CN1304387C

CN1304387C - 冬凌草甲素标准用对照品的分离制备工艺

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Publication number: CN1304387C
Application number: CNB2005100185403A
Authority: CN
Inventors: 王有为; 卢笑丛; 龚复俊; 崔慧芳; 葛建; 陈玲
Original assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Current assignee: Wuhan Botanical Garden of CAS
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2005-04-13
Publication date: 2007-03-14
Anticipated expiration: 2025-04-13
Also published as: CN1712401A

Abstract

冬凌草甲素标准用对照品的分离制备工艺，涉及一种从冬凌草中制备冬凌草甲素标准对照品的方法。将粉碎的冬凌草进行回流提取，提取液浓缩得稠膏状提取物，脱脂后上硅胶柱层析，解吸，减压浓缩，静置结晶，得含量大于90%的冬凌草甲素粗结晶。粗结晶用甲醇溶解，上硅胶柱层析，用石油醚洗涤前杂，再以石油醚、丙酮混合溶剂进行梯度解吸，合并富含冬凌草甲素组份的解吸液，浓缩结晶，减压抽滤，使晶体与母液分离，母液继续浓缩结晶，依此法重复操作多次，直至母液中再无结晶析出。合并结晶，以丙酮、甲醇混合溶剂进行重结晶精制，得纯度达99.5%以上的冬凌草甲素标准对照品。本发明所用溶剂量少，成本低廉，适于实验室小规模制备。

Description

冬凌草甲素标准用对照品的分离制备工艺

技术领域本发明涉及一种从具有抗癌药物成分的植物冬凌草中分离制备冬凌草甲素标准用对照品的方法。

背景技术冬凌草[Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara]为唇形科香茶菜属植物，其茎、叶可供药用，含有单萜、倍半萜、二萜、三萜类物质，实验证明其二萜类化合物冬凌草甲素是抗肿瘤成分之一。我国民间长期用冬凌草治疗食管癌。实验证明冬凌草甲素在体外对Hela细胞及食管鳞癌细胞株CaEs-17均有明显的抑制作用。在体内对多种动物移植性肿瘤如艾氏腹水癌(腹水型及实体型)、S-180肉瘤(腹水型及实体型)、肝癌(腹水型及实体型)网状细胞肉瘤等均有抑制作用。以冬凌草甲素为主要成分的一类中药抗癌新药已开始研究，但作为建立考察新药质量标准必需的冬凌草甲素标准对照品的分离制备工艺，至今还未见报道，虽有一些高纯度冬凌草甲素提取分离的专利申请和文献报道，但其化学结构都未经紫外、红外、核磁共振(NMR-H¹，NMR-C¹³)、质谱四大光谱、熔点全面确认，不能作为冬凌草甲素标准对照品。

“冬凌草甲素的提取工艺研究”(见文献1)报道了用近红外光谱(NIR)技术对冬凌草中冬凌草甲素的提取工艺进行研究，所得冬凌草甲素纯度较高，且样品与对照品的HPLC的保留时间相同、NMR和IR图谱相同。“中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺摘要”(见文献2)报道了采用中压柱层析法提取分离冬凌草甲素，经重结晶后用薄层扫描法测定合量达99.28％。上述方法虽提取分离冬凌草甲素的纯度都较高，但是没有説明以什么样的样品为标准用对照品，并且所得到的样品没有做全面的4大光谱分析，也没有测试熔点。“一种从冬凌草中提取冬凌草甲素的工艺方法”(专利申请号03151477)，将冬凌草用醇溶液提取，然后进行水浮回流处理，水浮液直接过以苯乙烯和二乙烯苯为单体聚合的大孔吸附树脂(如HZ-841大孔吸附树脂)柱工艺除去其中的糖分、植物色素等，采用硅胶与氧化镁混合柱层析法分离洗脱，最后进行重结晶得到纯度较高冬凌草甲素。它以水为提取溶剂，采用热回流等操作，容易造成冬凌草甲素的降解，影响提取率。

本申请人申请了《一种冬凌草甲素的制备方法》(专利申请号02139049)，是将冬凌草粉碎，用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流，提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到浸膏，加丙酮或乙醇处理，用柱层析硅胶拌混，然后均匀地将拌混硅胶装于上层，用二氯甲烷洗脱，再用二氯甲烷和丙酮的混合溶剂解吸，收集含冬凌草甲素的解吸液组份，减压浓缩，浓缩液置结晶罐中静置结晶，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全，冬凌草甲素结晶用甲醇溶液进行重结晶精制。产品冬凌草甲素含量达到90％以上。

发明内容本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种从抗癌植物冬凌草中提取制备冬凌草甲素标准用对照品的方法。

本发明目的的实现方式为，冬凌草甲素标准用对照品的分离制备工艺，按如下步骤进行：

A、含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶用20～40倍甲醇在50℃～64℃下溶解，按重量比粗结晶∶柱层析硅胶＝1∶0.3～1∶0.5将粗结晶与200～300目柱层析硅胶拌混均匀，置于温度低于50℃、通风的环境中干燥，

B、取重量是拌样硅胶8～12倍的200目～300目新鲜硅胶装柱，再将拌样硅胶置于其上，用5～8倍柱中硅胶体积的石油醚洗涤前杂，再用4∶1～8∶3的石油醚、丙酮混合溶剂梯度解吸，

C、收集富含冬凌草甲素的组份，用薄层层析法展开，以10％～50％硫酸乙醇显色，到冬凌草甲素层析斑点显色不明显时停止解吸，解吸液在温度为50℃、真空度0.6～0.8Mpa条件下浓缩，浓缩液出现浑浊时停止，

D、浓缩液在-4℃～4℃静置2到4h结晶，减压抽滤，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液继续减压浓缩至出现浑浊，再静置结晶，重复数次直至从母液中不再析出冬凌草甲素结晶，

E、合并冬凌草甲素结晶，用10～15倍的丙酮、甲醇混合溶剂进行重结晶精制，所获结晶用高效液相色谱仪测定冬凌草甲素纯度达到99.5％以上，即为冬凌草甲素标准对照品，丙酮、甲醇混合液二者的体积比为丙酮∶甲醇＝1∶8～1∶3。

本发明与现有的冬凌草甲素纯化制备技术比较，有如下优点和效果：

(1)冬凌草甲素粗结晶用足量的甲醇溶解，均匀后加硅胶拌样，使样品在硅胶中分布均一；

(2)本发明所用拌样硅胶用量只有粗结晶量的1/3～1/2，有利于柱层析分离效果的提高；

(3)因冬凌草甲素几乎不溶于水，故本发明不用水作为溶剂进行热回流提取，既保证了较高的得率，又避免了冬凌草甲素的降解和损失；

(4)选用石油醚和丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱，有利于柱层析时冬凌草甲素流分集中，大大地提高分离效率和得率；

(5)所获冬凌草甲素结晶纯度高(99.5％)，成本低廉，适于实验室小规模制备标准对照品；

(6)本发明中未使用药物提取分离时不提倡使用的各类树脂，使所制备的标准对照品能合法地应用于新药研究。

附图说明

图1为冬凌草甲素HPLC图谱

图2为冬凌草甲素红外光谱

图3为冬凌草甲素紫外光谱

图4为冬凌草甲素氢谱

图5为冬凌草甲素碳谱

图6为冬凌草甲素质谱

具体实施方式本制备方法是将含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶用甲醇溶解、柱层析、通风环境中干燥、醚洗涤前杂、解吸、跟踪检测10～50％硫酸乙醇显色，合格后停止解吸，解吸液浓缩，浓缩液置结晶罐中结晶，减压抽滤，晶体与母液分离，母液继续减压浓缩至冬凌草甲素从母液中分离，重结晶后得纯度达到99.5％的冬凌草甲素标准用对照品为止。用甲醇对冬凌草甲素粗结晶进行热处理的温度为50℃～64℃。

含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶的制备方法是采用本申请人申请的“一种冬凌草甲素的制备方法”(专利申请号02139049)，是将冬凌草粉碎，用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流，提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到浸膏，加丙酮或乙醇处理，用柱层析硅胶拌混，然后均匀地将拌混硅胶装于上层，用二氯甲烷洗脱，再用二氯甲烷和丙酮的混合溶剂解吸，收集含冬凌草甲素的解吸液组份，减压浓缩，浓缩液置结晶罐中静置结晶，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全，冬凌草甲素结晶用甲醇溶液进行重结晶精制得含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶。

下面举出本发明实施例：

实例1 取含量为92％的冬凌草甲素粗结晶50克，用1800mL分析纯甲醇溶解，再加入粗结晶量1/3的200目～300目硅胶、拌匀、碾成粉末后过100目筛。以200目～300目硅胶为柱层析填充剂，用石油醚以及石油醚和丙酮的混合溶剂作洗脱剂进行去杂洗脱和梯度洗脱，柱层析跟踪检测，30％硫酸乙醇显色，当层析板上只有一个主点，杂点较少且杂点总面积相对主点小许多，只占主点面积20％以内时，洗脱液浓缩结晶，再用甲醇重结晶即可获得20克纯度达到99.5％的冬凌草甲素标准对照品。

用石油醚、丙酮混合溶剂进行梯度解吸，解吸液流速为解吸液体积/吸附剂体积/分钟＝1/60～1/70/分钟。用10％～50％硫酸乙醇显色后，层析板置于105℃条件下烘烤5min。

冬凌草甲素标准用对照品薄层色谱法检测：色谱图为单一的斑点，无任何杂质斑点。从板层析推断本申请人制备的冬凌草甲素为单一的化合物。

用流动相作为溶剂溶解样品，在冬凌草甲素的吸收波长(238nm)下，HPLC检测，图谱见图1，从图中可见，无任何其它明显杂峰，只有冬凌草甲素的特征吸收峰，样品纯度为99.5％。

用日本产YANACD显微熔点仪测定熔点(温度未校正)，为248～250℃，数据与文献[3]值吻合。

用Thermo Nicolet分光光度计测定，KBr压片。红外光谱谱图见图2，谱图与文献[3]值吻合。

用TU-1901双光束分光光度计测定，以乙醇为溶剂。紫外光谱谱图见图3，谱图与文献[3]值吻合。

用Varian Mercury 300型核磁共振仪测定，CD3OD内标。氢谱谱图见图4，谱图数据与文献[3]值吻合；碳谱谱图见图5，谱图数据与文献[4]值吻合。

用Thermo Quest FINNIGAN TRACE MS型质谱仪测定，电子轰击方式进样。质谱谱图见图6，谱图数据与文献[3]值吻合。

上述结果与文献对照比较，各谱图数据与冬凌草甲素文献值吻合，确证该化合物为冬凌草甲素。冬凌草甲素样品含量(含量99.5％)符合作为标准对照品的要求(含量大于98％)，故该样品可作为标准用对照品。

实例2 同例1，不同的是，取含量为93％的冬凌草甲素粗结晶60克，用2000mL分析纯甲醇溶解，再加入冬凌草甲素粗结晶量1/2的200～300目硅胶，以200目～300目硅胶为柱层析填充剂，10％硫酸乙醇显色，当薄板上只有一个主点，结晶再用甲醇/丙酮重结晶即可获得24克纯度达到99.5％的冬凌草甲素标准对照品。

实例3 同例1，不同的是，冬凌草甲素粗结晶的拌样硅胶粉末过100目筛，以200目～300目硅胶为柱层析填充剂，10％硫酸乙醇显色，当薄板上只有一个主点，杂点较少且杂点总面积相对主点小许多，只占主点面积20％以内时，结晶再用甲醇/丙酮重结晶即可获得18克纯度达到99.5％的冬凌草甲素标准对照品。

实例4 取含量为95％的冬凌草甲素粗结晶130克，用3200mL分析纯甲醇溶解，再加入冬凌草甲素粗结晶量1/3的200～300目硅胶、拌匀、碾成粉末后过100目筛。以200目～300目硅胶为柱层析填充剂，用石油醚以及石油醚和丙酮的混合溶剂作洗脱剂进行去杂洗脱和梯度洗脱，板层析跟踪检测，10％硫酸乙醇显色，当薄板上只有一个主点，杂点较少且杂点总面积相对主点小许多，只在主点面积20％以内时，洗脱液浓缩结晶，再用甲醇/丙酮重结晶即可获得43克高纯度冬凌草甲素标准对照品(99.5％)。

参考文献

[1]王宁，谢国祥，史晓浩等等，冬凌草甲素的提取工艺研究，《中草药》2003，34(10)，901-902。

[2]赵伟，郭兆霞，中压柱层析法提取分离冬凌草甲素的新工艺摘要，《黑农江医药》2001，11(1)，6-8。

[3]孙汉董，林中文等，抗癌植物冬凌草化学成分的研究。云南植物研究，1981，3(1)：95-100。

[4]杨延武，姬昂等，COLOC-S脉冲序列在天然有机化合物结构分析中的应用，波谱学杂志.1991，8(4).-415-424。

Claims

1、冬凌草甲素标准用对照品的分离制备工艺，其特征在于按如下步骤进行：

C、收集富含冬凌草甲素的洗液，用薄层层析法展开，以10％～50％硫酸乙醇显色，到冬凌草甲素层析斑点显色不明显时停止解吸，解吸液在温度为50℃、真空度0.6～0.8Mpa条件下浓缩，浓缩液出现浑浊时停止，

2、根据权利要求1所述的冬凌草甲素标准对照品的分离制备工艺，其特征在于用石油醚、丙酮混合溶剂进行梯度解吸，解吸液流速为解吸液体积/吸附剂体积/分钟＝1/60/分钟～1/70/分钟。

3、根据权利要求1所述的冬凌草甲素标准对照品的分离制备工艺，其特征在于用10％～50％硫酸乙醇显色后，层析板置于105℃条件下烘烤5min。

4、根据权利要求1所述的冬凌草甲素标准用对照品的制备方法，其特征在于含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶的制备方法是，将冬凌草粉碎，用二氯甲烷、丙酮的混合溶剂或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流，提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到浸膏，加丙酮或乙醇处理，用柱层析硅胶拌混，然后均匀地将拌混硅胶装于上层，用二氯甲烷洗脱，再用二氯甲烷和丙酮的混合溶剂解吸，收集含冬凌草甲素的解吸液组份，减压浓缩，浓缩液置结晶罐中静置结晶，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全，冬凌草甲素结晶用甲醇溶液进行重结晶精制得含量大于90％的冬凌草甲素粗结晶。