CN114031694B - 一种三七多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药有效成分提取领域，具体涉及一种三七多糖的提取方法。所述提取方法简单高效，三七水提物经过硼酸功能化树脂，先用碱性水溶液洗脱、再用酸性水溶液洗脱，收集酸性水溶液后利用溶液酸性进行水解，得到特定分子量的三七多糖，整体过程得到了较高产率和纯度。进一步地，本发明特定分子量范围的三七多糖提取物，相对于未经水解的三七多糖，具有更好的降血糖活性。

Description

一种三七多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及中药有效成分提取领域，具体涉及一种三七多糖的提取方法。
背景技术
多糖为三七中的主要活性物质之一，在多个产地的三七中，三七中多糖的含量大约在10%左右。多糖易溶于热水，难溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。利用此性质，常采用水提醇沉法提取多糖。但水提醇沉法提取得到的物质常含有大量的蛋白质、色素等杂质，需要进一步使用大孔树脂或离子交换树脂进行进一步纯化，而且使用大孔树脂或离子交换树脂纯化时，往往存在回收率和纯度无法同时保证的情况发生。
中国专利申请CN106749731A公开了一种小分子三七多糖提取物的制备方法，该方法以三七为原料，原料粉碎后乙醇溶液提取后所得药渣用水提取得三七粗多糖提取液，乙醇沉淀，沉淀水溶后加三氟乙酸或溶菌酶水解得小分子多糖粗液；小分子多糖粗液经阴阳离子交换柱去除蛋白质、色素等后活性炭粉末脱色、钛棒过滤器过滤得到无色低粘性小分子多糖溶液，浓缩、冷冻干燥制得小分子三七多糖提取物。所述方法需要多次过柱纯化，操作相对复杂，损失较大。
中国专利申请CN109354629A公开了一种中性三七多糖的提取纯化方法及应用，以三七废渣为原料，采用水提醇沉法，得到三七粗多糖，使用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及透析法纯化三七粗多糖，得到中性三七多糖PNPS I及酸性三七多糖PNPS II、PNPS III、PNPS IV、PNPS V洗脱液，冷冻干燥得到5个样品。发现只有酸性三七多糖PNPS I对7种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用。
中国专利申请CN110105459A公开了一种三七多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：A)、提取：取三七块状药材，加入乙醇，倒入湿式微粉机中进行粉碎收集滤液；B)、离心：将收集的滤液通过离心机进行分离；C)、真空浓缩，制得提取液；D)、精制；将得到提取液中加入纯化水溶解，然后加入三氟甲磺酸，得到多糖粗提液；E)、层析：将多糖粗提液加入阳离子树脂，用纯化水进行洗涤，并合并制得洗脱液；F)、提纯：G)、浓缩：三七多糖溶液先减压倒入正丁醇中搅拌后静置，分层后制得三七多糖结晶沉淀物；H)、通过真空干燥制得三七多糖。
发明内容
本发明的目的是提供一种三七多糖的提取方法，所述方法步骤简单，提取率高，且提取得到的三七多糖具有较好的降血糖功效。
一方面，本发明提供一种三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1：将三七粉碎后，经溶剂脱脂，过滤，得滤渣A；
S2：将滤渣A使用水提取，得提取液B；
S3：将提取液B使用硼酸功能化树脂进行吸附、过滤，得树脂C；
S4：将树脂C加入到硼酸功能化树脂为填料的层析柱上层，先后使用碱性水溶液、水和酸性水溶液洗脱，收集酸性洗脱液。
S5：将S4得到的酸性洗脱液加热回流，后减压蒸馏移除溶剂，干燥，即得所述三七多糖。
进一步地，S1中，所述所述溶剂选自石油醚或正丁醇，优选为正丁醇。
进一步地，S1中，按重量份数计，所述溶剂用量为三七的4-8倍，脱脂温度为60-80℃，脱脂时间为1-3h。
进一步地，S2中，按重量份数计，所述水的用量为三七的6-10倍，提取温度为80-100℃，提取时间为1-2h。
进一步地，S3中，所述硼酸功能化树脂中，硼酸的含量为1-1.5 mmol/g，粒径为100-200目。
进一步地，S3中，按重量份数计，所述硼酸功能化树脂的用量为三七的10-20%。
进一步地，S3中，所述吸附是将硼酸功能化树脂加入到提取液B中，使用无机碱调节反应体系pH=8-9，在20-30℃下，吸附2-3h。
进一步地，S4中，所述层析柱中，填料径高比为1：5-8，按重量份数计，填料用量为S3中硼酸功能化树脂的3-5倍。
进一步地，S4中，所述层析柱中，硼酸功能化树脂中硼酸的含量为1-1.5 mmol/g，粒径为100-200目。
进一步地，S4中，所述层析柱中，硼酸功能化树脂和S3中使用的硼酸功能化树脂具有相同的硼酸含量和粒径。
进一步地，S4中，所述碱性水溶液为pH=8-9的氢氧化钠水溶液，用量为2-4柱体积。
进一步地，S4中，水的用量为1-2柱体积。
进一步地，S4中，所述酸性水溶液为pH=3-4的三氟乙酸水溶液，用量为4-6柱体积。
进一步地，S5中，加热回流至反应体系中的多糖重均分子量为5000-10000时，停止回流。
进一步地，所述硼酸功能化树脂是使用氯甲基化树脂和对氨基苯硼酸在碱性条件下反应得到。
进一步地，所述硼酸功能化树脂的制备方法，包括以下步骤：
SS1：将氯甲基聚苯乙烯树脂、对氨基苯硼酸加入有机溶剂中，加入无机碱和I-进行反应。
SS2：检测反应体系中对氨基本硼酸的含量不再变化，停止反应，将反应体系调节pH至酸性，过滤，水洗，干燥，即得所述硼酸功能化树脂。
进一步地，SS1中，所述氯甲基聚苯乙烯树脂中，氯甲基负载量为1-1.5mmol/g，粒径为100-200目。
进一步地，SS1中，所述有机溶剂选自DMF、DMAc或DMSO中的至少一种。
进一步地，SS1中，按摩尔量计，所述对氨基苯硼酸的用量为氯甲基聚苯乙烯树脂中氯甲基负载量的1-1.2倍。
进一步地，SS1中，按摩尔量计，所述无机碱选自NaOH、LiOH、KOH中至少一种，用量为氯甲基聚苯乙烯树脂中氯甲基负载量的3-5倍。
进一步地，SS1中，按摩尔量计，所述I-来源为NaI或KI中的至少一种，用量为氯甲基聚苯乙烯树脂中氯甲基负载量的0.05-0.1倍。
进一步地，SS2中，所述调节pH是将反应体系调节至pH=5-6。
另一方面，本发明提供一种所述提取方法提取得到的三七多糖的应用，所述应用为在制备降血糖的产品中的应用。
本发明的优势在于：
1. 本发明使用的提取方法简单高效，三七水提物经过硼酸功能化树脂，先用碱性水溶液洗脱、再用酸性水溶液洗脱，收集酸性水溶液后利用溶液酸性进行水解，得到特定分子量的三七多糖，整体过程得到了较高产率和纯度。
2. 本发明特定分子量范围的三七多糖提取物，相对于未经水解的三七多糖，具有更好的降血糖活性。
具体实施方式
本发明多糖含量检测方法参考苯酚-硫酸比色法。
本发明中重均分子量使用GPC（凝胶色谱法）进行测定。
本发明使用的氯甲基化树脂通过商业化途径购得，CAS号:55844-94-5。
本发明使用的三七药材产自云南，多糖含量约7%。
制备例1
硼酸功能化树脂的制备
取氯甲基化树脂（氯甲基负载量为1.2 mmol/g，粒径100-200目）10g，对氨基苯硼酸13 mmol，NaOH 45 mmol和NaI 0.8 mmol加入到DMF 300 mL中，搅拌反应，HPLC监测反应，发现对氨基苯硼酸余量为1.5mmol时，反应体系不再变化，此时停止反应，使用盐酸调节反应体系pH=5.5，过滤，水洗，干燥即得所述硼酸功能化树脂，树脂增重约1.15g，和理论值相符。
制备例2
硼酸功能化树脂的制备
取氯甲基化树脂（氯甲基负载量为1.2 mmol/g，粒径100-200目）10g，对氨基苯硼酸13 mmol和NaOH 45 mmol加入到DMF 300 mL中，搅拌反应，HPLC监测反应，发现对氨基苯硼酸余量为5.3 mmol时，反应体系不再变化，此时停止反应，使用盐酸调节反应体系pH=5.5，过滤，水洗，干燥即得所述硼酸功能化树脂，树脂增重约0.75 g，此时推测树脂上硼酸含量约为0.7 mmol/g。
发明人发现，I-的存在一定程度上影响着硼酸功能化的进程，在常规条件下，I-可促进硼酸功能化反应。
实施例1
一种三七多糖的制备方法
S1：取100 g三七粉碎，加入石油醚600 g，搅拌下升温至60℃，保温3 h后降温至室温，过滤，得滤渣A；
S2：将滤渣A使用水1000 g在80℃提取1 h，后降至室温，过滤，得提取液B；
S3：将提取液B使用氢氧化钠调节pH至8，使用制备例1得到的硼酸功能化树脂20 g在25℃下搅拌吸附2 h，过滤，得树脂C；
S4：取制备例1得到的硼酸功能化树脂为填料，径高比为1:5，填料量为80 g的层析柱，将树脂C加入所述层析柱上层，使用pH=8.5的氢氧化钠水溶液洗脱3柱体积，再用水洗脱1柱体积，最后用pH=3的三氟乙酸水溶液洗脱5柱体积，收集三氟乙酸洗脱液。
S5：将S4得到的三氟乙酸洗脱液加热回流，检测反应体系中多糖重均分子量为5.3x103时，停止回流，后减压蒸馏移除溶剂，干燥，得固体 5.6 g，多糖含量81.3%。
发明人发现，使用石油醚作为脱脂溶剂，无法去除多糖和其他类型物质的缀合物，使最终产物中会含有黄酮、皂苷类物质，多糖含量较低。
实施例2
一种三七多糖的制备方法
S1：取100 g三七粉碎，加入正丁醇400 g，搅拌下升温至80℃，保温1 h后降温至室温，过滤，得滤渣A；
S2：将滤渣A使用水800 g在100℃提取1 h，后降至室温，过滤，得提取液B；
S3：将提取液B使用氢氧化钠调节pH至9，使用制备例1得到的硼酸功能化树脂15 g在25℃下搅拌吸附3 h，过滤，得树脂C；
S4：取制备例1得到的硼酸功能化树脂为填料，径高比为1:8，填料量为50 g的层析柱，将树脂C加入所述层析柱上层，使用pH=8的氢氧化钠水溶液洗脱3柱体积，再用水洗脱1柱体积，最后用pH=4的三氟乙酸水溶液洗脱4柱体积，收集三氟乙酸洗脱液。
S5：将S4得到的三氟乙酸洗脱液加热回流，检测反应体系中多糖重均分子量为7.2x103时，停止回流，后减压蒸馏移除溶剂，干燥，得固体 5.9 g，多糖含量95.5%。
发明人发现，使用正丁醇作为脱脂溶剂，最终得到的多糖含量较高。
实施例3
一种三七多糖的制备方法
S1：取100 g三七粉碎，加入正丁醇400 g，搅拌下升温至80℃，保温2 h后降温至室温，过滤，得滤渣A；
S2：将滤渣A使用水600 g在100℃提取2 h，后降至室温，过滤，得提取液B；
S3：将提取液B使用氢氧化钠调节pH至8，使用制备例1得到的硼酸功能化树脂10 g在25℃下搅拌吸附3 h，过滤，得树脂C；
S4：取制备例1得到的硼酸功能化树脂为填料，径高比为1:5，填料量为50 g的层析柱，将树脂C加入所述层析柱上层，使用pH=8的氢氧化钠水溶液洗脱2柱体积，再用水洗脱1柱体积，最后用pH=3的三氟乙酸水溶液洗脱4柱体积，收集三氟乙酸洗脱液。
S5：将S4得到的三氟乙酸洗脱液加热回流，检测反应体系中多糖重均分子量为9.6x103时，停止回流，后减压蒸馏移除溶剂，干燥，得固体 5.1 g，多糖含量93.9%。
实施例4
和实施例2的区别仅在于使用制备例2得到的硼酸功能化树脂，得固体4.3g，多糖含量92.3%。
对比例1
使用中国专利申请CN106749731A中实施例3的方法制备得到的小分子三七多糖。
对比例2
和实施例2的区别在于，直接将S3中的树脂C作为层析柱填料进行洗脱。
对比例3
和实施例2的区别在于，不使用碱性水溶液洗脱。
对比例4
和实施例2的区别在于，S5水解至多糖重均分子量为2.8x103。
效果例-降血糖功效实验
实验动物：ICR雄性小鼠，18-22g
动物模型：四氧嘧啶诱导的糖尿病模型
造模方法：适应性饲养3天，后禁食不禁水饲养12小时，尾静脉注射新鲜配制的四氧嘧啶生理盐水溶液(剂量 80mg/kg)，正常饲养三天后禁食不禁水12小时，用血糖仪测定血糖值，血糖值≥ 11.1mmol/L，并出现多饮、多尿症状的小鼠为造模成功的糖尿病模型小鼠。
给药次数与计量：空白对照组和模型组每天同一时间灌胃蒸馏水；其他各实验组每天同一时间灌胃给药，按生药量5g/kg.BW给药，给药周期14天。
实验结果见表1。
表1 各实验组血糖变化情况（mmol/L，n=10只）
组别 给药第0天 给药第7天 给药第14天
空白对照组 3.12±0.35*** 3.56±0.51*** 3.93±0.58***
模型组 23.18±4.75 25.52±3.34 29.36±4.21
实施例1 22.35±4.27 15.68±4.31** 10.66±5.56**
实施例2 24.15±5.81 12.43±4.48** 7.89±2.91**
对比例1 23.82±6.14 19.01±6.53*# 14.63±5.57**#
对比例2 25.32±5.17 17.89±5.49*# 13.21±6.64**#
对比例3 24.66±5.29 16.93±6.18*# 12.26±5.99**#
对比例4 24.28±6.65 20.18±5.24*# 17.32±7.66*#
与模型组相比***P＜0.001；**P＜0.01；*P＜0.05
与实施例2相比##P＜0.01；#P＜0.05
可以看到，本申请制备得到的特定分子量的三七多糖在四氧嘧啶诱导的糖尿病模型中可以取得较好的降血糖效果，不合适的纯化方法虽然也可以得到部分三七多糖，但由于其中还有较多的其他物质，可能抑制本申请三七多糖的降血糖效果，导致效果较差。而进一步发明人验证了，在本发明方案中，较小分子量的三七多糖也无法取得较好的降血糖效果。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
S1：将三七粉碎后，经溶剂脱脂，过滤，得滤渣A；S2：将滤渣A使用水提取，得提取液B；
S3：将提取液B使用硼酸功能化树脂进行吸附、过滤，得树脂C；
S4：将树脂C加入到硼酸功能化树脂为填料的层析柱上层，先后使用碱性水溶液、水和酸性水溶液洗脱，收集酸性洗脱液；
S5：将S4得到的酸性洗脱液加热回流，后减压蒸馏移除溶剂，干燥，即得所述三七多糖；
S1中，所述溶剂选自正丁醇；
S3中，所述硼酸功能化树脂中，硼酸的含量为1-1.5 mmol/g；S3中，所述吸附是将硼酸功能化树脂加入到提取液B中，使用无机碱调节反应体系pH=8-9，在20-30℃下，吸附2-3h；
S4中，所述层析柱中，按重量份数计，填料用量为S3中硼酸功能化树脂的3-5倍；所述碱性水溶液为pH=8-9的氢氧化钠水溶液；所述酸性水溶液为pH=3-4的三氟乙酸水溶液；S4中，所述层析柱中，填料径高比为1：5-8；
S5中，加热回流至反应体系中的多糖重均分子量为5000-10000时，停止回流；
其中，所述硼酸功能化树脂的制备方法，包括以下步骤：
SS1：将氯甲基聚苯乙烯树脂、对氨基苯硼酸加入有机溶剂中，加入无机碱和I-进行反应；
SS2：检测反应体系中对氨基苯 硼酸的含量不再变化，停止反应，将反应体系调节pH至酸性，过滤，水洗，干燥，即得所述硼酸功能化树脂；
SS1中，所述有机溶剂选自DMF、DMAc或DMSO中的至少一种；
SS1中，按摩尔量计，所述对氨基苯硼酸的用量为氯甲基聚苯乙烯树脂中氯甲基负载量的1-1.2倍；
SS1中，按摩尔量计，所述无机碱选自NaOH、LiOH、KOH中至少一种，用量为氯甲基聚苯乙烯树脂中氯甲基负载量的3-5倍。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S1中，所述溶剂用量为三七的4-8倍，脱脂温度为60-80℃，脱脂时间为1-3h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中，按重量份数计，所述水的用量为三七的6-10倍，提取温度为80-100℃，提取时间为1-2h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中，所述硼酸功能化树脂的粒径为100-200目；按重量份数计，所述硼酸功能化树脂的用量为三七的10-20%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述碱性水溶液用量为2-4柱体积；水的用量为1-2柱体积；所述酸性水溶液用量为4-6柱体积。
6.一种如权利要求1-5任一项所述制备方法得到的三七多糖的应用，所述应用为在制备降血糖的产品中的应用。
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