CN104873686A - 参茸补脑胶囊的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了参茸补脑胶囊的质量检测方法，该参茸补脑胶囊由如下重量份数的原料药制成：人参106.4份、制远志266份、石菖蒲399份、茯苓266份、鹿茸26.6份、肉苁蓉399份、石决明532份、葛根532份、麻黄53.2份；其质量检测方法包括如下各项：性状：本品为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒物和粉末，味微苦；鉴别：包括人参、鹿茸、制远志和麻黄的薄层色谱鉴别；检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；含量测定：包括人参含量测定和葛根含量测定。以该方法为标准检测参茸补脑胶囊，可以很好的保证制剂的稳定性，从而保证其疗效。

Description

参茸补脑胶囊的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种治疗AD病的药物，具体涉及一种用于治疗AD病的参茸补脑胶囊的质量检测方法。

背景技术

AD病也叫阿尔茨海默病，亦即我们现在习称的老年性痴呆，或早老性痴呆。它的英文简称就是AD。AD病为现代社会最常见的老年性中枢神经系统疾病之一，现代医学认为，AD病是一种不可逆性的脑功能逐渐衰退性疾病。迄今为止，尚无任何有效的能够治疗和阻断这一疾病的方法。所以，一旦患上这个疾病，那就无疑只有等待其逐渐衰竭，直至死亡。

根据AD发病过程，对AD中西医结合病因病机进行探讨，结合国医大师邓铁涛教授的五脏相关理论，本发明发现了“心肾相关”理论与AD的联系，并初步验证了“心肾同病”是AD发生的病理基础。中医“心肾相关”理论是基于阴阳五行及藏象学说，依据脏腑在生理功能上彼此相通，在病理上相互演变的原则，体现了整体观念。因此，根据“心肾相关”理论与AD的联系，采用中药制剂治疗AD病是可行的。

参茸补脑胶囊是一种治疗AD病的中药制剂，其配方和制法如下：

处方：由如下重量份数的原料药制成：人参 95～110份、制远志 250～270份、石菖蒲 385～410份、茯苓 250～270份、鹿茸24～28份、肉苁蓉385～410份、石决明500～550份、葛根500～550份、麻黄 50～55份。

其制备方法包括如下步骤：

（1）将制远志、石菖蒲、茯苓、肉苁蓉、石决明、葛根这六味药材加水煎煮提取；（2）对步骤（1）的水提液浓缩、干燥得干膏；（3）将干膏粉碎成细粉后过40~70目筛得到干膏粉；（4）取人参、鹿茸、麻黄分别粉碎与步骤（3）得到的干膏粉按比例混匀，分装得到成品。

参茸补脑胶囊由九味中药原料制成，但目前没有适用的质量检测方法，为了保证制剂的稳定性和疗效，发明人对该胶囊剂的质量检测进行了研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供一种用于参茸补脑胶囊的质量检测方法，以保证该胶囊制剂的稳定性和疗效。。

本发明的技术方案是这样的：

参茸补脑胶囊的质量检测方法，该参茸补脑胶囊由如下重量份数的原料药制成：人参 95～110份、制远志 250～270份、石菖蒲 385～410份、茯苓 250～270份、鹿茸24～28份、肉苁蓉385～410份、石决明500～550份、葛根500～550份、麻黄 50～55份。

其质量检测方法包括如下各项：

性状：本品为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒物和粉末，味微苦；

鉴别：包括人参、鹿茸、制远志和麻黄的薄层色谱鉴别；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：包括人参含量测定和葛根含量测定。

其中，人参薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物3~6 g，加三氯甲烷30~50 mL，加热回流0.5~2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水湿润，再加水饱和正丁醇5~15mL，超声处理20~40 min，吸取上清液加2~4倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加1mL甲醇溶解作供试品溶液；取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；另取人参皂苷Rb1对照品、Rg1对照品、Re对照品、Rf对照品，加甲醇制成1 mL含2 mg的混合溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述三种溶液各1~3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水按10~20:30~50:18~26:5~15的比例8~15℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以5~15%的硫酸乙醇在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯下检视。

鹿茸薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物3~8 g，置具塞锥形瓶中，加60~80%乙醇40~60 mL，超声处理10~20 min，滤过，取滤液作为供试品溶液；取鹿茸对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液；另取甘氨酸对照品，加60~80%乙醇制成1 mL含2 mg的溶液作为对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各1~3 μL、对照药材溶液5~15 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水按2~4:0.5~1.5:0.5~1.5比例为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮丙酮溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

制远志薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物2 g，置具塞锥形瓶中，加入60~80%甲醇40~60 mL，超声处理0.5~2 h；摇匀，滤过；将滤液置圆底烧瓶中，水浴加热蒸干；残渣加5~20%的氢氧化钠溶液40~60 mL加热回流1~3 h，放冷，用盐酸调pH值为3~6.5，用水饱和正丁醇振摇提取2~3次，每次40~60 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加2 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取细叶远志皂苷对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各3~6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水按5~7:2~4:0.2~0.8比例为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以5~20%硫酸乙醇溶液，在100~110℃加热至斑点显色清晰。

麻黄薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物2~6 g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷 10~30 mL，加热回流0.5~2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2~6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液按20~50:3~6:0.3~0.6比例显色为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

人参含量测定方法是：取本品内容物2~6 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷20~60 mL加热回流0.5~2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水适量湿润，再加水饱和正丁醇5~15 mL，超声处理20~40 min，吸取上清液加1~4倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加0.5~1.5 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取人参皂苷Rg1、 Re 、Rb1对照品，精密称定，加甲醇溶解制成0.1~0.3 mg/mL对照品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20 μL，注入液相色谱仪，测定。

人参含量测定的色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为203 nm。

人参含量测定的供试品溶液还可采用以下方法配制：取本品内容物2~6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇20~60 mL加热回流0.5~2小时和超声处理0.5~2小时，放冷，再称定重量，用溶剂补足减少的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液测定。

葛根含量测定方法是：

（1）取本品内容物约0.05~0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20~40%乙醇40~60 mL，称定重量，超声振动10~50分钟，放冷，再称定重量，用20~40%乙醇补足减少的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

（2）精密称定葛根素对照品置5~20mL量瓶中，加20~40%乙醇超声溶解并至刻度，摇匀，精密吸取1~3 mL，置100 mL量瓶中，加入20~40%乙醇并稀释刻度，摇匀，制成每1mL含葛根素32.02 μg的对照品溶液；

（3）取缺葛根的阴性样品，按步骤（1）供试品溶液的制备处理方法制备，即得缺葛根的阴性空白对照溶液；

   （4） 选用甲醇-0.2%冰醋酸溶液按15~30:60~80的比例为流动相；采用250 nm为检测波长；采用20~40%乙醇溶剂作为提取样品的溶剂；以超声20~40min提取方法作为供试品的提取方法。

与现有技术相比，本发明是专用于参茸补脑胶囊的质量检测方法，经实验证明，以该方法为标准检测参茸补脑胶囊，可以很好的保证制剂的稳定性，从而保证其疗效。

附图说明

图1是人参薄层色谱鉴别方法的实验研究；

图2是人参薄层色谱鉴别方法的实验研究（ 耐用性实验）；

图3是鹿茸薄层鉴别图；

图4是制远志薄层色谱图；

图5是麻黄薄层色谱图；

图6是麻黄薄层色谱图耐用实验；

图7是人参皂苷对照品色谱图；

图8是供试品色谱图；

图9是人参皂苷对照品色谱图；

图10是供试品色谱图；

图11是人参皂苷对照品色谱图；

图12是供试品色谱图；

图13是流动相的选择；

图14是最大吸收光谱图；

    图15是专属性实验（A、葛根素对照品溶液；B、供试品溶液；C、缺葛根素的阴性样品溶液；）；

图16是线性关系考察色谱图；

图17是线性方程；

图18是精密度考察色谱图；

图19是稳定性考察色谱图；

图20是重复性实验色谱图；

图21是加样回收率实验色谱图；

图22是样品含量测定；

图23是耐用性实验色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围不受具体实施例的任何限制，而是由权利要求加以限定。

    一、参茸补脑胶囊的原料（饮片）质量标准：

    人参：本品为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根和根茎。

本品应符合《中国药典》2010年版一部第8页人参项规定。

制远志：本品为远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志Polygala sibirica L.的干燥根的炮制品。

本品应符合《中国药典》2010年版一部第146-147页制远志项规定。

石菖蒲：本品为天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的干燥根茎。

本品应符合《中国药典》2010年版一部第85页石菖蒲项规定。

茯苓：本品为多孔菌科茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核。

本品应符合《中国药典》2010年版一部第224页茯苓项规定。

鹿茸：本品为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon Temminck或马鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

本品应符合《中国药典》2010年版一部第303页鹿茸项规定。

肉苁蓉：本品为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y. C. Ma或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。

本品应符合《中国药典》2010年版第一部第126页肉苁蓉项规定。

石决明：本品为鲍科动物Haliotis diversicolor Reeve、皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino、羊鲍Haliotis ovina Gmelin、澳洲鲍Haliotis ruber (Leach)、耳鲍Haliotis asinina Linnaeus或白鲍Haliotis laevigata (Donovan)的贝壳。

应符合《中国药典》2010年版第一部第84-85页石决明项规定。

葛根：本品为豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.) Ohwi的干燥根。

    应符合《中国药典》2010年版第一部第312-313页葛根项规定。

麻黄：本品为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapf、中麻黄Ephedra intermedia Schrenk et C. A. Mey.或木贼麻黄Ephedra equisetina Bge.的干燥草质茎。

应符合《中国药典》2010年版第一部第300-301页麻黄项规定。

    二、参茸补脑胶囊质量标准：

处方：人参 95～110份、制远志 250～270份、石菖蒲 385～410份、茯苓 250～270份、鹿茸24～28份、肉苁蓉385～410份、石决明500～550份、葛根500～550份、麻黄 50～55份。

制法： 以上九味，取人参、鹿茸、麻黄粉碎成细粉；其余葛根等六味药材，加6~12倍水（首次加水8~12倍，浸泡0.5~2小时）煎煮2~3次，每次0.5~1小时，合并煎液，滤过。滤液常压浓缩至相对密度为1.35~1.40（60℃）的稠浸膏，置于80℃常压干燥。干膏粉碎成细粉（过40~70目筛）与人参粉 95～110份、鹿茸粉24～28份、麻黄粉 50～55份混合均匀，装入0#硬胶囊制成1000粒，即得。

    性状：本品为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒物和粉末，味微苦。

鉴别：

（1） 取本品内容物3~6 g，加三氯甲烷20~60 mL，加热回流0.5~2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水适量湿润，再加水饱和正丁醇5~15mL，超声处理20~40min，吸取上清液加2~4倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加0.5~3 mL甲醇溶解，作供试品溶液。取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取人参皂苷Rb₁对照品、Rg₁对照品、Re对照品、Rf对照品，加甲醇制成1 mL含2 mg的混合溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅵ B）实验，吸取上述两种溶液各1~3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（10~20:30~50:18~26:5~15）8~15℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以5~15%的硫酸乙醇在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点。

（2） 取本品内容物2~6 g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷 10~30 mL，加热回流0.5~2小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液。取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅵ B）实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2~6μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20~50:3~6:0.3~0.6）为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

检查：应符合胶囊剂项下有关各项规定（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅰ L）。

含量测定：照高效液相色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅵ D）测定。

色谱条件与系统适用性实验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2%冰醋酸溶液（25:75）为流动相；检测波长为250 nm。理论板数按葛根素峰计算应不低于4000。

供试品溶液的制备：取本品约0.05~0.15  g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20~40%乙醇40~60mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）10~50分钟，放冷，再称定重量，用20~40%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备  取葛根素对照品适量，加20~40%乙醇制成每1 mL含葛根素20~40 μg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每粒含葛根以葛根素（C₂₁H₂₀O₉）计，不得少于4.75 mg。

功能与主治：补心肾、通络闭、开清窍，心肾并调。适用于健忘（脾肾亏虚型），轻度认知功能障碍。

用法与用量：口服，一次4粒，一日三次。

    规格：每粒装0.48 g。

包装：聚乙烯塑料瓶装，每瓶36粒。

注意：1. 对本品过敏者禁用；忌烟、酒及辛辣、生冷、油腻食物。2. 如正在使用其他药品，使用前咨询医师或药师。

贮藏：密封，置阴凉干燥处。

三、成品的质量标准：

     性状：根据样品的实验结果拟定。本品为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒物和粉末，味微苦。

鉴别：

    1 仪器与试剂：

电子分析天平（METTLER TOLEDO AB 204-S）；HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；YHG-600-S-Ⅱ型红外快速干燥箱(贺德试器有限公司)；SX2式箱形电阻炉(长沙市远东电炉厂)；CAMAG REPROSTAR3型薄层色谱照相系统（瑞士卡玛公司制造）；试剂为蒸馏水，三氯甲烷、正丁醇、甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、氢氧化钠等为分析纯。

实验结果：

2.1 人参薄层色谱鉴别方法的实验研究：

取本品内容物5 g，加三氯甲烷40 mL，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水适量湿润，再加水饱和正丁醇10 mL，超声处理30 min，吸取上清液加3倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加1mL甲醇溶解作供试品溶液。取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取人参皂苷Rb₁对照品、Rg₁对照品、Re对照品、Rf对照品，加甲醇制成1 mL含2 mg的混合溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅵ B）实验，吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15:40:22:10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以10%的硫酸乙醇在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图1。

图1中，1、样品20130601；2、样品20130602；3、人参药材；4人参皂苷对照混合溶液； 5、人参对照药材；6、缺人参的阴性样品；7、样品20130603；薄层色谱G板：青岛海洋化工分厂，规格100×200mm，100×100mm，批号20100902。

结论：供试品色谱中，与人参对照药材、人参皂苷Rb₁、Rg₁、Re、Rf对照品对照品色谱相应的位置上，均出现相同颜色的斑点，缺人参的阴性样品的其他成分无干扰，经耐用性实验（见图2），方法重现良好，可以建立人参中人参对照药材、人参皂苷Rb₁、Rg₁、Re、Rf的薄层色谱鉴别方法。

图2中：1、样品批号20130601；2、样品批号20130602；3、人参药材；4人参皂苷对照混合溶液； 5、人参对照药材；6、缺人参的阴性样品；7、样品批号20130603；薄层色谱G板：烟台江友硅胶开发有限公司，烟台市芝罘黄务硅胶开发实验厂，规格 HSG 100×200mm，批号20100520。

鹿茸薄层色谱鉴别方法的实验研究：

取本品内容物5 g，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇50 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。取鹿茸对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液。另取甘氨酸对照品，加70%乙醇制成1 mL含2 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录Ⅵ B）实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2 μL、对照药材溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮丙酮溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，结果见图3。

图3中，1、样品批号20130601；2、对照药材；3、样品批号20130602；4、甘氨酸；5、缺鹿茸阴性样品； 6、对照药材；7、样品批号20130603。

    结论：供试品色谱中，在与鹿茸对照药材和甘氨酸对照品色谱相应的位置上，未显相同颜色的斑点，不能建立鹿茸药材和鹿茸中甘氨酸的薄层色谱鉴别方法。

    2.3 制远志薄层色谱鉴别方法的实验研究：

取本品内容物2 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）1 h。摇匀，滤过。将滤液置圆底烧瓶中，水浴加热蒸干。残渣加10%的氢氧化钠溶液50 mL加热回流2 h，放冷，用盐酸调pH值为4~6，用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加2 mL甲醇溶解，作供试品溶液。取细叶远志皂苷对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录Ⅵ B）实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(6:3:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，结果见图4。

图4中，1、缺远志阴性样品；2、样品批号20130601；3、细叶远志皂苷；4、样品批号20130602；5、细叶远志皂苷；6、样品批号20130603。

结论：供试品及缺远志的阴性样品色谱中，与细叶远志皂苷对照品色谱相应的位置上，均出相似颜色的斑点，缺远志阴性样品的其他成分有干扰，不能建立远志中细叶远志皂苷薄层色谱鉴别方法。

    2.4 麻黄薄层色谱鉴别方法的实验研究：

取本品内容物5 g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷 20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液。取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅵ B）实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（40:5:0.5）显色为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰，结果见图5。

图5中，1、样品批号20130601；2、麻黄药材；3、样品批号20130602；4、麻黄对照品；5、缺麻黄阴性样品；6、样品批号20130603；薄层色谱G板：青岛海洋化工分厂，规格100×200mm，100×100mm，批号20100902。

结论：供试品色谱中，与盐酸麻黄碱对照品色谱相应的位置上，显出相同红色的斑点，缺麻黄阴性样品的其他成分无干扰，经耐用性实验（见图6），方法重现良好，可建立麻黄中盐酸麻黄碱薄层色谱鉴别方法。

图6中，1、样品批号20130601；2、麻黄药材；3、样品批号20130602；4、麻黄对照品；5、缺麻黄阴性样品；6、样品批号20130603；薄层色谱G板：烟台江友硅胶开发有限公司，烟台市芝罘黄务硅胶开发实验厂，规格 HSG  100×200mm，批号20100520。

检查：按照胶囊剂项下的有关规定（《中国药典》2010年版一部 附录 Ⅰ L）进行检查。分别检查水分、装量差异、崩解时限、微生物限度。

    微生物限度：按照《中国药典》2010年版一部 附录 ⅩⅢ C “微生物限度法”检查，应符合规定。微生物限度检查法验证实验见参茸补脑胶囊医疗机构注册申报资料7附件。

含量测定：

3 人参含量测定方法的实验研究：

    3.1 仪器与试剂：

Agilent technolongies 1260 Infinity、岛津LC-2010A型高效液相色谱仪、G4212B 1260DAD二极管阵列检测器；梅特勒 MS105DU电子天平；舒美KQ-500DA型数控超声波清洗器。甲醇（色谱纯），水（超纯水），乙醇（分析纯）；葛根素（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号：110752-201313）；本发明的参茸补脑胶囊样品（批号：20130601、20130602、20130603），缺葛根的阴性样品。

方法与结果：

参考《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ D）第8页高效液相色谱法测定人参中人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁含量。

供试品溶液的制备：

取本品内容物5 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷40 mL加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水适量湿润，再加水饱和正丁醇10 mL，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理30 min，吸取上清液加3倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作供试品溶液。

对照品溶液的制备：

取人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁对照品，精密称定，加甲醇溶解制成 0.2 mg/mL对照品溶液。

色谱条件：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B，按表3-1进行梯度洗脱；检测波长为203 nm。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。

结果：在供试品色谱图中（见图7，图8），与人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁对照品相同保留时间位置处出现的色谱峰与其他色谱峰不能完全分离，其他成色谱分峰干扰测定。

按表3-2调整梯度洗脱检测方法进行实验。

结果：在供试品色谱图中（见图9，图10），与人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁对照品相同保留时间位置处出现的色谱峰与其他色谱峰仍然不能完全分离，其他成色谱分峰干扰测定，且分析测定时间过长。

另分别取本品内容物5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇40 mL加热回流1小时和超声（功率250 W，频率40 kHz）处理1小时，放冷，再称定重量，用溶剂补足减少的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液测定。按表3-3调整梯度洗脱检测方法进行实验。

结果：在供试品色谱图中（见图11，图12），与人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁对照品相同保留时间位置处出现的色谱峰与其他色谱峰不能完全分离，其他色谱峰干扰测定。采用甲醇加热回流或超声处理1小时方法不适用于该品种提取测定人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁，综合上述实验研究情况，本品不能建立人参中人参皂苷Rg₁、 Re 、Rb₁含量测定方法。

葛根含量测定方法的实验研究：

4.1 仪器与试剂：

Agilent technolongies 1260 Infinity、岛津LC-2010A型高效液相色谱仪、G4212B 1260DAD二极管阵列检测器；梅特勒 MS105DU电子天平；舒美KQ-500DA型数控超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz）。甲醇（色谱纯），水（超纯水），乙醇（分析纯）；葛根素（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号：110752-201313）；补脑胶囊样品（批号：20130601、20130602、20130603），缺葛根的阴性样品。

溶液的配制：

参考《中国药典》2010年版一部 附录Ⅵ D）第312页及有关文献以高效液相色谱法测定葛根中葛根素含量。

供试品溶液的制备：

取本品内容物约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，称定重量，超声振动30分钟，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减少的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

对照品溶液的制备：

精密称定葛根素对照品0.01601g置10 mL量瓶中，加30%乙醇超声溶解并至刻度，摇匀，精密吸取2 mL，置100 mL量瓶中，加入30%乙醇并稀释刻度，摇匀，制成每1mL含葛根素32.02 μg的对照品溶液。

阴性对照溶液的制备：

取缺葛根的阴性样品，按“4.2.1 供试品溶液的制备”处理方法制备，即得缺葛根的阴性空白对照溶液。

色谱条件：

4.3.1 流动相的选择：

选择甲醇-水（25:75）比例为流动相进行实验考察，检测结果表明，此流动相能较好的分离样品中葛根素峰和其它成分峰，但峰型钝，峰形差；改用甲醇-0.2%冰醋酸溶液（25:75）为流动相测定，葛根素峰和其它成分峰基线分离，DAD检测峰为纯峰，峰形对称，同时检测缺葛根的阴性空白对照溶液，不干扰测定，因此，本法选用甲醇-0.2%冰醋酸溶液（25:75）为流动相，见图13。

检测波长的选择：

选择波长200 nm~400 nm处进行DAD二极管阵列扫描测定，样品中的葛根素峰在250 nm处有最大吸收；与《中国药典》2010年版一部的250 nm一致，故采用250 nm为检测波长，见图14。

系统适用性实验：

    4.4.1 供试品溶液处理方法实验：

    4.4.1.1 提取溶剂的考察：

    取本品内容物约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，编号1~9号；精密加入溶剂，1号溶剂为30%甲醇；2号溶剂为50%甲醇；3号溶剂为70%甲醇；4号溶剂为100%甲醇；5号溶剂为30%乙醇；6号溶剂为50%乙醇；7号溶剂为70%乙醇，8号溶剂为100%乙醇，9号溶剂为水。按照供试品的制备方法处理，结果见表4-1。

测定结果：30%乙醇溶剂的提取高于其他溶剂提取葛根素的含量，葛根素峰和其他成分峰的分离良好，故本法拟采用30%乙醇溶剂作为提取样品的溶剂。

提取方法和时间的考察：

    取本品内容物约0.1 g，精密称定，共12份，置具塞锥形瓶中，各精密加入30%乙醇50 mL，称定重量，取三份，分别水浴加热回流30 min、1 h、2 h；另取三份分别超声波处理30 min、1 h、2 h；放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减少的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。剩下六份浸渍过夜后重复上述六份样品的处理方法即可，结果见表4-2。

检测结果表明：以上提取方法所得含量结果基本相同。故本法选择简便快捷的超声处理超声30min提取方法作为供试品的提取方法。

    4.4.1.3 专属性实验：

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺葛根素的阴性样品溶液各10 μL进样，结果表明，缺葛根的阴性样品其他成分不干扰测定，见图15。

线性与范围：

    精密吸取对照品溶液2 μL、6 μL、10 μL、15 μL、18 μL、20 μL注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，以峰面积A对浓度C（μL）进行线性回归，结果见表4-3，图16，图17。

线性回归方程：y=4106.82x+0.68，r=1.0000。结果表明，葛根素在0.064 μg~0.6404 μg范围内线性关系良好。设置强制过原点的线性回归得方程Y=4105.44X，r=1.0000；将重复性实验样品1的峰面积2158.1带入上述两个方程，分别计算含量为14.429 mg/g和14.442 mg/g，相对平均偏差为0.044%，因此可以采用一点法测定含量。

精密度实验：

精密吸取葛根素对照品溶液（32.02 μg/mL）10 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算平均峰面积值和RSD%值，见表4-4，图18。

结果表明，RSD=0.23%，精密度良好。

    4.4.1.6 稳定性实验：

取重复性实验的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12小时进样，测定葛根素峰面积，计算葛根素平均峰面积和RSD（%），见表4-5，图19。

  结果表明，RSD=0.20%，样品溶液在12 h内稳定。

    4.4.1.7 重复性实验：

取批号20130601内容物约0.1 g，精密称定，按照供试品溶液的制备方法，平行制备6份供试品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积，计算含量、平均含量及RSD%。结果见表4-6，图20。

结果表明，RSD=1.60%，重复性良好。

加样回收率：

    采用加样回收法，分别取6份已测定含量的补脑胶囊各0.1 g（批号：20130601，葛根素含量14.4975 mg/g），精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25 mL、葛根素对照品溶液（32.02 μg/mL）25 mL，按供试品溶液的制备方法制备，即得。结果见表4-7，图21。

结果显示：该方法测得平均回收率为98.80%，RSD%=1.2%，回收率良好。

样品测定：

精密称定3批样品粉末0.1 g（20130601、20130602、20130603），按照供试品溶液的制备方法进行制备，分别进样10 μL，记录色谱，测定峰面积，计算。结果见表4-8，图22。

结果表明，供试品溶液中葛根素苷含量约为13.7~14.1 mg/g，考虑大生产实际情况，将葛根素苷含量限度暂定为不少于11.0 mg/g，按实际每粒装0.48 g计算考虑装量差异，本品每粒含葛根以葛根素（C₂₁H₂₀O₉）计，不得少于4.75 mg。

    4.4.1.10 耐用性实验：

    考察不同厂家色谱柱，色谱条件耐用性。柱子1：Waters C₁₈（4.6×250 mm，5 μm），柱号186003117；柱子2：Agilent C₁₈（4.6×250mm，5μm），柱号AKAD09670；仪器：Agilent 1260 LC高效液相色谱仪，DAD紫外检测器。结果见表4-9，图23。

结果：葛根素苷峰与相邻色谱峰基线分离，分离良好，保留时间约在10～20分钟，理论板数均在4000左右，实验重现良好。

当然，以上只是发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.参茸补脑胶囊的质量检测方法，该参茸补脑胶囊由如下重量份数的原料药制成：人参 95～110份、制远志 250～270份、石菖蒲 385～410份、茯苓 250～270份、鹿茸24～28份、肉苁蓉385～410份、石决明500～550份、葛根500～550份、麻黄 50～55份；

其质量检测方法包括如下各项：

性状：本品为硬胶囊，内容物为棕色至棕褐色颗粒物和粉末，味微苦；

鉴别：包括人参、鹿茸、制远志和麻黄的薄层色谱鉴别；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：包括人参含量测定和葛根含量测定。

2.根据权利要求1所述的参茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：人参薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物3~6 g，加三氯甲烷30~50 mL，加热回流0.5~2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水湿润，再加水饱和正丁醇5~15mL，超声处理20~40 min，吸取上清液加2~4倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加1mL甲醇溶解作供试品溶液；取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；另取人参皂苷Rb1对照品、Rg1对照品、Re对照品、Rf对照品，加甲醇制成1 mL含2 mg的混合溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述三种溶液各1~3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水按10~20:30~50:18~26:5~15的比例8~15℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以5~15%的硫酸乙醇在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯下检视。

3.根据权利要求1所述的参茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：鹿茸薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物3~8 g，置具塞锥形瓶中，加60~80%乙醇40~60 mL，超声处理10~20 min，滤过，取滤液作为供试品溶液；取鹿茸对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液；另取甘氨酸对照品，加60~80%乙醇制成1 mL含2 mg的溶液作为对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各1~3 μL、对照药材溶液5~15 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水按2~4:0.5~1.5:0.5~1.5比例为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮丙酮溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

4.根据权利要求1所述的参茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：制远志薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物2 g，置具塞锥形瓶中，加入60~80%甲醇40~60 mL，超声处理0.5~2 h；摇匀，滤过；将滤液置圆底烧瓶中，水浴加热蒸干；残渣加5~20%的氢氧化钠溶液40~60 mL加热回流1~3 h，放冷，用盐酸调pH值为3~6.5，用水饱和正丁醇振摇提取2~3次，每次40~60 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加2 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取细叶远志皂苷对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各3~6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水按5~7:2~4:0.2~0.8比例为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以5~20%硫酸乙醇溶液，在100~110℃加热至斑点显色清晰。

5.根据权利要求1所述的参茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：麻黄薄层色谱鉴别方法是：取本品内容物2~6 g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷 10~30 mL，加热回流0.5~2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL充分振摇，滤过，取滤液作为供试品溶液；取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述对照品溶液、供试品溶液各2~6 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液按20~50:3~6:0.3~0.6比例显色为展开剂，展开，取出，晾干，显色，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。

6.根据权利要求1所述的茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：人参含量测定方法是：取本品内容物2~6 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷20~60 mL加热回流0.5~2小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水适量湿润，再加水饱和正丁醇5~15 mL，超声处理20~40 min，吸取上清液加1~4倍氨试液，摇匀，放置分层，取上清液蒸干，残渣加0.5~1.5 mL甲醇溶解，作供试品溶液；取人参皂苷Rg1、 Re 、Rb1对照品，精密称定，加甲醇溶解制成0.1~0.3 mg/mL对照品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20 μL，注入液相色谱仪，测定。

7.根据权利要求6所述的茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：人参含量测定的色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为203 nm。

8.根据权利要求6所述的茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：人参含量测定的供试品溶液还可采用以下方法配制：取本品内容物2~6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加甲醇20~60 mL加热回流0.5~2小时和超声处理0.5~2小时，放冷，再称定重量，用溶剂补足减少的重量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液测定。

9.根据权利要求1所述的茸补脑胶囊的质量检测方法，其特征在于：葛根含量测定方法是：

（1）取本品内容物约0.05~0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入20~40%乙醇40~60 mL，称定重量，超声振动10~50分钟，放冷，再称定重量，用20~40%乙醇补足减少的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液；

（2）精密称定葛根素对照品置5~20mL量瓶中，加20~40%乙醇超声溶解并至刻度，摇匀，精密吸取1~3 mL，置100 mL量瓶中，加入20~40%乙醇并稀释刻度，摇匀，制成每1mL含葛根素32.02 μg的对照品溶液；

（3）取缺葛根的阴性样品，按步骤（1）供试品溶液的制备处理方法制备，即得缺葛根的阴性空白对照溶液；

   （4） 选用甲醇-0.2%冰醋酸溶液按15~30:60~80的比例为流动相；采用250 nm为检测波长；采用20~40%乙醇溶剂作为提取样品的溶剂；以超声20~40min提取方法作为供试品的提取方法。