CN100336801C

CN100336801C - 从三七中提取三七素的方法

Info

Publication number: CN100336801C
Application number: CNB2006100279621A
Authority: CN
Inventors: 贾伟; 邱明丰; 谢国祥; 赵爱华
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2006-06-22
Filing date: 2006-06-22
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2026-06-22
Also published as: CN1865232A

Abstract

本发明公开了一种药物技术领域的从三七中提取三七素的方法，即采用醇溶液提取法，然后进行水浸提处理，水溶液加入乙醇沉淀，滤去杂质，水溶液再用正丁醇萃取，合并水相直接以苯乙烯和二乙苯为单体聚合的离子交换树脂(如D001型离子交换树脂)柱工艺除去其中的糖分、植物色素等，洗脱液丙酮沉淀，最后进行重结晶得到纯度较高的三七素。本发明安全，成本低廉，适用于工业化生产，能够提取纯度较高的三七素。

Description

从三七中提取三七素的方法

技术领域

本发明涉及一种药物技术领域的方法，具体是一种从三七中提取三七素的方法。

背景技术

名贵中药“三七”具有活血化瘀、消肿定痛、舒经活络等功能，其中尤以止血功能著称。《本草纲目》称“三七止血散血定痛”，三七具有“止血不留瘀，化瘀不伤正”的美名，实为理血的要药。历代医家将三七作为止血上品，广泛用于跌打损伤、内伤出血等内外出血症。三七的水溶性成分三七素，是从三七根中分离的一种特殊的氨基酸，它能缩短小鼠的凝血时间，并使血小板数量显著增加，但目前还没有三七素制剂的生产与使用。

三七中三七素的提取工艺文献报道与已有专利均采用醇提，残渣水提取，过滤、浓缩，正丁醇萃取，水提液上树脂层析，如中国的郑毅男，李向高，鲁歧，郑璐，日本的小菅卓夫，中国专利CN 1267665A，中国专利CN 1166679C等。这些报道工艺上基本一致，特别是在提取工艺中均采用过Sephadex LH-20以及CM Sephadex C-25树脂柱，而此两种树脂均价格昂贵，成本较高，且处理样品耗时，不利于工业生产。

为了能够提取得到三七中止血成分三七素，并使工艺能用于工业化生产，将三七素制剂用于临床，因此有必要改进上述传统的生产工艺。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种从三七中提取三七素的方法。本发明是一种具有简单、适用于工业化生产，并且成本低的提取纯化三七中止血有效成分三七素的新工艺，并可用于开发止血制剂。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明采用醇溶液提取，然后水浸提处理，水提液乙醇沉淀，正丁醇萃取，合并水相直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的离子交换树脂(如D001型离子交换树脂)，氨试液洗脱，丙酮沉淀，最后进行重结晶就可以得到纯度较高的三七素。

本发明具体实现步骤如下：

(1)将三七用5-15倍的体积比为95％的乙醇溶液，最好是10倍量的乙醇溶液，醇提10-20h，最好12h；再用2-10倍的体积比为95％的乙醇，最好是5倍量的乙醇溶液，醇提4-10h，最好6h，提取温度为室温；

(2)合并两次醇提液，留作他用。将残渣晾干，加入10-20倍量的水浸提，最好是10倍，提取10-20h，最好12h；再用2-10倍量的水浸提，最好5倍，提取4-10h，最好6h，提取温度为室温；

(3)过滤，滤液浓缩至一定量，加入乙醇调节醇浓度为50-90％，最好是75％，搅拌，静置0.5-2h，最好1h；

(4)过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；

(5)将(4)中合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的离子交换树脂(如D001型离子交换树脂)柱，先用水洗去大部分植物色素，再用0.05M-0.2M的氨水溶液洗脱，最好是0.1M的氨水溶液，效果较好；

(6)将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，加入水溶液体积的10-50倍量的丙酮，最好是30倍量；

(7)将沉淀物过滤，用水-丙酮重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99％以上的三七素。

本发明技术上具有以下显著优点和进步：1)本发明方法增加在用水提取后，采用乙醇沉淀的方法，除去一部分杂质，可初步提高产品的纯度。2)采用过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的离子交换树脂(如D001型离子交换树脂)柱技术，避免了使用Sephadex LH-20和CM Sephadex C-25树脂，即降低了成本，又加快了处理量，同时可很大程度提高产品纯度。3)用丙酮沉淀法析出三七素，方法简便，操作容易。4)可以得到含量较高的三七素(可高达99.5％)。

附图说明

图1是本发明所得三七素对照品与样品薄层色谱图比较；

图2是本发明所得三七素样品HPLC测试结果；

图3是本发明所得三七素样品与对照品HPLC图比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明进行进一步说明。

实施例1

将三七用5倍的体积比为95％的乙醇溶液提取10h，再用2倍的体积比为95％的乙醇，提取4h，提取温度为室温；合并两次醇提液，留作他用。将残渣晾干，加入10倍量的水浸提12h；再用2倍量的水浸提4h，提取温度为室温；过滤，滤液浓缩至3倍量，加入乙醇调节醇浓度为50％，搅拌，静置0.5h；过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；将合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的D001离子交换树脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用0.05M的氨水溶液洗脱，，将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，加入水溶液体积的10倍量的丙酮；将沉淀物过滤，用水-丙酮重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99.15％的三七素。

实施例2

将三七用10倍的体积比为95％的乙醇溶液提取15h，再用6倍的体积比为95％的乙醇，提取6h，提取温度为室温；合并两次醇提液，留作他用。将残渣晾干，加入15倍量的水浸提15h；再用6倍量的水浸提6h，提取温度为室温；过滤，滤液浓缩至3倍量，加入乙醇调节醇浓度为75％，搅拌，静置1h；过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；将合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的D001离子交换树脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用0.1M的氨水溶液洗脱，，将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，加入水溶液体积的30倍量的丙酮；将沉淀物过滤，用水-丙酮重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99.50％的三七素。

实施例3

将三七用15倍的体积比为95％的乙醇溶液提取20h，再用10倍的体积比为95％的乙醇，提取10h，提取温度为室温；合并两次醇提液，留作他用。将残渣晾干，加入20倍量的水浸提20h；再用10倍量的水浸提10h，提取温度为室温；过滤，滤液浓缩至3倍量，加入乙醇调节醇浓度为90％，搅拌，静置2h；过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；将合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的D001离子交换树脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用0.2M的氨水溶液洗脱，，将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，加入水溶液体积的50倍量的丙酮；将沉淀物过滤，用水-丙酮重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99.38％的三七素。

薄层层析分析将三七素对照品和样品用水溶解后，在同一层析纸上点样，用正丁醇∶水∶乙酸∶无水乙醇，4∶2∶1∶1(V/V)展开，取出晾干，喷以0.2％茚三酮溶液，105℃显色，样品和对照品具有相同的Rf值(见附图1)，并呈现同样的紫红色斑点，样品中无杂质斑。

HPLC分析将三七素对照品和样品用水溶解后，在同一条件下进样，得到相同的色谱图，保留时间相同，峰形也相同。见附图2和3。

NMR和IR的测定红外光谱λ_max ^KBrcm^-1：3420，3520(羟基峰)；3040，1619，1545(氨基酸I、II带)；3300，1545，1250(仲酰胺I、II、III带)；2620，2500(系列小峰)；2800，1440(-CH₂-峰)；1380处无吸收表示无-CH₃。

三七素结构式

核磁共振谱(¹H NMR和¹³C NMR)谱峰归属列于下表

H	δ(¹H)	C	δ(¹³C)
H	δ(¹H)	C	δ(¹³C)	233	4.24(1H，dd，J＝6.8，4.2Hz)3.87(1H，ABd，J＝15.0，4.15Hz，)3.96(1H，ABd，J＝15.0，4.15HZ)	12345	166.73756.31442.075173.207167.012

MS检测该化合物的质谱分析API-ES，m/e：175(M-1⁺，C₅H₈N₂O₅)(100％)，176。经分析为三七素。

HPLC、¹H NMR、¹³C NMR、IR、MS分析：

NMR、IR、MS检测分析为三七素，与文献报道一致，将产物进行HPLC检测，结果见附图2。

药理实验

1.出血时间测定：取体重18-22g健康小鼠30只，雌雄兼用，随机分为3组：阳性对照“止血芳酸注射液”组；三七素组；空白组。除空白组外，药物均腹腔注射三天，于最后一次给药后30min，分别以利剪将小鼠尾尖0.5cm处横端，血液自行流出后计时，每隔15s用滤纸吸去血滴一次，直至血液自然停止，计算出血时间，结果见表1。

2.凝血时间测定：取18-22g健康小鼠30只，雌雄兼用，随机分为3组，组别同前。除空白组外，药物均腹腔注射，1h后用内径为1mm的玻管毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细玻管内血柱达到5cm.。每隔30s折断毛细玻管一段，检查有无出现血凝丝。计算从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间，即为凝血时间，结果见表1。

3.血小板计数：取体重18-22g健康小鼠30只，雌雄兼用，随即分为7组，组别同前。除空白组外，药物均腹腔注射三天，取小鼠尾静脉血20ul，吹入盛有0.38ml血小板稀释液的试管内，充分混匀，显微镜下计数。将血细胞计数板5个中方格内的血小板总数乘以1000，即得1ul血液内的血小板数量，结果见表1。

表1三七素止血实验结果

组别	空白组	对照组	三七素组
组别	空白组	对照组	三七素组	出血时间凝血时间血小板计数(×10³)	33.95±16.082.49±0.63572.50±164.64	7.95±6.091.22±0.50798.36±194.90*	4.80±2.851.06±0.64949.30±204.57**

注：与对照组比较：*P＜0.05，与对照组比较：**P＜0.01

表1药理实验结果均显示，三七素具有明显的止血效果。

Claims

1、一种从三七中提取三七素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将三七用5-15倍的体积比为95％的乙醇溶液，醇提10-20h；再用2-10倍的体积比为95％的乙醇，醇提4-10h；

(2)合并两次醇提液，将残渣晾干，加入10-20倍量的水浸提，提取10-20h，再用2-10倍量的水浸提，提取4-10h，提取温度为室温；

(3)过滤，滤液浓缩，加入乙醇调节醇浓度为50-90％，搅拌，静置0.5-2h；

(4)过滤，滤液再用等体积正丁醇萃取，合并水相；

(5)将(4)中合并水溶液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的离子交换树脂柱，先用水冲洗，再用氨水溶液洗脱，氨水溶液浓度为0.05M-0.2M；

(6)将过离子交换树脂柱液减压浓缩至干，加水溶解，用丙酮沉淀，丙酮量为水溶液体积的10-50倍；

(7)将沉淀物过滤，重结晶，过滤后用丙酮洗至白色，得到纯度为99％以上的三七素。

2、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(1)中，第一次醇提用10倍量的乙醇溶液，第二次醇提用5倍量的乙醇溶液。

3、如权利要求1或2所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(1)中，第一次醇提时间为12h，第二次醇提时间为6h，提取温度为室温。

4、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(2)中，第一次水浸提用10倍量的水，第二次水浸提用5倍量的水。

5、如权利要求1或者4所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(2)中，第一次水浸提时间为12h，第二次水浸提时间为6h。

6、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(3)中，加入乙醇调节醇浓度为75％，静置1h。

7、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(5)中，氨水溶液浓度为0.1M。

8、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(6)中，加入丙酮沉淀时，丙酮量为水溶液体积的30倍。

9、如权利要求1所述的从三七中提取三七素的方法，其特征是，步骤(7)中，重结晶时采用水与丙酮的混合液。