CN1868503B - 一种冬凌草二萜提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冬凌草二萜提取物的制备方法，以及由该制备方法得到的冬凌草二萜提取物和含有该提取物的药物组合物。本发明提供的冬凌草二萜提取物的制备方法为冬凌草叶或地上部分醇提或超临界萃取后用水或含一定浓度离子的水或石灰乳沉淀，静置过滤回收醇至无醇味，调PH至碱性或直接使用，有机溶剂萃取或上柱层析。

Description

一种冬凌草二萜提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种冬凌草提取物及其制备方法和药物组合物，具体涉及一种冬凌草二萜提取物及其制备方法和药物组合物。

背景技术

冬凌草[Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara.]，别名碎米桠，为唇形科香茶菜属植物，产于我国河南、河北、山西等地，冬凌草主要的化学成分是贝壳杉烯类二萜，另外还含有一些三萜成分和挥发性成分。大量的研究表明，冬凌草的主要有效成分存在于二萜类化合物中，其中又以冬凌草甲素、冬凌草乙素为主要成分，在抗菌、消炎、抗肿瘤等方面表现出明显的药理活性。

现有冬凌草制剂均采用传统的中药制备方法，以冬凌草的粗提物入药，服用剂量大，质量和疗效不稳定。

因此，从冬凌草中提取出疗效确切、毒副作用小，质量可控，使用方便、工艺简单、适于大规模工业生产的冬凌草二萜提取物，对于提高冬凌草制剂产品质量，减小剂量，提高疗效是很有意义的。

发明内容

本发明提供了一种冬凌草二萜提取物。

本发明提供了一种冬凌草二萜提取物的制备方法。

本发明提供的冬凌草二萜提取物的制备方法为：

(1)冬凌草叶或地上部分用醇提取或用超临界萃取法提取；

(2)提取液用水或含一定浓度离子的水或石灰乳沉淀得上清液；

(3)静置过滤后的上清液回收醇至无醇味，调PH至碱性或直接使用；

(4)有机溶剂萃取或上柱层析。

其中，萃取所用有机溶剂可以是乙酸乙酯、正丁醇、乙醚等，优选乙酸乙酯；柱层析可以是硅胶柱、氧化铝柱、聚酰胺柱、离子交换树脂柱或大孔吸附树脂柱，优选为大孔吸附树脂柱。

本发明提供的冬凌草二萜提取物优选的制备方法为：

(1)干燥冬凌草叶用超临界萃取法提取，萃取物用乙醇调节至药材重的2～20倍体积；

(2)提取液加入水或一定浓度的盐溶液至醇浓度为30-70％；

(3)静置沉淀12～48小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；

(4)上大孔树脂柱：先用水洗脱，再10～40％浓度的乙醇洗脱，再用50～90％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥即得。

本发明提供的冬凌草二萜提取物更优选的制备方法为：

(1)取干燥冬凌草叶用超临界CO₂萃取，用一定浓度的乙醇作为夹带剂，夹带剂用量为药材重的2～10倍，合并萃取液；

(2)加入0.1％～5％的无机盐水溶液至醇浓度为40-60％；

(3)静置沉淀12～24小时，过滤，滤液减压回收乙醇至无醇味；

(4)上D101或AB-8大孔树脂柱：先用水洗脱，再30～40％浓度的乙醇洗脱，再用60～80％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥即得。

本发明所述的冬凌草二萜提取物为上述任一制备方法制备得到的提取物。

本发明所述的冬凌草二萜提取物可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括有效剂量的本发明提取物及药用载体，该药物组合物包含剂量为1-1000mg的冬凌草二萜提取物，优选剂量为5-500mg，更优选剂量为20-200mg。可通过静脉、口服、舌下、经肌肉或皮下等途径给药，可以以口服乳、滴丸、软胶囊、片剂、胶囊、含片、颗粒、注射液、静脉乳等形式存在，其中优选为口服乳、滴丸、注射液、静脉乳。

具体实施方式

制备例1冬凌草二萜提取物的制备

取干燥冬凌草地上部分2kg用95％的乙醇提取2次，用醇量为8倍，每次提取的时间为60分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至药材重量的8倍体积，加入水溶液至醇浓度为40％，静置沉淀12小时，过滤；滤液减压回收乙醇至无醇味，加Na₂CO₃至5％，用乙酸乙酯等量萃取2次，减压回收溶剂，干燥得到冬凌草提取物12g，经HPLC检测，总二萜的含量为50.2％，其中冬凌草甲素含量为25.8％。

制备例2冬凌草二萜提取物的制备

取干燥冬凌草叶2kg用90％的乙醇提取4次，用醇量为9倍，每次提取的时间为120分钟，合并滤液，滤液减压浓缩至药材重量的10倍体积，加入1％的AlCl₃水溶液至醇浓度为50％，静置沉淀24小时，过滤；滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱，先用水洗脱，再用20％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到冬凌草提取物15g，经HPLC检测，总二萜的含量为61.2％，其中冬凌草甲素含量为32.1％。

制备例3冬凌草二萜提取物的制备

取干燥冬凌草叶2kg用超临界CO₂萃取，用95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用量为4000mL，合并萃取液，加入0.5％的明矾水溶液至醇浓度为60％，静置沉淀36小时，过滤；滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱，先用水洗脱，再用30％乙醇洗脱，再用90％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到冬凌草提取物13g，经HPLC检测，总二萜的含量为82.2％，其中冬凌草甲素含量为50.8％。

制备例4冬凌草二萜提取物口服乳的制备

将5g制备例2制备得到的冬凌草提取物、200g大豆油、100g大豆磷脂、2g甘油混合，加热至60～80℃，全部溶融，加入高速捣碎机中，同时加入适量的水，高速搅拌3分钟以上，反复3次以上，直到得到均匀的乳剂。

制备例5冬凌草二萜提取物滴丸的制备

称取处方量的880g聚乙二醇-6000在85℃～95℃下熔融，缓慢加入制备例2制备得到的冬凌草提取物100g搅拌，依次加入15g硬脂酸、4.5g吐温-80、0.5g亚硫酸钠、充分搅拌均匀后，将混合在75～85℃恒温条件下滴入液体石蜡冷却液中冷凝成丸，再用毛边纸吸去多余的石蜡即得。

制备例6冬凌草二萜提取物软胶囊的制备

称取200g氢化棕榈油，加入到1200g药用豆油中，加热混匀，制得软胶囊基质，将500g制备例2制备得到的冬凌草提取物加入到基质中，搅拌均匀，胶体磨研磨，制得软胶囊内容物。按明胶∶甘油∶水(1∶0.3∶1)制胶，采用软胶囊机压丸，制得1000粒软胶囊。

制备例7冬凌草二萜提取物片剂的制备

称取制备例2制备得到的冬凌草提取物100g，100g淀粉，40g预胶化淀粉、10g羧甲基淀粉钠，充分混合均匀，过80目筛，加入95％乙醇适量制成软材，12目制粒，60℃干燥3小时，12目筛整粒，加入颗粒总重0.3％的硬脂酸镁，调整片重约250mg，压片，共制得1000片。

制备例8冬凌草二萜提取物胶囊的制备

称取制备例2制备得到的冬凌草提取物100g，淀粉50g，糊精50g，充分混合均匀，过80目筛，用95％乙醇制粒，过12目筛，填充于1号胶囊中，共制得1000粒。

制备例9冬凌草二萜提取物含片的制备

称取制备例1制备得到的冬凌草提取物200g，淀粉500g，糊精295g，5g蛋白糖，过120目筛后充分混合，用80-90％乙醇制粒，40℃下干燥，干燥后的颗粒用12目筛网整粒，压片， 共制得1000片。

制备例10冬凌草二萜提取物颗粒的制备

称取制备例1制备得到的冬凌草提取物500g，糊精500g，1500g蔗糖，过120目筛后充分混合，用蒸馏水制成适宜的软材，用18目筛网制粒，于40℃下干燥，干燥后的颗粒用12目筛网整粒，分装为2.5g/袋，共制得1000袋。

制备例11冬凌草二萜提取物注射液的制备

称取制备例3制备得到的冬凌草提取物10g，溶于适量的50％丙二醇中，加适量活性炭搅匀，用双层滤纸抽滤，加50％丙二醇全量。最后将冬凌草溶液通过0.65pm滤膜灌装、封口，流通蒸汽100℃灭菌30min，每支为2ml，含冬凌草二萜100mg。

制备例12冬凌草二萜提取物静脉乳的制备

将制备例3制备得到的冬凌草提取物5g，200g注射用大豆油、100g大豆磷脂、2g丙二醇等混合，加热至60～80℃，全部溶融，加入高速捣碎机中，同时加入适量的注射用水，高速搅拌3分钟以上，反复3次以上，得到初乳。初乳以超声波细胞粉碎仪超声5min，再以滤膜滤过，罐封于安剖即得。

实验例1.冬凌草二萜提取物的细胞毒作用

材料：冬凌草提取物：根据制备例3制备得到的

人宫颈癌细胞Hela株引自中国医学科学院北京药物研究所

注射用盐酸阿霉素：浙江海门制药厂，批号：135501

本实验选用人宫颈癌细胞Hela，采用噻唑蓝还原法(MTT)，对冬凌草提取物的细胞毒活性进行了研究。

按文献方法【沈玲玲，等.贝叶多孔菌提取物对小鼠移植现代应用药学，1994，11(4)：9-10】，取对数生长的细胞2-2.5×10⁵/mL，放入96孔板，每孔0.2mL，设盐水对照组，溶剂对照组和不同浓度的实验组，以及阿霉素(ADM)阳性对照组，每组设3～5个平行孔。实验组分别加入不同浓度的药物2μL，对照组和溶剂对照组分别加入等量的生理盐水和DMSO，而阳性对照组加入不同浓度的ADM 2μL。37℃温箱孵育45h后，各孔加入10μL的MTT液(10mg/mL)，继续培养至48h，吸去上清后加入DMSO 100μL，待结晶溶解后，即用酶标仪在570nm波长测量各孔的OD值，计算细胞生长抑制率。结果见表1，利用学生t测验进行组间比较。

结果表明，凌草提取物对Hela细胞生长有一定的抑制作用，IC50为27μg/mL。

表1.冬凌草提取物对Hela细胞生长的影响( x±s) 

实验例2.冬凌草二萜提取物对肿瘤的抑制作用

材料：NIH小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供制备例3制备得到的冬凌草提取物，制备例11制备得到的冬凌草注射液注射用环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份有限公司产品，200mg/支，批号：03042521瘤株：小鼠U14宫颈癌引自中国医学科学院北京药物研究所

本实验选用NIH小鼠，采用经典的抗肿瘤药物初筛模型，对冬凌草提取物对小鼠移植肉瘤S180生长的抑制作用及其对荷瘤小鼠寿命的影响进行了研究。

NIH性成熟雄性小鼠120只，分别按常规方法接种S180肉瘤细胞【徐叔云，等。药理实验方法学(第二版)北京：人民卫生出版社，1991，1423】。瘤龄10d的瘤源小鼠拉断脊椎处死，无菌剖取瘤块，取粉红色瘤组织部位，用灭菌生理盐水灭菌制成匀浆，调成1×10⁷个/mL浓度的瘤细胞悬液，拌种于实验小鼠右前肢腋下皮下，0.2mL/只。NIH小鼠分别按体重随机分组。按剂量给药。第1批小鼠于实验结束时拉断脊椎处死，完整剥离瘤体，观察瘤体形态及出血坏死情况，称量瘤重，计算各组平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接种后按同样方法给药，标准条件喂养，任其生长，记录每只小鼠的死亡时间，计算存活时间和寿命延长率。结果见表2，表3，利用学生t测验进行组间比较。

结果表明，5～200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射给药，对小鼠移植肉瘤S180有显著抑制作用，能够延长S180荷瘤小鼠的寿命，且有一定的量效关系。

表2.冬凌草提取物对小鼠移植肉瘤S180的抑制作用( x±s，n＝10) 

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

表3.冬凌草提取物对小鼠寿命的影响( x±s，n＝12) 

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

实验例3.冬凌草提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性升高的治疗作用

材料：昆明种小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供制备例3制备得到的冬凌草提取物，制备例11制备得到的冬凌草注射液

本实验选用雄性昆明种小鼠，采用醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性升高的急性炎症模型，对冬凌草提取物的抗炎活性进行了研究。

昆明种小鼠50只，随机分为5组，分别为模型组、阳性药对照组(氢化可的松25mg/kg)、冬凌草提取物高(200mg/Kg)、中(50mg/Kg)、低(5mg/Kg)剂量组。每组10只。冬凌草提取物用0.5％羧甲基纤维素钠混悬，配成相应浓度，灌胃给药。氢化可的松用注射用生理盐水配成相应浓度，造模前尾静脉给药一次。每日按体重给予相应药物，给药体积0.2ml/10g体重。连续给药3天，末次给药后1小时，按文献【朱社敏，等。双黄连滴丸的主要药效学研究。中国现代应用药学杂志。2001，18：120】方法，每只小鼠尾静脉注射0.5％伊文斯蓝0.1ml/10g体重，并立即腹腔注射0.6％醋酸生理盐水溶液0.2ml/只，20min后脱颈椎处死，打开腹腔，用6ml生理盐水洗涤腹腔，收集洗涤液并离心，取上清液于590nm处测光吸收。结果见表4。利用学生t测验进行组间比较。

结果表明，5～200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射给药，均对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性升高具有一定的抑制作用，且有一定的量效关系。

表4.冬凌草提取物对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性升高的影响( x±s，n＝10) 

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

实验例4.冬凌草提取物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的治疗作用

材料：Wistar大鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供制备例3制备得到的冬凌草提取物，制备例11制备得到的冬凌草注射液

本实验选用雄性Wistar大鼠，采用角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的的亚急性炎症模型，对冬凌草提取物的抗炎活性进行了研究。

Wistar大鼠5只，体重130～150g，按体重随机分为5组，分别为模型组、阳性药对照组(氢化可的松15mg/kg)、冬凌草提取物高(200mg/Kg)、中(50mg/Kg)、低(5mg/Kg)剂量 组。每组10只。冬凌草提取物用0.5％羧甲基纤维素钠混悬，配成相应浓度。每日按体重灌胃给予相应药物，给药体积0.4ml/100g体重。连续给药3天，按文献【徐叔云，等。解热、抗炎药物实验法。药理实验方法学。2002，911】方法用角叉菜胶造模。每只大鼠末次用药前用软皮尺测量右后足跖部位周径，然后各组给予相应药物后，立即给大鼠右后肢足跖皮下注射1％角叉菜胶混悬液0.1ml/只，于注射后3h，在同一位置同法测量右后足跖部位周径，以致炎后足跖周径减去致炎前足跖周径作肿胀度，计算各组肿胀度并比较组间的差异。

结果表明，5～200mg/kg冬凌草提取物灌胃或注射给药，均对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀具有一定的抑制作用，且有一定的量效关系。

表5.冬凌草提取物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀的影响( x±s，n＝10) 

与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

实验例5.口服冬凌草提取物对腹腔注射金黄色葡萄球菌引起小鼠死亡的保护作用

材料：昆明种小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供制备例3制备得到的冬凌草提取物

雄性昆明种小鼠按体重随机分组，每组12只，灌胃给予冬凌草提取物，剂量如表3所示。每天给药一次，连续给药7d，在最后一次给药30min后，腹腔注射金黄色葡萄球菌的硫乙醇酸盐培养液(37℃±1℃，24h，细菌数约108/ml)，0.5ml/只，即刻观察，并连续观察7d，记录每天小鼠死亡情况，存活小鼠用Bliss’s法计算出半数有效量(ED₅₀)。结果见表6。

结果表明，冬凌草提取物对腹腔注射金黄色葡萄球菌引起的小鼠死亡有一定的保护作用，ED₅₀为42.68mg/kg。

表6.口服冬凌草提取物对腹腔注射金黄色葡萄球菌引起小鼠死亡的影响( x，n＝12) 

实验例6.冬凌草提取物体外抗菌试验

材料：制备例3制备得到的冬凌草提取物

金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎双球菌、流杆杆菌、B型链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均由卫生部北京生物制品研究所提供。

冬凌草提取物用肉膏汤配制成100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.6mg/L的含药培养液，共7个药物浓度，每管总量1ml，流通蒸汽灭菌。链球菌的试验在灭菌药液中添加1％葡萄糖，空白对照为不含药物的培养基。分别加入10-3试验菌液(8小时培养物)0.1ml，37℃培养18小时后观察结果。判定最小抑菌浓度(MIC)，结果见表7。

结果表明冬凌草提取物对多种细菌均的生长具有明显的抑制作用，最低抑菌浓度在1.6～25mg/L间。

表7.冬凌草提取物体外抑菌作用(MIC，mg/L) 

实验例7.冬凌草提取物对小鼠流感性肺炎的治疗作用

材料：昆明种小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供制备例3制备得到的冬凌草提取物，制备例11制备得到的冬凌草注射液

昆明种小鼠按体重随机分组，每组10只，灌胃给予不同剂量的冬凌草提取物，病毒感染对照组和正常动物对照组均给相同药液容积的蒸馏水。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉， 以15个LD₅₀流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始给药或水，每天1次，连续6d，感染后第6天称取小鼠体重后固定，放血、解剖，摘取全肺称重，逐个计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。肺指数＝肺重(g)/体重(g)×100；肺指数值大，表示肺病变程度严重。结果见表8。利用学生t测验进行组间比较。

结果表明，感染后小鼠肺指数值明显增大，冬凌草提取物对流感病毒感染小鼠引起的肺炎有明显的抑制作用，肺指数值明显降低。表明冬凌草提取物对流感病毒感染小鼠所致肺病变有治疗作用。

表8.冬凌草提取物对流感病毒感染小鼠肺部炎症(肺指数)的影响( x±s，n＝10) 

与正常组比较：^##，P＜0.01。与模型组比较：^*，P＜0.05；^**，P＜0.01

Claims (1)

1.一种冬凌草二萜提取物的制备方法，其特征为：

取干燥冬凌草叶2kg用超临界CO₂萃取，用95％乙醇作为夹带剂，夹带剂用量为4000mL，合并萃取液，加入0.5％的明矾水溶液至醇浓度为60％，静置沉淀36小时，过滤；滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱，先用水洗脱，再用30％乙醇洗脱，再用90％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥即得。