CN110196301A - 一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，包括确定色谱条件，对照品溶液的制备，供试品溶液的制备和测定法等步骤。该方法可以在同一色谱条件下同时检测蟾酥中八种成分的含量，不仅能有效简化操作步骤，而且显著缩短了测定时间，大大提高了检测效率，有利于实现对蟾酥质量的全面控制。本发明的检测方法灵敏度高，八种成分的色谱峰分离度均大于1.5，且峰型完整，检测方法具有专属性，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法。
背景技术
蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺及表皮腺体的分泌物，白色乳状液体或浅黄色浆液，有毒。蟾酥提取浆液，干燥，上色，密封保存后可以入药，是我国常用的一味传统名贵中药。其性温, 味辛, 有毒, 归心经, 具有解毒、止痛、开窍醒神之功效, 用于治疗痈疽疔疮、咽喉肿痛、中暑神昏、痧胀腹痛吐泻。而现代药理学研究表明, 蟾酥具有增强心肌收缩力、升压、抑制血小板聚集、增加冠状动脉血流、抗炎、抗辐射、抗肿瘤、降压和麻醉等药理活性。蟾酥亦是国家重点保护的Ⅱ级野生药材, 也是28种毒性中药材品种之一, 在国内外应用广泛。以蟾酥入药的制剂在《部颁标准》和《中国药典》2015年版中共有88个成方制剂 (329个批号)，其质量的好坏会直接影响制剂的疗效。并且蟾酥毒性也较大，用药不当会出现严重的毒副作用，2015版中国药典规定蟾酥不入汤剂，入丸散内服人体用量0.015～0 .03g，按成人60kg体重计算，人的服用剂量为0 .00025～0 .0005g/kg，对蟾酥的服用剂量有严格的要求。
但目前，对蟾酥的评价标准大多是以每种单项成分，或某几种成分的含量指标来表征其质量，其方法存在操作繁琐，检测时间长，检测不全面，且检测成本高等缺点。因此，有必要对该药物的含量测定方法进行研究，开发一种操作简单，全面、准确，且耗时短的方法，以便对蟾酥的质量进行有效全面的控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，该方法可以在同一色谱条件下同时检测蟾酥中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒他灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精和华蟾毒他灵八种成份的含量，简便快捷，耗时短，有利于实现对蟾酥的质量进行有效全面的控制。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱序列为：0min，20%B；2min，35%B；7min，53%B；14min，65%B；14.1min，35%B；15min，20%B；18min，20%B；
（2）对照品溶液制备：精密称取华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，日蟾毒他灵，蟾毒灵，沙蟾毒精，蟾毒它灵，远华蟾毒精和华蟾毒他灵对照品为溶质，加入纯甲醇制成八种单项对照品标准溶液，精密吸取八种单项对照品标准溶液混合后，加入适量甲醇制成混合对照品标准溶液，即得；
（3）供试品溶液制备：取供试品，研细，取25mg，精密称定，精密加入甲醇10-20ml，称定重量，加热回流或超声处理30-60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-20μl，依上述色谱条件进行测定，按外标法计算即得。
进一步优选的，步骤（1）中，确定的色谱条件的检测波长为296nm，流速为0.6-1ml/min，柱温25-30℃。
进一步优选的，步骤（2）中，八种单项对照品标准溶液的质量浓度均为1mg/ml，混合对照品标准溶液中各溶质的质量浓度均为0.1mg/ml。
在制备供试品溶液时，因加热回流提取方法较为耗时，耗力，考虑试验省时节约等因素，进一步优选的，步骤（3）中，取供试品，研细，取25mg，精密称定，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明方法通过优化色谱条件可以在同一色谱条件下同时检测蟾酥中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、日蟾毒他灵、蟾毒灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、远华蟾毒精和华蟾毒他灵八种成份的含量，不仅能有效简化操作步骤，而且显著缩短了测定时间，大大提高了检测效率，有利于实现对蟾酥质量的全面控制。
本发明的检测方法灵敏度高，八种成分的色谱峰分离度均大于1.5，且峰型完整，检测方法具有专属性，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明混合对照品溶液的色谱图；
图2为本发明供试品溶液的色谱图；
图3为流动相及洗脱条件的选择中方法一的色谱图；
图4为流动相及洗脱条件的选择中方法二的色谱图；
图5为流动相及洗脱条件的选择中方法三的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1. 仪器与试剂
对照品：华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，日蟾毒他灵，蟾毒灵，沙蟾毒精，蟾毒它灵，远华蟾毒精和华蟾毒他灵（HPLC≥98%，购于成都克洛玛生物科技有限公司）。
供试品：批号为20180502、20180503、20180901、20180902、20180903的蟾酥样品，由华佗国药股份有限公司提供。
仪器：Waters2489高效液相系统，电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），离心机（常州市万丰仪器制造有限公司）。
试剂：乙腈（色谱纯），超纯水（PALL）。
2.方法与结果
2.1 确定的色谱条件：
色谱柱：Thermo Scientific C18(250mm×4 .6mm ,5μm)；
流动相：水（A）-乙腈（B），流速0.6ml/min，柱温30℃，检测波长296nm，进样量为10-20μL，梯度洗脱序列为：0min，20%B；2min，35%B；7min，53%B；14min，65%B；14.1min，35%B；15min，20%B；18min，20%B。
2.2对照品溶液的制备：
精密称取华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，日蟾毒他灵，蟾毒灵，沙蟾毒精，蟾毒它灵，远华蟾毒精和华蟾毒他灵对照品各1mg为溶质，然后置于1mL容量瓶中，加入纯甲醇制得浓度分别为1mg/ml的八种单项对照品标准溶液，精密吸取适量上述八种单项对照品标准溶液混合后，加入适量甲醇制得混合对照品标准溶液，使得混合对照品标准溶液中各溶质的浓度皆为0.1mg/ml，即得。
2.3 供试品溶液的制备：
分别取上述5批供试品，研细，各取约25mg，精密称定，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
2.4 测定法：
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，依上述色谱条件进行测定，按外标法计算即得，结果见下表1。
表1 蟾酥样品中八种成分的含量
| 样品20180502（mg/g） | 样品20180503（mg/g） | 样品20180901（mg/g） | 样品20180902（mg/g） | 样品20180903（mg/g） | |
| 日蟾毒他灵 | 7.04 | 6.19 | 6.13 | 7.17 | 5.12 |
| 沙蟾毒精 | 26.05 | 23.81 | 23.53 | 27.08 | 18.96 |
| 远华蟾毒精 | 8.6 | 8.03 | 7.96 | 9.24 | 6.57 |
| 蟾毒它灵 | 9.8 | 9.22 | 9.16 | 10.87 | 7.47 |
| 华蟾毒他灵 | 17.73 | 15.32 | 15.24 | 18.1 | 12.45 |
| 蟾毒灵 | 11.61 | 10.45 | 10.33 | 11.79 | 8.52 |
| 华蟾酥毒基 | 26.43 | 23.52 | 23.22 | 26.41 | 19.02 |
| 酯蟾毒配基 | 16.9 | 15.16 | 14.92 | 16.58 | 12.29 |
以下对本发明检测方法的方法学进行考察：
1、流动相及洗脱条件的选择
要实现同一色谱条件下同时测定蟾酥中八种成分的含量测定，流动相及洗脱条件的选择是关键技术。
本发明流动相及洗脱条件的选择采用如下方法进行比较：
方法一：流动相采用0.5%甲酸（A）-乙腈（B），并用0min，28%B；15min，54%B；35min，54%B；35.1min，28%B；37min，28%B的梯度洗脱程序进行试验，其HPLC色谱图如图3所示，其中日蟾毒他灵,沙蟾毒精色谱峰与远华蟾毒精等其余各色谱峰出峰时间间距过大，检测时间过长。
方法二：为改善上述各峰间距过大，检测时间长等缺点，流动相采用水（A）-乙腈（B），并用0min，34%B；1min，54%；3min，60%B；11min，54%B；11.1min，34%B；13min，34%B的洗脱程序试验，其HPLC色谱图如图4所示，发现虽耗时减少，八种成分都可检测到，但重复进样多次，日蟾毒他灵色谱峰一直出现裂分现象。
方法三：为改善裂分现象，在时间程序不变的情况下，改变有机相比例在0min，11.1min，
13min时为34%的乙腈，其余时间段有机相比例同方法（2），其HPLC色谱图如图5所示，发现日蟾毒他灵色谱峰仍出现轻微裂分现象，虽色谱峰型保持较为完整，但各峰相距过近。
方法四：选用本发明的流动相及洗脱条件：，以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯
度洗脱序列为：0min，20%B；2min，35%B；7min，53%B；14min，65%B；14.1min，35%B；15min，20%B；18min，20%B，其HPLC色谱图如图2所示，所出结果无论是混合对照品还是供试品溶液，其日蟾毒他灵,沙蟾毒精等八种成分的色谱峰分离度均大于1.5，且峰型完整，无裂分现象，各峰相距适宜。
2、方法学验证
（1）线性关系考察
以化合物浓度对峰面积积分值进行回归处理，得日蟾毒他灵,沙蟾毒精,远华蟾毒精,蟾毒它灵,华蟾毒他灵,蟾毒灵,华蟾酥毒基及酯蟾毒配基回归方程，分别为：y=14972x-18511(R2=0.9992),y=14066x-8508.4(R2=0.9998),y=13112x-16422(R2=0.9992),y=15155x-13020(R2=0.9996),y=11757x-13171(R2=1),y=19446x-21297(R2=0.9994),y=17269x-8185.6(R2=0.9989),y=15763x-16283(R2=0.9996)。由此可见，蟾酥中这八种成分在0 .005-0 .1mg/ml范围内线性良好。
（2）精密度考察 精密吸取同一混合对照品溶液20μL，连续进样6次，记录峰面积，结果见下表2。结果表明仪器精密度良好。
（3）稳定性试验 取同一供试品溶液分别于2h，4h，6h，12h，24h，48h进行分析，记录峰面积，结果见下表2，结果表明供试品溶液在48小时内稳定。
（4）重复性试验 称取蟾酥药材粉末约25mg共6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，结果见下表2。结果表明本方法重复性良好。
表2 蟾酥中八种成分的精密度，稳定性和重复性
| 精密度（n=6） | 稳定性（n=6） | 重复性（n=6） | |
| RSD% | RSD% | RSD% | |
| 日蟾毒他灵 | 0.37 | 0.49 | 2.03 |
| 沙蟾毒精 | 0.39 | 0.49 | 2.44 |
| 远华蟾毒精 | 0.38 | 0.40 | 2.87 |
| 蟾毒它灵 | 0.39 | 0.53 | 3.93 |
| 华蟾毒他灵 | 0.37 | 0.42 | 1.24 |
| 蟾毒灵 | 0.40 | 0.54 | 2.81 |
| 华蟾酥毒基 | 0.49 | 0.60 | 2.57 |
| 酯蟾毒配基 | 0.48 | 0.56 | 2.83 |
综上所述，本发明方法以水为流动相A，以乙腈为流动相B，通过优化梯度洗脱条件，在18分钟内可同时检测8种成分的含量，大大缩短了检测时间，提高了检测效率，且各峰分离度良好，峰型完整，其准确性、重现性、线性关系、稳定性均能达到科研和生产的要求，有利于对蟾酥的全面有效的控制。
Claims (4)
1.一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）确定的色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱序列为：0min，20%B；2min，35%B；7min，53%B；14min，65%B；14.1min，35%B；15min，20%B；18min，20%B；
（2）对照品溶液制备：精密称取华蟾酥毒基，酯蟾毒配基，日蟾毒他灵，蟾毒灵，沙蟾毒精，蟾毒它灵，远华蟾毒精和华蟾毒他灵对照品为溶质，加入纯甲醇制成八种单项对照品标准溶液，精密吸取八种单项对照品标准溶液混合后，加入适量甲醇制成混合对照品标准溶液，即得；
（3）供试品溶液制备：取供试品，研细，取25mg，精密称定，精密加入甲醇10-20ml，称定重量，加热回流或超声处理30-60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
（4）测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-20μl，依上述色谱条件进行测定，按外标法计算即得。
2.根据权利要求1所述的一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（1）中，确定的色谱条件的检测波长为296nm，流速为0.6-1ml/min，柱温25-30℃。
3.根据权利要求1所述的一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，八种单项对照品标准溶液的质量浓度均为1mg/ml，混合对照品标准溶液中各溶质的质量浓度均为0.1mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种蟾酥中多种化学成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（3）中，取供试品，研细，取25mg，精密称定，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
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