洗脱，再将洗脱液经脱色、浓缩、干燥、重结晶等制备出甜茶苷。此工艺通过絮凝作用可以除去多酚等一些苦涩味成分，所得到的产品的苦涩味较少，通过树脂吸附、重结晶等手段得到的甜茶苷含量比较高，但是由于在除杂的过程中加入了含有大量金属阳离子的絮凝剂，给甜茶素溶液带来了新的杂质，增加了后续分离纯化的负担，同时絮凝作用也会带走部分甜茶苷，造成甜茶苷的损失。
不同于上述甜茶苷的提取工艺，现有技术也有采用如下工艺的：专利CN104262425A公开了一种提取甜茶苷的方法，原料经过粉碎、溶剂提取、膜浓缩、离心、调pH值、大孔树脂纯化、碱酸处理、洗脱、浓缩、复合离子交换树脂层析、浓缩、结晶、干燥后得到成品，本方法能够得到纯度99％的甜茶昔产品，并且产品纯白，无苦味，溶剂残留少，无农药残留。专利CN105166198A公开了一种高纯度甜茶苷的制备方法，该制备方法将甜茶叶粉碎，经水提取后得到甜茶粉提取液，提取液经中空纤维超滤膜和反渗透膜，得到浓缩液，浓缩液干燥、粉碎，得到甜茶苷粗品，再用乙醇重结晶，得到高纯度甜茶苷。专利CN109180755A公开了一种从甜茶叶中提取甜茶苷的方法，将甜茶叶粉碎，连续逆流提取，过滤；加入酶制剂酶解，灭活，冷却，絮凝，过滤，水洗滤渣，超滤、纳滤；上大孔吸附树脂层析柱吸附，水洗，水洗液弃掉，有机溶剂梯度洗脱，减压浓缩；上氧化铝层析柱吸附，加入活性炭脱色，喷雾干燥；有机溶剂结晶得甜茶苷产品。
甜茶苷(Rubusoside，又名甜茶素、甜茶甙)是甜茶的主要甜味成分，甜茶苷的分子式为C32H50O13，是葡萄糖和斯替维醇结合形成的四环二萜苷，其单体呈白色晶体。熔点为176～179℃，甜茶苷甜度约为蔗糖的300倍，但热值仅为蔗糖的1％，是一种甜度高，低热值，健康安全的天然甜味剂。甜茶苷的口感接近于蔗糖，没有后苦味，更容易被人们接受。但是，甜茶树不易种植，甜茶苷主要来源于野生甜茶，由于生长环境的不断变化，甜茶越来越稀少，不少地方出现人工种植的甜茶，其主要用于绿化观赏，却没有药用功效，甜茶叶的来源又相对有限，这就在一定程度上限制了甜茶苷的产量。
甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)又称甜草、甜菊等，原产于巴拉圭、巴西等国家，其叶片含有多种甜菊糖苷，甜菊糖苷是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂，其中包括很多种相似物，如Stevioside(甜菊苷)、Rebaudioside C(瑞鲍迪苷C)、RebaudiosideA(瑞鲍迪苷A)和Rubusoside(甜茶苷)。
专利CN101701238A公开了一种由甜菊糖苷制备甜茶苷的方法，甜菊糖经黄杆菌JH(Chryseobacterium sp.JH)CCTCC NO:M209202或其所产的β-葡萄糖苷酶的催化转化为甜茶苷。具体为将甜菊糖制成菌培养液或酶转化液，加入适量菌或酶后，在适当装液量、转化温度、pH、时间等条件下，甜菊糖被转化为甜茶苷，转化后的粗转化液经进一步的分离和纯化后得到高纯度的甜茶苷，此方法需要引入外源微生物或酶源，经过生物转化，生产时间长，过程较复杂，对外界条件比较苛刻。
甜叶菊产品主要以STV(甜菊苷)，RA(瑞鲍迪苷A)为主，生产完RA，STV等产品的母液糖中含有一定量的甜茶苷(Rubusoside)和其他杂质糖，通过一定的技术手段可以富集出更多高含量的甜茶苷，从而扩大了甜茶苷生产的原料来源，满足更多的社会需求。
发明内容
本申请针对现有技术上述不足，提供一种不需要引入外源的微生物或酶源进行生物转化，不会改变甜菊苷的结构，安全有效的从甜叶菊母液糖中分离纯化纯天然甜茶苷的方法。
为了解决上述技术问题，本申请采用的技术方案为：一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，该方法的步骤包括：
(1)取甜叶菊母液糖，用水溶解成水溶液，经过树脂吸附，不同浓度乙醇水溶液进行梯度洗脱，分段收集，洗脱液浓缩干燥成干粉，合并甜茶苷含量较高的收集段，得到产物A；
(2)将步骤(1)中得到的产物A用低浓度的乙醇水溶液溶解，再过树脂进行吸附，吸附完成后用乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到产物B；
(3)将步骤(2)中得到的产物B加入溶剂打浆洗涤2～3次，即得到甜茶苷。
优选的，本申请步骤(1)和(2)中所用的树脂(如LX-1，LX-18，LX-28，LX-69，LX-T81等中的一种或者多种)是以苯乙烯为结构的非极性或弱极性的吸附大孔树脂。
优选的，本申请步骤(1)中的大孔树脂装柱时其径高比保持在1:20～40，进一步优选的径高比为1:35。上述径高比的限定，可以有效的提高理论塔板数，使各个成分分离的更彻底一些。
优选的，本申请步骤(1)中母液糖的上样量为树脂柱体积的十分之一，具体的为母液糖干粉(没有水进行溶解稀释)的上样量为树脂柱体积的十分之一。
优选的，本申请步骤(1)中梯度洗脱合并甜茶苷含量较高的收集段，具体的是通过高效液相检测甜茶苷含量在25％以上的洗脱产物进行合并获得产物A。
优选的，本申请步骤(1)中的母液糖原来其所含甜茶苷含量为2％-8％，总甜菊糖苷含量55％-65％。
优选的，本申请步骤(1)中母液糖用水溶解成水溶液的浓度为5％-10％。
优选的，本申请步骤(1)中洗脱溶剂(洗脱用的乙醇水溶液)为20％-80％乙醇水溶液。
优选的，本申请步骤(2)中低浓度乙醇为10％-30％的乙醇水溶液，进一步优选的为20％乙醇水溶液。
优选的，本申请步骤(2)中的脱溶剂(洗脱用的乙醇水溶液)为70％-80％的乙醇水溶液。
优选的，本申请步骤(1)和(2)中浓缩干燥温度为60℃-80℃。
优选的，本申请步骤(3)打浆用到的溶剂为甲醇、乙醇或者甲醇、乙醇的混合溶剂，溶剂倍量为2-3倍。
优选的，本申请步骤(3)中打浆温度为10℃-20℃。
本发明具有以下有益效果：
1.本申请首次直接从甜叶菊母液糖中分离纯化得到甜茶苷，不需要以甜茶为原料，不需要引入外源的微生物或酶源进行生物转化，不会改变甜茶苷的结构，获得的甜茶苷更加的纯净、安全，杂质少。
2.本发明采用两次树脂层析分离与打浆洗涤相结合的技术来制备高纯度的甜茶苷，大孔树脂结构稳定，安全系数高，可以循环使用很多次；而打浆只用到一种或两种溶剂，溶剂残留少，成本低，操作简单，效果好，处理过程无污染，适合大规模生产，增加了甜茶苷原料来源；本发明以市售的甜叶菊母液糖为原料，母液糖价格低廉，销售困难，经济效益低，但是通过本申请的方法则可以从中制备出甜茶苷纯度可达90％以上，增加了甜叶菊产品的附加值，同时也丰富了甜茶苷的来源，不受到甜茶叶这种稀少植物来源的限制。
附图说明
图1本申请从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法工艺流程图。
图2实施例1中5％的母液糖水溶液中各个组分成分含量的检测图。
图3实施例1获得的固体B中各个组分成分含量的检测图。
图4实施例1获得的固体C中各个组分成分含量的检测图。
图5实施例1目标产物甜茶苷的含量检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是优选实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围；
如图1所示，为本申请的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法工艺流程图，参照工艺流程图，结合如下实施例对本申请的方案进行说明。
本申请的乙醇浓度为体积百分含量，本申请其他成分的浓度为质量百分含量。
实施例1
(1)取母液糖(总甜菊糖苷含量62.82％，甜茶苷含量2.71％)300g，加入6L纯水充分搅拌溶解，配成5％的水溶液，经过大孔树脂(LX-28)吸附，吸附树脂径高比为1:35，母液糖干粉用量为树脂柱体积的十分之一，吸附速度为2.5BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用60％乙醇水溶液进行梯度洗脱，解析速度为1.5BV/h，分段收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，液相检测甜茶苷含量25％以上合并，得到25.8g固体A，具体的母液糖水溶液中各个组分的成分含量检测见图2所示，可知获得的其中总甜菊糖甘62.82％，甜茶苷2.71％。
(2)取步骤(1)中固体A用20％乙醇溶液溶解，配成5％的溶液，再过另一种型号的大孔树脂(LX-69)进行吸附，吸附速度为2.5BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用70％乙醇水溶液洗脱，解析速度为1.5BV/h，收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，得到9.4g固体B，固体B的成分含量检测见图3所示，可知获得的固体B其中甜茶苷高达69.12％。
(3)取步骤(2)中固体B，加入2倍量的97％的甲醇水溶液磁力搅拌6h，转速900rpm，过滤，滤饼干燥得到3.3g固体C，固体C的成分含量检测见图4所示，可知获得的固体C其中甜茶苷高达85.32％。
(4)取步骤(3)中固体C，加入3倍量的无水甲醇磁力搅拌4h，转速900rpm，过滤，滤饼再重复用无水甲醇打浆一次，过滤干燥得到2.4g甜茶苷产品，经检测含量为91.32％，具体的可见附图5所示，可知最终的产物中的甜茶苷的含量为91.32％。
实施例2
(1)取母液糖(总甜菊糖苷含量60.58％，甜茶苷含量4.25％)600g，加入12L纯水充分搅拌溶解，配成5％水溶液，经过大孔树脂((LX-28)吸附，吸附树脂径高比为1:35，母液糖干粉用量为树脂柱体积的十分之一，吸附速度为3BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用70％乙醇水溶液进行梯度洗脱，解析速度为1BV/h，分段收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，液相检测甜茶苷含量25％以上合并，得到68.8g固体A。
(2)取步骤(1)中固体A用20％乙醇溶液溶解，配成5％溶液，再过另一种型号的大孔树脂(LX-69)进行吸附，吸附速度为3BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用70％乙醇水溶液洗脱，解析速度为1BV/h，收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，得到32.1g固体B。
(3)取步骤(2)中固体B，加入2倍量的97％的甲醇水溶液磁力搅拌4h，转速1000rpm，过滤，滤饼干燥得到14.4g固体C。
(4)取步骤(3)中固体C，加入3倍量的无水甲醇磁力搅拌3h，转速1000rpm，过滤，滤饼再重复用无水甲醇打浆一次，过滤干燥得到10.3g甜茶苷产品，经检测含量为93.12％。
实施例3
(1)取母液糖(总甜菊糖苷含量58.65％，甜茶苷含量6.42％)900g，加入18L纯水充分搅拌溶解，配成5％水溶液，经过大孔树脂(LX-28)吸附，吸附树脂径高比为1:35，母液糖干粉用量为树脂柱体积的十分之一，吸附速度为2BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用50％乙醇水溶液进行梯度洗脱，解析速度为1.2BV/h，分段收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，液相检测甜茶苷含量25％以上合并，得到154.1g固体A。
(2)取步骤(1)中固体A用20％乙醇溶液溶解，配成5％溶液，再过另一种型号的大孔树脂(LX-69)进行吸附，吸附速度为2BV/h，吸附完成后用纯水洗至流出澄清，再用70％乙醇水溶液洗脱，解析速度为1.2BV/h，收集洗脱液，洗脱液70℃浓缩干燥，得到69.3g固体B。
(3)取步骤(2)中固体B，加入2倍量的97％的甲醇水溶液磁力搅拌4h，转速850rpm，过滤，滤饼干燥得到32.3g固体C。
(4)取步骤(3)中固体C，加入3倍量的无水甲醇磁力搅拌2h，转速850rpm，过滤，滤饼再重复用无水甲醇打浆一次，过滤干燥得到24.5g甜茶苷产品，经检测含量为95.75％。
通过上述实施例可知，本申请甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷操作步骤简单，不需要引入外源的微生物或酶源进行生物转化，不会改变甜菊苷的结构，获得的甜菊苷更加的纯净、安全，杂质少，获得的甜菊苷的纯度达到91％以上。
本申请甜茶苷的具体检测方法如下：
(1)色谱条件
色谱柱：C185μm 250mm×4.6mm
流动相：甲醇:水20:80(V/V)
稀释剂：甲醇
流速：1.0ml/min
进样体积：20μL
检测波长：210nm；
(2)溶液制备
标准品溶液的配制
精密称取甜茶苷标准品约15mg于50mL容量瓶中，加入大约40mL的稀释剂超声溶解30min，冷却后用稀释剂定容至刻度，摇匀待用。
供试品溶液的配制
①提取物类供试品溶液的配制：
精密称取供试品约15mg于50mL容量瓶中(含量约98％，其它根据含量浓度计算即可)，加入约40mL稀释剂超声溶解30min，溶液冷却至室温后用稀释剂定容至刻度，摇匀待用。
②原料供试品溶液的配制：
取原料充分粉碎，精密称取约1.5g置250mL锥形瓶中，加100mL稀释剂超声2h，冷却至室温后，再用稀释剂精密稀释10倍，摇匀待用
(3)含量的测定
取标准品和供试品溶液分别经0.45μm膜过滤后注入液相色谱仪，记录色谱图(具体的如附图2-5所示)；结果按外标法计算甜茶苷的含量。

Claims (10)

1.一种从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：该方法的步骤包括：
（1）取甜叶菊母液糖，用水溶解成水溶液，经过树脂吸附，不同浓度乙醇水溶液进行梯度洗脱，分段收集，洗脱液浓缩干燥成干粉，合并甜茶苷含量较高的收集段，得到产物A；步骤（1）中所述的树脂为大孔树脂LX-28；
（2）将步骤（1）中得到的产物A用低浓度的乙醇水溶液溶解，再过树脂进行吸附，吸附完成后用乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩干燥得到产物B；步骤（2）中所述的树脂为大孔树脂LX-69；
（3）将步骤（2）中得到的产物B加入溶剂打浆洗涤2~3次，即得到甜茶苷；
步骤（1）中母液糖所含甜茶苷含量为2%-8%，总糖苷含量55%-65%；
步骤（3）打浆用到的溶剂为甲醇、乙醇或者甲醇与乙醇的混合溶剂，溶剂倍量为2-3倍。
2.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）中的大孔树脂装柱的径高比保持在1:20~40。
3.根据权利要求2所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）中的大孔树脂装柱的径高比保持在1:35。
4.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）中母液糖的上样量为树脂柱体积的十分之一。
5.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）中含量较高的收集段为甜茶苷含量在25%以上的洗脱产物进行合并获得产物A。
6.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）中母液糖用水溶解成水溶液的浓度为5%-10%；步骤（1）中洗脱溶剂为20%-80%乙醇水溶液。
7.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（2）中低浓度乙醇为10%-30%的乙醇水溶液；步骤（2）中的洗脱溶剂为70%-80%乙醇水溶液。
8.根据权利要求7所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（2）中低浓度乙醇为20%的乙醇水溶液。
9.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（1）和（2）中浓缩干燥温度为60℃-80℃。
10.根据权利要求1所述的从甜叶菊母液糖中分离纯化甜茶苷的方法，其特征在于：步骤（3）中打浆温度为10℃-20℃。
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