CN115491316A - 隐蔽型毒素t-2-3g的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种隐蔽型毒素T‑2‑3G的制备方法，以T‑2毒素作为研究对象，基于酵母菌的生物转化，通过中压制备液相色谱仪分离纯化隐蔽型毒素T‑2‑3G，然后采用液相色谱串联四极杆时间质谱进行初步鉴定，最后以核磁共振波谱仪鉴定纯化产物、通过液相色谱仪分析其纯度，MS/MS图谱与文献基本一致。另外，T‑2毒素本身对酵母菌有一定的侵害作用，浓度越高，酵母菌死亡越多，生物转化效率越低。

Description

隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法。
背景技术
在镰刀菌中，单端孢霉烯族对农作物的污染最为严重。其中以A类单端孢霉烯族毒素为代表的T-2毒素毒性最强，一般会引起动物拒食、呕吐、白细胞减少和免疫抑制等症状。
当T-2毒素侵染植物时，植物为了保护自身免受侵害，其通过葡萄糖、丙二酸和谷胱甘肽等极性较强的物质共价结合T-2毒素，改变T-2毒素的真菌结构，从而降低T-2毒素的植物毒性。由于毒素结构发生改变，没有相应的标准品，常规分析方法很难有效地检测其存在，因此又称为隐蔽型真菌毒素。
近些年来，霉菌毒素研究发现，霉菌毒素可以在植物体内发生代谢。在植物体内，霉菌毒素会与葡萄糖等极性较大的化合物发生结合，修饰几种真菌毒素的结构，从而降低其毒性，目前现有的检测方法不能有效的检测出这些毒素的存在，因此将其称之为隐蔽型毒素(masked mycotoxins)[1]。已发现的隐蔽型真菌毒素有几十种，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖(deoxynivalenol-3-glucoside，DON-3-Glc，D3G)、玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖苷(zearalenone-14-glucoside，ZEN-14-Glc，Z14G)和T-2毒素-3-葡萄糖苷(T-2toxin-3-glucoside，T2-3G)、HT-2毒素-3-葡萄糖苷(HT-2toxin-3-glucoside，HT-2-3G)等[2]。
全球有接近25％的粮食受到真菌的侵染，但关于隐蔽型真菌毒素的污染状况与危害程度报道较少。资料显示，巴伐利亚地区随机抽样25个小麦和玉米样品，有24个样品受到ZEN的侵害，检出率为96％，含量为11-860μg/kg，受到其隐蔽型ZEN-14G侵染的样品有10个，检出率为42％，含量在17-104μg/kg[3]；在捷克地区随机抽样的白粉、面粉、混合面粉等116个样品中，有75％的样品检测出DON的存在，含量为13-594μg/kg，其中DON隐蔽型毒素D3G的检出率更高，达80％，含量为5-72μg/kg[4]；2007-2008年，在我国河南、河北、广西、安徽、四川、重庆和江苏等七个省采集玉米和小麦共446份样品，小麦和玉米中真菌毒素主要以DON和ZEN为主，其中两种基质中都有检测出D3G，检出率为34％，小麦和玉米中D3G的含量中位数分别为21.4μg/kg和34.6μg/kg[5]；对德国谷物的调查发现，真菌毒素含量超过人体每日耐受摄入量的百分比分别为0.85％(DON及隐蔽型)、2.75％(ZEN及隐蔽型)和4.11％(T-2、HT-2及隐蔽型)，T-2毒素风险最高[6]。
隐蔽型毒素T-2-3G的产生源于植物对外来入侵者的保护机制，降低T-2毒素对其的毒害作用，但T-2-3G本身对于人或动物的毒害作用研究较少。McCormick等开展了T-2-3G在人结肠微生物菌群的代谢研究，证明了肠道微生物可以有效的降解T-2-3G，将其降解成原型T-2毒素及其水解产物HT-2毒素[2]；有研究证明，给小鼠灌服3mg/kg的T-2-3G之后，12h、24h、48h和72h分别收集尿液和粪便等排泄物，结果显示尿液中无T-2-3G及其原型，但在粪便中发现T-2毒素和未代谢的T-2-3G[2]。上述研究也证明了T-2-3G在被人或动物食入以后，会在肠道微生物的作用下还原其亲本，造成动物食物中毒，甚至死亡[2]。
由于隐蔽型毒素较毒素原型结构发生了改变，没有相应的标准品，常规分析方法很难有效地检测其存在，因此又称为隐蔽型毒素。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足，目的是提供一种隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其包括如下步骤：
(1)、将YPD固体培养基灭菌，灭菌结束后，将YPD固体培养基倒入培养皿内，放置过夜凝固；
(2)、将灭菌后的酵母菌放入凝固的YPD固体培养基中培养；
(3)、将步骤(2)培养过的酵母菌放入G-YNB液体培养基中，并加入T-2毒素，黑暗条件下，放入恒温叠加式摇床中转速培养；
(4)、培养后离心，并将上清液旋转蒸发，然后加入甲醇，再次离心，采用中压制备液相色谱仪检测上清液。
进一步地，步骤(1)中，YPD固体培养基的组分包括酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖和琼脂粉。
进一步地，步骤(1)中，灭菌的温度为120℃，时间为20min。
进一步地，步骤(3)中，G-YNB液体培养基的组分包括酵母氮源和葡萄糖。
进一步地，步骤(3)中，叠加式摇床的转速为200rpm，转速培养的时间为5-6天。
进一步地，步骤(4)中，离心的转速为5000rpm，时间为10min。
进一步地，步骤(4)中，再次离心的转速为5000rpm，时间为10min。
进一步地，步骤(4)中，中压制备液相色谱仪中色谱柱为wasters的5μm 100A，20×250mm，Unitary C18色谱柱，流动相A为0.1％甲酸-水溶液，流动相B为纯乙腈；进样体积为200μL，流速为18mL/min。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明以T-2毒素作为研究对象，基于酵母菌的生物转化，通过中压制备液相色谱仪分离纯化隐蔽型毒素T-2-3G，然后采用液相色谱串联四极杆时间质谱进行初步鉴定，MS/MS图谱与文献基本一致。另外，T-2毒素本身对酵母菌有一定的侵害作用，浓度越高，酵母菌死亡越多，生物转化效率越低。
附图说明
图1为本发明实施例2中酵母菌在YPD和PDA固体培养基上的生长情况图。
图2为本发明实施例4中酵母菌体内T-2毒素的代谢转化情况图。
图3为本发明实施例4中T-2-3G在制备液相上的色谱图。
图4为本发明实施例4中T-2和T-2-3G在制备液相色谱仪上的分离情况图之一。
图5为本发明实施例4中T-2和T-2-3G在制备液相色谱仪上的分离情况图之二。
图6为本发明实施例5中T-2-3G在LC-Q TOF/MS上的色谱图。
图7为本发明实施例5中T-2-3G的精确MS和MS/MS图谱及其可能的裂解途径图。
图8为本发明实施例6中T-2-3G的1H和13C核磁共振光谱图。
图9为本发明以碳编号的T-2-3G的结构图。
图10为本发明基于UPLC-MS/MS的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法。
1.试验酵母菌：
酵母菌(B.muscicola)编号为NRRL Y-993，购于北京北纳创联生物技术研究院。
2.试剂材料
T-2毒素(T-2toxin)(>99％)购于青岛普瑞邦生物工程有限公司。
甲醇(色谱纯)购于美国Merck公司。
乙腈(色谱纯)购于美国Merck公司。
YNB购于北京拜尔迪生物技术有限公司。
D-无水葡萄糖购于上海源叶生物科技有限公司。
胰蛋白胨购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
琼脂购于美国BD公司上海有限公司。
胶头滴管购于北京维莱博生物技术有限公司。
酵母浸粉购于北京索莱宝科技有限公司。
50mL离心管购于上海秋爽生物科技有限公司。
移液枪枪头购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
3.仪器
超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)购于美国Waters公司。
Sorvall ST16R型高速冷冻离心机购于美国Thermo Fisher公司。
DC-24型氮吹干仪购于上海安普实验科技股份有限公司。
2500TH型超声波清洗机购于上海安普实验科技股份有限公司。
0.22μm有机系滤膜购于天津市津腾实验设备有限公司。
电子分析天平AL-104购于梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
ALP/CL-40L高压灭菌锅购于日本TOMY公司。
TS-2S100叠加式摇床购于上海捷呈实验仪器有限公司。
中压制备液相色谱仪购于美国Waters公司。
液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-Q TOF/MS)、AB-SCIEX质谱、Milli-Q超纯水仪购于美国Milli-Q公司。
LL3000冷冻干燥机购于丹麦Heto PowerDry。
R-250旋转蒸发仪购于瑞士BUCHI公司。
Thermo Scientific Heraguard ECO超净台购于美国Thermo Fisher scientific公司。
AVANCE-500核磁共振波谱仪(NMR)购于德国BRUKER公司。
Sorvall ST 16R 75004380台式冷冻离心机购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
MX-RL-PRO旋转混匀仪购于上海怡临仪器科技有限公司。
实施例1
溶液配制
YPD固体培养基：分别将酵母浸粉(Yeast Extract)10g、胰蛋白胨(Peptone)20g、葡萄糖(Dextrose glucose)20g和琼脂粉20g等溶入1L无菌水中搅拌均匀，培养基放入高压锅内，以121℃高压灭菌20min。
G-YNB液体培养基：分别将酵母氮源(YNB)5g和葡萄糖(Dextrose glucose)20g溶入1L无菌水中搅拌均匀，在超净台内过滤灭菌，后置高压灭菌后的容量瓶中。
YNB液体培养基：将酵母氮源(YNB)5g溶入1L无菌水中搅拌均匀，在超净台内过滤灭菌，置高压灭菌后的容量瓶内。
实施例2
酵母菌(B.muscicola)活化
1.配制培养基
将装有YPD琼脂培养基的500mL容量瓶瓶口拧松并用锡纸包裹完全，放入高压蒸汽灭菌锅内以121℃高压灭菌20min。灭菌结束，待容量瓶温度低于60℃时，将YPD琼脂培养基稍稍混匀，用75％酒精杀菌消毒后放入无菌通风操作台内。点燃酒精灯，取60cm一次性塑料无菌培养皿若干，将YPD琼脂培养基倒入其中，使培养基体积为培养皿本身的1/3。倒完培养基后，于无菌通风操作台内放置过夜，待YPD琼脂培养基凝固后接种酵母菌。
2.酵母菌活化
将存有酵母菌(B.muscicola)的玻璃管用75％酒精杀菌消毒后放入无菌通风橱台内，点燃酒精灯，把装有酵母菌的玻璃小管放置到酒精灯上使玻璃管软化，使用高压灭菌的镊子打开玻璃管。取少量酵母菌(B.muscicola)干粉放入已经高温杀菌后的YPD琼脂培养基中培养2-3天，观察酵母菌形态与生长情况。
如图1所示，在YPD琼脂培养基(左)和PDA琼脂培养基(右)上，酵母菌(Blastobotrys muscicola)形态为多边，细胞为单发或成对，偶见球形，2.0×4.1μm，但多数为细长形，常为纺锤形，1.5-2.5×8.0-22.0μm。较大的长形细胞常形成顶生小齿，可产生芽分生孢子。菌落生长呈暗白色和菌丝状。菌丝在各种培养基上发育膨胀的球形细胞，生长在短齿上，但这些细胞不形成子囊孢子，也不表现为子囊孢子[7]。
实施例3
生物转化
1.酵母菌的培养
G-YNB组：取10支无菌的50mL离心管，加入20mL过滤灭菌的葡萄糖酵母氮源液体培养基(G-YNB液体培养基)，将在YPD琼脂培养基上培养了3天的酵母菌(B.muscicola)用灭菌的挑菌棒取等量菌丝分别放入10个50mL离心管中。在黑暗条件下，放入25℃恒温叠加式摇床中以200rpm的转速培养5-6天。
YNB组：取10支无菌的50mL离心管中含有20mL过滤灭菌的酵母氮源液体培养基(YNB液体培养基)，将在YPD琼脂培养基上培养了3天的酵母菌(B.muscicola)用灭菌的挑菌棒取等量菌丝分别放入10个50mL离心管中。在黑暗条件下，放入25℃恒温叠加式摇床中以200rpm的转速培养5-6天。
2.酵母菌攻毒
G-YNB组：五天后，将含有酵母菌培养物的50mL离心管与不含有酵母菌培养物的50mL离心管以3000rpm的转速离心10min，弃上清液，重新加入20mL过滤灭菌的葡萄糖酵母氮源液体培养基(G-YNB液体培养基)，使酵母菌重悬于G-YNB液体培养基中。
将50mg T-2毒素溶入到5mL甲醇中，配成10000mg/L的标准工作液，加入200μL T-2毒素标准溶液到含有酵母菌和不含有酵母菌的50mL离心管中，使其最终浓度达到2000mg/L。(甲醇的终浓度要小于培养总体积的1％)。
攻毒结束后，在黑暗条件下，放入25℃恒温培养箱摇床中以200rpm的转速培养6天。每天分别取20μL离心后的上清液放入4℃冰箱中保存，待测。
YNB组：五天后，将含有酵母菌培养物的50mL离心管与不含有酵母菌培养物的50mL离心管以3000rpm的转速离心10min，弃上清液，重新加入20mL过滤灭菌的葡萄糖酵母氮源液体培养基(YNB液体培养基)，使酵母菌重悬于G-YNB液体培养基中。
将50mg T-2毒素溶入到5mL甲醇中，配成10000mg/L的标准工作液，加入200μL T-2毒素标准溶液到含有酵母菌和不含有酵母菌的50mL离心管中，使其最终浓度达到2000mg/L.(甲醇的用量小于最终培养体积的1％)。
攻毒结束后，在黑暗条件下，放入25℃恒温培养箱摇床中以200rpm的转速培养6天。每天分别取20μL离心后的上清液放入4℃冰箱中保存，待测。
实施例4
T-2-3G的制备
1.毒素提取
将摇床中的50mL离心管全部拿出，使用台式冷冻离心机以5000rpm离心10min，取无菌的滤纸和灭菌的漏斗于旋蒸瓶口处，将上清液倒入高压灭菌后的旋蒸瓶中，待所有上清液过滤至旋蒸瓶中，通过R-250旋转蒸发仪60℃进行浓缩。当旋蒸瓶中液体全部蒸干，毒素贴在旋蒸瓶内壁中，少量多次加入纯甲醇(色谱级)，放入2500TH型超声波清洗机中，使毒素充分溶解在甲醇中，用胶头滴管将所有液体吸入灭菌的50mL离心管中。当毒素全部从旋蒸瓶上洗脱下来，静置24h，使用台式冷冻离心机以5000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜后待测。
T-2毒素向T-2-3G生物转化条件的优化：
(1)培养时间与T-2毒素攻毒剂量的选择
预试验过程中，分别给酵母菌培养液中添加终浓度为5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L的T-2毒素，并每天取少量上清液待测。
如图2所示，A-F依次为添加5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L的T-2毒素，当喂食T-2毒素1-2天时，T-2毒素的减少量没有明显的变化，只减少了15％；当喂食T-2毒素3-4天时，T-2毒素的减少量并没有明显增加，反而减少了2％；当喂食T-2毒素5-6天时，T-2毒素减少量到达一个峰值；当喂食T-2毒素7天之后，T-2毒素减少量趋于稳定，不再变化。
通过T-2毒素的减少量，初步推算酵母菌的生物转化率。分别给酵母菌喂食终浓度分别为5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L的T-2毒素七天后，通过UPLC-MS/MS检测T-2毒素含量显示，酵母菌的生物转化率为82％、65％、73％、77％和58％。
由此可见，酵母菌(B.muscicola)随着培养时间的推移，葡萄糖的不断减少，6天是最佳培养时间；通过喂食不同浓度的T-2毒素，发现毒素含量越高，转化效率越低，这说明了T-2毒素本身对酵母菌有一定的侵害作用，浓度越高，酵母菌死亡越多，生物转化效率越低。考虑制备含量的高低，最好选择终浓度为200mg/L的T-2毒素作为最优选择。
其中，培养时间与T-2毒素剂量的选择
T-2毒素有两个乙酰基，分别是C-4和C-15，这两个乙酰基都是生物转化的靶点。例如，据报道，一株短小杆菌(Curtobacterium)可以迅速将T-2毒素转化为HT-2毒素和T-2三醇，后者的毒性明显低于T-2毒素[8]。据报道，土壤和淡水细菌混合富集培养也可将T-2毒素转化为HT-2毒素和T-2三醇[8]。
基于微生物可以使T-2生物转化为弱毒或无毒的代谢产物的前提下，根据文献报道，酵母菌(B.muscicola)在喂食足够量的T-2毒素时，可以生物转化为隐蔽型毒素T-2-3G，这为本发明的第一阶段打下了坚实的基础[9]
本发明以酵母菌(B.muscicola)作为生物转化媒介，加入一定量的T-2毒素来转化T-2-3G。通过T-2毒素的减少量，初步推算酵母菌的生物转化率。分别给酵母菌加入终浓度分别为5mg/L、25mg/L、100mg/L、200mg/L、250mg/L、500mg/L的T-2毒素七天后，通过UPLC-MS/MS检测T-2毒素含量显示，酵母菌的生物转化率为82％、65％、73％、77％和58％。
由此可见，酵母菌随着培养时间的推移，葡萄糖的不断减少，6天是最佳培养时间；通过喂食不同浓度的T-2毒素，发现毒素含量越高，转化效率越低，这说明了T-2毒素本身对酵母菌有侵害作用，浓度越高，酵母菌死亡越多，生物转化效率越低。考虑制备含量的高低，最好选择终浓度为200mg/L的T-2毒素作为最优选择。
(2)培养基的选择
如图2所示，在无葡萄糖的YNB培养基上培养的酵母菌，喂食T-2毒素后，T-2毒素浓度有所下降，但下降的速度明显低于有葡萄糖的培养基。尤其是4天以后，有超过一半的T-2毒素仍然存在。结果显示，酵母菌生物转化的同时仍然需要葡萄糖提供足够的营养，否则无法产生T-2毒素的葡萄糖结合体。
2.中压制备液相制备
采用中压制备液相色谱仪(Waters Auto-P LC)，色谱柱为wasters的5μm 100A，20×250mm，Unitary C18色谱柱，质谱检测器采集的质谱信息见表1；流动相A为0.1％甲酸-水溶液(V/V)，流动相B为纯乙腈；进样体积为200μL，流速为18mL/min。洗脱条件设置见表2。
表1 T-2毒素和T-2-3G在多反应监测模式下的质谱参数
Figure BDA0003726402160000071
表2 Unitary C18制备液相色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003726402160000081
中压制备液相色谱仪制备T-2-3G
(1)色谱条件的优化
为了更好的分离纯化T-2和T-2-3G两种毒素，对水相进行了优化，分别尝试了纯水和0.1％甲酸水(V/V)。当使用纯水时，T-2-3G并未出峰，峰形杂乱，如图3中(A)；当使用0.1％甲酸水(V/V)时，出现一个较为尖锐的峰形，但杂峰较多；如图3中(B)所示：在流动相为0.1％甲酸水溶液(V/V)的基础上，对洗针液纯甲醇中添加0.1％甲酸之后，杂峰少，峰形尖锐。由此，本次实验选择乙腈作为有机相，0.1％甲酸水作为水相，并在洗针液中添加0.1％甲酸作为液相条件。
(2)T-2-3G分离纯化
为了保证T-2毒素和T-2-3G二者分离，故选择0.1％甲酸水溶液和纯乙腈作为水相和有机相；以0-18min，70％A，18-20min，40％A，20-22min，5％A，22-25min，70％A为洗脱梯度。如图4(图4中左侧为T-2-3G曲线，右侧为T-2曲线)和图5所示，T-2-3G在10-11min的时候出峰，T-2毒素在17-18min时出峰，二者分离良好，峰形尖锐。
(3)T-2-3G含量
通过中压制备液相分离纯化，使用旋蒸仪对T-2-3G进行浓缩，加热温度为60℃，取3mL甲醇放入旋蒸瓶内，于2500TH型超声波清洗机内超声至旋蒸瓶上的毒素完全溶解于甲醇内。然后在冷冻干燥机中真空干燥。
为了分离出足够多量的T-2-3G，培养了较多的菌种，并喂食了25.6mg T-2毒素。最终得到了13.3mg的T-2-3G，转化效率为51.9％。
(4)中压制备液相色谱仪制备T-2-3G
McCormick等人通过通过乙酸乙酯萃取结合薄层色谱法进行T-2-3G的制备，以甲醇和乙酸乙酯(50：50，V/V)从硅胶中洗脱T-2-3G[9]。基于当时条件有限，此方法对于T-2-3G的纯度无法保证。
通过文献报道[10]，中压制备液相色谱仪可以更好的做到T-2-3G的分离纯化，一次制备可保证T-2-3G纯度达90％以上。
根据T-2毒素的减少量可以初步断定，酵母菌是否将T-2毒素完全转化为T-2-3G，所以转化产物中预计含有T-2毒素和T-2-3G的混合液。UPLC-MS/MS对产物进行初步鉴定发现，产物中含有大量的T-2毒素和T-2-3G，以及少量的HT-2毒素和HT-2-3G。由此可见，虽然酵母菌培养物能将T-2毒素转化为T-2-3G，但它们不能代谢HT-2毒素。通过C-4乙酰基的轻度水解，T-2-3G可以得到HT-2-3G。HT-2-3G含量不高，仅占T-2毒素和T-2-3G总浓度的5％。
基于UPLC-MS/MS的色谱图情况(如图10所示)，发现T-2-3G和T-2毒素的出峰时间分别为3.26min和3.97min。二者出峰位置靠近，难以分离纯化。故流动相A为0.1％甲酸，流动相B为纯乙腈，在梯度洗脱程序上选择为：0-18min，70％A，18-20min，40％A，20-22min，5％A，22-25min，70％A，使二者充分分离，便于分离纯化T-2毒素和T-2-3G。
结果显示，经中压制备液相色谱仪分离纯化，通过旋蒸仪浓缩与真空冻干机冻干后，得到13.3mg的T-2-3G。由于加入了T-2毒素25.6mg，故通过酵母菌生物转化的转化率为51.9％。
3.Unitary C18制备色谱柱馏分采集
经Unitary C18制备色谱柱分离T-2和T-2-3G，使二者完全分离。在不同时间段内分别采集T-2-3G、T-2馏分，根据样品出锋时间在不同样品之间分别设置重复洗针程序，防止不同样品交叉感染。不同样品收集及洗针时间设置如表3。
表3 Unitary C18制备不同时馏分收集和洗针时间设置
Figure BDA0003726402160000091
4.冷冻干燥
将收集的含目标化合物的液体在旋转蒸发仪下浓缩至干，其水浴温度控制在60℃。取3mL甲醇放入旋蒸瓶内，于2500TH型超声波清洗机内超声至旋蒸瓶上的毒素完全溶解于甲醇内。
真空冻干机预冷：点击打开制冷机，制冷系统开始运行，冷阱开始降温，待仪器预冷一小时后放入冷冻样品。同时，冷阱温度需降到-40℃以下。
放样：需检查玻璃罩与橡胶圈是否清洁无异物。首先，将样品放入10mL离心管内，用液氮将样品凝固成固态，打开离心管盖，用封口膜将离心管口封住；接着，用针头在封口膜上扎几个小孔；最后将样品放入升华架上，罩上干燥桶。
抽真空：拧紧充气阀，点开真空计，当真空度下降至稳定，即100Pa以内。
取样：当监测到样品温度达到室温且3个小时没有任何变化，说明样品已经干燥完毕，此时缓慢拧开充气阀，待真空计数值趋于稳定时，打开玻璃罩，取出样品。
实施例5
液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-Q TOF/MS)鉴定产物
1.样品前处理
取出4℃冰箱中待测样品，按照样品:乙腈(50/50，V/V)分别加入500μL的样品与500μL的乙腈，涡旋超声各3min，放入高速冷冻离心机中以13000rpm离心5min，过0.22μm尼龙膜后待测。
2.色谱条件
色谱柱为：XBridge BEH C18(100mm×3.0mm，2.5μm)。柱温：40℃；进样器温度：室温；进样量：3μL。色谱条件见表4。
表4液相色谱串联四极杆时间质谱色谱梯度洗脱条件
Figure BDA0003726402160000101
3.质谱条件
液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-Q TOF/MS)的质谱配备了电喷雾电离源(ESI)，碰撞气体为氩气，压力为8*10-3mBar；托溶剂气体为氮气(N2)。有关T-2-3G的质谱信息参数设置如下表5。
表5 T-2-3G的质谱条件
Figure BDA0003726402160000102
液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-Q TOF/MS)鉴定产物：
(1)液相色谱串联四极杆时间质谱分析结果
如图6所示，在转化产物中随机选择四管进行LC-Q TOF/MS分析，结果四管产物中都在保留时间为9.430min时出峰，峰形尖锐。
(2)T-2-3G的MS/MS图谱解析
在保留时间为9.340处进行MS和MS/MS分析，如图7所示。
T-2-3G在ESI正离子模式下易生成加氨离子m/z 646.2959([M+NH4]+,[C30H48O14]+)。图7中(右)为T-2-3G的MS/MS图谱。随后，该离子C-8位的己戊酰基和C-3位的糖苷基团发生碎裂，通过分别丢失102Da和162Da形成碎片离子m/z 527.2042和m/z467.2180。碎片离子m/z 467.2180进一步的丢失102Da形成碎片离子m/z 365.1545，而碎片离子m/z365.1545C-3位羟基、C-15位乙酰基、C-4位乙酰基和C-6位甲基醇在CID作用下，相继发生断裂，生成碎片离子m/z 305.1341，m/z 245.1135，m/z 215.1034，m/z 185.0934。
实施例6
NMR核磁共振
样品处理
取核磁管和管塞，先用超纯水清洗两到三次后，用色谱级甲醇清洗两到三次，放入标物干燥罐中干燥24h；精准称取待测样品10.283mg放入10mL离心管中，放入标物干燥罐中干燥24h。
待核磁管和待测样品干燥完全，在待测样品中加入氘代甲醇(CD3OD)500μL，涡旋30s，超声3min，用离心机以10000rpm离心10min后，吸取上清液至核磁管内。
用AVANCE-500核磁共振波谱仪(NMR)进行定性分析。
NMR核磁共振鉴定
如图8所示，质子和13C NMR谱(表6和表7)证实了通过酵母菌(B muscicola)生物转化产物为T-2-3G，此外，葡萄糖苷基的异位信号(H-26,4.96ppm,d,J＝3.7Hz；C-26,100.47ppm)表明它通过轴向(α-)糖苷键与T-2毒素相连。
表6 T-2-3G的质子核磁共振光谱
Figure BDA0003726402160000121
α*indicates that shifts for positions 23and 25may be reversed
表7 T-2-3G在核磁共振上的13C数据
Figure BDA0003726402160000131
α*indicates that shifts for positions 23and 25may be reversed；**indicates that shifts for positions 22and 24may be reversed
鉴定T-2-3G：
仅有少量文献进行了T-2-3G的MS/MS和NMR分析。
根据文献显示，T-2-3G在进行MS/MS分析时，母离子易于结合氨离子m/z 646([M+NH4]+,[C30H48O14]+)[9]。通过对产物进行液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-QTOF/MS)分析，特征性离子m/z 527、467、365、305、245、215和185和文献中MS/MS图谱[9]进行比对完全吻合，初步判断转化产物为T-2-3G。
基于此，对制备纯化产物进行核磁共振(NMR)分析，质子和13C NMR谱(表8)证实了通过酵母菌(Blastobotrys muscicola)生物转化产物为T-2-3G。
表8制备得到的T-2-3G核磁图谱数据与文献中T-2-3G核磁数据比对
Figure BDA0003726402160000151
总之，以T-2毒素作为研究对象，基于酵母菌(B.muscicola)的生物转化，通过中压制备液相色谱仪分离纯化隐蔽型毒素T-2-3G，然后采用液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-QTOF/MS)进行初步鉴定，最后以AVANCE-500核磁共振波谱仪(NMR)结果确定产物。
在酵母菌(B.muscicola)足够多的情况下，给予25.6mg T-2毒素，在黑暗条件下培养6-7天。通过中压制备液相色谱仪的分离纯化，得到了13.3mg的T-2-3G，生物转化效率为51.9％；在此基础之上，对产物进行初步鉴定，通过液相色谱串联四极杆时间质谱(LC-QTOF/MS)结果显示，MS/MS图谱与文献基本一致，特征性离子如下：m/z 527.0261、m/z467.2221、m/z 365.1547、m/z 305.1343、m/z 245.1146、m/z 215.1041和m/z 185.0944；最后，通过AVANCE-500核磁共振波谱仪(NMR)碳谱和氢谱的解析，证实产物为T-2-3G。
T-2-3G的确切结构为T-2-3α-G，理化性质与T-2毒素类似，但其易溶于水。其相对分子质量为628.7，分子式为C30H44O14。其化学结构如图9。
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对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (8)

1.一种隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）、将YPD固体培养基灭菌，灭菌结束后，将YPD固体培养基倒入培养皿内，放置过夜凝固；
（2）、将灭菌后的酵母菌放入凝固的YPD固体培养基中培养；
（3）、将步骤（2）培养过的酵母菌放入G-YNB液体培养基中，并加入T-2毒素，黑暗条件下，放入恒温叠加式摇床中转速培养；
（4）、培养后离心，并将上清液旋转蒸发，然后加入甲醇，再次离心，采用中压制备液相色谱仪检测上清液。
2.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述YPD固体培养基的组分包括酵母浸粉、胰蛋白胨、葡萄糖和琼脂粉。
3.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述灭菌的温度为120℃，时间为20min。
4.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述G-YNB液体培养基的组分包括酵母氮源和葡萄糖。
5.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述叠加式摇床的转速为200rpm，转速培养的时间为5-6天。
6.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述离心的转速为5000rpm，时间为10min。
7.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述再次离心的转速为5000rpm，时间为10min。
8.根据权利要求1所述的隐蔽型毒素T-2-3G的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述中压制备液相色谱仪中色谱柱为wasters的5µm 100A，20×250 mm，Unitary C18 色谱柱，流动相A为0.1 %甲酸-水溶液，流动相B为纯乙腈；进样体积为200 µL，流速为18 mL/ min。
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