CN110669186B - 一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于天然产物的分级纯化领域，具体涉及一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物的及其制备方法和用途；本发明运用链转移技术将温敏嵌段和苯硼酸嵌段聚合，得到一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，所得到的嵌段聚合物具有识别邻二羟基和温敏功能；本发明将两亲性温敏嵌段聚合物与含有邻二羟基的多糖结合，通过调节不同的温度，使不同分子量的多糖聚集沉淀，实现对多糖的分级纯化。本发明运用的控温沉淀不同级分多糖的方法与目前通用的方法相比更加绿色环保，并且各多糖样品的结构和活性均未受到破坏。

Description

一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于天然产物的分级纯化技术领域，具体涉及一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物的及其制备方法和用途。
背景技术
多糖由于低毒性和高特异性激活免疫系统已在食品和制药工业中得到广泛研究，研究表明，多糖具有许多生物活性，如抗氧化，抗肿瘤，抗病毒，抗糖尿病，抗炎，以及免疫调节和保肝。多糖的生物活性通常与其化学和物理性质密切相关，包括糖苷键，官能团，单糖组成和分子量(Mw)等特征，特别是多糖的分子量对多糖的活性具有显着影响。
多糖分级纯化的目的是获得具有不同分子量的多糖，主要的分级纯化方法包括乙醇沉淀、凝胶渗透色谱、离子交换色谱和膜分离。乙醇分级沉淀是一种简单有效的提取物初始纯化方法，然而，该方法的主要问题是程序耗时且产品纯度低。凝胶渗透色谱法是一种高效的纯化方法，但是设备昂贵和操作复杂限制了其大规模应用。离子交换色谱法耗费大量时间和大量有机溶剂。膜透析方法方便，收率高，但粗多糖的粘度相对较高，不经过进一步处理，膜多糖容易被粗多糖污染。因此，开发一种简单，绿色和有效的粗多糖分级纯化方法是非常有意义的。
发明内容
本发明的目的在于克服目前多糖的分级沉淀方法中的一些不足，提供一种带有苯硼酸嵌段的温敏聚合物及其制备方法，使得聚合物与含有邻二羟基的多糖结合，通过调节不同的温度，使不同分子量的多糖聚集沉淀，实现对多糖的分级纯化。
为达到上述技术目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明合成了一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，运用链转移技术将温敏嵌段和苯硼酸嵌段聚合，嵌段聚合物具有识别邻二羟基和温敏功能，所述聚合物的化学式为PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105，b表示PEG113、PVBA和PNIPAM之间以嵌段聚合的方式结合，所述聚合物结构式为：
Figure BDA0002201586690000021
本发明还提供所述嵌段聚合物的制备方法，包括：
苄基三硫代碳酸酯(BTPA)的制备：
将3-巯基丙酸(MPA)(5.00mL)加入KOH(1.84mol/L，65.00mL)水溶液中，CS2(3.65mL)缓慢滴入上述混合溶液中，然后在圆底烧瓶中进行反应，并在室温下浸入油浴中5小时，同时，在1小时内逐滴加入苄基溴(10.00g)。油浴反应后，将反应物升温至85.0℃并通过冷凝回流12小时。然后加入氯仿(80.00mL)稀释溶液，再向反应溶液中加入大量浓盐酸直至上相澄清。此外，将下相浓缩成橙色油状液体并用去离子水洗涤，最后过滤分离溶液，得到黄色粉末样品。
PEG大分子链的制备：
使用聚乙二醇单甲醚(PEG113-OH)和BTPA之间的酯化反应获得PEG大分子链。
首先，将10.00g PEG113-OH和1.60g BTPA溶解在50.00mL二氯甲烷中，然后将混合物倒入反应容器中。再将催化剂0.8mmol 4-二甲氨基吡啶和除水剂9.7mmol N,N'-二环己基碳酰亚胺溶解在20mL二氯甲烷中，在冰水浴中冷却至0℃。
其次，将溶有催化剂和除水剂的溶液缓慢滴入上述反应容器中，并在室温下反应48小时，过滤除去不溶性盐，滤液在旋转蒸发器上浓缩，然后加入过量的冷乙醚以沉淀固体。
最后，重复上述溶解-沉淀步骤循环，将得到的沉淀物在室温下真空干燥，得到PEG大分子链，为浅黄色粉末。
PEG113-b-PNIPAM105的制备：
通过对PEG大分子链转移剂的改性合成两亲性嵌段共聚物，包括：
将N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环装入配有磁力搅拌的反应容器中；除去反应容器中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应；反应完成后，将溶液在冰箱中冷冻，用过量的乙醚除去杂质，得到浅黄色粉末，即为PEG113-b-PNIPAM105，其中b代表PEG大分子链与PNIPAM以嵌段聚合的方式结合在一起。
其中，所述N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为7-8mmol：0.04-0.06mmol：10-14μmol：1-3g；
所述油浴反应的温度为70-80℃，反应时间为1-2小时。
温敏三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备：
将4-乙烯基苯硼酸置于干燥的备有磁力搅拌棒的反应容器中，再加入PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环；将反应容器中空气排出，同时注入氮气；搅拌反应；反应后，将溶液冷却至室温，在冰箱中冷冻半小时，用乙醚沉淀出产物；重复上述步骤，最终得到白色粉末为聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105。
其中，所述的4-乙烯基苯硼酸、PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为1-1.2mmol：1-1.4g：10-14μmol：1-3g；
所述搅拌反应的温度为60-80.0℃；
所述搅拌反应的时间为15-25小时。
本发明还提供一种多糖的分级沉淀方法，包括：
多糖样品的预处理：去除多糖中的蛋白质，沉淀并冻干备用；
控温沉淀多糖：
将待分级沉淀的含多糖样品溶解在PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物溶液中，控制不同的沉淀温度，使多糖沉淀，得到沉淀和上清液，收集沉淀并分离沉淀中的多糖和两亲性温敏嵌段聚合物，将产物冻干，不同沉淀温度下得到不同分子量级别的多糖。
其中，所述控温沉淀温度高于聚合物与不同分子量级别多糖结合的临界溶解温度(LCST)。
本发明中，多糖的沉淀可以选择逐级沉淀不同分子量级别的多糖，也可以选择直接沉淀目标分子量级别的多糖。
在本发明的一个实施例中，控制沉淀温度为28.0-40℃时，在不同沉淀温度下得到不同分子量的多糖。
在本发明的一个实施例中，具体的，逐级沉淀的方法包括：
首先，将待分级沉淀的含多糖样品溶解在浓度为0.8-1.2％(优选的，为1％)的PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物溶液中，调节pH值为7-10(优选的，pH值为8.0)，升温使得沉淀温度为28.0℃时，一部分多糖沉淀，得到沉淀和上清液，收集沉淀并转移到另一个容器中，此时的沉淀中包含多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物。然后分离多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物，具体步骤包括：
加入一定量的由Na2HPO4和KH2PO4配制的PBS缓冲溶液，在25.0℃下调节溶液的pH值为3-6，优选的，pH值为4.0，再升高温度至60.0℃时，温敏聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105在底部沉淀，离心分离收集温敏聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105再利用，同时用乙醇沉淀上清液中的多糖，用冷冻干燥机将产物冻干24小时，得到第一级别多糖。
将上述得到的上清液控温使得沉淀温度至32.0℃时，进一步得到沉淀和上清液，收集沉淀并按照上述沉淀中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到第二级别多糖；
进一步，将得到的上清液继续控温使得沉淀温度为36.0℃时，再次得到沉淀和上清液，收集沉淀并按照上述沉淀中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到第三级别多糖；
进一步，将得到的上清液继续控温使得沉淀温度为40.0℃时，再次得到沉淀和上清液，收集沉淀并按照上述沉淀中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到第四级别多糖。
本发明中，直接沉淀目标分子量多糖的方法包括：将冻干的多糖溶解在所述的PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物溶液中，直接控制温度为28.0-40℃，使多糖沉淀，得到沉淀和上清液，收集沉淀并分离沉淀中的多糖和两亲性温敏嵌段聚合物，将产物冻干，得到目标分子量级别的多糖。
本发明的有益效果如下：
本发明选择温敏嵌段和苯硼酸嵌段聚合制备聚合物，硼酸可以通过可逆的环状硼酸酯键在碱性水溶液中结合含邻二羟基的化合物，并且目标生物分子可以在酸性介质中产生硼酸酯键的解离。这种硼酸的独特性质使其成为分离科学中硼酸盐亲和材料快速发展的主要驱动力。硼酸亲和材料在引入硼酸官能团方面具有几个显着优势，如广谱选择性，可逆共价结合，pH控制捕获/释放，快速缔合/解吸动力学，以及与质谱法的良好兼容性。硼酸被嵌入聚合物中，可以实现功能聚合物和超分子结构之间更先进的分子识别。温敏聚合物经历热诱导的可逆相变，它们在低温下可溶于溶剂(水)，但随着温度升高到其临界溶解温度(LCST)而变得不溶。为了提高聚合物的分离选择性，必须将苯硼酸基团引入温敏聚合物结构中。重要的是，即使在高于LCST的温度下，苯硼酸基团也应该对溶液保持亲和性能，使得多糖分子可以与聚集的聚合物牢固结合。
本发明利用可逆加成-断裂链转移聚合链转移技术合成的三嵌段聚合物具有多种响应性，既能对温度做出响应，也能特异性识别邻二羟基类化合物。
在本发明中，开发了一种新的粗多糖分级纯化方法。本发明研究了多糖的分级纯化条件，以及多糖的分子结构与其沉淀行为之间的关系。使用可逆加成-断裂链转移聚合机理合成三嵌段共聚物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105，其作为硼酸标记的热响应聚合物可通过温度控制分离目标物多糖。本发明的聚合物将多糖的分级与纯化同时进行，相比于其它方法，得到的多糖分子量分散系数更接近于1。
本发明运用的控温沉淀不同级分多糖的方法与目前通用的方法相比更加绿色环保。
本发明对得到的各级分多糖样品进行了刚果红，红外测试，还应用于自由基清除实验和细胞实验，结果表明各多糖样品的结构和活性均未受到破坏，验证了该方法的可靠性。
附图说明
图1是实施例1所制备的聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的合成原理图；图中，步骤a是BTPA的合成过程，b是PEG大分子链的合成过程，c是二嵌段PEG113-b-PNIPAM105的合成过程，d是三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的合成过程。
图2是实施例1所制备的BTPA(a)、PEG大分子链(b)、PEG113-b-PNIPAM105(c)和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105(d)的1H NMR图。
图3是实施例1所制备的聚合物PEG113-b-PNIPAM105(I)、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105(II)GPC洗脱曲线。
图4是实施例1所制备的聚合物PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的红外光谱图。
图5是实施例1所制备的聚合物PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105及苯硼酸的紫外光谱图。
图6是聚合物PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105以及PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与不同分子量的葡聚糖的复合物的LCST数据。
图7是实施例3中聚合物PEG113-b-PNIPAM105(I)、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105(II)、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105和葡聚糖40000的复合物(III)在10℃，20℃，30℃和40℃的状态。
图8是实施例4中接有苯硼酸嵌段的聚合物与多糖分子上邻二羟基反应的原理图。
图9是实施例4在多糖沉淀分级过程中聚合物浓度对多糖分离率的影响。
图10是实施例4在多糖沉淀分级过程中聚合物与多糖结合时体系pH对多糖分离率的影响。
图11是实施例4在多糖沉淀分级过程中聚合物与多糖解离时体系pH对多糖分离率的影响。
图12是实施例4在多糖沉淀分级过程中聚合物与多糖的结合时间对多糖分离率的影响。
图13是实施例4在多糖沉淀分级过程中聚合物与多糖的解离时间对多糖分离率的影响。
图14是PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105对多糖的特异性吸附结果。
图15是实施例5中4种级别多糖的红外谱图。
图16是实施例6中4种级别多糖的GPC洗脱曲线。
图17是实施例8中4种级别多糖的刚果红实验结果。
图18是实施例9中4种级别多糖对DPPH自由基(a)和羟自由基(b)的清除率。
图19是实施例9中4种级别多糖对HepG2的抑制率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图说明对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：温敏性聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备
使用可逆加成-断裂链转移聚合机理合成三嵌段共聚物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105。首先合成PEG大分子链，然后将PNIPAM嵌段和BA嵌段依次添加到聚合物中，详细的合成流程图如图1，图中a是BTPA的合成过程，b是PEG大分子链的合成过程，c是PEG113-b-PNIPAM105的制备过程，d是PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备过程。具体步骤如下：
(1)苄基三硫代碳酸酯(BTPA)的制备：
Figure BDA0002201586690000061
将5.00mL的3-巯基丙酸(MPA，28.65mmol)加入65.00mL的KOH(1.84mol/L)水溶液中，再将3.65mL的CS2缓慢滴入上述混合溶液中；然后在圆底烧瓶中进行反应，并在室温下浸入油浴中5小时，同时，在1小时内逐滴加入苄基溴(10.00g，28.65mmol)；由于反应后将反应物升温至85.0℃并通过冷凝回流12小时。反应后加入氯仿(80.00mL)稀释溶液，然后向反应溶液中加入大量浓盐酸直至上相澄清。此外，将下相浓缩成橙色油状液体并用去离子水洗涤，最后过滤分离溶液，得到黄色粉末样品。
(2)PEG大分子链的制备：
Figure BDA0002201586690000062
使用PEG113-OH和BTPA之间的酯化反应获得PEG大分子链。
首先，将10g PEG113-OH和1.6g BTPA溶解在50mL二氯甲烷中，然后将混合物倒入250mL圆底烧瓶中。再将0.8mmol催化剂4-二甲氨基吡啶和9.7mmol除水剂N,N'-二环己基碳酰亚胺溶解在20mL二氯甲烷中，在冰水浴中冷却至0℃。
其次，将溶液缓慢滴入圆底烧瓶中，并在室温下反应48小时，过滤除去不溶性盐，滤液在旋转蒸发器上浓缩，然后加入过量的冷乙醚以沉淀固体。最后，重复上述溶解-沉淀循环三次，将沉淀物在室温下真空干燥，得到PEG大分子链，为浅黄色粉末。
(3)PEG113-b-PNIPAM105的制备：
Figure BDA0002201586690000071
通过对PEG大分子链转移剂的改性合成两亲性嵌段共聚物，包括：将8.00mmol(0.91g)N-异丙基丙烯酰胺、0.05mmol(0.28g)PEG大分子链、12.00μmol(2mg)偶氮二异丁腈和2g的1,4-二氧六环装入配有磁力搅拌的圆底烧瓶中；从体系中除去空气，溶液在氮气保护下75℃油浴反应1.5小时。反应完成后，将溶液在冰箱中冷冻，用过量的乙醚除去杂质，得到浅黄色粉末。
(4)温敏三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备
Figure BDA0002201586690000072
将1.16mmol(0.14g)4-乙烯基苯硼酸置于干燥的备有磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，再加入1.2g PEG113-b-PNIPAM105、12.00μmol偶氮二异丁腈和2g 1,4-二氧六环。将圆底烧瓶与带有三通阀的冷凝管连接，气球连接到三通阀的顶部，从体系中排出空气，并注入氮气，将反应在70.0℃下搅拌20小时。反应后，将溶液冷却至室温，在冰箱中冷冻半小时，用乙醚沉淀出产物。上述溶解-沉淀循环重复三次。最终得到白色粉末为聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105。如图2所示为本实施例所制备的BTPA(a)、PEG大分子链(b)、PEG113-b-PNIPAM105(c)和PEG113-b-PNIPAM105-b-PBA49(d)的1H NMR图，图中可得：
BTPA：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.33(5H,ArH),4.64(2H,ArCH2-),3.65(2H,-CH2COOH),2.87(2H,-C(＝S)SCH2)。图中可见，7.33处的峰是苯环上氢原子的峰，苯环与硫之间的氢原子出峰位置在4.64，靠近氧的氢原子出峰位置为3.65，靠近硫的氢原子出峰位置为2.87。
PEG113大分子链：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.29(5H,ArH),4.62(2H,ArCH2-),4.27(2H,-CH2OCOCH2-),3.65(452H,-CH2CH2O-),3.39(3H,CH3O-),2.82(2H,-CH2OCOCH2CH2SC-(＝S)-)。与BTPA相比主要多了PEG中氢原子的峰，出峰位置是3.65，峰面积为452。
PEG113-b-PNIPAM105：Mn＝12.493KDa,Mw/Mn＝1.331；可见，二嵌段的数均分子量为12.493KDa,分子分散系数为1.331，说明二嵌段纯度较高。
PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105：Mn＝14.948KDa,Mw/Mn＝1.250。可见，三嵌段的数均分子量为14.948KDa,分子分散系数为1.250，说明三嵌段纯度较高。
图3是PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的GPC图，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的出峰时间明显比PEG113-b-PNIPAM105的出峰时间短，说明PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的分子量更大，与图2、图4、图5共同证明PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105被成功合成。
对得到的聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105进行傅里叶变换红外光谱图(FTIR，图4)和紫外可见吸收光谱(图5)分析：
傅里叶变换红外光谱(FT-IR)用于研究分子的振动和不同原子之间的极性键，并表征聚合物的结构。将聚合物样品和光谱级溴化钾粉末一起研磨，然后压成1mm薄片，在4000-500cm-1内进行FT-IR光谱测量。
PEG113-b-PNIPAM105的红外光谱分析如下：2975.3-2871.9cm-1处的峰是由于C-H拉伸和弯曲振动。在约1639.2cm-1和1544.3cm-1的区域中的强吸收带是由酰胺基团引起的。主链中C＝O键的吸收峰与酰胺基的峰重叠，因此在1639.2cm-1处出现强吸收峰。1365.1cm-1处的弱吸收带归属于亚甲基，1112.4cm-1处的峰归因于C-C键，669.7cm-1处的特征吸收带归因于苯环上的氢。合成三嵌段共聚物PEG113-b-PNIPAM105-b-PBA49后，在3310.4cm-1处检测到苯硼酸的羟基吸收带，这表明三嵌段共聚物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105成功合成。此外，从图5中，BA在水中的特征吸收带在220nm和250nm，这在PEG113-b-PNIPAM105中基本上不存在，引入BA后，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105表现出相似的BA吸收带。
实施例2：温敏性聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备
苄基三硫代碳酸酯(BTPA)和PEG大分子链的制备步骤同实施例1中的步骤(1)和步骤(2)。然后包括如下步骤：
PEG113-b-PNIPAM105的制备：通过对PEG大分子链转移剂的改性合成两亲性嵌段共聚物，包括：
将N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环装入配有磁力搅拌的反应容器中；除去反应容器中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应；反应完成后，将溶液在冰箱中冷冻，用过量的乙醚除去杂质，得到浅黄色粉末，即为PEG113-b-PNIPAM105，其中b代表PEG大分子链与PNIPAM以嵌段聚合的方式结合在一起。
其中，所述N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为7mmol：0.04mmol：10μmol：1g；
所述油浴反应的温度为70℃，反应时间为2小时。
温敏三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备：
将4-乙烯基苯硼酸置于干燥的备有磁力搅拌棒的反应容器中，再加入PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环；将反应容器中空气排出，同时注入氮气；搅拌反应；反应后，将溶液冷却至室温，在冰箱中冷冻半小时，用乙醚沉淀出产物；重复上述步骤，最终得到白色粉末为聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105。
其中，所述的4-乙烯基苯硼酸、PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为1.0mmol：1.0g：10μmol：1g；
所述搅拌反应的温度为60℃；
所述搅拌反应的时间为25小时。
实施例3：温敏性聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备
苄基三硫代碳酸酯(BTPA)和PEG大分子链的制备步骤同实施例1中的步骤(1)和步骤(2)。然后包括如下步骤：
PEG113-b-PNIPAM105的制备：
通过对PEG大分子链转移剂的改性合成两亲性嵌段共聚物，包括：
将N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环装入配有磁力搅拌的反应容器中；除去反应容器中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应；反应完成后，将溶液在冰箱中冷冻，用过量的乙醚除去杂质，得到浅黄色粉末，即为PEG113-b-PNIPAM105，其中b代表PEG大分子链与PNIPAM以嵌段聚合的方式结合在一起。
其中，所述N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为8mmol：0.06mmol：14μmol：3g；
所述油浴反应的温度为80℃，反应时间为1小时。
温敏三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备：
将4-乙烯基苯硼酸置于干燥的备有磁力搅拌棒的反应容器中，再加入PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环；将反应容器中空气排出，同时注入氮气；搅拌反应；反应后，将溶液冷却至室温，在冰箱中冷冻半小时，用乙醚沉淀出产物；重复上述步骤，最终得到白色粉末为聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105。
其中，所述的4-乙烯基苯硼酸、PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为1.2mmol：1.4g：14μmol：3g；
所述搅拌反应的温度为80℃；
所述搅拌反应的时间为15小时。
实施例4：PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105-葡聚糖复合物的热响应性
温度响应性共聚物因其在分离和生物医学中的广泛应用而受到越来越多的关注。聚(N-异丙基丙烯酰胺)(聚NIPAM)是最著名的温度响应性聚合物，在纯水中具有较低的临界溶解温度(LCST)约32℃。此外，硼酸盐亲和材料是典型的pH响应材料之一，因为它能通过pH控制捕获/释放含顺式二醇的分子。含硼酸的热响应共聚物和共聚物与含顺式二醇的分子的复合物也可显示出温敏性能。
LCST或浊点(CP)是描述这些热响应共聚物性质的重要参数。LCST可定义为聚合物溶液的透射率降低1％的温度。
图6显示了3种聚合物PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105以及PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与不同分子量的葡聚糖的复合物(Mn＝6000、40000和100000，购买于安耐吉化学网)的热响应数据，在3种聚合物浓度为1.0mg/mL下测量这些热响应共聚物的水溶液，以获得波长为700nm的透光率。700nm处的光学吸收在发色团BA的吸收范围之外，并且可以用于研究LCST而不受可溶性聚合物的固有紫外吸收的干扰。
根据图6所示，PEG113-b-PNIPAM105，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105，以及PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与不同分子量葡聚糖的复合物(Mn＝6000,40000和100000)的低临界溶解温度分别为21.8℃，21.2℃，8.7℃，6.9℃和6.3℃。一方面，将BA引入聚合物中不会显着改变PEG113-b-PNIPAM105的热响应性。与纯PNIPAM的32℃相比，嵌段共聚物的LCST变化归因于亲水嵌段的存在，其促进了水与PNIPAM嵌段之间的氢键。另一方面，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105和葡聚糖形成的复合物的LCST随着葡聚糖分子量的增加而降低。换句话说，可以通过温度控制分级沉淀首先沉淀高分子量的葡聚糖。
这些温度响应性共聚(PEG113-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105、PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105和分子量为40000的葡聚糖形成的复合物)的相变在图7中更清楚地显示，随着温度的持续升高，这些温度响应性共聚物的水溶液越来越浑浊。这些共聚物的LCST越低，共聚物的混浊效果越明显。当温度高于30℃时，它们都形成明显的聚集体和沉淀。这种可见的相变是可逆的，并且可以通过重复的加热和冷却循环来观察。
实施例5：使用本发明制备得到的聚合物分级沉淀黄芪多糖
(1)多糖样品的预处理
将黄芪原料粉碎，粉末溶于300mL去离子水中，在80℃水浴中萃取5h，合并没有滤渣的样品溶液并通过旋转蒸发浓缩。然后加入三倍体积的乙醇并置于冰箱中过夜。使用离心机以3000R/min的速度运行10分钟获得沉淀物。将沉淀物用乙醇，丙酮和乙醚洗涤三次，然后将其溶解在热水中。Sevage方法用于去除蛋白质，用氯仿和正丁醇洗涤沉淀物直至水层和氯仿层之间没有变性蛋白质。将多糖再次用乙醇沉淀并用冷冻干燥机干燥，然后将其置于4.0℃的冰箱中备用。
(2)控温沉淀
首先，将冻干的黄芪多糖溶解在浓度为1％的PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物溶液中，调节pH值为8.0，升温使得沉淀温度为28.0℃时，一部分多糖沉淀，得到沉淀1和上清液1，收集沉淀1并转移到另一个容器中，此时的沉淀1中包含多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物。然后分离多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物，具体步骤包括：
加入一定量的由Na2HPO4和KH2PO4配制的PBS缓冲溶液，在25.0℃下调节溶液的pH值为4.0，再升高温度至60.0℃时，温敏聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105在底部沉淀，离心分离收集温敏聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105再利用，同时用乙醇沉淀上清液中的多糖，用冷冻干燥机将产物冻干24小时，得到浅黄色黄芪多糖，记为APS1。
将上述得到的上清液1控温使得沉淀温度至32.0℃时，得到沉淀2和上清液2，收集沉淀并按照沉淀1中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到的黄芪多糖记为APS2；
将得到的上清液2继续控温使得沉淀温度为36.0℃时，得到沉淀3和上清液3，收集沉淀并按照沉淀1中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到的黄芪多糖记为APS3；
将得到的上清液3继续控温使得沉淀温度为40.0℃时，得到沉淀4和上清液4，收集沉淀并按照沉淀1中多糖和PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物的分离步骤进行，得到的黄芪多糖记为APS4。
使用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
本实施例中，也可以选择直接沉淀目标分子量多糖的方法包括：将冻干的多糖溶解在所述的PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105聚合物溶液中，直接控制温度为32.0℃(或直接控温至28.0℃、36.0℃或40℃)，使多糖沉淀，得到沉淀和上清液，收集沉淀并分离沉淀中的多糖和两亲性温敏嵌段聚合物，将产物冻干，得到目标分子量的多糖APS2(或得到APS1、APS3、APS4)。
实施例6：使用本发明制备得到的聚合物分级沉淀多糖
硼酸盐亲和材料的分子相互作用原理依赖于硼酸配体和含邻二羟基的化合物之间的可逆共价反应。通过pH和温度的切换，多糖的捕获/释放过程的示意图如图8所示。当体系的pH大于PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的pKa值时，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的硼酸以四方硼酸根阴离子(sp3)的形式存在，并且它可以与多糖反应并形成五元或六元环酯。加入多糖后，通过加热溶液使PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105和多糖的复合物从溶液中沉淀出来。然后，将样品温度降低至低温。当体系溶液的pH值变为酸性时，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与多糖的复合物解离，因为在这样的pH条件下，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的硼酸呈现为三角构型(sp2)，sp2形式的硼酸和多糖之间的结合通常非常有限。
PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与不同分子量的多糖的复合物具有不同的LCST，不同的沉淀温度可沉淀出不同分子量的多糖。本实施例选择28℃，32℃，36℃和40℃作为沉淀温度。为了获得PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105分级沉淀的最佳结果，讨论了PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的浓度、体系pH(组合pH和解离pH)以及形成PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105与多糖复合物的时间和解离时间。
(1)聚合物浓度对多糖分离率的影响
在图9中显示了PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105浓度对多糖分离率的影响。随着PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105浓度的增加，多糖的分离率呈先上升后下降的趋势，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的浓度为1％达到最大分离率。当PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的浓度为0.8％时，多糖的分离率最小，为3.12％。原因可能是随着聚合物的加入硼酸基团增加，因此能在体系中捕获更多的多糖，导致多糖的分离率增加。然而，通过继续增加PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的浓度引起链聚集，多糖的分离率降低。
(2)系统pH对多糖分离率的影响
PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105可以共价结合多糖的顺式二醇结构并在中性碱性水性介质中产生环酯，而在酸性条件下，硼酸酯键可以被水解。本实施例中讨论了碱性条件的pH值在7-10时和酸性条件的pH值在3-6时的情况，结果显示在图10和图11中。形成和水解环酯的最佳pH分别为8和4。
(3)时间对多糖分离率的影响
当形成环酯的时间为10分钟到30分钟时，多糖的分离率显着增加，原因可能是需要一定的时间硼酸分子与邻二羟基才能达到形成环酯的平衡。本实施例讨论了水解环酯的时间。随着解离时间的增加，多糖的分离率先增加后保持几乎不变。随着开始时释放时间的增加，大部分多糖已从聚合物中解离。如上所述，形成和水解环酯的最佳时间均为30分钟。
图14中可见，PEG113-b-PNIPAM105不能与多糖结合，PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105能与多糖结合。可证明是多糖的分离主要是利用苯硼酸(VBA)嵌段与多糖的共价结合作用。
实施例7：多糖的红外表征
红外光谱分析是鉴定植物多糖中特征有机基团的有力技术。如图15所示，用实施例5中得到的干燥的多糖和KBr颗粒制备薄膜，在4000-500cm-1的范围内测量APS的红外光谱。在3340.5cm-1和2923.7cm-1处的宽峰归因于O-H，C-H和-CH 2的伸缩振动。在1619.3cm-1处的拉伸峰表明存在C＝O。此外，在1398.5cm-1处的吸收峰表明存在糖醛酸。在1024.7cm-1附近的吸收峰归因于吡喃糖环的伸缩振动。综上，这些结果显示四种多糖显示出植物多糖的典型吸收峰。由于四个样品都是黄芪多糖，所以特征吸收峰相似。该实施例证明的本发明的沉淀纯化多糖的方法多多糖的结构是没有影响的。
实施例8：多糖样品的GPC分析
多糖是天然的高分子物质，多糖的纯产物是多糖组成的总称，其分子量均匀分布在一定范围内。凝胶渗透色谱(GPC)根据分子筛的原理，样品的分子量对应于其保留时间。对实施例6中得到的多糖的GPC的分析结果如表1所示。当样品的分子量较大时，保留时间较短。多糖分子具有微观的差异性，并且通过温度控制沉淀的每种黄芪多糖部分仍然是不同大小的多糖分子的混合物。
四种黄芪多糖组分的平均分子量差异较大，表明黄芪多糖是一种高分子量多糖聚合物，本发明采用的提取分离纯化方法未引起黄芪多糖明显降解。黄芪多糖的天然结构保持较好。
本发明所得到的多糖纯度可通过表1的Mw/Mn体现，Mw/Mn的值越靠近1说明纯度越高，现有的方法得到的多糖Mw/Mn一般在1.5-2之间。与乙醇分馏方法相比，本发明使用PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105分级沉淀多糖的方法可以产生具有更高纯度和更窄分子量分布的多糖产物。
表1.分级沉淀得到的多糖的GPC洗脱时间和相应的相对分子质量
Figure BDA0002201586690000131
Figure BDA0002201586690000141
实施例9：单糖组成分析
本领域研究人员普遍认为，单糖组成是决定杂多糖的物理化学性质和生物活性的最重要因素之一。通过与标准乙酰基衍生物的结果比较，确认所有样品中单糖的存在。本实施例中，选择7种单糖作为标准参考物质，毛细管柱加热后7种标准单糖糖腈衍生物的出峰顺序为D-核糖(7.648min)，L-鼠李糖(7.716min)，L-阿拉伯糖(7.898min)，D-木糖(8.048min)，D-甘露糖(10.462min)，葡萄糖(10.571min)和半乳糖(10.881min)，七个单糖峰分离良好，除D-核糖和L-鼠李糖的峰形有轻微叠加外，其他单糖均达到基线分离。
将一定量的多糖样品(50.00mg)和三氟乙酸(2.00mol/L，0.20mL)加入瓶中密封并在110.0℃的烘箱中水解6小时。反应完成后，将其取出并冷却至室温，加入碳酸钡粉末并过夜，然后将上清液转移至70.0℃的旋转蒸发器中干燥，将水解产物溶于5mL水中进行衍生化。
衍生化的具体步骤如下，将0.20mL多糖水解产物，20.00mg盐酸羟胺和1.00mL吡啶加入管中。涡旋混合后，将管放入水浴中，在90.0℃下加热30分钟。加入1.00mL乙酸酐，在90.0℃下继续反应30分钟。将样品溶液通过0.22μm膜过滤。标准单糖D-核糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，葡萄糖，半乳糖以相同方式衍生。然后通过气相色谱在具有SE-54毛细管柱(30m×0.32mm×0.5μm)的Agilent 7890A色谱仪上测定单糖的含量。色谱条件如下：高纯氮气流速为1mL/min，进样量为1.0μL，初始温度为50.0℃，色谱柱温度保持在100.0℃，然后以30.0℃/min的速度逐渐升高至300.0℃。
基于不同单糖的不同保留时间，各样品的单糖组成不同，具体的相对含量见表2。可以得出以下结论：APS1的主要成分为D-木糖和D-甘露糖。APS2具有更高的D-甘露糖含量，使其成为主要的单糖组分。APS3中最丰富的单糖也是D-甘露糖。然而，葡萄糖和D-甘露糖是APS4的主要成分。
表2.分级沉淀得到的多糖中含有的各组分单糖的相对含量％
Figure BDA0002201586690000142
Figure BDA0002201586690000151
实施例8：刚果红分析
多糖的三螺旋构象可以通过复合的多糖-CR在可见光谱中的最大吸收值的红移来鉴定。三螺旋构象在碱性环境中展开以形成单螺旋构象，其与刚果红形成复合物，并且最大吸收波长改变。在不同浓度的NaOH溶液中多糖-CR复合物的最大吸收的演变如图17所示。随着NaOH浓度从0.2-1.2mg/mL的增加，APS1-CR和APS3-CR复合物的最大吸收波长明显下降。当NaOH浓度高于0.6mg/mL时，APS-CR复合物的λmax逐渐降低，接近350nm。表明APS1和APS3存在三螺旋构象。随着NaOH浓度的增加，APS2-CR和APS4-CR复合物的最大吸收波长没有明显变化，这表明APS2和APS4中不存在三螺旋构象。一些多糖样品不能显示最大吸收波长急剧下降的原因可能是它们没有三螺旋链构象或多糖的三螺旋链构象是特异性的，以及糖链之间的氢键很强，使糖链难以断裂无法与刚果红形成复合物。该实施例很好的证明了本发明中的多糖沉淀纯化的方法没有破坏多糖的空间构象。
实施例9：多糖的生物活性
(1)DPPH自由基清除活性
DPPH自由基已被广泛用于评估天然化合物的清除能力。
使用1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)测量APS1、APS2、APS3及APS4的DPPH自由基清除活性，将1mL不同浓度的APS溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4mg/mL)加入到1.0mLDPPH-乙醇溶液(0.08mg/mL)中。充分摇动混合物并在室温下，黑暗中反应30分钟，然后在517nm下测量混合物溶液的吸光度。DPPH自由基的清除活性计算如下：
Figure BDA0002201586690000152
其中A0是没有样品的DPPH溶液的吸光度。Ai是APS样品中DPPH的吸光度，Aj是背景溶液(蒸馏水代替DPPH溶液)的吸光度。
黄芪多糖APS1，APS2，APS3和APS4对DPPH的清除作用见图18a。结果表明，随着黄芪多糖浓度的增加，黄芪多糖(APS1，APS2，APS3和APS4)的清除率逐渐增加。换句话说，黄芪多糖对DPPH自由基清除活性是浓度依赖性的。可以看出，高分子量多糖组分对DPPH的去除效果优于低分子量多糖。其他三个组分(APS2，APS3，APS4)的清除效果大致满足上述结论，APS2组分显示出细微差异。原因可能是多糖的抗氧化活性不仅与分子量有关，而且与每种组分的单糖组成和比例有关。
(2)羟自由基清除活性
羟自由基(·OH)是最活跃的氧自由基，它可以氧化各种生物大分子，如碳水化合物、核酸和脂类，由于其高反应性，严重危害了人体健康。因此，我们检测了APS的自由基去除能力。
反应液中含有0.5mL不同浓度(0.2、0.4、0.6、,0.8、1.0、1.2和1.4mg/mL)的APS样品溶液，0.5mL水杨酸乙醇溶液(10mmol/L)，0.5mL Fe2+(9.0mmol/L)溶液和1mL过氧化氢(6mmol/L)。将混合物在37℃下反应30分钟，并在510nm下测量混合物溶液的吸光度。羟自由基清除活性计算如下：
Figure BDA0002201586690000161
A3是阴性对照(无样品)的吸光度，A1是含有APS样品的样品混合物的吸光度，A2是背景溶液(蒸馏水代替H2O2)的吸光度。
该实验的具体研究结果如图18b所示。从羟自由基去除的实验数据可以看出，在Fenton体系中加入黄芪多糖APS1，APS2，APS3和APS4对羟自由基具有一定的清除作用。羟自由基的清除率与黄芪多糖的浓度呈正相关。APS1对羟基自由基具有较好的清除作用。该结论与DPPH清除实验的结论一致。
(3)抗癌活性
多糖的抗肿瘤活性在其物理性质，化学结构和空间构型方面差异很大，例如溶解度，一级结构和溶液构象(单螺旋，三螺旋和无规螺旋)。检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化物(MTT)还原成蓝紫色结晶甲瓒沉积在细胞中，而死细胞则没有此功能，MTT晶体形成的量与细胞数成比例。
将HepG2细胞(购买于生工生物工程(上海)股份有限公司)以每孔5×104个细胞的初始密度接种在96孔板中，在100μLDMEM完全培养基中培养24小时。然后，将细胞与各种浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mg/mL)的多糖样品一起培养。在CO2恒温培养箱中培养24小时后，向每孔中加入20μL 0.50mg/mL MTT试剂，并将细胞与5％CO2在37℃下培养4小时。移除每个孔中的培养基并用150μL二甲基亚砜(DMSO)代替，通过酶标仪在波长570nm处测量吸光度。多糖的抗肿瘤活性计算如下公式：
Figure BDA0002201586690000162
其中Am是多糖处理细胞的吸光度，An是对照组的吸光度。
四种黄芪多糖的抗肿瘤结果如图19所示。APS的抗癌活性与多糖浓度之间存在一定的相关性。APS1对HepG2细胞的抑制率最强，当多糖浓度为1.2mg/mL时，抑制率达到最高为61.29％，APS4对HepG2细胞的抑制率最弱。多糖浓度达到1.0mg/mL后，APS3对肿瘤细胞的抑制率显着增加。可能的原因是APS3具有三螺旋结构，并且三螺旋结构对癌细胞具有一定的抑制作用。基于上述描述其生物活性的结果，APS具有显着的抗HepG2细胞的抗肿瘤活性，高分子量黄芪多糖对体外肿瘤生长具有强烈的抑制作用。该实施例证明了本发明的多糖沉淀纯化方法保留了多糖的活性，从而说明该提取方法的可行性。

Claims (9)

1.一种基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，所述聚合物化学式为PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，所述聚合物的制备方法包括：
苄基三硫代碳酸酯BTPA的制备：
将3-巯基丙酸 MPA加入KOH水溶液中，滴加CS2进行反应，然后在油浴中反应，同时滴加苄基溴，油浴反应后升温并冷凝回流；向溶液中加入氯仿稀释溶液，再加入大量浓盐酸直至上相澄清，将下相浓缩成橙色油状液体并用去离子水洗涤，最后过滤分离溶液，得到黄色粉末样品；
PEG大分子链的制备：使用聚乙二醇单甲醚（PEG113-OH）和BTPA之间的酯化反应获得PEG大分子链；具体的，将PEG 113-OH 和 BTPA 溶于二氯甲烷中，以4-二甲氨基吡啶为催化剂、N,N'-二环己基碳酰亚胺为除水剂，在室温下反应，过滤得滤液，浓缩，然后加入过量的冷乙醚以沉淀固体；
重复上述溶解-沉淀步骤循环，将得到的沉淀物在室温下真空干燥，得到 PEG大分子链，为浅黄色粉末；
PEG113-b-PNIPAM105的制备：将N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环装入配有磁力搅拌的反应容器中；除去反应容器中的空气，溶液在氮气保护下油浴反应；反应完成后，将溶液在冰箱中冷冻，用过量的乙醚除去杂质，得到浅黄色粉末，即为PEG113-b-PNIPAM105，其中b代表PEG大分子链与PNIPAM以嵌段聚合的方式结合在一起；
温敏三嵌段PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105的制备：将4-乙烯基苯硼酸置于干燥的备有磁力搅拌棒的反应容器中，再加入PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环；将反应容器中空气排出，同时注入氮气；搅拌反应；反应后，将溶液冷却至室温，在冰箱中冷冻半小时，用乙醚沉淀出产物；重复上述步骤，最终得到白色粉末为聚合物PEG113-b-PVBA49-b-PNIPAM105 。
2.根据权利要求1所述的基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，其特征在于，所述N-异丙基丙烯酰胺、PEG大分子链、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为7-8mmol：0.04-0.06mmol：10-14μmol：1-3g；所述油浴反应的温度为70-80℃，反应时间为1-2小时。
3.根据权利要求1所述的基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，其特征在于，所述4-乙烯基苯硼酸、PEG113-b-PNIPAM105、偶氮二异丁腈和1,4-二氧六环的用量为1-1.2mmol：1-1.4g：10-14μmol：1-3g。
4.根据权利要求1所述的基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物，其特征在于，所述搅拌反应的温度为60-80.0℃；
所述搅拌反应的时间为15-25小时。
5.权利要求1所述的基于苯硼酸两亲性温敏嵌段聚合物在分级沉淀多糖中的用途。
6.一种分级沉淀多糖的方法，其特征在于，包括：
将待分级沉淀的含多糖样品溶解在权利要求1所述的两亲性温敏嵌段聚合物溶液中，控制不同的沉淀温度使多糖沉淀，收集沉淀并分离沉淀中的多糖和两亲性温敏嵌段聚合物，不同沉淀温度条件下得到不同分子量级别的多糖。
7.根据权利要求6所述的分级沉淀多糖的方法，其特征在于，包括一种分级沉淀黄芪多糖的方法，将待分级沉淀的含多糖样品溶解权利要求1所述的两亲性温敏嵌段聚合物溶液中，控制温度为28.0-40℃时，使多糖沉淀，得到沉淀和上清液，收集沉淀并分离沉淀中的多糖和两亲性温敏嵌段聚合物，将产物冻干，不同沉淀温度条件下得到不同分子量级别的多糖。
8.根据权利要求7所述的一种分级沉淀多糖的方法，其特征在于，所述两亲性温敏嵌段聚合物溶液的浓度为0.8-1.2％，pH为7-10。
9.根据权利要求8所述的一种分级沉淀多糖的方法，其特征在于，所述两亲性温敏嵌段聚合物溶液的浓度为1％，pH为8。
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