CN101564466A - 一种含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种由仙鹤草、白花蛇舌草、白英和甘草四味中药组成的组合物。以及从该组合物中分离制备总黄酮、脂溶性总皂苷、萜类、总多糖和水溶性总皂苷有效部位的方法及含有有效部位活性成分的组合物在抗肿瘤药物中的应用。本发明的有效部位制备方法,具有工艺简单,收率高,经济且环境污染小,易于大规模的工业化生产等特点。同时本发明制备的含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物经体内、体外药理活性研究表明:总黄酮、脂溶性总皂苷、总多糖和水溶性总皂苷及其组合物均具有较好的抗肿瘤活性,有望研制成低毒高效的肿瘤治疗的中药复方制剂。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂技术领域,涉及含有抗肿瘤的中药复方组成、有效部位及其制备方法;更进一步涉及中药复方有效部位的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
随着人类生活环境和水平的不断变化,恶性肿瘤已经成为当今世界上威胁人类健康的最严重疾病之一,其发病率和死亡率位距榜首,成为人类健康的头号大敌。因此预防和治疗恶性肿瘤疾病药物的研发日益成为医药界的研究热点,由于临床常用的化疗药物本身的缺陷,使具有抗肿瘤活性的传统中药越来越受到科研人员的高度重视。
中医学认为由于人体正气内虚,脏腑功能失调,以致邪毒乘虚而入,蕴及于经络脏腑,使得机体阴阳失调,气血功能障碍,导致气滞,血瘀,痰凝,毒聚相互结交的一系列病理变化,日久而形成肿瘤。因此,中医治疗肿瘤的方法,主要为扶正和祛邪两个方面。扶正的方法有补气,补血,滋阴温阳等;祛邪的方法有清热解毒,化瘀软坚等。中医药治疗癌症有其独特优势:即“祛邪不伤正”因而避免了一些风险大,复发率高、后遗症多的手术;也没有化疗药物的毒副反应和难以耐受的弊端,从而提高了部分患者的生存质量和生存率,在与癌症的斗争中,中医药显示了不可忽视的作用。
发明内容
本发明的目的之一提供一种抗肿瘤中药复方及其组成和剂量配比。
本发明的目的之二是提供一种抗肿瘤有效部位及其制备方法。
本发明的目的之三是提供以所述有效部位的药物组合的各种制剂。
本发明的目的之四是提供所述有效部位在制备抗肿瘤及其相关药物中的应用。
中药复方一般以药材(饮片)入药,存在着剂量大,服用不方便等诸多不利因素。提取中药复方有效部位,对其药理活性进行验证,进一步将有效部位复配,制成有效部位复方是一条可行的路子。本发明涉及的中药复方含有总黄酮、脂溶性皂苷、萜类、总多糖和水溶性皂苷等多个有效部位,这些有效部位因其结构特点,表现出抗肿瘤,抗病毒,抗菌消炎,增强免疫功能等多方面的生物活性。在研究中药复方及其组成和剂量配比的基础上,寻找和发现中药复方抗肿瘤有效部位及其制备方法及其应用十分必要。因此,本发明提供了含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物,由仙鹤草、白花蛇舌草、白英、甘草原料药中的仙鹤复方有效部位组成;其中所述的仙鹤复方有效部位包括脂溶性皂苷,总黄酮苷和/或苷元,萜类和脂肪酸,水溶性皂苷,总多糖中的一种或多种的组合物。
本发明所述组合物由仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g中的脂溶性甾体皂苷,总黄酮苷,萜类,水溶性皂苷,总多糖中的一种或多种有效部位组成;其中脂溶性甾体皂苷、水溶性皂苷>50%,总黄酮苷、总多糖>40%。
本发明所述的有效部位可以与脂溶性皂苷,总黄酮苷和/或苷元,萜类和脂肪酸,水溶性皂苷,总多糖以及药学上可接受的载体混合制成各种制剂。例如口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
本发明所述含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物的制备方法,其特征在于该有效部位是由下述方法制备而成:
(1)将药材仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g混合,加50-95%的乙醇,回流、提取、浓缩后得醇提浸膏,该浸膏先用与药材等体积的50-95%乙醇,超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化后得有效部位XHC I;
(2)滤液1-a浓缩后,用碱提、酸沉淀,得沉淀2和滤液2-a,沉淀2经聚酰胺树脂纯化后得有效部位XHC II;
(3)滤液2-a用乙酸乙酯萃取,浓缩干燥后得有效部位XHCIII;
(4)将(1)的乙醇提后药材,水煮,提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次所得提取液过滤,合并,离心弃去沉淀后,上清液减压浓缩至小体积,透析3-4天,将透析液浓缩至小体积,用2-3倍体积的饱和正丁醇萃取2-5次,合并正丁醇层萃取液,浓缩,干燥得XHS I;
(5)水层经ZTC II天然澄清剂澄清,除去蛋白、树脂、色素等成分,用3-10%双氧水脱色后得XHS II。
其中所述有效部位XHC I采用的大孔吸附树脂为sp-825,洗脱溶媒为50%乙醇;所述有效部位XHC II的聚酰胺树脂纯化指的是:聚酰胺60-80目,湿法上样,控制pH值为3.0,上样浓度为1g生药/3ml,洗脱液为20%-95%乙醇,5%NaOH,10%NaOH,收集各部分洗脱液,纯化;所述有效部位XHS II采用II型ZTC天然澄清剂纯化。II型ZTC是一种新型的澄清剂,购买于天津正天成澄清技术有限公司。
本发明同时也提供了一种抗肿瘤中药复方制剂及其组成和剂量配比:它由仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草5~30g的提取物与一种或多种药学上可接受的载体组成。其制备方法如下:
(1)将药材仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g混合,加50-95%的乙醇,回流提取2--4次,每次提取时间为3-5h,合并提取液,回收乙醇后得醇提部分的浓缩物,干燥得浸膏;
(2)该浸膏先用与药材等体积的50-95%乙醇,超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化后得有效部位XHC I;
(3)滤液1-a浓缩后,用碱提取,酸沉淀得沉淀2和滤液2-a,沉淀2经聚酰胺树脂纯化后得有效部位XHC II;
(4)滤液2-a用乙酸乙酯萃取,合并,浓缩,干燥后得有效部位XHCIII;
(5)将(1)乙醇提后的药材,干燥,用10-14倍量的水,煮沸提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次所得提取液过滤,合并,离心弃去沉淀后,上清液减压浓缩至小体积,透析3-4天。将透析液浓缩至小体积,用2-3倍体积的饱和正丁醇萃取2-5次,合并正丁醇层萃取液,浓缩,干燥得XHS I;
(5)水层经II型ZTC天然澄清剂澄清,除去蛋白、树脂、色素等成分,用3-10%双氧水脱色后得XHS II。
(6)将上述分离得到的5个有效部位中的一个或多个与药学上可接受的载体混合制成复方制剂。
本发明所涉及的抗肿瘤中药复方制剂或含有有效部位的组合物,其组方均由仙鹤草、白花蛇舌草、白英和甘草四味中药组成。方中仙鹤草味苦辛,性平,入肺、肝、脾经,“下气活血,理百病,散脾满”(《百草镜》),“味苦辛平入肺脏,穿肠穿胃能攻坚”(《本草纲目拾遗》),“滚咽膈之痰,平翻胃之哕”(《药镜拾遗赋》),“攻坚散脾理百病之良品”(《中国医学大辞典》),故而为君药;白花蛇舌草味苦甘,性寒,入心、肝、脾三经,“清热散瘀,消痈解毒”(《泉州本草》),“清热解毒,消炎止痛”(《闽南民间草药》),故而为臣药;白英味甘苦,性寒,“消痰祛瘀,理气解结”(《张寿颐》),“清热,利湿,祛风,解毒”(《中药大辞典》),故而为佐药;甘草味甘性平,无毒,入脾胃、肺经,“有补有泻,能表能里,可升可降”(《本草从新》),“凡用纯寒纯热之品,必用之以缓其势……”(《本草汇言》),“入峻剂则缓正气”(《本草求真》),故而为佐为使。诸药合用,具有清热解毒,攻坚散结,祛瘀止痛等功能,主治因气滞、血瘀、痰凝、毒聚而导致的各种实体瘤,尤其对肝癌、胃癌、宫颈癌等效果尤佳。
本发明所述中药复方组成或含有有效部位组合物制剂的制备方法如下:
使用标准和常规的技术,将本发明5个有效部位中的一个或多个与制剂学上可接受的固体或液体载体结合,以及使之任意地与制剂学上可接受的辅助剂和赋形剂结合制备成各种制剂。这些制剂形式包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。所述的药学上可接受的固体或液体载体,包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如乳糖、聚乙二醇),粘合剂(淀粉、微晶纤维素),崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素),润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁),湿润剂(如丙二醇、乙醇),稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。其中固体剂型包括片剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等等。固体载体可以是至少一种物质,其可以充当稀释剂、香味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、崩解剂以及包裹剂。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、丙二醇、干淀粉、聚山梨酯-80、糊精、淀粉、明胶、纤维素类物质例如甲基纤维素、微晶纤维素、低熔点石蜡、聚乙二醇、甘露醇、可可脂等。液体剂型包括溶剂、悬浮液例如注射剂、粉剂等等。
本发明所述中药复方制剂或含有有效部位组合物以及单元剂型中含有的活性成份(脂溶性皂苷,总黄酮苷和/或苷元,萜类和脂肪酸,水溶性皂苷或总多糖)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用,所用(活性成分的有效部位)的量或浓度在一个较宽的范围内调节,通常,活性成分的有效部位的量范围为组合物的0.5%~90%(重量)。另一优选的范围为0.5%-70%。
本发明所涉及的复方药材有效部位的具体提取方法如下:
取干燥的复方药材仙鹤草(拉丁名)、白花蛇舌草(拉丁名)、白英(拉丁名)、甘草(拉丁名)经过鉴定,挑选、粉碎、过筛后,按固定配比,加95%的乙醇,回流提取2--4次,每次提取时间为3-5h,合并提取液,回收乙醇后得醇提部分的浓缩物,干燥得浸膏。该浸膏先用与药材等体积的95%乙醇,超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化后得有效部位XHC I,滤液1-a浓缩后,用碱提取酸沉淀方法得沉淀2和滤液2-a,沉淀2经聚酰胺树脂纯化后得有效部位XHC II,滤液2-a用乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯萃取液,浓缩干燥后得有效部位XHCIII。
乙醇提后的药材,干燥,用10-14倍量的水,煮沸提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次所得提取液过滤,合并,离心弃去沉淀后,上清液减压浓缩至小体积,透析3-4天。将透析液浓缩至小体积,用2-3倍体积的饱和正丁醇萃取2-5次,合并正丁醇层萃取液,浓缩,干燥得XHS I,水层经II型ZTC天然澄清剂澄清,除去蛋白、树脂、色素等成分,用3-10%双氧水脱色后得XHS II。
采用不同的提取方法获得的各有效部位,经检测分析证实:
有效部位XHC I是具有薯蓣皂苷元母核结构的一类脂溶性甾体皂苷。
XHC II是黄酮苷及其苷元的复合物。有效部位XHCIII是萜类和脂肪酸。
XHS I为水溶性皂苷。XHS II是多糖。
本发明所述的复方有效部位系上述5个有效部位之一或各部位的自由组合物。例如XHS I与XHS II组合;XHC I与XHC II组合;XHC II与XHC I和XHS II组合;XHC II与XHS II组合;XHC II与XHC I、XHS I、XHS II组合,其中XHC II与XHC I和XHS II效果最好。
本发明进一步提供了各有效部位组合物在制备抗肿瘤药物中的应用;其中的肿瘤包括:人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、人子宫颈癌或肺癌。下面通过体内、体外抗肿瘤实验进一步说明本发明各有效部位组合物的药理活性。
(1)体外抗肿瘤实验:分别以抑制MCF-7、Hep-G2、ES-2、JTC-26、S180、A549细胞增殖能力为指标。取人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、卵巢癌细胞系ES-2、人子宫颈癌细胞系JTC-26、肉瘤S180细胞系、肺癌A549细胞系在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,37℃,5%CO2培养箱中生长至细胞旺盛,取对数生长期的细胞进行实验,经0.25%胰酶后加入0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl,培养过夜,给药组分别加入不同剂量的预处理好的药物浓度,对照组加入相应的培养液,终体积为200μl/孔,继续培养48h,加2mg/ml MTT40μl(四甲基偶氮唑:Sigma),培养4h,弃去上清液,加二甲基甲酰胺(DMSO)150μl,于恒温震荡器震荡3min,待蓝色结晶体完全溶解,用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值,并按下列公式计算其抑制率。抑制率计算公式:抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%。有效部位对三种肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示。计算50%细胞杀伤时药物浓度(IC50),IC50采用加权直线回归法处理。体外抗肿瘤试验结果表明:XHC I、XHC II、XHS I、XHS II可明显抑制Hep-G2、MCF-7,具有细胞毒作用。
(2)体内抗肿瘤实验:主要观察各有效部位给药后,对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制作用。在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂),有效部位XHC I、XHC II、XHS I、XHS II小剂量,中剂量,大剂量,XHC I、XHC II、XHS I、XHS II四个有效部位等比例组合(1∶1∶1∶1),以及采用权重配方法对其中三个有效部位XHC I、XHC II、XHS I按照不同配比(1∶1∶1;1∶2∶3;2∶5∶10;2∶5∶2;2∶1∶4或4∶4∶1),单纯水煎剂。口服灌胃给药,每天一次,共10天,观察小鼠的生理指标和存活时间。并按下列公式计算其抑瘤率。
抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
体内抗肿瘤实验整体解剖实验观察,得出数据结果采用SAS统计学软件处理。结果表明:各有效部位不同剂量对肝癌H22均有显著的抑制作用,其中XHC II和四组等比例组配抑制肿瘤的效果最好,分别为62.03%和72.19%,最高抑瘤率和阳性对照药顺铂相当,毒性明显小于顺铂,对免疫功能系统损伤小。权重配方法优化三个有效部位XHCII、XHCI、XHS I按照不同配比(1∶1∶1;1∶2∶3;2∶5∶10;2∶5∶2;2∶1∶4;4∶4∶1)组合后,抑瘤率明显高于单个有效部位抑瘤率效果,效果最好配比为XHC II、XHC I、XHSI(4∶4∶1)。
具体实施方式
以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
实施例1
有效部位的制备方法:
按上述配比取干燥的复方药材仙鹤草、白花蛇舌草、白英、甘草经过挑选、粉碎、过筛后,按固定配比,加95%乙醇,回流提取2-4次,每次提取时间为1-3h,合并提取液,回收乙醇后得醇提部分的浓缩物,进一步干燥得浸膏。该浸膏先用与药材1-3倍体积95%乙醇超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化,洗脱液,干燥得有效部位XHC I,以薯蓣皂苷元为对照品作标准曲线,以紫外分光光度法测定百分含量为57.53%。为提高XHC I中脂溶性皂苷的含量,采用静态吸附分离法确定适合的大孔吸附树脂;采用动态吸附分离法确定分离条件,洗脱溶媒为水和不同比例的乙醇。结果得出大孔吸附树脂sp-825对脂溶性皂苷有良好的吸附分离性能,最佳洗脱溶媒为50%乙醇。
实施例2:
有效部位XHC II的制备方法:
实施例1中沉淀抽虑后的滤液部分(滤液1-a),回收溶剂得浓缩液,加入pH值8-9的NaOH水溶液8-12倍量,微沸30min,趁热抽虑,残渣加入5倍量的蒸馏水煮沸30min,抽虑,合并得抽虑液。滤液在70-80℃下,浓HCL调pH值在3-5之间,静置24h有沉淀吸出得沉淀2和滤液2-a,沉淀干燥得总黄酮粗品,以槲皮素为对照品,紫外分光光度法测定百分含量为31.59%。聚酰胺树脂纯化过程:通过吸附量和解吸附量为参数得出筛选试验得出结果为,聚酰胺60-80目,湿法,上样pH值为3.0,上样浓度为1g生药/3ml时纯化效果最好,洗脱液依次采用不同比例的乙醇,分别为20%,40%,60%,80%,95%,5%NaOH,10%NaOH,收集各部分洗脱液,回收洗脱液,浓缩后并用盐酸-镁粉反应和聚酰胺薄膜跟踪检测黄酮类成分的洗脱情况,同时合并斑点相同的洗脱液。聚酰胺薄膜条件为,以槲皮素为对照,乙酸乙酯-甲醇(3∶1)为展开剂,晾干后,喷以1%三氯化铝溶液,于紫外灯下观察,如有荧光斑点说明有黄酮存在。各不同比例浓度的乙醇洗脱液的盐酸-镁粉反应和聚酰胺薄膜跟踪检测均为阳性,说明吸附的黄酮类成分已被洗脱。10%NaOH洗脱液盐酸-镁粉反应和聚酰胺薄膜跟踪检测均为阴性,说明吸附的黄酮类成分已被洗脱完毕。合并洗脱浓缩液的纯化后总黄酮,紫外分光光度法测其百分含量为45.28%。
实施例3:
有效部位XHCIII的制备方法:
将碱提取酸沉淀得到滤液2-a,冷却,用5%NaOH调pH值至中性,加入1-3倍体积的乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯层,浓缩得浸膏为有效部位XHCIII,干燥称重,定性鉴别为小分子萜类。以车叶草苷为对照品作标准曲线,以紫外分光光度法测定百分含量为37.83%。
实施例4:有效部位XHS I的制备方法:
醇提后药材干燥,用10-14倍量的水,煮沸提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次提取的提取液过滤,所得的水提液合并,离心弃去沉淀后水提液减压浓缩至小体积,对流水透析3-4天,继续将溶液浓缩至小体积,用正丁醇萃取,得正丁醇层干燥部分XHSI,主要是水溶性皂苷类成分。以熊果酸为对照品,紫外分光光度法测定其百分含量为56.07%。大孔吸附树脂纯化过程:通过静态吸附试验和动态吸附试验结果表明SP825型树脂在静态洗脱率、静态饱和吸附量、动态比上柱量、动态比吸附量均高于其它型号的树脂,上样方法为湿法水溶液上样,上样浓度为1g生药/5ml,洗脱液为不同比例乙醇:分别为10%、30%、60%、95%,收集各部分洗脱液,回收洗脱液,干燥得纯化后,通过紫外分光光度法测定其百分含量为57.83%。
实施例5:有效部位XHS II的制备方法:
醇提后药材干燥,用10-14倍量的水,煮沸提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次提取的提取液过滤,所得的水提液合并,离心弃去沉淀后水提液减压浓缩至小体积,流动水透析3-4天,继续将溶液浓缩至小体积,用正丁醇萃取,水层部分加入ZTC II天然澄清剂除蛋白、树脂。加入澄清剂后,产生絮状沉淀,离心,弃去沉淀部分,上清液澄明度明显提高,70℃加入H2O2,每100ml水提液中加入10%H2O210-20ml。通过正交试验优选纯化多糖部分的实验条件:药液浓度配成生药∶水=1∶20,加入B/A两组分的添加量为8%/4%,于60℃水浴加热,加入B组分后加热2小时,然后加入A组分加热1小时。以葡萄糖为对照品,采用苯酚-硫酸法,通过紫外分光光度法测得多糖百分含量为44.61%。
实施例6:有效部位XHC I体外抗肿瘤活性实验:
肿瘤细胞株:人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、卵巢癌细胞系ES-2、人子宫颈癌细胞系JTC-26、肉瘤S180细胞系、肺癌A549细胞系在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,温度37℃,5%CO2培养箱中生长至细胞旺盛,取对数生长期的细胞进行实验,经0.25%胰酶后加入0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl,培养过夜,给药组分别加入不同剂量的有效部位XHC I,对照组加入相应的培养液,终体积为200μl/孔,继续培养48h,加2mg/ml MTT 40μl,培养4小时,弃去上清液,加DMSO 150μl,于恒温震荡器震荡10min,待蓝色结晶体完全溶解,用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值,并按下列公式计算其抑制率。有效部位对六种肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示,见表1。
抑制率计算公式:
抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%
计算50%细胞杀伤时药物浓度(IC50),IC50采用加权直线回归法处理。
表1有效部位XHC I体外抗肿瘤活性实验结果
实施例7:
有效部位XHII C体外抗肿瘤活性实验:
肿瘤细胞株:人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、卵巢癌细胞系ES-2、人子宫颈癌细胞系JTC-26、肉瘤S180细胞系、肺癌A549细胞系在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,温度37℃,5%CO2培养箱中生长至细胞旺盛,取对数生长期的细胞进行实验,经0.25%胰酶后加入0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl,培养过夜,给药组分别加入不同剂量的有效部位XHC II,对照组加入相应的培养液,终体积为200μl/孔,继续培养48h,加2mg/ml MTT 40μl,培养4小时,弃去上清液,加DMSO 150μl,于恒温震荡器震荡10min,待蓝色结晶体完全溶解,用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值,并按下列公式计算其抑制率。有效部位对六种肿瘤细胞株的抑制作用结果以□±S表示,结果见表2。
抑制率计算公式:
抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%
计算50%细胞杀伤时药物浓度(IC50),IC50采用加权直线回归法处理。
表2:有效部位XH II C体外抗肿瘤活性实验结果
实施例8:
有效部位XHS I体外抗肿瘤活性实验:
肿瘤细胞株:人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、卵巢癌细胞系ES-2、人子宫颈癌细胞系JTC-26、肉瘤S180细胞系、肺癌A549细胞系在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,温度37℃,5%CO2培养箱中生长至细胞旺盛,取对数生长期的细胞进行实验,经0.25%胰酶后加入0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl,培养过夜,给药组分别加入不同剂量的有效部位XHS I,对照组加入相应的培养液,终体积为200μl/孔,继续培养48h,加2mg/ml MTT 40μl,培养4小时,弃去上清液,加DMSO 150μl,于恒温震荡器震荡10min,待蓝色结晶体完全溶解,用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值,并按下列公式计算其抑制率。有效部位对六种肿瘤细胞株的抑制作用结果以±S表示,结果见表3。
抑制率计算公式:
抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%
计算50%细胞杀伤时药物浓度(IC50),IC50采用加权直线回归法处理。
表3有效部位XHS I体外抗肿瘤活性实验结果
实施例9:
有效部位XHS II体外抗肿瘤活性实验:
肿瘤细胞株:人乳腺癌细胞系MCF-7、肝癌细胞系Hep-G2、卵巢癌细胞系ES-2、人子宫颈癌细胞系JTC-26、肉瘤S180细胞系、肺癌A549细胞系在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液,温度37℃,5%CO2培养箱中生长至细胞旺盛,取对数生长期的细胞进行实验,经0.25%胰酶后加入0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,将细胞悬液均匀接种于96孔微量培养板中(细胞个数为2×104个/孔)100μl,培养过夜,给药组分别加入不同剂量的有效部位XHS II,对照组加入相应的培养液,终体积为200μl/孔,继续培养48h,加2mg/ml MTT 40μl,培养4小时,弃去上清液,加DMSO 150μl,于恒温震荡器震荡10min,待蓝色结晶体完全溶解,用酶标仪在550nm波长处测定吸光度(OD)值,并按下列公式计算其抑制率。有效部位对六种肿瘤细胞株的抑制作用结果以OD±S表示,结果见表4。
抑制率计算公式:
抑制率(%)=[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100%
计算50%细胞杀伤时药物浓度(IC50),IC50采用加权直线回归法处理。
表4有效部位XHS II体外抗肿瘤活性实验结果
实施例10:
XHC I体内抗肿瘤实验:
仙鹤复方XHC I有效部位对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制情况。在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂,10mg/kg),XHC I有效部位小剂量(800mg/kg),中剂量(1600mg/kg),大剂量(3200mg/kg),XHC I、XHCII、XHS I、XHS II四个有效部位等比例组合(1600mg/kg)(表5-8中简称组合物,以下同),单纯水煎剂(800mg/kg)。口服灌胃给药,每天一次,共七天,观察小鼠的生理指标和存活时间。并按下列公式计算其抑瘤率,结果见表5。抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
表5XHC I有效部位对肝癌H22的抑制作用(x±S)
实施例11:
XHC II体内抗肿瘤实验:
仙鹤复方有效部位XHC II对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制情况。在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂,10mg/kg),XHC II有效部位小剂量(800mg/kg),中剂量(1600mg/kg),大剂量(3200mg/kg),XHC I、XHCII、XHS I、XHSII四个有效部位等比例组合(1600mg/kg)(表5-8中简称组合物,以下同),单纯水煎剂(800mg/kg)。口服灌胃给药每天一次共七天,观察小鼠的生理指标和存活时间。并按下列公式计算其抑瘤率,结果见表6。
抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
表6XHCII有效部位对肝癌H22的抑制作用(x±S)
实施例12:
XHS I体内抗肿瘤实验:
仙鹤复方XHS I有效部位对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制情况。在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂,10mg/kg),XHS I有效部位小剂量(800mg/kg),中剂量(1600mg/kg),大剂量(3200mg/kg),XHC I、XHC II、XHS I、XHS II四个有效部位等比例组合(1600mg/kg)(表5-8中简称组合物,以下同),单纯水煎剂(800mg/kg)。口服灌胃给药天一次,共七天,观察小鼠的生理指标和存活时间。并按下列公式计算其抑瘤率,结果见表7。
抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
表7XHS I有效部位对肝癌H22的抑制作用(x±S)
实施例13:
XHS II体内抗肿瘤实验:
仙鹤复方XHS II有效部位对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制情况。在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂,10mg/kg),XHS II有效部位小剂量(800mg/kg),中剂量(1600mg/kg),大剂量(3200mg/kg),XHC I、XHCII、XHS I、XHSII四个有效部位等比例组合(1600mg/kg)(表5-8中简称组合物以下同),单纯水煎剂(800mg/kg),口服灌胃给药,每天一次,共七天,观察小鼠的生理指标和存活时间。并按下列公式计算其抑瘤率,结果见表8。
抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
表8XHS II有效部位对肝癌H22的抑制作用(x±S)
实施例14:
复方各组配物的体内抗肿瘤实验:
采用权重配方法对仙鹤复方XHC I、XHC II、XHS I有效部位的组配物的剂量配比进行优化,每个有效部位设定六个剂量组,分别为最大剂量和最小剂量,在这个范围内的等比例取其中四个剂量,XHC I最大剂量为120mg/ml,最小剂量12mg/ml,XHCII最大剂量为60mg/ml,最小剂量为18mg/ml,XHS I最大剂量为90mg/ml,最小剂量24mg/ml。给药观察对小鼠肝癌H22肿瘤的抑制情况,具体操作为在无菌条件下,从预先接种好的小鼠腹腔腹水中取肿瘤,用NaCl注射液稀释,混匀后消毒接种小鼠右前肢腋下皮下,每支0.2ml,约含瘤细胞1×106个。24h后随机分组,对照组(水),阳性对照组(顺铂,10mg/kg),不同组配物药物浓度见表9。根据权重配方法试验安排6组剂量,由于组方中每个组分药各发挥不同的作用,可根据其剂量和联合效应关系来衡量每个组分的作用程度和总体的药理作用。口服灌胃给药天一次,共七天,观察小鼠的生理指标和存活时间。采用整体解剖实验观察,各生理指标,并按下列公式计算其抑瘤率,结果见表10。
抑瘤率计算公式:
抑瘤率(%)=[(空白组瘤重值-给药组瘤重值)/空白组瘤重值]×100%
表9:权重配方法安排三个有效部位组配剂量
表10复方组配物位对肝癌H22的抑制作用(x±S)
实施例15:
药物制剂剂型的研究:
(1)片剂:不同含量(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=4∶4∶1),包衣:提取物压片制成片剂的使用,用作赋型剂的辅料有MgSO4、玉米淀粉、滑石粉(规格:100mg、150mg、200mg、300mg)。
(2)胶囊:(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=4∶1∶2)普通及肠溶胶囊,不同规格。
(3)散剂:(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=4∶1∶3)药物提取后加入一定辅料后,干燥研粉。
(4)颗粒冲剂:(活性成分XHCII、XHC I、XHS I=2∶5∶10)袋装速溶颗粒剂。
(5)滴丸剂:(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=2∶5∶2)增加吸收率和吸收速度,起效快。
(6)注射剂:(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=1∶1∶4)过滤,除菌,除热源,用注射用水按一定比例溶解完全均匀,吸收效果好,起效快。
(7)冻干粉针:(活性成分XHC II、XHC I、XHS I=4∶4∶1)便于贮存。
各种药物制剂的制备具体操作如下:
(1)按配置总量计称取含10~70%有效部位提取物,加入30~90%的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等,充分搅拌混合制成颗粒,在60~70℃干燥2~4小时后,压制成片,使每片含有效部位提取物50~150mg。
(2)将制成的颗粒直接充填入各种空胶囊壳中,使每粒胶囊含提取物50~200mg,为胶囊剂。当然各制剂配比及辅料选用会有所差异。
(3)按配置总量计称取含20~70%提取物,加入30-80%的助溶剂如糊精、矫味剂等,溶解均匀后干燥,磨细粉装袋,即得粉剂。
(4)按配置总量计称取含10%~60%提取物,加入40%~90%的填充剂、崩解剂、矫味剂等,充分搅拌混合用12~14目筛制成颗粒。在60~70℃干燥充分后装袋,使每克颗粒剂含提取物100~500mg。
(5)按配置总量计称取含10%~60%提取物,加入40%~90%的助溶剂聚乙二醇、抗氧剂等,加热熔融温度(40~90℃),使原料和辅料充分混溶,滴制成丸,使每粒滴丸含提取物5~20mg。
(6)取水溶性提取物30g,加入适量的注射用水,搅拌并水浴60℃加热使之溶解,以5%Na2CO3溶液调pH值到6.5-8.0,加入0.1%活性炭加热煮沸15min,以脱色除去热源,待稍冷后过滤,注射用水加至全量5000ml,微孔滤膜过滤后熔封于5ml安瓿中,105℃加热灭菌即得。
(7)取水溶性提取物30g,加入适量的注射用水,搅拌并水浴60℃加热使之溶解,以5%Na2CO3溶液调pH值为6.5-8.0,加入0.1%活性炭加热煮沸15min,以脱色除去热源,待稍冷后过滤,注射用水加至全量2500ml,微孔滤膜过滤后分装于西林瓶中,每瓶中装2.5ml。冻干条件:预冻温度-25℃,预冻时间3小时,升华时间为10小时,第一次干燥温度20℃,干燥时间为4小时,第二次干燥温度40℃,干燥时间为6-8小时,105℃加热灭菌即得。
实施例16
用下述成分制备硬明胶胶囊:活性成分(XHC I、XHC II、XHS I、XHS II四个有效部位等比例组成)320mg,干淀粉200mg,硬脂酸镁10mg,将上述成分混合后,以460mg填充入硬明胶胶囊中。
实施例17
活性成分(XHC I、XHC II、XHS I、XHS II=1∶2∶1∶1组成)10mg,淀粉45mg,羧甲基淀粉钠盐4.5mg,硬脂酸镁0.5mg,滑石粉1mg。将原辅料预先干燥,过100目筛备用。先将处方量的辅料充分混匀。将原料药以递增稀释法加到辅料中,每次加时充分混匀2-3次,保证药与辅料充分混匀,过20目筛,在55℃通风烘箱中干燥2h,干颗粒过16目筛整理,测定中间体含量,混合均匀,在压片机上压片。
实施例17注射液的制备
活性成分(XHC I、XHCII、XHS I、XHS II=1∶1∶1∶1)200mg,丙二醇100mg,聚山梨300ml。取活性成分加入到已溶解山梨醇和丙二醇的注射用水中,加入药用碱调节PH值至4-8使其溶解。加入活性炭,搅拌吸附30分钟,除炭、精滤、灌封、灭菌。
实施例18
活性成分(XHC I、XHC II、XHS I=1∶1∶0.1)100mg,药用碱1-7%,甘露醇55-85%。取活性成分加入注射用水,用药用碱调节PH值至4-8使其溶解。再加入甘露醇,按注射剂的要求进行高压灭菌,加入活性炭,采用微孔滤膜过滤,滤液进行分装,采用冷冻干燥法,制得疏松块状物,封口即得。
综上所述,本发明的内容并不局限在的实施例中,相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例,但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
Claims (10)
1、一种含有抗肿瘤活性成分的中药有效部位组合物,其特征在于该组合物由仙鹤草、白花蛇舌草、白英、甘草原料药中的仙鹤复方有效部位组成;其中所述的仙鹤复方有效部位包括脂溶性皂苷,总黄酮苷和/或苷元,萜类和脂肪酸,水溶性皂苷,总多糖中的一种或多种的组合物。
2、如权利要求1所述的组合物,其特征在于该组合物由仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g中的脂溶性甾体皂苷,总黄酮苷,萜类,水溶性皂苷,总多糖中的一种或多种有效部位组成;其中脂溶性甾体皂苷、水溶性皂苷>50%,总黄酮苷、总多糖>40%。
3、如权利要求1所述的组合物,其特征在于有效部位脂溶性皂苷,总黄酮苷和/或苷元,萜类和脂肪酸,水溶性皂苷,总多糖与药学上可接受的载体混合制成各种制剂。
4、如权利要求3所述的组合物,其中的各种制剂包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
5、一种制备权利要求1或2所述组合物的方法,其特征在于该有效部位是由下述方法制备而成:
(1)将药材仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g混合,加50-95%的乙醇,回流、提取、浓缩后得醇提浸膏,该浸膏用与药材等体积的50-95%乙醇,超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化后得有效部位XHC I;
(2)滤液1-a浓缩后,用碱提、酸沉淀,得沉淀2和滤液2-a,沉淀2经聚酰胺树脂纯化后得有效部位XHC II;
(3)滤液2-a用乙酸乙酯萃取,浓缩干燥后得有效部位XHCIII;
(4)将(1)的乙醇提后药材,水煮,提取3-5次,合并,上清液减压浓缩,透析3-4天,用2-3倍体积的饱和正丁醇萃取2-5次,合并正丁醇层萃取液,浓缩,干燥得XHS I;
(5)水层经ZTCII天然澄清剂澄清,除去蛋白、树脂、色素等成分,用3-10%双氧水脱色后得XHS II。
6、如权利要求5所述的制备方法,其中所述有效部位XHC I采用的大孔吸附树脂为sp-825,洗脱溶媒为50%乙醇;所述有效部位XHC II的聚酰胺树脂纯化指的是:聚酰胺60-80目,湿法上样,控制pH值为3.0,上样浓度为1g生药/3ml,洗脱液为20%-95%乙醇,5%NaOH,10%NaOH,收集各部分洗脱液,纯化;所述有效部位XHS II采用II ZTC天然澄清剂除蛋白。
7、权利要求1~4任一项所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用;其中的肿瘤包括:人乳腺癌、肝癌、卵巢癌、人子宫颈癌或肺癌。
8、一种含有抗肿瘤药物的中药复方制剂,其特征在于,该复方由仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草5~30g的提取物与一种或多种药学上可接受的载体组成。
9、权利要求8所述中药复方制剂的制备方法,其特征在于该复方制剂由下述方法制备而成:
(1)将药材仙鹤草10~150g,白花蛇舌草5~100g,白英5~80g,甘草为5~30g混合,加50-95%的乙醇,回流提取2-4次,每次提取时间为3-5h,合并提取液,回收乙醇后得醇提部分的浓缩物,干燥得浸膏;
(2)该浸膏先用与药材等体积的50-95%乙醇,超声溶解,加入2-5倍的无水乙醚,得沉淀1和滤液1-a,沉淀1通过大孔吸附树脂纯化后得有效部位XHC I;
(3)滤液1-a浓缩后,用碱提取,酸沉淀得沉淀2和滤液2-a,沉淀2经聚酰胺树脂纯化后得有效部位XHC II;
(4)滤液2-a用乙酸乙酯萃取,合并,浓缩,干燥后得有效部位XHCIII;
(5)将(1)乙醇提后的药材,干燥,用10-14倍量的水,煮沸提取3-5次,每次提取时间为2-5h,将每次所得提取液过滤,合并,离心弃去沉淀后,上清液减压浓缩至小体积,透析3-4天。将透析液浓缩至小体积,用2-3倍体积的饱和正丁醇萃取2-5次,合并正丁醇层萃取液,浓缩,干燥得XHS I;
10、如权利要求8或9所述的中药复方制剂,包括口服液、注射液、混悬剂、丸剂、片剂、胶囊、散剂、颗粒剂或滴丸剂。
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