CN104774234A

CN104774234A - 一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法

Info

Publication number: CN104774234A
Application number: CN201410009557.1A
Authority: CN
Inventors: 李晓龙; 梁鑫淼; 刘艳芳; 张云; 张秀莉; 薛兴亚
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2014-01-09
Filing date: 2014-01-09
Publication date: 2015-07-15

Abstract

本发明提供了一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法。基于低pH值条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的离子性质的不同，我们采用带正电荷的XCharge C18柱发展了一种新型的高选择性的高效液相色谱分离方法。流动相无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。选取蟾蜍皮95%乙醇提取物反相色谱制备分离所得的一个馏分，通过反相色谱制备获得两类共八个化合物。该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类、非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类的高效制备，特别是对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类，该方法解决了拖尾问题，并表现出的较好的峰形和优异分离效果。从而提供了一种高效系统分离蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础和技术支撑。

Description

一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法

技术领域

本发明涉及蟾蜍二烯内酯类化合物的分离纯化，具体地说是一种反相色谱采用带正电荷的XCharge C18柱在低pH条件下高选择性地分离纯化蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法。该方法对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物表现出较优的分离效果。

背景技术

蟾蜍二烯内酯（bufadienolides）是一类C24甾，并且在甾体母核的C17位接有β六元不饱和内酯环，该类化合物也常被称为蟾蜍二烯内酯。Liselotte.Krenn,Pieter S.Steyn和高慧敏等分别对蟾蜍二烯内酯合物具有的生物活性进行了综述。这些活性主要包括局麻、强心、升压、Na⁺/K⁺-ATP酶抑制活性及抗肿瘤等作用（L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolides from animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.；P.S.Steyn,Fanie R.van Heerden,Bufadienolides of plant andanimal origin,Nat.Prod.Rep,15(1998)397-413.；H.Gao,R.Popescu,B.Kopp,Z.Wang,Bufadienolides and their antitumor activity,Nat.Prod.Rep.,28(2011)953-969.）。另外，此类蟾蜍二烯内类成分中的许多化合物都具有较高的毒性和较严重的副作用，从而制约了此类制剂的使用（D.Wang,F.Qi,W.Tang,F.Wang,Chemical Constituents andBioactivities of the Skin of Bufo bufo gargarizansCantor,Chem.Biodivers.,8(2011)559-567.）。并对使用者带来一定的安全隐患。从天然产物（蟾蜍皮、蟾酥）中分离纯化是获得蟾蜍二烯内酯单体的主要途径。由于蟾蜍二烯内酯类化合物数量多、结构复杂，常规的分离纯化方法较为耗时、低效(L.Krenn,B.Kopp,Bufadienolidesfrom animal and plant sources,Phytochemistry,48(1998)1-29.)。然而，由于此类化合物的本身的结构复杂性和数目的繁多，关于此类化合物的药效理，目前的认识还是远远不够的。因此，采用较为系统的高效的方法从蟾蜍皮中分离出高纯度的蟾蜍二烯内酯类化合进而开展相关药理毒理方面的研究是十分迫切的。

发明内容

本发明涉及一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离纯化方法。

基于低pH值条件下，氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物的离子性质的不同，我们采用带正电荷的XCharge C18柱发展了一种新型的高选择性的高效液相色谱法。流动相组成为乙腈、甲醇、乙醇、甲酸、乙酸、三氟乙酸、水，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理。其中所述的带正电荷的柱子为混合模式柱（XCharge C18，北京华谱新创科技有限公司）。色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；样品浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。所述流动相组成为乙腈-酸-水、甲醇-酸-水、乙醇-酸-水；其中酸可以是以下酸中的一种或几种：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸。在该纯化体系中从蟾蜍皮提取物中制备获得两组八个蟾蜍二烯内酯化合物。所述化合物的结构信息见式1、表1。

式1氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（1-4）和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯（5-8）的结构式

表1纯化制得的8个蟾蜍二烯内酯类化合物信息

一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，

1）蟾蜍皮乙醇提取物先经制备型RPLC分离，水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为体积浓度25%→100%B（V/V）；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，每个组分浓缩至干后备用；

2）针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13，分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%，采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-酸水溶液、甲醇-酸水溶液或乙醇-酸水溶液流动相体系，对F13进行选择性地分离和化合物制备。

反相色谱柱为极性共聚的带正电荷的混合模式柱（XCharge C18）；采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性分离和纯化。

色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。

所述流动相中酸可以是以下酸中的一种或二种以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理，所述酸水溶液中酸的体积浓度为0.1%-0.5%（V/V）。

所述蟾蜍皮提取物为50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

所述化合物具体制备方法为：

1）蟾蜍皮95%乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；样品溶液浓度为440mg/mL，其采用体积浓度65%甲醇-水溶解；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对F13组分(分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%),采用半制备反相色谱进行进一步制备，色谱柱为XChargeC18柱；采用乙腈-酸水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物。

2）选取组分F13采用半制备反相色谱进一步分离，色谱条件：色谱柱为带正电荷的混合模式色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7,8八个化合物；

该方法可以实现蟾蜍二烯内酯化合物的高效制备，特别是解决了氨基酸修饰的蟾蜍二烯内类化合物在低pH条件下拖尾的问题，实现对两类化合物的选择性分离。从而提供了一种高效分离蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。

附图说明

图1蟾蜍皮提取物的高效液相制备色谱图。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例：

1）蟾蜍皮95%（体积浓度）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；分离过程中采用紫外检测器检测，检测波长为300nm；其采用体积浓度65%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计收集22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对富含蟾蜍二烯内酯的组分F13（分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%）采用半制备反相色谱进行制备，色谱柱为XChargeC18柱；以乙腈-酸水为流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物。

化合物1,2,3,4,5,6,7,8的制备：

2）选取组分F13采用半制备反相色谱进行分离纯化，色谱条件：色谱柱为带正电荷的混合模式色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；0.1%（V/V）甲酸水（A）和乙腈（B）流动相体系；洗脱梯度为0-20min,体积浓度23%→23%B;20-25min,体积浓度23%→25%B;25-30min,体积浓度25%→30%B;30-35min,30%→30%B；35-50min,体积浓度30%→40%B;50-60min,体积浓度40%→40%B;流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7,8八个化合物；HPLC检测纯度大于95%，核磁数据数据见下表（表2、表3）

表2化合物1-8的¹³C NMR数据(150MHz，氘代甲醇)

该方法可以实现氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类、非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类的高效制备，特别是对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类，该方法解决了拖尾问题，并表现出的较好的峰形和优异分离效果。从而提供了一种高效系统分离蟾蜍二烯内酯类化合物的新方法，为该类化合物的抗癌活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础和技术支撑。

Claims

1.一种蟾蜍二烯内酯类化合物选择性分离的纯化方法，其特征在于：

2.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：反相色谱柱为极性共聚的带正电荷的混合模式柱（XCharge C18）；采用线性梯度、台阶梯度或等度洗脱方式，对氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物和非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物进行选择性分离和纯化。

3.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：色谱操作参数如下：色谱柱内径为4.6-100mm；采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，蟾蜍皮95%乙醇提取物上样浓度为1mg/mL^-1-1g/mL；进样量为1μL-40mL；流速为1-480mL/min；柱温为10-60℃。

4.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述流动相中酸可以是以下酸中的一种或二种以上：甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸，无缓冲盐添加，便于样品制备后处理，所述酸水溶液中酸的体积浓度为0.1%-0.5%（V/V）。

5.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：所述蟾蜍皮提取物为50%-95%（V/V）乙醇回流提取物。

6.按照权利要求1所述蟾蜍二烯内酯分离纯化方法，其特征在于：

1）蟾蜍皮50%-95%（V/V）乙醇提取物先经制备型RPLC分离，色谱条件：色谱柱为碳十八柱（C18TDE柱）；水（A）和甲醇（B）流动相体系；洗脱梯度为0-7min,体积浓度25%→40%B;7-60min,体积浓度40%→65%B;60-65min,体积浓度65%→100%B;65-75min,100%B；流速为330mL/min；检测波长为300nm；其采用体积浓度65%-80%甲醇-水溶解，样品溶液浓度为440mg/mL；进样体积为40mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，共计22个组分，每个组分浓缩至干后备用；针对F13（分离过程中F13组分对应的流动相中甲醇的体积浓度为57%-58.3%），采用半制备反相色谱进行进纯化制备，色谱柱为XCharge C18柱；采用乙腈-酸水流动相体系，采用线性梯度洗脱方式制备蟾蜍二烯内酯单体化合物；

2）选取组分F13采用半制备反相色谱进行进一步分离，色谱条件：色谱柱为带正电荷的混合模式色谱柱（XCharge C18,250×20mm,i.d.,5μm）；体积浓度0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）流动相体系；流速为19mL/min；检测波长为300nm；进样量为2mL；按各色谱峰的保留时间分别收集各馏分，分别回收溶剂，经核磁实验确定，获得1,2,3,4,5,6,7,8八个化合物；

通过反相色谱制备获得两类八个高纯度蟾蜍二烯内酯化合物；所述两类化合物分别为4个氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯类化合物：化合物1为异沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物2为去乙酰华蟾毒它灵-3-庚二酰精氨酸酯，化合物3为沙蟾毒精-3-庚二酰精氨酸酯，化合物4为远华蟾毒精-3-己二酰精氨酸酯；4个非氨基酸修饰的蟾蜍二烯内酯：化合物5为远华蟾毒精，化合物6为乙酰华蟾毒精，化合物7为华蟾毒它灵，化合物8为3-去氢蟾毒灵。