CN111187316B

CN111187316B - 一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷d和莱包迪苷m的方法

Info

Publication number: CN111187316B
Application number: CN202010092863.1A
Authority: CN
Inventors: 江伟; 魏士明; 李俊; 孙平; 任连兵
Original assignee: Nanjing Quankai Research Institute of Biomaterials Co Ltd
Current assignee: Nanjing Quankai Research Institute of Biomaterials Co Ltd
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: CN111187316A

Abstract

本发明公开了一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法，其是将甜菊糖母液上样到含有固相吸附材料的色谱分离柱中，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液合并，蒸发结晶，即得莱包迪苷D和莱包迪苷M的混合物；其中，所述的固相吸附材料是以苯乙烯‑二乙烯苯共聚物为骨架结构；所述的固相吸附材料的粒径为5～30μm，比较面积为400～1000m²/g，孔径为80～1000A，孔容为0.6～1.2cm³/g。该方法工艺过程简单，分离效率高、工艺废液低。所得莱包迪苷D和莱包迪苷M产品纯度在95％以上。

Description

一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法

技术领域

本发明属于生物基原材料分离纯化技术领域，具体涉及一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法。

背景技术

甜叶菊原产于巴西和巴拉圭交界的高山草地，当地人使用甜叶菊作为甜茶或者甜味剂。我国1976年将甜叶菊引入，并且成功种植。目前我国福建、云南为甜叶菊种植地，每年种植大量的甜叶菊。

甜菊糖苷是多种结构相似的二萜类化合物。常温下呈白色粉末状，极易溶于水、乙醇。具有很好的稳定性。目前是继蔗糖、甜菜糖外的“世界第三糖原”。同时其甜度高 (约为蔗糖的150～300倍)、热量低(约为蔗糖的1/300)。针对高血压、糖尿病、肥胖病等病患者具有一定的辅助治疗作用。且未发现其具有任何毒性和副作用。目前欧盟委员会已经允许甜菊糖为食品添加剂。甜菊糖已经广泛应用于食品饮料、医药等行业。

当前广泛应用的甜菊糖苷有甜菊苷(STV)和莱包迪苷A(RA)也是甜菊叶成分最高的组分。虽然STV和RA具有相当高的甜度，但是其口感上存在一定的后苦味。有研究表明莱包迪苷D(RD)和莱包迪苷M(RM)具有更好的口感，同时添加一定比例的莱包迪苷D和莱包迪苷M可以很好的改善STV和RA的后苦味和风味。

专利CN 107404919 A日本守田化学工业株式会社提供一种甜味剂组合物，在RA中添加一定比例的RD和RM作为活性成分。最终得到甜味品质接近食用糖的优良的天然甜味剂。专利CN 109219355 A可口可乐公司使用莱包迪苷M改善甜味剂，使得甜味剂属性更接近于蔗糖甜味。

综上所述，使用莱包迪苷D和莱包迪苷M作为甜味调节剂已经被广泛的验证。但是从甜菊糖母液中分离纯化莱包迪苷D和莱包迪苷M的技术仍然不成熟，造成甜菊糖作为甜味剂的局限性。

目前国际上主要还是针对STV和RA等组分的分离纯化方法的研究。我国大部分甜菊苷生产企业也只是利用大孔吸附树脂初步的提取STV和RA。然而吸附后甜菊糖母液糖(提取STV和RA后的母液糖)中含有莱包迪苷D和莱包迪苷M。目前并没有很好处理方法，往往将母液糖直接当废弃物排掉。这就造成的资源的极大浪费，同时也造成的环境的污染。

针对以上情况有研究者对RD和RM的分离做了一定的工作。专利CN 103709215 B一种从甜菊糖结晶母液糖中提取莱包迪苷D的方法，通过一次结晶，固液分离得到50％左右的RD产品。专利CN 102060892 B甜菊糖苷RD的提纯方法使用大孔吸附树脂吸附分离RD，可得到纯度40％以上的RD产品，后续需要通过精制可得到纯度95％的RD 产品。专利CN102796152 A制取高Reb-D甜菊糖苷的方法，使用多柱二次树脂串联吸附提纯甜菊糖苷，其中使用到预处理、脱盐、吸附、解吸附、脱色、离子交换、纳滤、结晶等工艺最终得到高纯度的莱包迪苷D产品，其中莱包迪苷纯度80％以上。专利 CN108864222A一种高纯度甜菊糖苷RD和RM的制备方法，使用非极性吸附树脂Super 200-X19对甜菊糖母液处理，分离纯化得到RD和RM产品。

以上的研究方法都存在一定的局限性：1、重结晶的方法需使用大量的有机溶剂，且过程繁琐，能耗较大不利于工业放大；2、大孔吸附树脂只能得到相对纯度的莱包迪苷 D和莱包迪苷M产品，同时里面还含有其他甜菊糖苷成分，同时多柱串联对产地、设备需求过大，一次投入高；3、RA、STV、RD、RM结构相似，单一非极性吸附树脂色谱分离技术很难做到高纯度单一分离。

针对以上局限性，本发明提出一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法。本发明公开了以吸附材料为固定相，甜菊糖母液为上样液，乙醇水溶液为解吸附液体，对甜菊糖母液中的莱包迪苷D和莱包迪苷M进行有效的分离纯化。该方法工艺过程简单，分离效率高、工艺废液低。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法。

发明思路：甜叶菊中含有莱包迪苷A(RA)和莱包迪苷D(RD)、莱包迪苷M(RM)，其结构式如下，从结构式中看，其结构都是中心相同核心外端多羟基结构，所以对于 RA/RD/RM单一分离很难。同时RD/RM在甜叶菊中含量本身就很少，大约0.3％～0.8％ (RA成分含量超过20％)所以大部分提取RA基本都含有其他成分。而RD/RM的价值比RA更高，因此，需要开发一种分离RD/RM的工艺。本发明采用特定的酰胺键，提供特定的吸附位点，以提到对RD/RM的吸附作用，从而提高RD/RM的分离效果。本发明实现的是单一组分分离，尤其对于RD/RM组分，最终得到的是不含有RA产品。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D(RD)和莱包迪苷M(RM)的方法，将甜菊糖母液上样到含有固相吸附材料的色谱分离柱中，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液合并，用紫外检测器检测样品中莱包迪苷D和莱包迪苷M的含量，蒸发结晶，即得莱包迪苷D和莱包迪苷M的混合物。

其中，所述的固相吸附材料是以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架结构，苯乙烯-二乙烯苯共聚物的末端带有由酰胺、伯胺、叔胺、和季胺组合的基团。

优选地，酰胺键、伯胺键、叔胺键和季胺键的摩尔比为1:2:2:1；所述的酰胺键、伯胺键、叔胺键和季胺键总量与干燥固相吸附材料的摩尔质量不小于10mmol/g。

其中，所述的酰胺键能够为RD/RM提供特定的吸附位点(酰胺碱能够提供配位点，与RD/RM有特定的配位作用)，以增加对RD/RM吸附作用；伯胺可以比季胺和叔胺更强的氢键作用，提供更大的作用力。此处作用力的提高使得高浓度的洗脱液称为可能，从而能够提高回收利用率，保护环境。

其中，所述的固相吸附材料的粒径为5～30μm，比较面积为400～1000m²/g，孔径为80～1000A，孔容为0.6～1.2cm³/g；本发明采用小粒径的固定相材料，且粒径均一，可使得吸附速率和解析速率更快，更利于后期工业化。

其中，所述的色谱分离柱的制备方法为将以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架结构的作为固相吸附材料，采用湿法装柱，制备得到苯乙烯-二乙烯苯共聚物的色谱分离柱；所述的湿法装柱为将固相吸附材料分散于30～70vt％(优选50vt％)乙醇水溶液中，超声振荡以分散均匀(对超声频率没有具体的要求，仅需分散均匀即可)；将分散均匀的固相吸附材料湿法装柱(将100mL固定相置于柱筒，剩余部分使用水补满，确保里面不会产生气泡，装柱压力20～40bar，优选25bar，装柱时间5～10min，优选5min)，用 40～60vt％乙醇水溶液冲压色谱分离柱(冲压1～3个柱体积)，再用超纯水冲洗色谱分离柱至无醇味，即得；其中，40～60vt％乙醇水溶液的用量为1～3柱床体积，即100～300mL。

其中，所述的甜菊糖母液为经过大孔吸附树脂吸附甜菊苷和莱包迪苷A等一代糖后的残液；所述的甜菊糖母液中莱包迪苷D和莱包迪苷M的总质量分数低于3％；所述的甜菊糖母液中还含有杂质甜菊苷(STV)、莱包迪苷A(RA)、莱包迪苷C(RC)一代糖还有色素，母液溶剂是水。

其中，甜菊糖母液的上样流速为0.2～5BV/min(优选0.3BV/min)。

其中，所述的洗脱液为有机相与水相按照50/50～90/10v/v的混合液；其中，所述的有机相为乙腈、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的任意一种或几种组合。洗脱液中有机相的含量较高，能够有利于回收从而再利用，同时也降低了水相(即废液)，有利于环保。

其中，所述的洗脱为等度洗脱或梯度洗脱。

其中，所述的等度洗脱中，洗脱液的流速为0.2～5BV/min(优选0.3BV/min)，收集解吸附液的时间为15～20min，即当实验为DA50柱子，柱床100mL固定相，柱高5cm，流速为30mL/min，则解吸附液收集时间为12～20min(优选15～20min)。

其中，所述的梯度洗脱如表1所示，洗脱液的流速为0.2～5BV/min，收集解吸附液的时间为15～20min；其中，“→”表示线性变化。

表1

时间/min	有机相(vt％)	水相(vt％)
			0-5	50→70	50→30
5-10	70	30
			10-15	70→80	30→20
15-20	80	20
			20-25	80→90	20→10
25-35	90	10

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、通过该方法可得到纯度为95％以上的RD和RM产品，单RD/RM纯度最高可达99.5％以上。

2、吸附材料为表面带有酰胺、伯胺、叔胺、季胺官能团，可与甜菊糖苷表面羟基形成氢键作用，增大吸附能力和吸附量，同时针对RA、STV、RD、RM结构中羟基数量和分子量不同，洗脱时间不同进行分离纯化。

3、本发明对设备要求不高，可以工业化生产，同时流动相体系简单，环保，便于回收。

4、本发明操作简单，工艺路线简洁合理，工艺周期短。

5、本发明的孔道结构正是通过对RA/RD/RM结构及分子大小规律的掌握，特定的孔道结构才能进行特定的分离纯化。

附图说明

图1为RA、STV、RC、RD、RM标准品分离色谱图。

图2为甜菊糖母液分离色谱图。

图3为RD/RM产品液相色谱图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。分子量：STV:804；RA:966；RC:577；RD:1128；RM:1290。

以下实施例中莱包迪苷D和莱包迪苷M的检测方法为：

色谱柱：Ryoung NH2柱4.6*250mm 10nm 5μm；

流动相：A：乙腈B：水；

A/B＝70/30

检测波长：UV@205nm

柱温：40℃

流速：1mL/min

进样量：20μL

其中，RA、STV、RC、RD、RM标准品分离色谱图见图1。

实施例1

(1)色谱分离柱制备：将固相吸附材料100mL分散于200mL 30vt％乙醇水溶液中，超声震荡15min。将分散好的的固相吸附材料湿法装柱(将100mL固定相置于柱筒，剩余部分使用水补满，确保里面不会产生气泡，装柱压力5bar，装柱时间5min。)，并用50vt％的乙醇水溶液冲压色谱分离柱，冲压3柱体积时，停止冲压。使用超纯水冲洗色谱分离柱至冲洗液体无醇味。所述的吸附材料为骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，末端带有酰胺键、伯胺、叔胺、季胺功能基团(酰胺、伯胺、叔胺、季胺的摩尔比为1：2：2：1)的固体颗粒物；粒径为10微米、比表面积800m²/g、孔径200A、孔容0.8cm³/g。

(2)样品上样：将甜菊糖母液进行连续上样，流速为30mL/min。所述的甜菊糖母液为经过大孔吸附树脂吸附STV和RA等一代糖后的残液，其中，RD和RM 的含量不超过3％；其中，甜菊糖母液为来自甜菊糖叶子乙醇浸提后使用大孔树脂提取一代糖后残液结晶物。

(3)解吸附：取80/20v/v的乙醇水溶液作为流动相对色谱分离柱进行等度解吸附，洗脱速率为0.3BV/min；分段收集解吸附液体(15～20min解吸附液体为莱包迪苷D和莱包迪苷M)，并用紫外检测器检测纯度，解吸附过程中样品的色谱图如图2所示。

(4)蒸发结晶：将收集的解吸附液体合并蒸发结晶，样品纯度为95％，加标回收率100％，收率为96.5％，所得产品的液相色谱图如图3所示。

步骤(2)中，甜菊糖母液的制备方法如下：

1、浸提：将甜叶菊干叶粉碎大于16目，加入浸提罐，再加入水搅拌；甜叶菊干叶质量/水质量＝1：3；加入纤维素酶(酶活为15000U/g)15U/g甜叶菊干叶，搅拌浸提 60min，浸提温度为常温；三次浸提后合并浸提液，然后加入絮凝剂聚丙烯酸钠1g，絮凝30min，过滤得过滤液；其中，酶活定义为1小时生成1微摩尔葡萄糖算1个酶活单位。

2、大孔树脂吸附：将过滤液经过大孔吸附树脂(型号AB-8)，然后用水解吸附(流速0.3BV/min)，控制解吸附温度收集60～80摄氏度解吸附液，提取一代糖；其余用乙醇全部解吸附结晶后为提取一代糖后残液结晶物。

实施例2

(1)色谱分离柱制备：将固相吸附材料100mL分散于200mL 30vt％乙醇水溶液中，超声震荡15min。将分散好的的固相吸附材料湿法装柱(将100mL固定相置于柱筒，剩余部分使用水补满，确保里面不会产生气泡，装柱压力5bar，装柱时间5min。)，并用50vt％的乙醇水溶液冲压色谱分离柱，冲压3柱体积时，停止冲压。使用超纯水冲洗色谱分离柱至冲洗液体无醇味。所述的吸附材料为骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，末端带有酰胺键、伯胺、叔胺、季胺功能基团的固体颗粒物(酰胺、伯胺、叔胺、季胺的摩尔比为1：2：2： 1)。粒径为50微米、比表面积600m²/g。孔径200A，孔容0.8cm³/g。

(2)样品上样：将甜菊糖母液进行连续上样，流速为30mL/min。所述的甜菊糖母液为经过大孔吸附树脂吸附STV和RA等一代糖后的残液，其中，RD和RM 的含量不超过3％。

(3)解吸附：取乙醇水溶液作为流动相对色谱分离柱进行解吸附，解析流速为1mL/min。梯度如表1所示下，收集解吸附液体(15～20min解吸附液体为莱包迪苷D和莱包迪苷M)，并用紫外检测器检测纯度。

(4)蒸发结晶：将收集的解吸附液体合并蒸发结晶，样品纯度为99.5％，加标回收率102％，收率为97.2％。

表1

实施例3

(1)色谱分离柱制备：将固相吸附材料100mL分散于200mL30vt％乙醇水溶液中，超声震荡15min。将分散好的的固相吸附材料湿法装柱(将100mL固定相置于柱筒，剩余部分使用水补满，确保里面不会产生气泡，装柱压力5bar，装柱时间5min。)，并用50vt％的乙醇水溶液冲压色谱分离柱，冲压3柱体积时，停止冲压。使用超纯水冲洗色谱分离柱至冲洗液体无醇味。所述的吸附材料为骨架结构为苯乙烯-二乙烯苯共聚物，末端带有酰胺键、伯胺、叔胺、季胺功能基团的固体颗粒物(酰胺、伯胺、叔胺、季胺的摩尔比为1：2：2： 1)。粒径为100微米、比表面积400m²/g。孔径500A，孔容1.0cm³/g。

(3)解吸附：取85/15的乙醇水溶液作为流动相对色谱分离柱进行等度解吸附，分段收集解吸附液体(12-17min解吸附液体为莱包迪苷D和莱包迪苷M)，并用紫外检测器检测纯度。

(4)蒸发结晶：将收集的解吸附液体合并蒸发结晶，样品纯度为98％，收率为95.2％。

实施例4：

同实施例3，将步骤(3)中的85/15v/v的乙醇水溶液更改为70/30v/v的乙醇水溶液；

步骤(4)：结晶后，样品的纯度为98.6％。

本发明提供了一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.一种从甜菊糖母液中提取莱包迪苷D和莱包迪苷M的方法，其特征在于，将甜菊糖母液上样到含有固相吸附材料的色谱分离柱中，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液合并，蒸发结晶，即得莱包迪苷D和莱包迪苷M的混合物；

其中，所述的固相吸附材料是以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架结构，苯乙烯-二乙烯苯共聚物的末端带有由酰胺、伯胺、叔胺、和季胺组合的基团；

其中，所述的固相吸附材料的粒径为5~30 μm，比较面积为400~1000 m²/g，孔径为80~1000 A，孔容为0.6~1.2 cm³/g；

其中，所述的洗脱液为有机相与水相按照50/50~90/10 v/v的混合液；其中，所述的有机溶剂为乙腈、乙酸乙酯、甲醇和乙醇中的任意一种或几种组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甜菊糖母液中莱包迪苷D和莱包迪苷M的总质量分数低于3%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，甜菊糖母液的上样流速为0.2~5 BV/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗脱为等度洗脱或梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的等度洗脱中，洗脱液的流速为0.2~5BV/min，收集解吸附液的时间为12~20 min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的梯度洗脱如下所示，洗脱液的流速为0.2~5 BV/min，收集解吸附液的时间为15~20 min；

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