CN1240697C

CN1240697C - 一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法

Info

Publication number: CN1240697C
Application number: CN 03151477
Authority: CN
Inventors: 张立国; 倪力军; 谢国祥
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2003-09-29
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2006-02-08
Anticipated expiration: 2023-09-29
Also published as: CN1528757A

Abstract

本发明提出了一套适合分离纯化冬凌草甲素的新工艺。即采用醇溶液提取法，然后进行水浮回流处理，水浮液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱工艺除去其中的糖分、植物色素等，采用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，最后进行重结晶得到纯度较高冬凌草甲素。本发明的新工艺方法，安全，成本低廉，适于工业化生产，能够提取纯度较高的冬凌草甲素。

Description

一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法

技术领域

本发明涉及一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的新的工艺方法。

背景技术

药物研究表明，冬凌草有良好的消炎、抗菌、镇痛作用，可有效抑制甲型、乙型溶血型链球菌，金黄色葡球菌等。对体外培养的Hela细胞，人体食管癌109细胞及肝癌BEL-7402细胞有明显的细胞毒作用，对多种移植物性动物肿瘤如ECA，S₁₈₀，P₃₈₈，L₁₂₁₀肝癌及AKS有明显抗肿瘤作用，并且冬凌草甲素对食管上皮增生有轻度抑制作用。其中二萜类成分冬凌草甲素是抗肿瘤的有效成分，因而被誉为中药里的“盘尼两林”和“天然抗菌素”。并且美国也正在研究将冬凌草用于爱滋病的防治。冬凌草的开发将成为本世纪的“朝阳产业”和“黄金产业”。

冬凌草提取工艺主要通过提取——脱色——层析等工艺，提取其中的重要有效成分冬凌草甲素并除去其中的植物色素、糖类和鞣质类。各种文献报道的方法的区别体现在：

(1)提取溶剂的不同，如乙醚提取法，主要有中国的赵清治，王汉清等和日本的E.Fujita.T.Fujita，H，Katayama，M.Shibuya；乙醇提取法；

(2)提取后对提取液处理方法不同，如有用过滤等方法去除水不溶物质，最常用的是沉降，然后活性炭脱色；还有是直接用活性炭脱色；

(3)处理后的水提液一般采用有机溶剂萃取或层析或萃取+层析的工艺获得冬凌草甲素。

除在工艺路线上有上述差别外，不同方法的具体区别表现在所选萃取剂及柱层析方法上有所不同。

这些提取工艺通常是采用溶液提取法，然后采用活性炭脱色，浓缩后然后直接进行柱层析分离，此工艺不能很好的除去其中的鞣质和多糖，也不能很好除去与冬凌草甲素分子量只相差2的冬凌草乙素，很难得到冬凌草甲素的纯品。

冬凌草甲素的结构为：

冬凌草甲素

冬凌草乙素的结构为：

冬凌草乙素

为了得到纯度较高的冬凌草甲素，很好地除去其中的植物色素、多糖、树脂、鞣质类物质，因此有必要改进上述的传统生产工艺。

发明内容

本专利发明的目的是克服现有技术的缺陷，开发出一种简单、适于工业化生产，并且成本低的提取纯化冬凌草中有效成分冬凌草甲素的新工艺，并可用于开发新型抗肿瘤新药。

本发明的技术构思是这样的：

本发明综合运用几种提取纯化方法，将其进行有机组合，开发出了一套适合分离纯化冬凌草甲素的新工艺。采用醇溶液提取法，然后进行水浮回流处理，水浮液过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱除去其中的糖分、植物色素等，采用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，最后进行重结晶就可以得到纯度较高的冬凌草甲素。

本发明是通过如下技术方案实现的：

1、将冬凌草用4-10倍的体积比为95％的乙醇溶液，最好是6倍量的乙醇溶液，醇提2-6小时，最好4小时；再用2-6倍的体积比为95％乙醇溶液，最好是4倍量的乙醇溶液，醇提1-4小时，最好2小时，提取温度为76摄氏度；

2、合并两次提取液，减压浓缩，回收乙醇，得到绿褐色膏状物；加入1-6倍量的水进行水浮，最好是3倍；温度为60-90℃，最好是80℃；回流时间0.5-3h，最好1.5h；

3、过滤，将滤液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱，先用水洗去大部分植物色素，再用低浓度乙醇溶液洗脱，一般为体积比为5％-30％，最好为10％，而后用体积比为50％-70％的乙醇溶液洗脱，最好是60％的乙醇溶液，效果较好；

4、将过大孔吸附树脂柱液减压浓缩蒸干，硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，洗脱剂可采用氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮混合溶液中的一种，最好是氯仿-丙酮，洗脱剂比例为6∶1-9∶1，最好是85∶15；原料与吸附剂的比例为1∶5~1∶10，最佳为1∶7，吸附剂为硅胶与氧化镁的混合吸附剂，一般为15∶1为宜；

5、用甲醇-丙酮进行重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99％的冬凌草甲素。

以本发明的方法从冬凌草中提取有效成分冬凌草甲素，技术上具有以下显著优点和进步：

(1)本工艺增加在用乙醇溶液提取后，采用水浮回流技术除去一部分杂质，可初步提高产品的纯度。

(2)采用过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱技术，并采用硅胶+氧化镁的混合柱分离冬凌草甲素，可很大程度提高产品纯度。

(3)经过水浮与过大孔树脂柱处理，在过层析柱时因上样的样品纯度相对较高，因而同样量的吸附剂载样量就较大，这样就节省了吸附剂用量。

(4)仅用一套洗脱系统，大大节省了溶剂用量与洗脱时间。

(5)可以得到含量较高的冬凌草甲素(99.85％)

附图说明：

图1是柱层析洗脱不同馏分的薄层色谱图、图2冬凌草甲素对照品与样品薄层色谱图比较、图3是HPLC测试结果，图4冬凌草甲素样品与对照品HPLC图比较、图5是H^ENMR谱、图6是IR谱、图7是MS谱。

下面结合具体实施方式和附图对本发明进行进一步说明。

实施例1

提取原料1kg加6倍量95％乙醇提取4小时，倒出溶液，再加入4倍量95％乙醇回流2小时，减压浓缩，回收乙醇，得绿褐色膏状物，加入3倍量水回流1.5小时，过滤，将此滤液过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱，先用约6倍量水洗至近无色，然后用约4倍量60％的乙醇液洗脱，将此洗脱液减压浓缩，得到土黄色粉末约12g。

柱层析分离将上步中所得土黄色粉末与适量硅胶拌匀，将相当于粉末5倍量的硅胶、氧化镁(15∶1)装柱，加样后上层覆盖少量硅胶，再加少量脱脂棉。用9∶1的氯仿-丙酮洗脱，以5ml/min的流速进行洗脱，按每份100ml进行收集，进行薄层板分析，证明第6份以后为纯的甲素(见附图1)。减压浓缩，用甲醇-丙酮进行重结晶，减压过滤后，用少量丙酮洗至白色，干燥后称重，共1.5g。薄层层析分析将冬凌草甲素对照品和样品用甲醇溶解后，在同一硅胶薄层板上点样，以9∶1的氯仿-甲醇展开，取出晾干，在紫外灯下照射，样品和对照品具有相同的Rf值(见附图2)，并呈现同样的亮黄绿色斑点，样品中无杂质斑。HPLC分析将冬凌草甲素对照品和样品用甲醇溶解后，在同一条件下进样，得到相同的色谱图，保留时间相同，峰形也相同。冬凌草甲素HPLC图及对照图。见附图3、4。

NMR和IR的测定经红外光谱与核磁共振光谱测定，表明所提样品与对照品结构相同，为同一化合物。见附图5、6。

MS检测经分析为冬凌草甲素。见附图7。HPLC、H^ENMR、IR、MS分析：

IR、H^ENMR、MS检测分析为冬凌草甲素，与文献报道一致，将产物进行HPLC检测，结果见附图3。

Claims

1、一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将冬凌草用4-10倍的体积比为95％乙醇溶液，提取2-6小时；再用2-6倍的体积比为95％乙醇溶液，提取1-4小时，提取温度为76摄氏度；

(2)合并两次提取液，减压浓缩，回收乙醇，得到绿褐色膏状物；加入1-6倍量的水进行水浮，温度60-90℃，回流0.5-3h；

(3)过滤，将滤液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂柱，先用水洗去大部分植物色素，再用体积比为5％-30％的乙醇溶液洗脱，而后用体积比为50％-70％的乙醇溶液洗脱；

(4)将过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂柱液减压浓缩蒸干，用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，使用比例为6∶1-9∶1的氯仿-甲醇、氯仿-丙酮、石油醚-丙酮混合溶液中的一种作为洗脱剂，原料与吸附剂的比例为1∶5-1∶10，吸附剂采用比例为15∶1的硅胶与氧化镁的混合吸附剂；

(5)用甲醇-丙酮进行重结晶，过滤后用少量丙酮洗至白色，得到纯度为99％的冬凌草甲素。

2、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，用体积比为95％乙醇溶液提取时，第一次用6倍量的乙醇溶液，第二次用4倍量的乙醇溶液。

3、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，第一次醇提时间为4小时，第二次提取为2小时。

4、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，提取温度为76摄氏度。

5、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，进行水浮回流时，水浮量为3倍。

6、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，回流温度为80℃。

7、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，回流时间为1.5h。

8、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，在步骤(3)中过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂柱处理时，先用体积比为10％的乙醇溶液洗脱，再用体积比为60％的乙醇溶液洗脱收集。

9、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，在步骤(4)中过硅胶与氧化镁混合柱处理时，洗脱液为氯仿-丙酮，其比例为85∶15。

10、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，在步骤(4)中过硅胶与氧化镁混合柱处理时，硅胶与氧化镁的比为15∶1。

11、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，在步骤(4)中过硅胶与氧化镁混合柱处理时，原料与吸附剂的比为1∶7。

12、如权利要求1所述的从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法，其特征在于，重结晶时采用甲醇与丙酮混合液。