CN107162926B - 三七素的提取方法及其应用及三七氨基酸的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种三七素提取方法，以工业三七废渣为原料，提取三七素，在提取过程中采用薄层检测法验证得到的产物含有三七素的情况下，继续进行后续的纯化、结晶等后续步骤，纯化并进行薄层检测后，合并仅有一个斑点且与三七素对照品有相同Rf值对应的洗脱液并进行结晶。本发明另一方面还提供了一种三七氨基酸的提取方法，以工业三七废渣为原料，其过程步骤与上述三七素提取方法大致相同，不同之处在于，结晶时，合并的洗脱液与三七素对照品有相同的斑点且还有其他斑点。本发明进一步提供过来得到的三七素的应用，可用于制备牙膏、创可贴等具有需要止血功能的产品。本发明充分利用工业三七废渣，变废为宝，实现资源再利用，减少有效资源的浪费。

Description

三七素的提取方法及其应用及三七氨基酸的提取方法
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体地，本发明涉及三七废渣中三七素的提取方法；还涉及三七废渣中提取的三七素的应用。
背景技术
三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]是我国珍贵的药材。具有散瘀止血、消肿止痛的功效。道地产地是云南文山。三七有效成分包括皂苷、三七素、黄酮、聚炔醇、多糖、脂肪酸以及环肽类等。目前对三七有效成分的研究利用主要集中在皂苷成分。三七主产地云南文山的三七常年种植面积达到了12万亩左右，产量9000吨，每年用于提取三七皂苷的三七量约为1400吨，皂苷提取后，其他有效成分多被当作废渣废液弃去。
据统计，工业上，每年用于提取三七皂苷的三七约为1400吨，废渣约为400吨，测定工业三七废渣中三七素含量为0.72％，每年弃去的三七素近3吨。
公开号为CN1865232A的中国发明专利申请公开了从三七中提取三七素的方法，包括如下步骤：
(1)将三七用5-15倍的体积比为95％的乙醇溶液，醇提10-20h；再用2-10倍的体积比为95％的乙醇，醇提4-10h；
(2)合并两次醇提液，将残渣晾干，加入10-20倍量的水浸提，提取10-20h，再用2-10倍量的水浸提，提取4-10h，提取温度为室温；
(3)过滤，滤液浓缩，加入乙醇调节醇浓度为50-90％，搅拌，静置0.5-2h；
(4)过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；
(5)将(4)中合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的离子交换树脂柱，先用水冲洗，再用氨水溶液洗脱，氨水溶液浓度为0.05M-0.2M；
(6)将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，丙酮量为水溶液体积的10-50倍；
(7)将沉淀物过滤，重结晶，过滤后用丙酮洗至白色，得到纯度为99％以上的三七素。
以上现有技术中，采用正丁醇进行萃取，而正丁醇具有特殊气味，让人反胃；蒸汽可能引起困倦和眩晕；刺激呼吸系统和皮肤；而且在现有技术中，工业三七废渣并没有得到充分的利用，而是从三七中95％乙醇一去皂苷后，将废渣用于提取其中的三七素，而工业上三七中提取皂苷的方法过程与以上文件不同，产生的三七废渣也与之不同，采用以上方法不能保证能从工业三七废渣中得到三七素。
发明内容
为了克服以上现有技术中工业三七废渣没有得到充分利用的技术问题，本发明提供一种三七素的提取方法，该方法充分利用了工业三七废渣，并且能够保证最终从工业三七废渣中得到的有三七素。
为了达到以上目的，本发明采用如下技术方案：一种三七素的提取方法，包括以下步骤：
A、三七素的粗提：取工业三七废渣进行两次水浸提；收集并合并两次水浸提的滤液，并将合并后的滤液进行离心，取上清液进行浓缩得浓缩液；向浓缩液中加入乙醇，然后静置、抽滤，得滤液，并回收抽滤得到的滤液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；
B、三七素粗提液鉴别：采用薄层层析法(thin layer chromatography，简称TLC)对粗提液进行鉴别，判断所述三七素粗提液中是否含有三七素；
C、三七素的纯化：步骤B中鉴别结果显示所述三七素粗提液中含有三七素时，对三七素粗提液进行纯化，得到洗脱液；
D、洗脱液鉴别：采用薄层层析法(TLC)对所述洗脱液进行鉴别，判断所述洗脱液中是否含有三七素；
E、结晶：合并含有与三七素对照品有相同Rf值且只有一个斑点的洗脱液，并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶体沉淀；
F、重结晶：步骤E中得到的晶体沉淀和溶液用0.2μm微孔滤膜过滤，收集晶体沉淀，且向所述晶体沉淀加水使其刚好完全溶解得到水溶液；并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重结晶晶体沉淀，然后用0.2μm微孔滤膜过滤，收集重结晶晶体沉淀并加水使其刚好完全溶解，得到三七素水溶液；
G、三七素水溶液的鉴别；采用薄层层析法进行检测；
H、步骤G中检测结果显示为所述三七素水溶液仅有一个斑点且与三七素对照品有相同Rf值，将所述三七素水溶液进行冷冻干燥，得到三七素供试品。
工业上，从三七中提取皂苷的步骤大概如下：
将粉碎后的三七剪口，从投料口投入多功能提取罐内，然后关闭投料口。
按产品工艺规程的要求，加入原料的2.8倍量80％(2％)的乙醇，打开蒸汽阀进行温浸(60-80℃)提取四次；
第一次提取不得低于20小时，第二次提取不得低于12小时，第三、四次不低于8小时。每次放净提取液；
从多功能提取罐底部加热废渣，产生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精浓度为15-20％；
废渣在太阳下暴晒至水分至9％以下，装麻袋，当废料丢弃。
可见，工业上从三七中提取皂苷的过程与试验室不同：首先，量不同，试验室一般量较小，而工业上用的三七的量要比试验室大很多；第二，工业上从三七中提取皂苷所用乙醇的浓度与试验室不同，试验室一般用95％的乙醇来提取三七中的皂苷；而工业上不会用这么高浓度的乙醇来提取三七中的皂苷，一般用的75％-80％的乙醇浓度，乙醇浓度小，溶液中水含量更多，那么三七中的三七素则更容易被提取出去，所以工业上的三七废渣中三七素的含量可能比试验室三七废渣中的三七素的含量低更多，甚至有可能工业上的三七废渣中已经没有三七素；第三，工业上从三七中提取皂苷的次数也与试验室不一样，工业上提取皂苷的次数一般为四次，而试验室一般仅提取两次；第四，工业上提取皂苷的工艺条件也不一样，如提取的温度、时间、真空度等，工业上一般采取60-80℃的温度提取，有时还会采用真空条件，这种情况下，三七素很容易被破坏，从而导致工业三七废渣中可能不存在三七素；第五，工业上提取皂苷个过程中没可能还会添加酸或碱来调节pH，这样也可能会破坏三七素，导致三七废渣中可能没有三七素的存在。采用本发明的三七素提取方法，在从工业三七废渣中提取三七素的过程中，在多个节点采用薄层层析法进行鉴别，确定存在三七素后，再继续后续的纯化、结晶、干燥等等，以确保最终得到的供试品中含有三七素；而如果在粗提液的鉴别中就不存在三七素，则放弃所用工业废渣，不继续进行粗提液的纯化、结晶、干燥等，可最大化保证资源的再利用与不浪费。
优选的是，步骤A中，所述两次水浸提为：第一次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时，第二次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时。
上述任一方案优选的是，第一次水浸提，工业废渣中加入6-10倍量的蒸馏水。
上述任一方案优选的是，第二次水浸提，第一次水浸提的滤渣中加入3-5倍量的蒸馏水。
上述任一方案优选的是，步骤A中，收集两次水浸提的滤液的操作为：将两次水浸提溶液采用纱布粗滤，再将纱布粗滤得到的滤渣用离心机分离，倾倒上清液，得两次水浸提的滤液。
上述任一方案优选的是，步骤A中，取上清液浓缩至所述上清液体积的1/5，得浓缩液。
上述任一方案优选的是，步骤A中，上清液浓缩采用旋转蒸发仪进行，温度为50-80℃。
上述任一方案优选的是，步骤A中，浓缩液中加入3倍量的无水乙醇，然后在4℃下静置24小时。
上述任一方案优选的是，步骤A中，所述抽滤采用化学分析滤纸，真空度为0.06-0.08MPa。
上述任一方案优选的是，回收抽滤得到的滤液中的乙醇时，采用旋转蒸发仪，温度为50℃-80℃。
上述任一方案优选的是，步骤B中，判定三七素粗提液中不存在三七素时，更换工业三七废渣重新进行步骤A。
上述任一方案优选的是，步骤C中，所述对三七素粗提液进行纯化时，采用001×7阳离子交换树脂柱，其尺寸为3cm×20cm(长度)。001×7树脂是凝胶树脂，而且001×7树脂是以苯乙烯—二乙烯苯共聚交联结构的高分子基体上带有磺酸基(—SO3H)的离子交换树脂，相比于以苯乙烯—二乙苯为单体聚合的离子交换树脂，纯化效果好。
上述任一方案优选的是，步骤C中，用001×7阳离子交换树脂柱纯化时，流速为0.1-0.25mL/min。流速过大，纯化效果变差，而流速太慢，在纯化效果基本不变的情况下，耗时更长，效率低下。
上述任一方案优选的是，步骤C中，用001×7阳离子交换树脂柱纯化时，流速为0.15mL/min。这个流速下，纯化效果和效率达到最佳平衡。
上述任一方案优选的是，步骤C中，对三七素粗提液进行纯化时，先用水洗脱，收集水洗脱液，至无色；再用氨水洗脱，收集氨水洗脱液。
上述任一方案优选的是，所述氨水洗脱液，用茚三酮显色，直至洗脱液不显紫色，结束冲洗。
上述任一方案优选的是，步骤D中，将茚三酮显色结果显紫色的各洗脱液与三七素对照品在硅胶板上进行点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液为显色剂。
上述任一方案优选的是，步骤E中，合并含有与三七素对照品有相同Rf值且只有一个斑点的洗脱液后，用旋转蒸发仪在50-80℃下浓缩蒸干，然后加入蒸馏水使其刚好完全溶解，加入此时溶液体积30倍量的丙酮，析出晶体沉淀。
上述任一方案优选的是，步骤F中，旋转蒸发仪浓缩蒸干时的温度为50-80℃，且加入的丙酮的量为加入丙酮前溶液体积的30倍量。
上述任一方案优选的是，步骤H中，所述冷冻干燥的操作为：
(1)、预冻：在-40℃预冻12h；
(2)、在真空度为0.05-0.07mBar、温度为-49℃条件下，冻存38h。
本发明提供的三七素提取方法，得到的三七素供试品，三七素含量50％以上，止血效果好，且合理利用工业三七废渣，实现资源的再利用，节约能源，成本低。
本发明第二方面的目的是提供一种三七氨基酸的提取方法，包括以下步骤：
a、三七氨基酸的粗提：取工业三七废渣进行两次水浸提；收集并合并两次水浸提的滤液，并将合并后的滤液进行离心，取上清液进行浓缩得浓缩液；向浓缩液中加入乙醇，然后静置、抽滤，得滤液，并回收抽滤得到的滤液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；
b、三七氨基酸粗提液鉴别：采用薄层层析法(thin layer chromatography，简称TLC)对粗提液进行鉴别，判断所述三七氨基酸粗提液中是否含有氨基酸；
c、三七氨基酸的纯化：步骤b中鉴别结果显示所述三七氨基酸粗提液中含有氨基酸时，对三七氨基酸粗提液进行纯化，得到洗脱液；
d、洗脱液鉴别：采用薄层层析法(TLC)对所述洗脱液进行鉴别，判断所述洗脱液中是否含有氨基酸；
e、结晶：合并含有与三七素对照品水溶液有相同斑点且还有其他斑点的洗脱液，并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶体沉淀；
f、重结晶：步骤e中得到的晶体沉淀和溶液用0.2μm微孔滤膜过滤，收集晶体沉淀，且向晶体沉淀加水使其刚好完全溶解得到水溶液；并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重结晶晶体沉淀，然后用0.2μm微孔滤膜过滤，收集重结晶晶体沉淀并加水使其刚好完全溶解，得到三七素氨基酸水溶液；
g、三七氨基酸水溶液的鉴别；采用薄层层析法进行检测，判断该水溶液中是否含有氨基酸；
h、步骤g中检测结果显示为所述三七氨基酸水溶液与三七素照品有相同斑点，且还有其他斑点，然后将所述三七氨基酸水溶液进行冷冻干燥，得到三七氨基酸供试品。
优选的是，步骤a中，所述两次水浸提为：第一次水浸提和是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时，第二次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时。
上述任一方案优选的是，第一次水浸提，工业废渣中加入6-10倍量的蒸馏水。
上述任一方案优选的是，第二次水浸提，第一次水浸提的滤渣中加入3-5倍量的蒸馏水。
上述任一方案优选的是，步骤a中，收集两次水浸提的滤液的操作为：将两次水浸提溶液采用纱布粗滤，再将纱布粗滤得到的滤渣用离心机分离，倾倒上清液，得两次水浸提的滤液。
上述任一方案优选的是，步骤a中，取上清液浓缩至所述上清液体积的1/5，得浓缩液。
上述任一方案优选的是，步骤a中，上清液浓缩采用旋转蒸发仪进行，温度为50-80℃。
上述任一方案优选的是，步骤a中，浓缩液中加入3倍量的无水乙醇，然后在4℃下静置24小时。
上述任一方案优选的是，步骤a中，所述抽滤采用化学分析滤纸，真空度为0.06-0.08MPa。
上述任一方案优选的是，回收抽滤得到的滤液中的乙醇时，采用旋转蒸发仪，温度为50-80℃。
上述任一方案优选的是，步骤b中，判定三七氨基酸粗提液中不存在氨基酸时，更换工业三七废渣重新进行步骤a。
上述任一方案优选的是，步骤b中，所述对三七氨基酸粗提液进行纯化时，采用001×7阳离子交换树脂柱，其尺寸为3cm×20cm(长度)。
上述任一方案优选的是，步骤c中，用001×7阳离子交换树脂柱纯化时，流速为0.15mL/min。
上述任一方案优选的是，步骤c中，对三七氨基酸粗提液进行纯化时，先用水洗脱，收集水洗脱液，至无色；再用氨水洗脱，收集氨水洗脱液。
上述任一方案优选的是，所述氨水洗脱液，用茚三酮显色，直至洗脱液不显紫色，结束冲洗。
上述任一方案优选的是，步骤d中，将茚三酮显色结果显紫色的各洗脱液与三七素对照品在硅胶板上进行点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液为显色剂。
上述任一方案优选的是，步骤e中，合并含有与三七素对照品有相同斑点且还有其他斑点的洗脱液后，用旋转蒸发仪在50-80℃下浓缩蒸干，然后加入蒸馏水使其刚好完全溶解，加入此时溶液体积30倍量的丙酮，析出晶体沉淀。
上述任一方案优选的是，步骤f中，旋转蒸发仪浓缩蒸干时的温度为50-80℃，且加入的丙酮的量为加入丙酮前溶液体积的30倍量。
上述任一方案优选的是，步骤h中，所述冷冻干燥的操作为：
(1)预冻：在-40℃预冻12h；
(2)在真空度为0.05-0.07mBar、温度为-49℃条件下，冻存38h。
本发明提供的三七氨基酸提取方法，得到的三七氨基酸供试品，含有三七素，具有止血效果，且合理利用工业三七废渣，实现资源的再利用，节约能源，成本低。
第三方面，本发明另一目的在于提供通过本发明第一方面提供的三七素提取方法得到的三七素的应用，得到的三七素用于制备具有止血功能的牙膏。
第四方面，本发明另一目的在于提供通过本发明第一方面提供的三七素提取方法得到的三七素的应用，得到的三七素用于制备具有止血功能止血产品，如创可贴、止血喷剂、止血凝胶、止血粉、含片、内服产品等等。
本发明充分、合理利用了工业三七废渣，实现资源再利用，且采用本发明的方法，保证提取的产品含有三七素，真正实现了资源再利用，变废为宝。采用本发明的三七氨基酸提取方法，得到的产品中含有少量三七素，同时还含有其他种类的氨基酸，也可用于轻微出血的止血，同时，其中的氨基酸也得到提取，也可以用于制备其他产品，既能补充氨基酸又能预防出血。
附图说明
图1是按照本发明的三七素提取方法的一优选实施例的工艺流程图。
图2是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液的TLC结果图，其中，A代表三七素对照品溶液，B代表三七素粗提液。
图3-1是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第1-18管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-2是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第19-36管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-3是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第37-54管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-4是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第55-72管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-5是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第73-90管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-6是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第91-108管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-7是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第109-126管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-8是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第127-144管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-9是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第145-162管和三七素对照片的TLC结果图。
图3-10是图1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液纯化的氨水洗脱液第163-180管和三七素对照片的TLC结果图。
图4是本发明采用的三七素对照品HPLC色谱图。
图5是是图1所示三七素提取方法得到的三七素供试品HPLC色谱图。
图6是按照本发明的三七氨基酸提取方法的一优选实施例的工艺流程图。
具体实施方式
为了更加清楚、正确地理解本发明的发明内容，下面结合附图及具体实施例进行进一步详细的阐述。
本发明采用的三七素对照品购买自上海纯优生物科技，纯度>98％；其他原料均为市售，001×7树脂柱来自山东鲁抗医药股份有限公司树脂分厂。
工业三七废渣为昆药制药集团股份有限公司所提供，为提取过三七总皂苷后的废渣，三七总皂苷的提取操作如下：
1.1将粉碎后的三七剪口，从投料口投入多功能提取罐内，然后关闭投料口。
1.2按产品工艺规程的要求，加入原料的2.8倍量80％(±2％)的乙醇，打开蒸汽阀进行温浸(60-80℃)提取四次。
1.3第一次提取不得低于20小时，第二次提取不得低于12小时，第三、四次不低于8小时。每次放净提取液。
1.4吹渣：从多功能提取罐底部加热废渣，产生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精浓度为15-20％。
1.5废渣在太阳下暴晒至水分至9％以下，装麻袋，当废料丢弃。
实施例1
一种三七素的提取方法，包括以下步骤：
1、三七素的提取
取工业三七废渣1kg，加6-10倍量体积的蒸馏水在50-80℃的恒温水浴锅中提取8h，收集滤液(纱布粗滤，再用离心机分离，4500r/min，离心10min，倾倒上清液)，滤渣加3-5倍量体积的蒸馏水在50-80℃的恒温水浴锅中提取8h，收集滤液，合并两次滤液。以4500r/min，离心5min，倾倒上清液，将上清液置于旋转蒸发仪，转速40r/min，50-80℃旋转浓缩至原体积的1/5，加入3倍量无水乙醇，4℃下静置24h，抽滤(采用化学分析滤纸，真空度为0.06-0.08MPa)；将滤液置于旋转蒸发仪50-80℃下回收乙醇，得粗提液。
2、粗提液经薄层层析法(TLC)鉴别含有三七素斑点：分别取三七素对照品储备液和三七素粗提液1mL在硅胶板上点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水(4:1:1:2)，加入10μL茚三酮溶液为显色剂，在110℃下显色5min，观察粗提液是否有三七素的斑点，结果如图2所示，可判定粗提液中含有三七素。
如果在这步鉴别结果显示，三七素粗提液中不存在三七素，则，放弃后面的操作并更换所用的工业废渣，重新从第1步开始。
3、三七素粗提液的纯化：取粗提液30mL，用3cm×20cm的001×7阳离子交换树脂柱纯化，流速为0.2mL/min，先用水洗脱，收集洗脱液，每管10mL，直至洗脱液为无色；再用0.1mol/L氨水洗脱，收集洗脱液，每管10mL，茚三酮显色(每管洗脱液吸取1mL置试管中，加显色剂10μL，置电炉加热，观察是否显色)，从茚三酮显色结果显示紫色的第一管洗脱液开始编号，编号为1，后面依次编号，直至洗脱液不显紫色，结束洗脱。D001树脂以苯乙烯—二乙苯为单体聚合的离子交换树脂，孔径大；001×7树脂是凝胶树脂，而且001×7树脂是以苯乙烯—二乙烯苯共聚交联结构的高分子基体上带有磺酸基(—SO3H)的离子交换树脂，纯化效果好。
在纯化这个步骤，收集洗脱液时，每管的体积并不是固定的，如显色较重，可一管多收集一些，如果显色非常浅，可以每管少量收集，根据实际情况做调整。
4、洗脱液鉴定：取步骤3中茚三酮显色结果中显色的各洗脱液与三七素对照品各1mL在硅胶板上点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水(4:1:1:2)，茚三酮溶液为显色剂(110℃显色5min)，观察哪些管中有三七素的斑点，结果如图3-1至3-10所示。
5、结晶：合并与三七素对照品斑点有相同Rf值且只有一个斑点的流份(从图3-3至图3-10所对应的的所有管中的氨水洗脱液，即第37-180管中的氨水洗脱液)。合并液于50-80℃下的旋转蒸发仪浓缩蒸干，加适量水使其刚好全部溶解，然后此时溶液体积加入30倍量的丙酮，析出大量沉淀，含有沉淀的溶液过0.2μm微孔滤膜，沉淀用少量水溶解得水溶液。
6、重结晶：步骤5最后所得水溶液继续用同样的方法再次结晶，即，先旋转浓缩蒸干，然后加适量水使其刚好完全溶解，加入此时溶液体积的30倍量的丙酮，析出大量重结晶晶体沉淀，并加入适量水使重结晶晶体沉淀刚好完全溶解，得到三七素水溶液。
7、三七素水溶液鉴别：将所得三七素水溶液，进行薄层检测验证，验证结果显示三七素水溶液仅有一个斑点且与三七素对照品有相同Rf值。
8、经过步骤7的确定后，将三七素水溶液冷冻干燥，得三七素供试品，备用。其中，冷冻干燥的操作为：首先，预冻：在零下40℃预冻12h；然后在真空度为0.05-0.07mBar、温度为-49℃条件下，冻存38h。
实施例2.1
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在60℃下进行。
实施例2.2
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在70℃下进行。
实施例2.3
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在80℃下进行。
实施例3.1
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，对三七素粗提液进行纯化时，流速为0.1mL/min。
实施例3.2
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，对三七素粗提液进行纯化时，流速为0.25mL/min。
实施例3.3
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，对三七素粗提液进行纯化时，流速为0.15mL/min。
实施例4
一种三七氨基酸的提取方法，与实施例1大部分相同，不同的是，步骤5中，不是合并与三七素对照品斑点有相同Rf值且只有一个斑点的流份(从图3-3至图3-10所对应的的所有管中的氨水洗脱液，即第37-180管中的氨水洗脱液)，而是合并剩余的含有与三七素对照品有相同斑点但还有其他斑点的流份(即图3-1和图3-2所对应的所有管中的氨水洗脱液，即第1-36管中的氨水洗脱液)，用同样的方法接近、重结晶、验证、冷冻干燥，得三七氨基酸供试品，备用。
实施例2.1-2.3及3.1-3.3中的变量，同样适用于实施例4。
实施例5
通过本发明的三七素提取方法得到的三七素的应用，用于制备具有止血功能的牙膏，该牙膏原料配比：(重量百分比，下同)
Figure BDA0001324497640000121
该牙膏制备方法如下：
(1)按组分比例备料。
(2)将三七素、糖精钠、苯甲酸钠、焦磷酸四钠加入去离子水中，溶解。
(3)取备料中的摩擦剂、表面活性剂、粘合剂、润湿剂、香精和其他辅料，分别加入到第(2)步骤的溶液中。加入的同时启动慢速刮板搅拌搅拌至充分混匀，启动高速搅拌机、抽真空制成均匀膏体。
(4)把制膏机内的膏体尽量吸入贮存罐再次进行搅拌，灭菌，分装。
其中，所述三七素为实施例1中三七素提取方法得到的三七素供试品。
通过本发明的三七素提取方法得到的三七素的应用，还可以用于制备具有止血功能的生物制品，如如创可贴、止血喷剂、止血凝胶、止血粉等等，而其制备方法可采用其常规的制备方法，仅仅是在其原料中加入本发明所得的三七素供试品。
对比例1
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，对三七素粗提液进行纯化时，流速为0.3mL/min。
对比例2
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在40℃下进行。
对比例3
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在90℃下进行。
对比例4
一种三七素提取方法，与实施例1不同的是，经过步骤7的确定后，将三七素水溶液置50℃烘箱干燥，最后发现三七素被破坏。
以上实施例中供试品中三七素含量的测定
按照以上实施例的方法，分别准备三批样品，分别进行含量测定，最终去平均值作为三七素的含量。
色谱条件：色谱柱：Hypersil ODS2(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：溶剂A:溶剂B(95:5，v:v)，溶剂A为0.001％的醋酸溶液，溶剂B为乙腈:甲醇:水(45:10:45,v:v:v)的混合溶液；流速1.0mL/min，检测波长：214nm，柱温为30℃，进样量为20μL。
三七素对照品溶液的配制：精密称取三七素对照品2.5mg，置25mL容量瓶中，用流动相(蒸馏水)稀释至刻度，摇匀，即得三七素对照品储备液。临用前用0.2μm微孔滤膜过滤。
供试品溶液的配制：精密称取供试品2.5mg，置25mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。临用前用0.2μm微孔滤膜过滤。
标准曲线的制备：精密吸取对照品储备液适量，用流动相配制成浓度分别为20、40、60、80、100μg/mL的对照品溶液，摇匀，依次进样20μL，按上述色谱条件测定，以三七素对照品浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标进行线性回归。回归方程为A＝1864.1C-24596，R＝0.99979，结果表明三七素对照品浓度在20μg/mL～100μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。
精密度试验：精密吸取浓度为0.1mg/mL的对照品溶液，按照色谱条件进样20μL，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值。进样量20μL的三七素对照品峰面积依次为162846、163192、162767、165971、161488、163790，RSD为0.81％。结果表明，用于本品的检测仪器精密度良好。
重复性试验：精密称取同一批号供试品5份，供试品溶液的制备，制备6份供试品溶液，分别测定，记录峰面积，计算RSD值。三七素供试品进样6次，峰面积依次为96762、95693、96848、96380、97434、95971，RSD为0.66％。结果表明，此方法重复性良好。
稳定性试验：精密吸取同一对照品溶液，分别在0、2、4、6、8、10h进样测定，记录峰面积，计算RSD值。0、2、4、6、8、10h的峰面积依次为96424、95984、96118、97357、96288、97165，RSD为0.59％。结果表明，本供试品溶液在10h内稳定性良好。
加样回收率试验：精密量取待测样品6份，按照3.3.3中“供试品溶液的制备”方法操作，分别加入三七素对照品(对照品浓度为0.1mg/mL)0.4mL，即加入0.04mg三七素，进样20μL，测定峰面积，计算回收率。将已加入对照品的供试品峰面积与供试品自身峰面积比较，差值代入回归方程，RSD为0.47％。结果表明，本方法加样回收率良好。
含量测定：称取供试品2.5mg，按照供试品溶液的制备方法，每个实施例的方法得到的供试品分别准备供试液3份，进样20μL，得到供试品的HPLC图(图4示出三七素对照品的HPLC图，图5示出实施例1的三七素供试品的HPLC图)，计算峰面积，然后对应标准曲线，计算三七素的含量，见表1，对于三七素粗提液，直接进样三七素粗提液20μL。
表1 三七素供试品中三七素的含量测定结果(n＝3)
Figure BDA0001324497640000141
Figure BDA0001324497640000151
Figure BDA0001324497640000161
40℃提取，在相同时间内，提取得到的三七素纯度小很多，而需要达到相同的量，则需要很长的时间；三七素粗提液中，三七素的含量均可达到8％，如果这个纯度可以满足需要，也可以将粗提液进行结晶、重结晶和干燥或直接进行干燥得到供试品，以备使用。
凝血药理实验(以实施例1为例)
1.给药剂量的选择
实施例1中，经001×7阳离子交换树脂柱纯化后的三七素粗品的纯度为59.03％，本课题凝血实验设定的三七素低、中、高浓度分别为9.4mg/kg、18.9mg/kg、37.8mg/kg，分别称取三七素供试品固体3.2mg、6.4mg、12.8mg，依次加入2mL生理盐水，配制成浓度为1.6mg/mL、3.2mg/mL、6.4mg/mL的注射液。经预实验测定三七素的凝血时间，发现中浓度效果最好，所以在后面的凝血时间实验中，三七素粗提液组(三七素含量：8.07％)和三七氨基酸组(三七素含量：20.0％)中三七素的浓度均设定为18.9mg/kg。
2.三七素对小鼠凝血时间的影响
取昆明种小鼠35只，随机分为7组，5只/组，分别用苦味酸标记。组别分别为生理盐水组(阴性对照组)、酚磺乙胺注射液组(阳性对照组，25mg/mL)、三七素粗提液注射液组(27mg/mL)、三七氨基酸注射液组(9.4mg/mL)、三七素粗品低浓度组(1.6mg/mL)、三七素粗品中浓度组(3.2mg/mL)、三七素粗品高浓度组(6.4mg/mL)。腹腔注射给药，剂量为10mL/kg。30min后用眼科弯镊迅速摘去小鼠一侧眼球，即有血液流出。将血滴至干净的载玻片上，血滴直径约为5mm，滴血同时用秒表计时，每隔10s用清洁针头自血滴边缘向里轻轻挑动1次，观察有无血丝挑起，记录凝血时间。从采血开始到挑起血丝止，所历时间为凝血时间。采用SPSS统计学软件中的单变量方差分析法对各组凝血时间进行比较，结果如表2和表3所示。
表2 三七素对小鼠凝血时间的影响(
Figure BDA0001324497640000171
n＝5)
组别 给药剂量(mg/kg) 凝血时间(s)
生理盐水组 0 163.4±36.74
酚磺乙胺注射液组 250 85.20±21.44<sup>**</sup>
三七素粗提液组 270 42.00±17.60<sup>**</sup>
三七氨基酸组 94 50.00±24.40<sup>**</sup>
三七素供试品低浓度组 16 28.20±11.05<sup>**</sup>
三七素供试品中浓度组 32 24.60±8.320<sup>**</sup>
三七素供试品高浓度组 64 38.40±12.00<sup>**</sup>
注：与生理盐水组相比，*p<0.05,**p<0.01
表3 三七素对小鼠凝血时间的影响(
Figure BDA0001324497640000172
n＝5)
组别 给药剂量(mg/kg) 凝血时间(s)
酚磺乙胺注射液组 250 85.20±21.44
三七素粗提液组 270 42.00±17.60<sup>**</sup>
三七氨基酸组 94 50.00±24.40<sup>*</sup>
三七素供试品低浓度组 16 28.20±11.05<sup>**</sup>
三七素供试品中浓度组 32 24.60±8.320<sup>**</sup>
三七素供试品高浓度组 64 38.40±12.00<sup>**</sup>
注：与酚磺乙胺组相比，*p<0.05,**p<0.01
从表2和表3可以看出，含有三七素的各组与生理盐水组比较，能缩短凝血时间(P<0.01)。含有三七素的各组与酚磺乙胺注射液组比较，凝血时间缩短。含有三七素的各组间相互比较，P>0.05，差异没有统计学意义。
酚磺乙胺注射液是一个公认的止血药，而本发明的三七素提取方法得到的三七素的凝血时间好更短，说明止血效果更好，也就是说，在能达到的效果没有变差(实际上是更好)的情况下，还充分利用了工业废弃物，变废为宝，实现资源再利用。
需要说明的是，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (34)

1.一种三七素的提取方法，由以下步骤组成：
A、三七素的粗提：取工业三七废渣进行两次水浸提，所述工业三七废渣通过如下方式得到：三七经过浓度为75-80％乙醇在60-80℃的温度下四次提取皂苷，和/或，提取皂苷过程在真空条件下进行，和/或，在提取皂苷过程中添加酸或碱来调节pH，再经过蒸汽吹渣和干燥得到，其中吹渣和干燥的操作如下：
吹渣：从多功能提取罐底部加热废渣，产生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精浓度为15-20％；
干燥：废渣在太阳下暴晒至水分至9％以下，装麻袋，当废料丢弃；
收集并合并两次水浸提的滤液，并将合并后的滤液进行离心，取上清液进行浓缩得浓缩液，其中，上清液浓缩采用旋转蒸发仪进行，温度为50℃-80℃；向浓缩液中加入乙醇，然后静置、抽滤，得滤液，并回收抽滤得到的滤液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；
所述两次水浸提为：第一次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时，第二次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时；
浓缩液中加入3倍量的无水乙醇，然后在4℃下静置24小时；
B、三七素粗提液鉴别：采用薄层层析法对粗提液进行鉴别，判断所述三七素粗提液中是否含有三七素；
C、三七素的纯化：步骤B中鉴别结果显示所述三七素粗提液中含有三七素时，对三七素粗提液进行纯化，得到洗脱液；其中，进行纯化时，用001×7阳离子交换树脂柱纯化，流速为0.1-0.25mL/min；
D、洗脱液鉴别：采用薄层层析法对所述洗脱液进行鉴别，判断所述洗脱液中是否含有三七素；
E、结晶：合并含有与三七素对照品有相同Rf值且只有一个斑点的洗脱液，并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加蒸馏水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶体沉淀；
F、重结晶：步骤E中得到的晶体沉淀和溶液用0.2μm微孔滤膜过滤，收集晶体沉淀，且向所述晶体沉淀加水使其刚好完全溶解得到水溶液；并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重结晶晶体沉淀，然后用0.2μm微孔滤膜过滤，收集重结晶晶体沉淀并加水使其刚好完全溶解，得到三七素水溶液；
G、三七素水溶液的鉴别；采用薄层层析法进行检测；
H、步骤G中检测结果显示为所述三七素水溶液仅有一个斑点且与三七素对照品有相同Rf值，将所述三七素水溶液进行冷冻干燥，得到三七素供试品；所述冷冻干燥的操作为：
(1)、预冻：-40℃预冻12h；
(2)、冷冻：在真空度为0.05-0.07MBar、温度为-49±1℃条件下，冻存38h。
2.如权利要求1所述的三七素提取方法，其特征在于：第一次水浸提，工业废渣中加入6-10倍量的蒸馏水。
3.如权利要求2所述的三七素提取方法，其特征在于：第二次水浸提，第一次水浸提的滤渣中加入3-5倍量的蒸馏水。
4.如权利要求3所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤A中，收集两次水浸提的滤液的操作为：将两次水浸提溶液采用纱布粗滤，再将纱布粗滤得到的滤渣用离心机分离，倾倒上清液，得两次水浸提的滤液。
5.如权利要求4所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤A中，取上清液浓缩至所述上清液体积的1/5，得浓缩液。
6.如权利要求5所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤A中，所述抽滤采用化学分析滤纸，真空度为0.06-0.08MPa。
7.如权利要求6所述的三七素提取方法，其特征在于：回收抽滤得到的滤液中的乙醇时，采用旋转蒸发仪，温度为50-80℃。
8.如权利要求7所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤B中，判定三七素粗提液中不存在三七素时，更换工业三七废渣重新进行步骤A。
9.如权利要求8所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤C中，所述对三七素粗提液进行纯化时，采用001×7阳离子交换树脂柱。
10.如权利要求9所述的三七素提取方法，其特征在于：001×7阳离子交换树脂柱尺寸为3cm×20cm。
11.如权利要求10所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤C中，用001×7阳离子交换树脂柱纯化时，流速为0.15mL/min。
12.如权利要求11所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤C中，对三七素粗提液进行纯化时，先用水洗脱，收集水洗脱液，至无色；再用氨水洗脱，收集氨水洗脱液。
13.如权利要求12所述的三七素提取方法，其特征在于：所述氨水洗脱液，用茚三酮显色，直至洗脱液不显紫色，结束冲洗。
14.如权利要求13所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤D中，将茚三酮显色结果显紫色的各洗脱液与三七素对照品在硅胶板上进行点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液为显色剂。
15.如权利要求14所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤E中，合并含有与三七素对照品有相同Rf值且只有一个斑点的洗脱液后，用旋转蒸发仪在50-80℃下浓缩蒸干，然后加入蒸馏水使其刚好完全溶解，加入此时溶液体积30倍量的丙酮，析出晶体沉淀。
16.如权利要求15所述的三七素提取方法，其特征在于：步骤F中，旋转蒸发仪浓缩蒸干时的温度为50-80℃，且加入的丙酮的量为加入丙酮前溶液体积的30倍量。
17.一种三七氨基酸的提取方法，由以下步骤组成：
a、三七氨基酸的粗提：取工业三七废渣进行两次水浸提，所述工业三七废渣通过如下方式得到：三七经过浓度为75-80％乙醇在60-80℃的温度下四次提取皂苷，和/或，提取皂苷过程在真空条件下进行，和/或，在提取皂苷过程中添加酸或碱来调节pH；再经过蒸汽吹渣和干燥得到，其中吹渣和干燥的操作如下：
吹渣：从多功能提取罐底部加热废渣，产生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精浓度为15-20％；
干燥：废渣在太阳下暴晒至水分至9％以下，装麻袋，当废料丢弃；
收集并合并两次水浸提的滤液，并将合并后的滤液进行离心，取上清液进行浓缩得浓缩液，其中，上清液浓缩采用旋转蒸发仪进行，温度为50℃-80℃；向浓缩液中加入3倍量的无水乙醇，然后4℃下静置24小时、抽滤，得滤液，并回收抽滤得到的滤液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；
所述两次水浸提为：第一次水浸提和是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时，第二次水浸提是在50℃-80℃恒温水浴提取8小时；
b、三七氨基酸粗提液鉴别：采用薄层层析法对粗提液进行鉴别，判断所述三七氨基酸粗提液中是否含有氨基酸；
c、三七氨基酸的纯化：步骤b中鉴别结果显示所述三七氨基酸粗提液中含有氨基酸时，对三七氨基酸粗提液进行纯化，得到洗脱液；其中，进行纯化时，用001×7阳离子交换树脂柱纯化，流速为0.1-0.25mL/min
d、洗脱液鉴别：采用薄层层析法对所述洗脱液进行鉴别，判断所述洗脱液中是否含有氨基酸；
e、结晶：合并含有与三七素对照品水溶液有相同斑点且还有其他斑点的洗脱液，并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶体沉淀；
f、重结晶：步骤e中得到的晶体沉淀和溶液用0.2μm微孔滤膜过滤，收集晶体沉淀，且向晶体沉淀加水使其刚好完全溶解得到水溶液；并采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，加水使其刚好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重结晶晶体沉淀，然后用0.2μm微孔滤膜过滤，收集重结晶晶体沉淀并加水使其刚好完全溶解，得到三七素氨基酸水溶液；
g、三七氨基酸水溶液的鉴别；采用薄层层析法进行检测，判断该水溶液中是否含有氨基酸；
h、步骤g中检测结果显示为所述三七氨基酸水溶液与三七素照品有相同斑点，且还有其他斑点，然后将所述三七氨基酸水溶液进行冷冻干燥，得到三七氨基酸供试品；所述冷冻干燥的操作为：
(1)、预冻：-40℃预冻12h；
(2)、冷冻：在真空度为0.05-0.07MBar、温度为-49±1℃条件下，冻存38h。
18.如权利要求17所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：第一次水浸提，工业废渣中加入6-10倍量的蒸馏水。
19.如权利要求18所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：第二次水浸提，第一次水浸提的滤渣中加入3-5倍量的蒸馏水。
20.如权利要求19所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤a中，收集两次水浸提的滤液的操作为：将两次水浸提溶液采用纱布粗滤，再将纱布粗滤得到的滤渣用离心机分离，倾倒上清液，得两次水浸提的滤液。
21.如权利要求20所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤a中，取上清液浓缩至所述上清液体积的1/5，得浓缩液。
22.如权利要求21所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤a中，所述抽滤采用化学分析滤纸，真空度为0.06-0.08MPa。
23.如权利要求22所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：回收抽滤得到的滤液中的乙醇时，采用旋转蒸发仪，温度为50-80℃。
24.如权利要求23所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤b中，判定三七氨基酸粗提液中不存在氨基酸时，更换工业三七废渣重新进行步骤a。
25.如权利要求24所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤b中，所述对三七氨基酸粗提液进行纯化时，采用001×7阳离子交换树脂柱，尺寸为3cm×20cm。
26.如权利要求25所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤c中，用001×7阳离子交换树脂柱纯化时，流速为0.15mL/min。
27.如权利要求26所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤c中，对三七氨基酸粗提液进行纯化时，先用水洗脱，收集水洗脱液，至无色；再用氨水洗脱，收集氨水洗脱液。
28.如权利要求27所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：所述氨水洗脱液，用茚三酮显色，直至洗脱液不显紫色，结束冲洗。
29.如权利要求28所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤d中，将茚三酮显色结果显紫色的各洗脱液与三七素对照品在硅胶板上进行点样，展开剂为正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液为显色剂。
30.如权利要求29所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤e中，合并含有与三七素对照品有相同斑点且还有其他斑点的洗脱液后，用旋转蒸发仪在50-80℃下浓缩蒸干，然后加入蒸馏水使其刚好完全溶解，加入此时溶液体积30倍量的丙酮，析出晶体沉淀。
31.如权利要求30所述的三七氨基酸提取方法，其特征在于：步骤f中，旋转蒸发仪浓缩蒸干时的温度为50-80℃，且加入的丙酮的量为加入丙酮前溶液体积的30倍量。
32.工业三七废渣用于制备具有止血功能的牙膏的应用，所述工业三七废渣通过如权利要求1-16中任一项所述的方法提取三七素后用于制备具有止血功能的牙膏。
33.工业三七废渣用于制备具有止血功能的产品的应用，所述工业三七废渣通过如权利要求1-16中任一项所述的方法提取三七素后用于制备具有止血功能的产品。
34.如权利要求33的应用，其特征在于：所述生物制品包括创可贴、止血喷剂、止血凝胶、含片、止血粉和内服产品中的一种或几种。
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