CN107987087A - 中压制备液相色谱分离纯化钩吻素子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种中压制备液相色谱分离纯化钩吻素子的方法，其特征是包括如下步骤：1）制备上样溶液和洗脱溶剂体系，2）填充色谱柱填料，3）加入上样溶液，梯度洗脱，按出峰时间收集相应吸收峰的洗脱液并用高效液相色谱检测，合并含钩吻素子的洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体；所述的上样溶液制备步骤为：钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经有机溶剂溶解后，采用有机滤膜对样品溶液过滤；所述色谱柱填料为正相硅胶或反相硅胶填料。本发明分离纯化钩吻素子较传统的柱色谱法和高速逆流法具有操作简便、可控性好。可选择不同规格的中压制备色谱仪进行分离，制备量可达到百克级，能满足工业化生产需求。
Description
技术领域
本发明涉及钩吻素子的产业化制备领域，特别是涉及采用中压制备液相色谱法从钩吻生物碱中分离纯化钩吻素子的方法。
背景技术
钩吻（Gelsemium elegans Benth.）马钱科胡蔓藤属常绿木质藤本植物，全株入药，具有“消肿止痛、祛风散瘀、攻毒杀虫”之功效。钩吻的主要有效成分为吲哚类生物碱，具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗银屑病、促进禽畜生长等药理作用。至今已发现的钩吻生物碱单体有98种，其中含量最高且毒性较低的单体为钩吻素子。钩吻素子具有高效低毒的镇痛、抗焦虑等功效，具有良好的药用前景。
目前钩吻素子的来源依赖于从钩吻植物所含钩吻生物碱中分离纯化获得。现有技术主要为柱层析法和高速逆流色谱法。柱层析法的不足之处为分离周期长、回收率低、溶剂量大且难以回收，不利于环保；高速逆流色谱仪器单次制备量仅达克级。
中压制备液相色谱(Medium-pressure liquid chromatography ，MPLC)为近年流行起来的一项新型色谱技术，色谱柱的压力介于低压层析色谱与高压制备色谱之间；可实现在线检测，有上样量大、分离纯度高、成本低等优点，在制药工业中得到逐渐推广和应用。本发明公开中压制备液相色谱法从钩吻生物碱中分离纯化钩吻素子的方法。
发明内容
本发明的目的是在于针对现有钩吻素子产业化制备技术存在的不足，提供一种简单快速、高效环保的中压制备液相色谱分离纯化钩吻素子的方法。
本发明的目的是这样实现的，一种中压制备液相色谱分离纯化钩吻素子的方法，其特征是包括如下步骤：1）制备上样溶液和洗脱溶剂体系，2）填充色谱柱填料，3）加入上样溶液，梯度洗脱，按出峰时间收集相应吸收峰的洗脱液并用高效液相色谱检测，合并含钩吻素子的洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体；
所述的上样溶液制备步骤为：钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经有机溶剂溶解后，采用有机滤膜对样品溶液过滤；
所述色谱柱填料为正相硅胶或反相硅胶填料。
所述的洗脱溶剂系统为有机溶剂的水溶液，梯度体积浓度在10-90%。
上述钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经甲醇溶解后，采用有机滤膜对样品溶液过滤。
所述的洗脱溶剂系统的有机溶剂包括但不局限于甲醇或乙腈。
所述的钩吻素子经适合的酸溶液酸化处理，重结晶可得相应的钩吻素子盐。其中所述钩吻素子盐选自盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐，优选是盐酸盐。
上述洗脱溶剂为甲醇-水梯度洗脱溶剂。
具体地说，本发明采用的技术方案为：
一种中压制备液相色谱产业化分离纯化钩吻素子的方法，其特征是：制备上样溶液和洗脱溶剂体系，填充色谱柱填料，加入上样溶液，梯度洗脱150 min，流速6~18 mL/min，按出峰时间收集相应吸收峰的洗脱液并用高效液相色谱检测，检测波长为256 nm，合并含钩吻素子的洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体。
所述的上样溶液为钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经有机溶剂优选甲醇溶解后，采用0.45 µm有机滤膜对样品溶液过滤。
所述色谱柱填料为正相硅胶或反相硅胶填料，正相硅胶粒径选用200-600目，反相硅胶粒径选用30 ~70 µm。
所述的洗脱溶剂系统为有机溶剂的水溶液，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙腈等，梯度浓度在10-90%。
所述的钩吻素子经适合的酸溶液酸化处理，重结晶可得相应的钩吻素子盐。
本发明的优点是：
1）方便快捷。本发明操作简便，分离周期短。传统的分离制备方法操作繁杂、分离周期长；本法采用中压制备色谱法分离纯化钩吻素子，整个分离流程在150 min内完成，只需一步即可得到钩吻素子单体。
2）重复可控性好。传统的柱层析可控和重复性较差，而本法参数可控、重复性好，适合自动化生产，可推广应用。
总之，中压制备液相色谱法分离纯化钩吻素子较传统的柱色谱法和高速逆流法具有操作简便、可控性好；根据所需的目标样品量，可选择不同规格的中压制备色谱仪进行分离，制备量可达到百克级，能满足工业化生产需求。中压制备色谱纯化所得的钩吻素子可与酸成盐扩大适用范围。本方法可作为钩吻素子及其可接受的盐在制备药品、保健品和饲料等方面应用时的产业化制备方法。
附图说明
图1是钩吻素子中压制备液相分离谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明，但不对本发明的实施范围构成任何限制。
实施例1
1.样品：钩吻素子粗品，系从钩吻中提取获得的钩吻总生物碱（徐坚，梁崇真. 钩吻总生物碱提取方法的比较[J]. 药学通报，1988,23(6):341-342.），钩吻素子纯度为17%。钩吻素子粗品用甲醇溶解，配制成浓度为25 mg/mL，过0.45 µm有机滤膜得上样液。
2.仪器：江苏利穗Dr flashⅡ中压制备液相色谱仪。
3.洗脱溶剂：甲醇-水体积比（50︰50~80︰20）梯度洗脱溶剂体系。
4.分离纯化：先用甲醇-水体积比（50︰50）对填装好的步骤2的中压制备色谱仪中的色谱柱进行平衡，调整泵流速为12 mL/min，检测波长256 nm。将上样液10 mL泵入色谱柱后甲醇-水体积比（50︰50~80︰20）梯度洗脱150 min，用高效液相色谱法检测含钩吻素子的洗脱液，中压制备分离谱图见图1。合并洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体。钩吻素子纯品加1 mol/L盐酸溶解，旋干，加少量甲醇加热溶解，放置冷却析晶，得钩吻素子盐酸盐。
实施例2
1.样品：钩吻素子粗品，系从钩吻中提取获得的钩吻总生物碱（张兰兰. 钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离[J]. 第一军医大学学报，2004,24(9):1006-1008.），钩吻素子纯度为22%。钩吻素子粗品用甲醇溶解，配制成浓度为25 mg/mL，过0.45 µm有机滤膜得上样液。
2.仪器：江苏利穗Dr flashⅡ中压制备色谱仪。
3.洗脱溶剂：甲醇-水体积比（50︰50~80︰20）梯度洗脱溶剂体系。
4.分离纯化：先用甲醇-水体积比（50︰50）对填装好的色谱柱进行平衡，调整泵流速为12 mL/min，检测波长256 nm。将上样液10 mL泵入色谱柱后甲醇-水（50︰50~80︰20）梯度洗脱150min，用高效液相色谱法检测含钩吻素子的洗脱液。合并洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体。钩吻素子纯品加1 mol/L盐酸溶解，旋干，加少量甲醇加热溶解，放置冷却析晶，得钩吻素子盐酸盐。
实施例3
1.样品：钩吻素子粗品，系从钩吻中提取获得的低纯度钩吻素子（纯度为26%）（赵庆春,郭涛,张萍. 大孔吸附树脂在分离纯化钩吻总生物碱的研究[J]. 中国药房，2006,17(13):969-971.）。钩吻素子粗品用甲醇溶解，配制成浓度为25 mg/mL，过0.45 µm有机滤膜得上样液。
2.仪器：江苏利穗Dr flashⅡ中压制备色谱仪。
3.洗脱溶剂：甲醇-水体积比（50︰50~80︰20）梯度洗脱。
4.分离纯化：先用甲醇-水体积比（50︰50）对填装好的色谱柱进行平衡，调整泵流速为12 mL/min，检测波长256 nm。将上样液10 mL泵入色谱柱后甲醇-水（50︰50~80︰20）梯度洗脱150 min，用高效液相色谱法检测含钩吻素子的洗脱液。合并洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体。钩吻素子纯品加1 mol/L盐酸溶解，旋干，加少量甲醇加热溶解，放置冷却析晶，得钩吻素子盐酸盐。
实施例1-3仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种中压制备液相色谱分离纯化钩吻素子的方法，其特征是包括如下步骤：1）制备上样溶液和洗脱溶剂体系，2）填充色谱柱填料，3）加入上样溶液，梯度洗脱，按出峰时间收集相应吸收峰的洗脱液并用高效液相色谱检测，合并含钩吻素子的洗脱液，减压蒸干，乙醇重结晶得钩吻素子单体；
所述的上样溶液制备步骤为：钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经有机溶剂溶解后，采用有机滤膜对样品溶液过滤；
所述色谱柱填料为正相硅胶或反相硅胶填料。
所述的洗脱溶剂系统为有机溶剂的水溶液，梯度体积浓度在10-90%。
2.根据权利要求1所述的产业化分离制备钩吻素子的方法，其特征是钩吻总生物碱或低纯度钩吻素子经甲醇溶解后，采用有机滤膜对样品溶液过滤。
3.根据权利要求1或2所述的产业化分离制备钩吻素子的方法，其特征是所述的洗脱溶剂系统的有机溶剂包括但不局限于甲醇或乙腈。
4.根据权利要求1或2所述的产业化分离制备钩吻素子的方法，其特征是所述的钩吻素子经适合的酸溶液酸化处理，重结晶可得相应的钩吻素子盐。其中所述钩吻素子盐选自盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐，优选是盐酸盐。
5.根据权利要求1或2所述的产业化分离制备钩吻素子的方法，其特征是洗脱溶剂为甲醇-水梯度洗脱溶剂。
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