CN101177445B - 蟾蜍二烯内酯类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
新的蟾蜍二烯内酯类化合物及其制备方法与应用本发明提供了一种具有通式(I)的蟾蜍二烯内酯类化合物或其药学上可接受的盐，以及包含该化合物的蟾蜍二烯内酯提取物或者药物组合物。所说的化合物和提取物具有抑制肿瘤细胞活性的作用以及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了该化合物和提取物适于工业化生产的制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及蟾蜍二烯内酯类的新化合物或其药学上可接受的盐以及包含该化合物的蟾蜍二烯内酯提取物或者药物组合物。本发明还涉及该类化合物的制备方法以及在抑制肿瘤细胞方面的应用。
背景技术
蟾蜍属动物有250多种，分布于世界各地。我国有近10种，主要分布的3种分别是：大蟾蜍华西亚种(Bufo bufo andrewsi Schmidt)、大蟾蜍中华亚种(Bufo bufo gargarizans Cantor)以及黑眶蟾蜍(Bufo melanostitus Schneider)。蟾蜍之名首载于《名医别录》，早在《神农本草经》就载有“虾蟆”的性味与主治。《本草蒙筌》：“味辛、气凉、微毒”，《本草再新》：入心、肝、脾、肺四经。古今验方广泛应用蟾蜍拔毒消肿、定痛杀虫、强心利尿。
以蟾蜍为基原的常用中药材有蟾酥、蟾皮、干蟾，其化学成分相当复杂，按溶解性可分为脂溶性甾族类(蟾毒配基类、蟾蜍毒素类)、水溶性吲哚生物碱类。
蟾毒配基属乙型强心甾族类化合物，在C17上接有一个A-吡喃酮基，又名蟾蜍二烯类酯(Bufodienolide)，主要存在于蟾蜍耳后腺及皮肤腺的分泌物中，现已知有20余种，例如蟾毒灵(bufalin)、日蟾毒它灵(gamabufotalin)、蟾毒它灵(bufotalin)、华蟾毒精(cinobufagin)、脂蟾毒配基(resibufogenin)等。
蟾蜍毒素由蟾毒配基的C3-羟基与辛二酰、琥珀酰、己二酰、庚二酰精氨酸分别结合成酯及硫酸酯类化合物，易分解为蟾毒配基。根据蟾毒配基不同可分为13类。【江成亮、竺叶青，蟾蜍抗肿瘤作用研究进展，天然产物研究与开发，2000.12(1)，67～72】。例如蟾毒它灵-3-丁二酰精氨酸酯、蟾毒灵-3-丁二酰精氨酸酯、华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯、Cinobufotalitoxin等。Cinobufotalitoxin【Studies on Cardiotonic Steroids from the Skin of Japanese Toads.Shimada，K.，Fujii，Y.，Yamashita，E.，et al.Chemical & Pharmaceutical Bulletin，1977.25(4)，714-730】结构式如下：
现已有蟾酥镇痛膏、蟾酥注射液、华蟾素注射液和复方蟾皮胶囊等制剂应用于临床抗肿瘤、镇痛、利水消肿、增强机体免疫力。蟾蜍制剂在临床上用于肿瘤的辅助治疗具有标本兼治的优点，能够显著抑制肿瘤的转移、提高机体免疫力，与化疗药物相比，具有能够减轻肿瘤患者痛苦，显著改善生活质量，延长生命周期的特点，同时也能够与化疗药物联合使用增强疗效。
然而，目前的蟾蜍制剂，都是以粗提取物入药，成分极为复杂，除含有蟾毒配基、蟾蜍毒素、吲哚类生物碱(如5-羟色胺，蟾蜍色胺、蟾蜍噻咛等)外，还含有氨基酸、还原糖、甾类、肽类等多种类型的化学成分。因此，在临床使用中，蟾蜍制剂具有以下两个主要缺点：①对肿瘤细胞的杀伤率低，②出现过敏反应，血管刺激症状，消化道和心脏毒性等不良反应的发生率高，这都是由于未能去除无效、不良反应成分，未能对真正的有效的成份进行控制造成的。
鉴于以上原因，本发明人经过深入研究，从蟾蜍中提取分离得到了一种新的蟾蜍二烯内酯类化合物，经过体外试验证明其具有较好的抑制肿瘤细胞的作用。并且本发明人还提供了化合物和蟾蜍二烯内酯提取物适于工业化生产的提取分离方法。
发明内容
本发明提供了一种新的化合物或其药学上可接受的盐，其结构式如下：
其中，R1选自
R2为CHO或CH3；
R3为OH或H；
R4为OH，R5为H；或者R4和R5为-O-
R6为H或OAc。
所说的化合物具体为：
化合物II、
本发明所说的盐是指药学上可接受的盐，例如与盐酸、硫酸、磷酸等酸形成的盐，或者与氢氧化钠、氢氧化钾等碱形成的盐。
本发明还提供了一种含有该化合物或其盐的蟾蜍二烯内酯提取物，其中蟾蜍总二烯内酯的重量百分含量为30-100％，优选为50-100％，更优选为90％-100％。
本发明提供了蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法：干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的乙醇洗脱，再用高浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，干燥或精制即得蟾蜍二烯内酯提取物。
本发明所说的蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法优选为：干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的乙醇洗脱，再用高浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，先以乙酸乙酯萃取，再以正丁醇萃取，收集正丁醇萃取部分，减压回收溶剂，干燥即得。
本发明所说的蟾蜍二烯内酯提取物的提取方法更优选为：干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及低浓度的乙醇洗脱，再用高浓度的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，上硅胶色谱柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集相应留份，回收溶剂，干燥即得。
其中所说的低浓度乙醇是指10-50％的乙醇，优选为30-40％；所说的高浓度乙醇是指60-100％的乙醇，优选为70-100％。
其中所说的大孔树脂可以选择非极性或者极性大孔树脂，所说的非极性大孔树脂可以选 自HPD-100、700，AB-8，D101，X-5，D4020等；极性大孔树脂可以选自HPD400、450、600、HPD800，S-8，NAK-9等。其中优选HPD-100、AB-8。
本发明还提供了蟾蜍二烯内酯类化合物的制备方法：取蟾蜍二烯内酯提取物，上硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇-水进行梯度洗脱，然后经HPLC精制，即得。
所述化合物具体制备方法为：取蟾蜍二烯内酯提取物，上硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇-水(CHCl3-MeOH5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH)进行梯度洗脱，分为16个部分(Franction1-16)；
Franction2回收溶剂，所得固体为化合物I粗品，粗品上HPLC(Rp C-18色谱柱)精制收集其中主要的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I；
Franction12上ODS柱，以水-甲醇梯度洗脱，得到17个流份(SubFr1-17)；
上述SubFr14经HPLC(Rp C-18色谱柱)分离，得到化合物II及化合物III；
上述SubFr12经HPLC(Rp C-18色谱柱)分离，得到化合物IV；
Franction14上ODS柱，以水-甲醇梯度洗脱，得到15个流份(SubFr1-15)；
上述SubFr14经HPLC(Rp C-18色谱柱)分离，收集得到化合物V。
本发明还提供了该化合物和蟾蜍二烯内酯提取物对肿瘤细胞的抑制作用，以及在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
本发明所提供的化合物或含有该化合物的蟾蜍二烯内酯提取物可以口服或非口服形式给药，单元剂量0.01-200mg，优选为0.05-100mg，更优选为0.1-20mg。
经口服给药时，可以与常规的药用辅料如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、包衣剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、软胶囊、片剂、滴丸或乳剂等形式给药。非口服形式给药时，可以制备成注射液、冻干粉针剂、输液剂等。
具体实施方式
以下实施例更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一：蟾蜍二烯内酯提取物的制备
取蟾皮10kg用95％的乙醇提取2次，用醇量为8倍，每次提取的时间为60分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上D101大孔树脂柱(天津南开大学化工厂生产)，先用水洗脱，再用50％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物49g，总二烯内酯的含量为32.1％。
实施例二：蟾蜍二烯内酯提取物的制备
取干燥蟾皮10kg用80％的乙醇提取4次，用醇量为9倍，每次提取的时间为120分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上AB-8大孔树脂柱(天津南开大学化工厂生产)，先用水洗脱，再用30％乙醇洗脱，再用80％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，水溶液先以乙酸乙酯等量萃取2次，水层再以等量正丁醇萃取3次，正丁醇层减压回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物26g，总二烯内酯的含量为60.3％。
实施例三：蟾蜍二烯内酯提取物的制备
取干燥蟾皮10kg用95％的乙醇提取2次，用醇量为10倍，每次提取的时间为90分钟，合并滤液，滤液减压回收乙醇至无醇味，上HPD-100大孔树脂柱(沧州宝恩化工有限公司生产)，先用水洗脱，再用40％乙醇洗脱，再用95％的乙醇洗脱，收集后者，减压回收溶剂，粗提物上硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集合并相应流份，回收溶剂，干燥得到蟾蜍二烯内酯提取物15g，总二烯内酯的含量为90.6％。
实施例四：化合物I的制备
取实施例三所得到的蟾蜍二烯内酯提取物40g，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分(Franction1-16)。
Franction2回收溶剂，所得固体为化合物I粗品。粗品上HPLC精制(Phenomenex LUNAC18，乙腈∶水30∶70，300nM)，收集其中主要的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I150mg，HPLC检测含量为98％。，经理化测定数据如下：白色粉末，ESI-MS，m/z：573(M+H)+，熔点：195～196℃。UVλmax MeOH nm：298.8。IRvmax KBrcm-1：3974.26，3899.98，3854.50，3822.58，3747.44，3524.40，3081.63，2944.36，2870.54，2744.48，1843.15，1718.11，1626.42，1539.85，1497.64，1455.90，1391.85，1317.12，1 144.66，1172.16，1132.72，1076.52，1032.80，988.13，948.32，896.54，827.57，751.18，654.72，584.12，547.60，515.67，450.72，411.99；1H-NMR(C5D5N，400MHz)δ：10.48(1H，s)，8.22(1H，dd，J＝2.4，9.7)，7.47(1H，d，J＝2.4)，6.36(1H，d，J＝9.7)，5.30(1H，brs)等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)δ：208.28，172.90，162.03，149.51，147.38，122.96，115.35，84.21，72.77，69.80，54.93，51.29，48.69，42.42，40.64，39.45，37.93，36.85，34.76，34.76，32.08，29.34，29.23，29.15，25.59，25.19，25.08，24.35，22.87，18.87，17.00。
实施例五：化合物II的制备
取实施例三所得到的蟾蜍二烯内酯提取物40g，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH 5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分 (Franction1-16)。
Franction12(8.9g)上ODS柱(150g)，以水→10％MeOH→30％MeOH→50％MeOH→70％MeOH→MeOH梯度洗脱，得到17个流份(SubFr1-17)。
上述SubFr14(342mg)经HPLC分离(Phenomenex LUNA C18，乙腈∶水40∶60，300nM)，收集2号色谱峰，得到化合物II(26mg)，HPLC检测含量为96％。，经理化测定数据如下：白色粉末，ESI-MS，m/z：757(M+H)+，熔点：214-215℃。1H-NMR(C5D5N，400MHz)δ：10.49(1H，s)，8.15(1H，brd)，7.53(1H，brs)，6.43(1H，d，J＝9.9Hz)，5.63(1H，d，J＝6.92Hz)，1.83(3H，s)，等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)δ：208.26，178.18，173.06，169.96，161.44，158.89，152.65，148.78，116.53，113.93，75.24，72.65，72.27，69.60，59.87，57.34，54.81，54.67，50.24，45.06，41.91，41.48，39.60，37.06，36.60，36.57，34.76，33.58，30.63，29.28，29.15，26.09，25.07，24.17，24.03，22.08，20.22，18.87，17.09。
实施例六：化合物III的制备
取实施例三所得到的蟾蜍二烯内酯提取物40g，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分(Franction1-16)。
Franction12(8.9g)上ODS柱(150g)，以水→10％MeOH→30％MeOH→50％MeOH→70％MeOH→MeOH梯度洗脱，得到17个流份(SubFr1-17)。
上述SubFr14(342mg)经HPLC分离(Phenomenex LUNA C18，乙腈∶水40∶60，300nM)，收集1号色谱峰，得到化合物III(55mg)，HPLC检测含量为97％。经理化测定数据如下：白色粉末，ESI-MS，m/z：785(M+H)+，熔点：177～178℃。UVλmax MeOH nm：295.0。IRvmax KBrcm-1：3900.69，3823.31，3747.63，3436.86，2942.46，1843.82，1735.27，1699.45，1640.63，1541.87，1498.10，1456.50，1384.53，1240.98，1130.36，1036.07，888.57，690.87，618.96，452.25，407.15；1H-NMR(C5D5N，400MHz)δ：8.16(1H，brd)，7.54(1H，brs)，6.44(1H，d，J＝9.9Hz)，5.66(1H，d，J＝9.2Hz)，1.84(3H，s)，1.17(3H，s)，0.85(3H，s)等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)δ：178.22，173.10，172.83，169.98，161.46，158.89，152.61，148.88，116.66，113.90，75.32，72.57，72.49，70.86，59.95，54.97，50.35，45.16，42.41，41.49，40.93，39.78，36.64，35.70，35.16，34.74，32.48，30.60，29.35，29.18，26.21，26.03，25.89，25.17，25.07，24.98，23.70，21.44，20.24，17.21，17.08。
实施例七：化合物IV的制备
取实施例三所得到的蟾蜍二烯内酯提取物40g，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分 (Franction1-16)。
Franction12(8.9g)上ODS柱(150g)，以水→10％MeOH→30％MeOH→50％MeOH→70％MeOH→MeOH梯度洗脱，得到17个流份(SubFr1-17)。
上述SubFr12(229mg)经HPLC分离(Phenomenex LUNA C18，乙腈∶水35∶65，300nM)，收集2号色谱峰，得到化合物IV(42mg)，HPLC检测含量为99％。，经理化测定数据如下：白色粉末，ESI-MS，m/z：785(M+H)+，熔点：184～185℃。UVmax MeOH nm：293.2。IRvmax KBrcm-1：3899.92，3854.30，3746.87，3428.08，2938.82，1843.19，1736.16，1639.96，1541.58，1498.70，1456.27，1384.62，1239.79，1131.53，1030.90，889.68，586.24；1H-NMR(C5D5N，400MHz)δ：10.49(1H，s)，8.18(1H，brd)，7.53(1H，brs)，6.42(1H，d，J＝9.8Hz)，5.64(1H，d，J＝9.2)，1.83(3H，s)，0.82(3H，s)等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)δ：208.26，178.10，173.05，169.94，161.43，158.83，152.61，148.76，116.50，113.89，75.19，72.61，72.24，69.55，59.83，54.80，54.64，50.18，45.02，41.85，41.46，39.54，37.01，36.52，34.73，33.54，30.59，29.27，29.14，26.08，25.05，24.12，23.98，22.05，20.19，18.82，17.05。
实施例八：化合物V的制备
取实施例三所得到的蟾蜍二烯内酯提取物40g，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH5∶1→CHCl3-MeOH-H2O10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分(Franction1-16)。
Franction 14上ODS柱，以水→10％MeOH→30％MeOH→50％MeOH→70％MeOH→MeOH梯度洗脱，得到15个流份(SubFr1-15)。
上述SubFr14经HPLC分离(Phenomenex LUNA C18，乙腈∶水35∶65，300nM)，收集2号色谱峰，得到化合物V(15mg)，HPLC检测含量为99％。经理化测定数据如下：白色粉末，ESI-MS，m/z：743(M+H)+，熔点：198～199℃。UVλmax MeOH nm；295.2。IRvmax KBrcm-1：3901.07，3853.79，3747.97，3420.58，2938.94，2869.45，1721.37，1638.31，1538.36，1451.05，1381.26，1255.46，1146.10，1098.49，1041.61，987.45，956.05，827.92，614.25，536.02；1H-NMR(C5D5N，400MHz)δ：8.66(2H，brd，J＝9.7Hz)，7.62(1H，brs)，6.39(1H，d，J＝9.8Hz)，5.76(1H，t-like)，1.79(3H，s)，0.96(3H，s)，0.99(3H，s)等；13C-NMR(C5D5N，100MHz)δ：177.82，172.94，172.31，169.98，161.90，159.07，151.91，150.52，117.97，112.87，83.50，74.59，70.48，57.53，54.61，49.98，42.34，41.31，41.00，40.25，37.47，36.64，35.80，35.41，34.74，31.00，30.81，30.80，29.22，26.93，26.41，25.96，25.32，23.97，21.70，21.50，20.73，17.12。
实施例九：蟾蜍二烯内酯提取物乳剂的制备
将实施例三制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物0.5g、200g大豆油、100g大豆磷脂、2g等渗剂等混合，加热至60～80℃，全部溶融，加入高速捣碎机中，同时加入适量的水，高速搅拌3分钟以上，反复3次以上，直到得到均匀的乳剂。
实施例十：蟾蜍二烯内酯提取物滴丸的制备
称取处方量的880g聚乙二醇-6000在85℃～95℃下熔融，缓慢加入实施例二制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物1g搅拌，依次加入15g硬脂酸、4.5g吐温-80、0.5g亚硫酸钠、充分搅拌均匀后，将混合在75～85℃恒温条件下滴入液体石蜡冷却液中冷凝成丸，再用毛边纸吸去多余的石蜡即得。
实施例十一：蟾蜍二烯内酯提取物软胶囊的制备
称取200g氢化棕榈油，加入到1300g药用豆油中，加热混匀，制得软胶囊基质，将1g实施例二制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物加入到基质中，搅拌均匀，胶体磨研磨，制得软胶囊内容物。按明胶∶甘油∶水(1∶0.3∶1)制胶，采用软胶囊机压丸，制得1000粒软胶囊。
实施例十二：蟾蜍二烯内酯提取物片剂的制备
称取实施例二制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物1g，100g淀粉，40g预胶化淀粉、9g羧甲基淀粉钠，充分混合均匀，过80目筛，加入95％乙醇适量制成软材，12目制粒，60℃干燥3小时，12目筛整粒，加入颗粒总重0.3％的硬脂酸镁，调整片重约150mg，压片，共制得1000片。
实施例十三：蟾蜍二烯内酯提取物胶囊的制备
称取实施例三制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物1g，淀粉50g，糊精49g，充分混合均匀，过80目筛，用95％乙醇制粒，过12目筛，填充于1号胶囊中，共制得1000粒。试验例1.蟾蜍二烯内酯类化合物I-V对SMMC-7721和ECV304的细胞毒活性
材料：SMMC-7721、ECV304均购自中国医学科学院药物研究所药理室
实施例四～八制备得到的化合物I-V
华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司
Cinobufotalitoxin：按文献方法【Studies on Cardiotonic Steroids from the Skin ofJapanese Toads.Shimada，K.，Fujii，Y.，Yamashita，E.，et al.Chemical&Pharmaceutical Bulletin，1977.25(4)，714-730】制备。
本实验选用人肝癌细胞SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞ECV304，采用噻唑蓝还原法(MTT)，对化合物I-V单体的细胞毒活性进行了研究，实验方法及结果如下：
取对数生长的细胞2-2.5×105/mL，放入96孔板，每孔0.2mL，设盐水对照组，溶剂对照组和不同浓度的实验组，以华蟾素注射液及Cinobufotalitoxin作为阳性对照组，每组设3～5个平行孔。实验组分别加入不同浓度的药物2μL，对照组和溶剂对照组分别加入等量的生理盐水和DMSO，而阳性对照组分别加入华蟾素注射液、Cinobufotalitoxin 2μL。37℃温箱孵育45h后，各孔加入10μL的MTT液(10mg/mL)，继续培养至48h，吸去上清后加入DMSO100μL，待结晶溶解后，即用酶标仪在570nm波长测量各孔的OD值，计算细胞生长抑制率和IC50值，结果见表1。
表1化合物I-V对SMMC-7721和ECV304细胞
的增殖抑制作用IC50(x±SD，n＝3)
| 名称 | S MMC-7721 (μg/ml) | ECV304 (μg/ml) |
| 化合物I 化合物II 化合物III 化合物IV 化合物V Cinobufotalitoxin 华蟾素注射液 | 0.35 0.58 2.61 0.62 2.05 1.95 115.6 | 0.29 0.46 2.34 0.41 2.15 2.58 132.5 |
从表1数据可知，对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制作用，新化合物I、新化合物II和新化合物IV分别约为对照品Cinobufotalitoxin的6倍、3倍、3倍左右，新化合物III、新化合物V与对照品Cinobufotalitoxin的抑制作用相似；新化合物I-V明显强于华蟾素注射液。
对人脐静脉内皮细胞ECV304的增殖抑制作用，新化合物I、新化合物II和新化合物IV分别约为对照品Cinobufotalitoxin的9倍、6倍、6倍左右，新化合物III、新化合物V与对照品Cinobufotalitoxin的抑制作用相似；新化合物I-V明显强于华蟾素注射液。
试验例2.蟾蜍二烯内酯提取物对肿瘤的抑制作用
材料：NIH小鼠，山东省天然药物工程技术研究中心实验动物中心提供
实施例三制备得到的蟾蜍二烯内酯提取物
华蟾素注射液：安徽金蟾生化股份有限公司
本实验选用NIH小鼠，采用经典的抗肿瘤药物初筛模型，对蟾蜍二烯内酯提取物对小鼠移植肉瘤S180生长的抑制作用及其对荷瘤小鼠寿命的影响进行了研究。
NIH性成熟雄性小鼠120只，分别按常规方法接种S180肉瘤细胞【徐叔云，等。药理实 验方法学(第二版)北京：人民卫生出版社，1991，1423】。瘤龄10d的瘤源小鼠拉断脊椎处死，无菌剖取瘤块，取粉红色瘤组织部位，用灭菌生理盐水灭菌制成匀浆，调成1×107个/mL浓度的瘤细胞悬液，拌种于实验小鼠右前肢腋下皮下，0.2mL/只。NIH小鼠分别按体重随机分组。按剂量给药。第1批小鼠于实验结束时拉断脊椎处死，完整剥离瘤体，观察瘤体形态及出血坏死情况，称量瘤重，计算各组平均瘤重及平均抑瘤率。第2批小鼠接种后按同样方法给药，标准条件喂养，任其生长，记录每只小鼠的死亡时间，计算存活时间和寿命延长率。结果见表2，表3，利用学生t测验进行组间比较。
结果表明，1～50mg/kg蟾蜍二烯内酯提取物灌胃给药，对小鼠移植肉瘤S180有显著抑制作用，能够延长S180荷瘤小鼠的寿命，且有一定的量效关系，其作用强度比华蟾素注射液强。表2.蟾蜍二烯内酯提取物对小鼠移植肉瘤S180的抑制作用(
，n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤重(g) | 抑瘤率(％) |
| 模型华蟾素注射液(高)华蟾素注射液(中)华蟾素注射液(低)蟾蜍二烯内酯提取物(高)蟾蜍二烯内酯提取物(中)蟾蜍二烯内酯提取物(低) | -- 200 20 2 50 5 1 | 2.73±1.79 1.45±0.45** 1.77±0.48* 2.32±0.41* 1.06±0.46** 1.35±0.28** 1.92±0.23* | 46.9 35.2 15.0 61.2 50.5 29.7 |
与模型组比较：*，P＜0.05；**，P＜0.01
表3.蟾蜍二烯内酯提取物对小鼠寿命的影响(
，n＝12)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 平均生存时间(d) | 寿命延长率(％) |
| 模型华蟾素注射液(高)华蟾素注射液(中)华蟾素注射液(低)蟾蜍二烯内酯提取物(高)蟾蜍二烯内酯提取物(中)蟾蜍二烯内酯提取物(低) | -- 200 20 2 50 5 1 | 25.4±4.7 36.3±3.2** 33.9±3.4** 28.7±4.4 40.1±5.2** 38.0±4.9* 30.1±2.9* | 42.9 33.4 13.0 57.8 49.6 18.5 |
与模型组比较：*，P＜0.05；**，P＜0.01
Claims (9)
1.一种蟾蜍二烯内酯类化合物，其化合物选自：
化合物I
化合物V。
2.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.包含权利要求1所述的化合物的制剂，其特征在于所述制剂为片剂、胶囊、滴丸、乳剂、注射液或冻干粉针剂。
4.含有权利要求1的一种或多种化合物的蟾蜍二烯内酯提取物，其制备方法为：干蟾、蟾皮或蟾酥用乙醇提取，回收乙醇后浓缩液上大孔树脂柱，先用水及10-50％的乙醇洗脱，再用60-100％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，上硅胶色谱柱，以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集相应留份，回收溶剂，干燥即得，其蟾蜍总二烯内酯的重量百分含量为90-100％。
5.根据权利要求4所述的蟾蜍二烯内酯提取物，其特征在于制备方法中前后两次乙醇洗脱液浓度依次为30-40％和70-100％。
6.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征为：取权利要求4-5任一所述的蟾蜍二烯内酯提取物，上硅胶色谱柱，用氯仿-甲醇-水进行梯度洗脱，然后经HPLC精制，即得。
7.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征为：取权利要求4-5任一所述的蟾蜍二烯内酯提取物，上硅胶色谱柱，用CHCl3-MeOH 5∶1→CHCl3-MeOH-H2O 10∶3∶1→7∶3∶1→6∶4∶1→MeOH进行梯度洗脱，分为16个部分即流份1-16；
流份2回收溶剂，所得固体为化合物I粗品，粗品上Rp C-18色谱柱精制，收集其中主要的色谱峰，回收溶剂，得到化合物I；
流份12上ODS柱，以水-甲醇梯度洗脱，得到17个流份即SubFr 1-17，其中SubFr 14经Rp C-18色谱柱分离，得到化合物II及化合物III，其中SubFr 12经Rp C-18色谱柱分离，得到化合物IV；
流份14上ODS柱，以水-甲醇梯度洗脱，得到15个流份即SubFr 1-15，其中SubFr 14经Rp C-18色谱柱分离，得到化合物V。
8.权利要求4-5任一所述的蟾蜍二烯内酯提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.包含权利要求4-5任一所述的蟾蜍二烯内酯提取物的制剂，其特征在于所述制剂为片剂、胶囊、滴丸、乳剂、注射液或冻干粉针剂。
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