CN106706812A - 一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其包括对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；HPLC法分析测定和标准曲线法计算含量。本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、色谱柱、洗脱程序、检测波长、柱温等色谱条件，优选得到最佳的检测条件。本发明提供的检测方法，测定快速、准确可靠，专属性强，重现性好，可同时检测六神丸中蟾蜍二烯内酯类9种成分，可用于六神丸的质量控制，对控制药品质量具有重要的意义。

Description

一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药制剂的检测方法，具体涉及六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，属于中药成分分析领域。
背景技术
六神丸由麝香、牛黄、蟾酥等中药组成，属于国家中药保护品种，具有清凉解毒，消炎止痛的功效，适用于烂喉丹痧，咽喉肿痛，喉风喉痈，单双乳蛾，小儿热疖，痈疡疔疮，乳痈发背，无名肿毒。其中所含药味蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider的干燥分泌物，其性味甘辛、温，有毒，具有解毒、消肿、醒神、开窍、强心和止痛等作用。根据文献报道，蟾酥主要活性成分为蟾蜍二烯内酯类化合物，该类化合物具有显著的洋地黄样作用、升压、呼吸兴奋和抗肿瘤作用。
现有文献报道中，已有学者采用紫外分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法对蟾酥及其制剂中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基进行了定量分析，但未见对和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒等其它蟾酥二烯内酯类化合物同时测定的报道。
六神丸目前执行标准为《卫生部药品标准中药成方制剂第十八册》(标准编号：WS3-B-3374-98)，标准中含量测定项中只有牛黄中胆酸的含量测定项。学术论文(邹瑾丽,祁海宏.HPLC法测定六神丸中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].中国临床药学杂志,2007,16(1):49-50.)公开了一种同时测定六神丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基两个蟾蜍二烯内酯类成分的含量方法；学术论文(王建,倪坤仪,于如报.六神丸中蟾毒内酯化合物的HPLC分析[J].中国药科大学学报,1991,22(6):372-374.)公开了六神丸中总蟾毒内酯类化合物含量。但由于蟾酥二烯内酯类化合物的极性非常接近，目前色谱条件并没有达到分离蟾酥二烯内酯类化合物的方法，因此现有技术均不能全面反映六神丸中蟾蜍二烯内酯类化合物含量水平，不能很好的控制产品的质量，存在一定的缺陷。
蟾酥既是六神丸中有效成分，也是毒性成分，为对六神丸产品中蟾蜍二烯内酯类成分进行全面检测和分析，本发明对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类成分检测方法同时进行了研究，为制定新的质量标准和有效控制产品质量提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法。该方法能够同时检测极性接近的9种蟾蜍二烯内酯类成分，简便快速、准确可靠，专属性强，重现性好，可用于六神丸产品的质量控制，具有重要的意义。
为实现以上目的，本发明的技术解决方案是：
一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵，用甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，取粉末适量，精密称定，精密加入醇适量，提取，放冷，用醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液；
(3)测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC，按标准曲线法测定蟾蜍二烯内酯类成分的含量；
色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；检测波长：245nm～360nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；进样量5μl～20μl。
作为优选方案，六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，步骤(1)对照品溶液的制备：分别取华蟾酥毒基(CAS:470-37-1)、脂蟾毒配基(CAS:465-39-4)、和蟾蜍他灵(CAS:465-11-2)、沙蟾毒精(CAS：464-74-4)、远华蟾毒精(CAS:472-26-4)、去乙酰华蟾毒它灵(CAS:4099-30-3)、蟾毒它灵(CAS:471-95-4)、华蟾毒它灵(CAS:1108-68-5)和蟾毒灵(CAS:465-21-4)对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为华蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml、和蟾蜍他灵70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、远华蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg/ml、蟾毒它灵214.73μg/ml、华蟾毒它灵366.44μg/ml、蟾毒灵241.56μg/ml的混合对照品储备液；
步骤(2)所述的供试品溶液的制备：
取六神丸适量，研磨粉碎，过100～200目筛，取粉末约0.1g～0.5g，精密称定，按料液比1︰50～1︰100精密加入体积浓度为70％～100％甲醇或乙醇，密塞，称重，超声(50KHz～100KHz，功率150W～250W)或回流提取30min～120min，放冷，用70％～100％甲醇或乙醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液。
一、提取方法的筛选：
本发明对提取方法(超声提取、回流提取)、提取溶剂(纯甲醇、90％甲醇、80％甲醇、70％甲醇、乙醇)、提取时间(30min、60min、90min、120min)、料液比等进行了单因素进行考察，筛选出以纯甲醇作为六神丸的提取溶剂，料液比为1︰50，50kHz频率下超声60min，蟾蜍二烯内酯类成分提取率最高。因此，本发明优选的提取方法为：取六神丸适量，研磨粉碎，过200目筛，取粉末约0.2g，精密称定，精密加入甲醇10ml(料液比1︰50)，密塞，称重，超声(工作频率50KHz，功率250W)提取60min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，待测。
二、色谱条件的筛选：本发明分别对色谱柱、洗脱系统、洗脱程序、柱温、检测波长进行了筛选。
1、色谱柱的筛选：分别筛选色谱柱1：Xbridge C18(4.6×250mm,5μm,Waters)；色谱柱2：ODS Hypersil C18(4.6×250mm,5μm,Thermo)；色谱柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)。根据色谱峰的分离情况，9种蟾蜍二烯内酯类成分在ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)色谱柱上分离较好，优选色谱柱3：ODS-2C18(4.6×250mm,5μm，汉邦)色谱柱。
2、洗脱系统的筛选：本发明分别筛选洗脱系统：1：甲醇-水；2：乙腈-水；3：乙腈-0.1％磷酸；4：乙腈-0.15％磷酸；5：乙腈-0.3％磷酸。根据9种蟾蜍二烯内酯类成分色谱峰分离效果和峰型等，优选4：乙腈-0.15％磷酸为最终洗脱系统。
3、洗脱程序的筛选：本发明以乙腈-0.15％磷酸做流动相，筛选了程序1-5的洗脱程序，以乙腈百分比表示，括号内表示时间(min)：
程序1：5％(0)～15％(12)～20％(20)～30％(25)～45％(35)～55％(45)～70％(50)～90％(55)～15％(60)～15％(62)
程序2：10％(0)～30％(10)～40％(20)～45％(30)～50％(35)～67％(37)～86％(40)～96％(42)～30％(44)～15％(45)
程序3：20％(0)～25％(15)～40％(25)～40％(35)～55％(37)～55％(45)～100％(47)～100％(52)～20％(54)～20％(55)
程序4：25％(0)～35％(14)～50％(26)～60％(36)～65％(46)～72％(58)～85％(60)～95％(70)～35％(75)～25％(80)
程序5：32％(0)～40％(20)～55％(35)～65％(45)～70％(55)～75％(65)～90％(70)～100％(80)～30％(90)～30％(100)
根据9种蟾蜍二烯内酯类成分色谱图的分离效果，优选程序3：20％(0)～25％(15)～40％(25)～40％(35)～55％(37)～55％(45)～100％(47)～100％(52)～20％(54)～20％(55)为最终洗脱程序。
4、柱温的筛选：本发明筛选25℃、30℃、35℃、40℃和45℃柱温，根据9种蟾蜍二烯内酯类成分色谱峰分离效果及分离时间，优选40℃为最终柱温。
5、检测波长的筛选：本发明筛选了254nm、280nm、296nm和316nm的波长，根据9 种蟾蜍二烯内酯类成分色谱峰分离效果和峰数优选296nm为最终检测波长。
本发明步骤(3)测定法中包括线性关系测定：精密吸取对照品溶液，依次稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，制备包括母液在内的7份溶液。分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。
本发明步骤(3)测定法中包括检测限和定量限测定：在色谱条件下，当信噪比为3时，测定和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的检测限；当信噪比为10时，测定和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的定量限。
本发明步骤(3)测定法中包括精密度实验：取对照品溶液，在色谱条件下，重复进样6次，每次10μL，计算各对照品色谱峰面积以及相对标准偏差；
本发明步骤(3)测定法中包括稳定性实验：取六神丸供试品溶液，室温放置，于0、2、4、8、10、12、16、24h进样，每次10μL，在色谱条件下进样分析，计算六神丸样品中各色谱峰面积以及相对标准偏差；
本发明步骤(3)测定法中包括重复性实验：取同一批六神丸样品，按供试品溶液的制备方法各平行制备6份，分别进样，每次10μL。在色谱条件下进样分析，计算六神丸样品中各色谱峰面积以及相对标准偏差；
本发明步骤(3)测定法中包括回收率实验：精密称取同一批六神丸样品各6份，分别准确加入一定量的蟾酥二烯内酯类化合物，按供试品溶液的制备方法处理后，在色谱条件下进行分析，记录峰面积，计算加样回收率。
本发明的优点是：
1、与现有技术相比，本发明可同时测定的六神丸中的9种极性非常接近的蟾蜍二烯内酯类成分，可大大大大提高检测效率，可更加全面的控制六神丸的质量。
2、本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、色谱柱、洗脱程序、检测波长、柱温等色谱条件，优选得到最佳的色谱条件。在优选定的色谱条件下，六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类成分在55min内便可完成分析，和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分别在线性范围内与峰面积呈良好线性关系(r≧0.9996)。加样回收率均在92％～105％，RSD＜5％。该法测定快速、准确可靠，专属性强，重现性好，可全面反映六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分情况，可用于六神丸的质量控制，对控制药品质量具有重要的意义。
附图说明
图1是本发明对照品溶液的高效液相色谱图
图2是本发明六神丸供试品溶液的高效液相色谱图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种非实质性的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
HPLC法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类成分含量的方法
1仪器与试药
1.1仪器
美国Waters e2695高效液相色谱系统，包括在线脱气机，自动进样器ProminenceSIL-20A，2998紫外可见光检测器和柱温箱CTO-20A；汉邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子分析天平(FA1204B，上海精密科学有限公司)；CPA22，5D电子天平(德国Sartorius公司)；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(美国密理博公司)；KQ-500DE超声机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
乙腈(色谱纯，美国TEDIA试剂公司)，甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)，重蒸水(由Milli-Q Synthesis 108超纯水仪制得)，和蟾蜍他灵(批号465-11-2)、沙蟾毒精(批号464-74-4)、远华蟾毒精(批号472-26-4)、去乙酰华蟾毒它灵(批号4099-30-3)、蟾毒它灵(批号471-95-4)、华蟾毒它灵(批号1108-68-5)、蟾毒灵(批号11981-201501)等对照品购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，经面积归一化法测定，纯度均大于98.0％；华蟾酥毒基(批号110803-201406，供含量测定用)、脂蟾毒配基(批号110718-201108，供含量测定用)购自中国食品药品检定研究院。六神丸(雷允上药业有限公司，批号分别为NA18003A、NA18008B、NA18018A、NA18021B、OA18019A、OA10005B、OA18025B、OA18009C、0A18004B、LA18012C)。
2方法与结果
2.1对照品溶液的制备
分别取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为和蟾蜍他灵70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、远华蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg/ml、蟾毒它灵214.73μg/ml、华蟾毒它灵366.44μg/ml、蟾毒灵241.56μg/ml、华蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml的混合对照品储备液。
2.2供试品溶液的制备
取六神丸粉末约0.2g，精密称定，精密加入甲醇10ml，密塞，称重，超声(工作频率50KHz，功率250W)处理60min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，离心，取上清液进样分析。
2.3色谱条件
色谱柱：ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，流动相：乙腈(A)-0.15％磷酸溶液，梯度洗脱：0～15min，20％～25％乙腈；15～25min，25％～40％乙腈；25～35min，40％乙腈；35～37min，40％～55％乙腈；37～45min，55％乙腈；45～47min，55％～100％乙腈；47～52min，100％乙腈；52～54min，100％～20％乙腈；54～55min，20％乙腈；体积流量1mL·min-1；检测波长296nm；柱温：40℃；进样量:10μL。
在上述色谱条件下，和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的对照品溶液，六神丸供试品溶液高效液相色谱图见图1和图2。各色谱峰依次为：1：和蟾蜍他灵、2：沙蟾毒精、3：远华蟾毒精、4：去乙酰华蟾毒它灵、5：蟾毒它灵、6：华蟾毒它灵、7：蟾毒灵、8：华蟾酥毒基、9：酯蟾毒配基。
2.4线性关系考察
精密吸取“2.1”项下对照品溶液，依次稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，制备包括母液在内的7份溶液。分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。见表1。
表1蟾酥二烯内酯类成分的回归方程
2.5检测限和定量限
在选定的色谱条件下，当信噪比为3时，测得和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的检测限分别为0.0027μg、0.0021μg、0.0051μg、0.0017μg、0.0042μg、0.0072μg、0.0047μg、0.0091μg、0.0130μg；测得当信噪比为10时，测得和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的检测定量限分别为0.0110μg、0.0085μg、0.0102μg、0.0034μg、0.0084、0.0143μg、0.0094μg、0.0366μg、0.0259μg。
2.6精密度试验
按照“2.3”项下色谱条件，分别取制备得到的对照品溶液10μL，重复进样6次，和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为1.36％、1.25％、1.44％、1.07％、1.08％、1.21％、1.20％、1.16％、1.11％，RSD均<3％，结果表明仪器精密度良好。
2.7稳定性试验
取六神丸供试品溶液，按“2.3”项色谱条件，在0、2、4、8、10、12、16、24h进样10μL，六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为1.70％、1.60％、1.80％、2.37％、1.83％、1.87％、1.93％、1.71％、1.75％，RSD均<3％，结果表明六神丸溶液在24h内稳定。
2.8重复性试验
取同一批六神丸样品，按供试品溶液的制备方法制备6份，分别进样10μL，六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基质量分数的RSD分别为2.06％、2.28％、2.47％、2.09％、2.44％、2.36％、2.47％、2.45％、2.45％，RSD均<3％，结果表明重复性良好。
2.9回收率试验
精密称取同一批六神丸样品6份，分别准确加入一定量的蟾酥二烯内酯类化合物，按供试品溶液的制备方法处理后，按“2.3”项色谱条件测定，计算回收率及RSD，结果见表2。
表2六神丸加样回收率试验
2.10样品测定
取六神丸按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算不同批次的六神丸中9种蟾酥二烯内酯类成分的含量见表3。
表3六神丸中9种蟾酥二烯内酯类成分的含量(mg/g)(n＝3)
本发明通过大量实验筛选，建立了HPLC法同时测定六神丸中9种极性接近的蟾蜍二烯内酯类成分含量的方法。并且采用本发明优选的方法测定了10批六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。方法学考察结果表明，本发明所建立的检测方法精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率实验结果符合定量分析的要求，方法简便易行，可为六神丸的质量标准的建立和完善提供科学依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于,包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵，用甲醇溶解并定容，得到混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取六神丸适量，研磨粉碎，取粉末适量，精密称定，精密加入醇适量，提取，放冷，用醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液；
(3)测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入HPLC，按标准曲线法测定蟾蜍二烯内酯类成分的含量；
色谱条件：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：A相为乙腈，B相为水，梯度洗脱；检测波长：245nm～360nm；柱温35℃～45℃；流速0.8ml/min～1.2ml/min；进样量5μl～20μl。
2.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于：
步骤(1)对照品溶液的制备：分别取华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵和蟾毒灵对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为华蟾酥毒基468.11μg/ml、脂蟾毒配基331.56μg/ml、和蟾蜍他灵70.39μg/ml、沙蟾毒精257.78μg/ml、远华蟾毒精261.89μg/ml、去乙酰华蟾毒它灵42.96μg/ml、蟾毒它灵214.73μg/ml、华蟾毒它灵366.44μg/ml、蟾毒灵241.56μg/ml的混合对照品储备液；
步骤(2)所述的供试品溶液的制备：
取六神丸适量，研磨粉碎，过100～200目筛，取粉末约0.1g～0.5g，精密称定，按料液比1︰50～1︰100精密加入体积浓度为70％～100％甲醇或乙醇，密塞，称重，超声或回流提取30min～120min，放冷，用70％～100％甲醇或乙醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液。
3.根据权利要求2所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(2)所述的供试品溶液的制备：
取六神丸适量，研磨粉碎，过200目筛，取粉末约0.2g，精密称定，按料液比1︰50精密加入甲醇10ml，密塞，称重，工作频率50KHz，功率250W下超声提取60min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，离心，取上清液，得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的梯度洗脱条件为：
0～15min，20％～25％乙腈；
15～25min，25％～40％乙腈；
25～35min，40％乙腈；
35～37min，40％～55％乙腈；
37～45min，55％乙腈；
45～47min，55％～100％乙腈；
47～52min，100％乙腈；
52～54min，100％～20％乙腈；
54～55min，20％乙腈。
5.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的色谱柱规格为4.6×250mm，5μm的ODS-2色谱柱。
6.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测波长：296nm；柱温40℃；流速1.0ml/min，进样量10μl。
7.根据权利要求1所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(3)测定法中包括线性关系测定：精密吸取对照品溶液，依次稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍，制备包括对照品母液在内的7份溶液；然后分别精密吸取7种质量浓度的混合对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线；根据标准曲线和供试品的峰面积计算出六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分的含量。
8.根据权利要求7所述的一种六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分检测方法，其特征在于，步骤(3)蟾蜍二烯内酯类成分的保留时间、标准曲线、线性系数和线性范围如下表：
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