CN104098734B - 苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法及其在莱鲍迪苷a和甜菊苷分离中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于分离莱鲍迪苷A和甜菊苷的苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法，其主要内容包括：(1)树脂预处理。将羧基树脂在有机溶剂中静置溶胀；(2)树脂活化。加入活化试剂1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基丁二酰亚胺，进行活化；(3)配基偶联。加入3‑氨基苯硼酸溶液，恒温反应6～24h；(4)修饰树脂的后处理。反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基修饰大孔树脂。本发明的有益效果：将制备得到的苯硼酸基修饰大孔树脂装填色谱柱，分离得到的莱鲍迪苷A的纯度到达90％以上，莱鲍迪苷A的回收率达到70％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种大孔树脂的制备方法及应用，具体地说，是指一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法及其在莱鲍迪苷A和甜菊苷分离中的应用。
背景技术
大孔树脂是一类聚合物基材的吸附分离材料，由聚合单体、交联剂、引发剂、致孔剂和其他助剂等经聚合反应制备而成。大孔树脂具有理化性质稳定，机械强度高，抗污染能力强，再生简便、解吸条件温和等特点，在水溶液和非水溶液中都能使用，使用周期较长、宜于构成闭路循环、节省费用。近年来，大孔树脂在植物组织和发酵液中的活性成分的提取、分离、纯化、浓缩等方面的应用日益广泛。
甜菊糖苷是富含于菊科植物甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni)茎叶中的一组甜味物质，其主要成分为莱鲍迪苷A和甜菊苷，约占甜菊糖苷的90％[参见：胡献丽等.食品研究与开发，2005，26(1)：36-38]。甜菊糖苷安全无毒、理化性质稳定，是一类高甜度、低热值的甜味剂。
大孔树脂技术广泛用于甜菊糖苷的提取纯化[参见：陈振斌等.应用化工，2011，6(40)：945-951]。不过，由于大孔树脂的吸附选择性较差，同时各种甜菊糖苷的结构和理化性质较为接近，造成大孔树脂对各种甜菊糖苷的区分度不够，较难实现单一成分的分离。各种甜菊糖苷中，莱鲍迪苷A甜度最高，口感最接近蔗糖，其他甜菊糖苷尤其是甜菊苷具有明显的后苦味，若不进行分离纯化，对产品品质会造成影响。重结晶法是目前莱鲍迪苷A纯化广泛采用的方法，但该方法具有耗时、工艺复杂、有机溶剂残留等不足。
公开号为CN 1192447A的中国专利公开了采用吸附树脂的弱选择性分离莱鲍迪苷A的方法。由于吸附选择性较弱，经吸附作用后的溶液中莱鲍迪苷A的纯度仍无法达到高纯度，需要借助重结晶方法才能达到高纯度。研究表明，将大孔树脂进行功能基团修饰可提高其吸附选择性[参见：Liu，et al.J Agric Food Chem，2012，60，1555-1566]。硼酸类亲和色谱材料具有富集、提取、分离含有顺式二羟基结构的各类生物分子(如糖类、糖蛋白、核苷酸等)的能力，原因在于硼酸基团可以同顺式二羟基发生可逆的共价相互作用[公开号CN 1939568A]。莱鲍迪苷A和甜菊苷分子上的葡萄糖基团可与硼酸基发生可逆的共价相互作用，利用这一性质，制备苯硼酸基团修饰大孔树脂，将有望提升大孔树脂对莱鲍迪苷A和甜菊苷的吸附选择性，实现莱鲍迪苷A的分离纯化。
发明内容
要解决的技术问题：
本发明提供一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法。该方法操作简单，重现性好，适于工业化生产。
本发明还提供了一种对莱鲍迪苷A和甜菊苷具有选择性吸附能力，并且可以用于这两种化合物柱色谱分离的苯硼酸基团修饰大孔树脂。
技术方案：
一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法，包括如下步骤：
(1)树脂预处理：以羧酸基团含量为4～12mmol/g的丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物或甲基丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物为原料树脂，在15～40℃下，于甲醇或乙醇中静置溶胀24h；所述原料树脂的粒径范围为0.09～1.25mm，孔径为2～65nm。
(2)树脂活化：将50～150mmol/L的活化试剂溶液与原料树脂以4～25mL/g比例混合，在5～80℃下反应2～6h，滤出树脂，待用；所述活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，两者物质的量之比为1∶1～2，以甲醇或乙醇为溶剂配制活化试剂溶液；
(3)配基偶联：将20～120mmol/L的3-氨基苯硼酸溶液与活化的树脂以2～20mL/g比例混合，在15～80℃下反应6～24h；
(4)后处理：反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基团修饰大孔树脂。
本发明基于苯硼酸团与葡萄糖基识别作用的苯硼酸基团修饰大孔树脂可用于柱色谱分离莱鲍迪苷A和甜菊苷。
采用本发明苯硼酸基团修饰大孔树脂分离莱鲍迪苷A和甜菊苷的方法一般为：
(1)将经过精制处理的甜菊糖苷加水溶解，过滤，配制成水溶液；
(2)将本发明苯硼酸基团修饰大孔树脂填充到色谱柱中，吸附柱的径长比为1∶4～1∶100；
(3)将甜菊糖苷水溶液加载于色谱柱顶端，按柱体积的1％～5％加入；
(4)采用2～5BV(柱体积)纯水以0.15～1.0BV/h的流速洗脱，分别收集莱鲍迪苷A和甜菊苷的洗脱峰。
有益效果：
本发明提供的苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法，工艺简便，重现性好，苯硼酸基团修饰大孔树脂对莱鲍迪苷A和甜菊苷具有选择性吸附能力，利用柱色谱即可实现莱鲍迪苷A和甜菊苷的分离，流动相为纯水，具有经济、环保的特点。经柱色谱分离得到的莱鲍迪苷A的纯度可达90％以上，回收率70％以上。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明做更详细的描述，但所述实施例不构成对本发明的限制。
实施例1
采用羧酸基团含量为4.7mmol/g的甲基丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物为原料树脂，25℃下，在甲醇中静置溶胀24h后将树脂滤出；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺按照物质的量之比1∶1，以甲醇为溶剂，配制成50mmol/L的活化试剂溶液。将活化试剂溶液与原料树脂按照20mL/g的比例混合，在40℃下反应2h，滤出树脂，待用；将20mmol/L的3-氨基苯硼酸溶液与活化的树脂以20mL/g比例混合，在60℃下反应24h；反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基团修饰大孔树脂。苯硼酸基团修饰大孔树脂中苯硼酸基团的含量约为310μmol/g。
应用例1
将经过精制处理的甜菊糖苷加水溶解，过滤，配制成400mg/mL的水溶液；将实施例1制得的苯硼酸基团修饰大孔树脂填充到色谱柱中，吸附柱的径长比为1∶80；将甜菊糖苷水溶液加载于色谱柱顶端，按柱体积的1％加入；柱温25℃，采用2BV的纯水以0.25BV/h的流速洗脱，分别收集莱鲍迪苷A和甜菊苷的洗脱峰，分离得到的莱鲍迪苷A和甜菊苷的纯度分别为90.1％和86.4％，两者的回收率分别为76.1％和81.2％。
实施例2
采用羧酸基团含量为9.5mmol/g的丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物为原料树脂，25℃下，在乙醇中静置溶胀24h后将树脂滤出；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺按照物质的量之比1∶2，以乙醇为溶剂，配制成100mmol/L的活化试剂溶液。将活化试剂溶液与原料树脂按照10mL/g的比例混合，在40℃下反应2h，滤出树脂，待用；将40mmol/L的3-氨基苯硼酸溶液与活化的树脂以5mL/g比例混合，在50℃下反应24h；反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基团修饰大孔树脂。苯硼酸基团修饰大孔树脂中苯硼酸基团的含量约为140μmol/g。
应用例2
将经过精制处理的甜菊糖苷加水溶解，过滤，配制成400mg/mL的水溶液；将实施例2制得的苯硼酸基团修饰大孔树脂填充到色谱柱中，吸附柱的径长比为1∶80；将甜菊糖苷水溶液加载于色谱柱顶端，按柱体积的1％加入；柱温25℃，采用3BV的纯水以0.15BV/h的流速洗脱，分离得到的莱鲍迪苷A和甜菊苷的纯度分别为96.3％和96.0％，两者的回收率分别为86.1％和89.9％。
实施例3
采用羧酸基团含量为12mmol/g的丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物为原料树脂，25℃下，在甲醇中静置溶胀24h后将树脂滤出；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺按照物质的量之比1∶2，以甲醇为溶剂，配制成80mmol/L的活化试剂溶液。将活化试剂溶液与原料树脂按照15mL/g的比例混合，在30℃下反应2h，滤出树脂，待用；将100mmol/L的3-氨基苯硼酸溶液与活化的树脂以3mL/g比例混合，在60℃下反应12h；反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基团修饰大孔树脂。苯硼酸基团修饰大孔树脂中苯硼酸基团的含量约为230μmol/g。
应用例3
将经过精制处理的甜菊糖苷加水溶解，过滤，配制成400mg/mL的水溶液；将实施例2制得的苯硼酸基团修饰大孔树脂填充到色谱柱中，吸附柱的径长比为1∶80；将甜菊糖苷水溶液加载于色谱柱顶端，按柱体积的2％加入；柱温25℃，采用3BV的纯水以0.15BV/h的流速洗脱，分离得到的莱鲍迪苷A和甜菊苷的纯度分别为90.4％和91.2％，两者的回收率分别为71.8％和68.5％。
Claims (4)
1.一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)树脂预处理：以带有羧酸基团的大孔树脂为原料树脂，在15～40℃下，于甲醇或乙醇中静置溶胀24h；所述的原料树脂为丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物或甲基丙烯酸-二乙烯基苯大孔共聚物，羧酸基团含量为4～12mmol/g，粒径范围为0.09～1.25mm，孔径为2～65nm；
(2)树脂活化：将50～150mmol/L的活化试剂溶液与原料树脂以4～25mL/g比例混合，在5～80℃下反应2～6h，滤出树脂，待用；
(3)配基偶联：采用3-氨基苯硼酸作为苯硼酸基团修饰大孔树脂的配基，将20～120mmol/L的3-氨基苯硼酸溶液与活化树脂以2～20mL/g比例混合，在15～80℃下反应6～24h；
(4)后处理：反应结束后，过滤，依次用丙酮、去离子水洗涤，得到苯硼酸基团修饰大孔树脂。
2.根据权利要求1所述的一种苯硼酸基团修饰大孔树脂的制备方法，其特征在于：所述的活化试剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，两者物质的量之比为1∶1～2，以甲醇或乙醇为溶剂配制的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法制备的苯硼酸基团修饰大孔树脂在莱鲍迪苷A和甜菊苷分离中的应用，其特征在于：适用于水溶液中莱鲍迪苷A和甜菊苷的分离，按以下步骤操作：
(1)将经过精制处理的甜菊糖苷加水溶解，过滤，配制成水溶液；
(2)将所述的苯硼酸基团修饰大孔树脂填充到色谱柱中，吸附柱的径长比为1∶4～1∶100；
(3)将甜菊糖苷水溶液加载于色谱柱顶端，按柱体积(BV)的1％～5％加入；
(4)采用2～5BV纯水以0.15～1.0BV/h的流速洗脱，分别收集莱鲍迪苷A和甜菊苷的洗脱峰。
4.根据权利要求3所述的苯硼酸基团修饰大孔树脂在莱鲍迪苷A和甜菊苷分离中的应用，其特征在于：经分离得到的莱鲍迪苷A的纯度达到90％以上，莱鲍迪苷A的回收率达到70％以上。
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