CN107589213A - 一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，尤其涉及特征图谱法检测和控制蟾皮中抗肿瘤活性组分——蟾毒配基类成分的质量控制方法。本发明建立了蟾皮药材的理化鉴别、水分、灰分以及浸出物的标准，同时对其中色胺类的主要成分蟾蜍噻咛的含量进行了测定方法学研究，并建立了含量标准；选择了药理作用明显、活性明确的蟾毒配基类成分作为特征峰进行控制，建立了蟾皮蟾毒配基类成分的特征图谱，同时对其中沙蟾毒精成分进行了质量控制。从而进一步保证了蟾皮药材质量的可控、稳定、有效及安全性，为保障药材、制剂以及药品的质量奠定了基础，为临床用药提供质量保障。

Description

一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法

技术领域

本发明涉及医药保健品领域，涉及一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，尤其涉及特征图谱法检测和控制蟾皮中抗肿瘤活性组分——蟾毒配基类成分的质量控制方法。

背景技术

《本经逢原》中记载蟾皮为蟾蜍去蟾酥、去内脏后晒干之物，经方入药目的多为以毒攻毒。从蟾皮中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为蟾毒配基类(bufogenins)、蟾蜍毒素类(bufotoxins)、蟾毒色胺类(bufoteidines)三大类以及核苷酸、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分主要有沙蟾毒精、华蟾酥毒基、蟾毒灵、蟾毒它灵等，其化学模式与蟾酥及其制剂存在较大差异。

蟾皮中的蟾毒配基(bufageins)，是一类具有蟾蜍甾烯母核的化合物，该类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性，同时也具有较强的毒副作用。大量研究结果表明，蟾毒配基类化合物对白血病、结肠癌、肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤，有明显抗肿瘤作用。然而，研究结果同样表明，在一个或几个蟾毒配基类成分存在下，其才具有抗癌活性；尤其我们近期实验表明蟾毒配基组分群的抗癌效果优于其中单体成分。因此合理有效的控制蟾皮药材或饮片中的蟾蜍配基类成分，对应用于临床的蟾皮制剂以及医学治疗都具有非常重要的意义。

另外，有学者也对蟾皮中的水溶性成分进行了研究，从中分离、鉴定出蟾蜍噻咛、4-氨基-3-羟甲基-环辛酰胺骈四氢-α-呋喃酮(蟾蜍环酰胺B)、蟾蜍环酰胺C等，其中蟾蜍噻咛在皮含量较高，而且体外抗肿瘤试验表明蟾蜍噻咛肿瘤抑制率为87.06％。

由蟾皮开发而成的药品已有多个上市，比如华蟾素注射液、片剂、口服液、胶囊剂等是从中华大蟾蜍皮经加工制成制剂，其具有解毒、消肿、止痛之功效，临床用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，且对化疗和放疗具有协同作用。

然而，众所周知，从动物类中药原料中获得有价值的化合物极为困难，成本很高，一般不使用蟾皮中的纯化合物，而使用提取物直接用作药用原料。但蟾皮提取物的一个缺点是，成分复杂、有效成分及其含量不清楚，到目前为止还没有明确的对其有效成分的质量控制方法和标准，因此给药品的质量控制造成很大困难。为了保持蟾皮提取物及含有该提取物的药物、制剂的质量稳定，对蟾皮药材进行多成分质量标准的建立是保证药材、饮片、制剂以及药品质量前题，具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述技术问题，本发明旨在提供一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，以保证药材、饮片、制剂以及药品的质量和临床疗效。

本发明实施例涉及一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，所述药材或饮片或制剂中含有蟾毒配基类成分，该蟾毒配基类成分即为蟾皮药材或饮片中抗癌活性组分群，

(1)对所述药材或饮片进行鉴别，包括：理化鉴别、水分灰分、浸出物含量、色胺类成分蟾蜍噻咛以及配基类成分沙蟾毒精的含量的鉴别，使其具有如下鉴别特征：

(a)水分含量不得超过17.0％；

(b)总灰分不得超过11.0％；

(c)本品按干法计算含量，含蟾蜍噻咛C₁₂H₁₄N₂O₄S不得少于0.1mg/g；

(d)本品按干法计算含量，含沙蟾毒精不得低于0.10％；

在上述一个或几个条件存在的情况下，

(2)对所述药材或饮片中含有的蟾毒配基类成分进行HPLC特征图谱分析，得到其HPLC特征图谱；重点控制所述HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中参照峰及各特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.2～1.6、1.3～1.7、1.5～1.9，且相对保留时间应在规定值的±15％之内；

(3)对所述制剂的检验及标准可参照上述药材或饮片。

优选地，所述HPLC特征图谱中，重点控制该HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中参照峰及各特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.40、1.53、1.72；且相对保留时间应在规定值的±15％之内。

所述药材或饮片或制剂的动物来源为：蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥全皮；上述夏季捕捉，杀死，剥取外皮，贴于板上或撑开，干燥而得到。

本发明的技术方案可以包括以下有益效果：

通过大样本的收集和检测，本发明建立了蟾皮药材的理化鉴别、水分、灰分以及浸出物的标准，同时对其中色胺类的主要成分蟾蜍噻咛的含量进行了测定方法学研究，并建立了含量标准；选择了药理作用明显、活性明确的蟾毒配基类成分作为特征峰进行控制，建立了蟾皮蟾毒配基类成分的特征图谱。从而进一步保证了蟾皮药材质量的可控、稳定、有效及安全性，为保障药材、制剂以及药品的质量奠定了基础，为临床用药的质量提供了保障。

本发明提供的质量控制方法，能够全面检测和蟾皮药材或饮片中蟾蜍噻咛以及蟾毒配基类成分的含量以及比例状况，可以有效全面的保证药材或饮片的质量和临床疗效。

本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1蟾蜍噻咛校正曲线图

图2沙蟾毒精校正曲线图

图3全梯度蟾毒配基类特征图谱

图4蟾皮特征图谱

图5蟾皮特征图谱中20-35min色谱峰紫外扫描图

图6各组分对HepG2相对肿瘤体积的影响

(对照：华蟾素注射液 A:蟾毒配基类成分 B:多肽类成分)

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，所述药材或饮片或制剂中含有蟾毒配基类成分，该蟾毒配基类成分即为蟾皮药材或饮片中抗癌活性组分群，该质量控制方法为：

(1)对所述药材或饮片进行鉴别，包括：理化鉴别、水分灰分、浸出物含量、色胺类成分蟾蜍噻咛以及配基类成分沙蟾毒精的含量的鉴别，使其具有如下鉴别特征：

(a)水分含量不得超过17.0％；

(b)总灰分不得超过11.0％；

(c)本品按干法计算含量，含蟾蜍噻咛C₁₂H₁₄N₂O₄S不得少于0.1mg/g；

(d)本品按干法计算含量，含沙蟾毒精不得低于0.10％；

在上述一个或几个成分存在的情况下，

(2)对所述药材或饮片中含有的蟾毒配基类成分进行HPLC特征图谱分析，得到其HPLC特征图谱；重点控制所述HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.2～1.6、1.3～1.7、1.5～1.9，；且相对保留时间应在规定值的±15％之内；

对所述制剂的检验及标准可参照上述药材或饮片。

优选地，所述HPLC特征图谱中，重点控制该HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中参照峰及各特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.40、1.53、1.72；且相对保留时间应在规定值的±15％之内。

实施例1.蟾皮的性状、理化鉴别以及检查

【性状】

本品呈扁平板状，厚约0.5mm，头部略呈钝三角形。四肢屈曲向外伸出。外表面粗糙，背部灰绿褐色，布有大小不等的疣状突起，色较深，腹部黄白色，疣点较细小。头部较平滑，耳后腺明显，呈长卵圆形，八字状排列。内表面灰白色，与疣点相应处有同样大小黑色浅凹点。较完整者四肢展平后，前肢趾间无蹼，后肢长而粗状，趾间有蹼.质韧，不易折断.气微腥、味微麻。以片大、身干、完整者为佳。

【鉴别】

1、本鉴别系针对干蟾皮中的强心苷类(蟾毒配基类)成分的鉴别，取本品碎片0.1g，加氯仿5ml,浸泡1小时，滤过。滤液蒸干，残渣加醋酐少量使溶解，滴加硫酸数滴初显蓝紫色，渐变蓝绿色。

2、本鉴别系针对干蟾皮中的吲哚类生物碱成分的鉴别，取本品碎片0.1g，加甲醇5ml,浸泡1小时，滤过。取滤液2ml，加对二甲氨基苯甲醛固体少许，滴加硫酸数滴，即显蓝紫色。

3、本鉴别系针对干蟾皮中的色胺类成分的鉴别取本品少许，加水10ml，水浸液置紫外光灯(254nm)下观察，显蓝紫色荧光。

【检查】

水分测定

按照《中国药典》2015年版四部(通则0831)检查，对4批药材进行了测定，规定水分不得超过17.0％。测定结果见表1：

表1 4批样品的水分测定结果

灰分测定

灰分测定按照《中国药典》2015年版四部(通则2302)。灰分测定法中1.总灰分测定法测定。对4批药材进行了测定，根据实验结果，规定总灰分不得超过11.0％。测定结果见表2：

表2 4批样品的灰分测定结果

浸出物测定

照《中国药典》2015年版四部(通则2201)检查中醇溶性浸出物测定法。

取供试品约2-4g，称定重量，置250ml的锥形瓶中，精密加入45％乙醇100ml，塞紧,称定重量,静置1小时后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1小时。放冷后，取下锥形瓶，密塞，称定重量，用45％乙醇补足减失的重量，摇匀，用干燥滤器滤过。精密量取滤液25ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，除另有规定外，以干燥品计算供试品中水溶性浸出物的含量(％)。根据上述实验结果，浸出物规定不得少于5.0％。结果见表3。

表3 10批样品的浸出物测定结果

实施例2.蟾蜍噻咛含量测定

1仪器、材料、试剂与药材

HPLC:安捷伦1200；HPLC-MS-MS：Agilent 6410；超声波提取器：KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；紫外扫描仪：T6新世纪北京普析通用仪器公司；噻咛对照品、蟾皮样品(批号：091126)：安徽华润金蟾药业股份有限公司提供。乙腈、甲醇：DikmaPure；高纯水:自制。

2干蟾皮中被测成分的确定

(1)紫外波长确定：蟾蜍噻咛对照品用50％甲醇溶解，使用HPLC-DAD对蟾蜍噻咛对照品200-400nm扫描，结果显示226nm为最大吸收，因此选定226nm为测定波长。

(2)使用HPLC-DAD方法来确定样品中蟾蜍噻咛成分。经过HPLC-DAD分析，在紫外波长226nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同。且对照品与样品中蟾蜍噻咛峰的3D光谱相同，因此，初步确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。

(3)HPLC-MS-MS方法的确定:经过HPLC-MS-MS分析，在紫外波长226nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与蟾蜍噻咛对照品的出峰时间相同，且其分子量与蟾蜍噻咛对照品相同。再将被测峰进行二级质谱检测，发现样品中被测峰裂解的分子离子碎片与蟾蜍噻咛对照品裂解的分子离子碎片相同，因此，确定样品中所测定的化学成分即为蟾蜍噻咛。

3色谱条件选择

依照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定。经过多种色谱柱筛选，不同流动相的选择，最终确定色谱柱的型号：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，ZORBAX C18，250*4.6mm；5μm,流动相：乙腈-水混合溶液(6：94)；检测波长：226nm；柱温：35℃；流速：1ml/min。

4样品提取条件的选择

(1)样品提取方法的选择根据文献报道及噻咛化学成分的理化特性，提取方法选择了加热提取与超声提取两种方法，实验结果为：0.068％、0.069％，因此选定使用超声提取的方法提取样品。

(2)样品提取条件的正交设计

根据噻咛对照品为水溶性的化学特性，提取溶媒选用水、20％甲醇、50％甲醇，提取时间进行了30分钟、45分钟、60分钟，对溶剂使用倍数25倍、50倍、100倍等提取条件进行了正交实验设计进行了考察。

结论：正交实验结果显示，样品的提取率其中以提取条件为A3B3C1的条件最佳，其中C1与C2的提取率也相差不大，为了保证测定的完全、准确。最终选定提取条件为A3B3C2。即以50％甲醇为提取溶媒，提取使用倍数为50倍，超声提取60分钟。

5样品的提取方法

精密称取本品细粉约1.0g，置100ml量瓶中，加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)60分钟，放至室温，补充减失重量，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)即得。

6样品浓度与峰面积之间的线性关系考察

精密称取蟾蜍噻咛对照品，用50％甲醇配制成浓度为0.158mg/ml的浓溶液，摇匀。分别取0.05ml、0.25ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0m置10ml量瓶中，加入50％甲醇至刻度，摇匀。分别取10μl注入高效液相色谱仪，测定，以对照品峰面积的为纵坐标，以对照品进样量为横坐标绘制工作曲线图(见图1)，测定数据详见表4。回归方程：y＝6746.1x+0.9436R²＝1线性范围：0.0079～0.632μg。

表4.蟾蜍噻咛对照品工作曲线测定数据

7精密度试验

精密吸取同一样品，重复测定5次，进行精密度试验。结果见表5。

表5.精密度试验结果

8样品稳定性试验

按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，室温下自然放置，每间隔一定时间测定一次含量，测至24小时，结果见下表6。可见样品溶液中蟾蜍噻咛的含量至少在24小时内稳定性良好。

表6.稳定性试验结果

9样品重复性试验

分别精密称取6份，按照上述样品的提取处理方法,对样品进行提取处理。试验结果表明可见该方法有良好的重复性。结果见表7.

表7.重复性试验结果

10回收率试验：

采用加样回收法，精密称取已知含量同一批号的样品(批号：091126，含量0.6988mg/g)0.5g，分别精密加入对照品溶液(7.60ug/ml)50ml，按正文供试品溶液的制备方法制备及上述色谱条件，测定，按下式计算回收率，结果平均回收率为98.57％，相对标准偏差为2.03％，说明方法是可靠的，结果见表8。

表8.回收率试验

11系统适应性试验

使用相同品牌、相同型号色谱柱以及不同品牌仪器(岛津20A、安捷伦1100)的多根色谱柱对同一样品进行测定，观察测定的分离情况，见表9。

表9.使用不同色谱柱型号清单

12不同批号干蟾皮的含量

按正文收载方法测定各批号干蟾皮含量，计算含量结果，即得。根据上述测定结果，本品每克蟾皮含蟾蜍噻咛(C₁₂H₁₄N₂O₄S)，不得少于0.1mg/g。结果见表10。

表10.样品测定结果

实施例3.蟾皮中沙蟾毒精的含量测定

1仪器、材料、试剂与药材

HPLC:岛津20A；HPLC-MS-MS：Agilent 6410；沙蟾毒精对照品：自制，含量98％以上，蟾皮样品：金蟾生化药业有限公司提供。乙腈：fisher；高纯水：哇哈哈纯净水。

2样品中被测成分的确定

(1)紫外波长确定：沙蟾毒精对照品用甲醇溶解，使用HPLC-DAD对沙蟾毒精对照品200-400nm扫描，结果显示296nm为最大吸收，因此选定296nm为测定波长。

(2)使用HPLC-DAD方法来确定样品中沙蟾毒精成分。沙蟾毒精的紫外最大吸收为：296nm，因此样品的测定波长也选定为296nm。经过HPLC-VWD分析，在紫外波长296nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与沙蟾毒精对照品的出峰时间相同。将沙蟾毒精对照品加入样品中，296nm检测条件下，对照品与样品中的被测峰同时出峰。

(3)HPLC-MS-MS方法的确定：使用HPLC-MS-MS确定，经过HPLC-MS-MS分析，在紫外波长296nm检测条件下，样品色谱图中的被测峰，与沙蟾毒精对照品的出峰时间相同，且其分子量与沙蟾毒精对照品相同，其二级碎片峰也与对照品的二级碎片峰相同。因此，确定样品中所测定的化学成分即为沙蟾毒精。

3样品提取，条件的选择

(1)样品提取溶剂的选择沙蟾毒精属配基类成分，因此，选择了甲醇、氯仿、乙醇为提取溶剂对样品进行提取。实验结果峰面积为：805888、395967、648400，因此，选择甲醇作为提取溶剂。

(2)样品提取方法、提取时间的选择根据文献报道及沙蟾毒精化学成分的理化特性，提取方法选择了加热回流提取与超声提取两种方法，分别提取15分钟、30分钟、45分钟、60分钟。实验结果为：以回流提取30分钟提取得率最高，因此选定加热回流提取的方法提取样品。

4样品的制备方法

将蟾皮用粉碎机打碎，取1.50g，精密称定，加入甲醇50ml，精密称定重量，室温放置30分钟，于水浴上回流提取30分钟，取下室温放置室温，用甲醇补重，摇匀，过0.45um膜滤过。测定。

5色谱条件选择

依照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定。经过多种色谱柱筛选，不同流动相的选择，最终确定色谱柱的型号：用十八烷基硅烷键合硅胶为填料，CNWAthena C₁₈，250*4.6mm；5um,流动相：乙腈-水溶液梯度洗脱；检测波长：296nm；柱温：35℃；流速：1ml/min。

乙腈-水溶液梯度如下：

6标准曲线制备方法

精密称取沙蟾毒精对照品4.15mg，至2ml量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，作为浓溶液。精密吸取浓溶液0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，照高效液相色谱法(附录ⅥD)测定，分别取10μl注入高效液相色谱仪，以对照品峰面积的为纵坐标，以对照品进样量为横坐标绘制工作曲线图，见图2。测定数据详见表11。回归方程：y＝1.32811e-006X-0.0165303R²＝0.0.9998线性范围：0.51875～8.300ug。

表11.工作曲线测定数据

7样品重复性试验

分别精密称取6份，按照上述样品的提取处理方法,对样品进行提取处理。试验结果表明可见该方法有良好的重复性。结果见表12.

表12.重复性试验结果

8精密度试验

精密吸取同一样品，重复测定6次，进行精密度试验。结果见表13。

表13.精密度试验结果

9样品稳定性试验

按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，室温下自然放置，每间隔一定时间测定一次含量，测至24小时，结果见表14。可见样品溶液中沙蟾毒精的含量至少在32小时内稳定性良好。

表14.稳定性试验结果

10回收率试验

采用加样回收法，精密吸取已知含量同一批号的样品(批号:，含量0.3104％)0.7g置50ml瓶中，共5份，分别精密加入对照品2.3mg，加入甲醇。按正文供试品溶液测定法及上述色谱条件，测定，按下式计算回收率，结果平均回收率为97.60％，相对标准偏差为0.84％，说明方法是可靠的，结果见表15。

表15.回收率试验

11样品测定

按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，HPLC测定，结果见表16。

通过结果可以发现，沙蟾毒精在蟾皮中的含量有高有低，其中四川蒲江、绵阳、自贡、峨边、南充、陕西汉中6个样品(样品均为小皮、中皮、大皮)中含量较高，含量在0.1305％-0.3219％。而山东的德州、苍山、河南周口、南阳以及江苏海安5个样品中含量较低，含量在0.0069％-0.0392％之间。文献显示，沙蟾毒精是蟾皮中的主要活性成分之一，其水溶性较强，同时具有较强的抗癌活性，因此，根据测定结果。沙蟾毒精在蟾皮中的含量暂定不得低于：0.10％。

表16.33个产地蟾皮中沙蟾毒精的测定结果

12系统适应性试验：

样品的处理按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液后，采用不同的HPLC(日本岛津20A 1号机、2号机)仪、同一型号3根色谱柱、不同型号不同厂家色谱柱，对样品进行测定。结果见表17。

表17.系统适应性实验结果

实施例4.蟾皮中蟾毒配基类成分特征图谱的建立

1仪器、试药

LC-MS-MS：ORBITRAP VELOS PRO,正离子Full Scan，一级FT二级Ion：30000，Range：50-1000，HPLC:戴安,色谱柱：BDS HYPERSIL C18 150*2.1mm，Particle size：2.4um；高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，检测器：二极管阵列检测器；超声波提取器：KB-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵对照品自制，纯度>98％；华蟾酥毒基对照品：购自中国药品生物制品检定所。试剂：甲醇：Fisher、CNW；纯净水：娃哈哈纯净水。

2色谱条件

高效液相色谱仪:岛津LC-20AT，色谱柱：菲罗门phenomenexGemini 4.6*250mm(5um)；梯度如下：

3方法学考察

(1)测定方法的选择

根据蟾皮药材所含成分的理化特性，以及《中国药典》2010年版附录、各地方标准中记载、相关文献报道、和本课题组多年来对蟾皮的研究，选定高效液相色谱法，使用二极管阵列检测器检测，选定296nm为检测波长，对图谱中主要的4个配基类成分的特征性峰进行了控制。

(2)测定条件的选择

根据特征性成分的特点，我们先后使用甲醇-水、乙腈-水不同梯度、多种比例不同梯度进行分离条件的探讨，经过反复摸索最终选定“2.色谱条件”为测定条件。

(3)提取方法的选择

为保证药材均匀，将蟾皮药材使用高速粉碎机粉碎，过10目筛，精密称取相同重量样品4份，分别加入100％甲醇，再使用回流提取与超声提取比较两种提取方法的提出率，计算4个特征峰的峰面积，回流提取样品比超声提取样品峰面积均高，结果见下表18。

表18.提取方法的选择

(4)提取时间的选择

分别精密称取相同重量样品4份，分别加入100％甲醇作为提取溶剂，回流提取30分钟、60分钟、90分钟、120分钟，取样进行测定。以谱图中的4个色谱峰的峰面积为参考标准，实验结果证明，样品回流提取90分钟，谱图中的4个特征峰的峰面积与提取120分钟的样品中的4个峰的峰面积相近，且略高于提取120分钟的样品。故选用回流提取90分钟为最佳提取时间。

(5)供试品溶液的制备

取蟾皮药材粗粉(过10目筛)约0.5g，精密称定，加甲醇25ml，称定重量，回流提取流90分钟，放至室温，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(6)供试品溶液全梯度测定

为保证测定的准确性，对制备的样品进行0→100％甲醇梯度检查。紫外波长：296nm。样品检测色谱图见图3。

(7)特征性有效成分确定

1).HPLC-UV确证

使用HPLC-UV法对谱图中所显示的色谱峰进行紫外全波长扫描，结果显示，

保留时间17-35分钟所显示的均为配基类成分。见图4、5。

2).使用LC-MS-MS：对色谱图中的4个特征性成分进行一级质谱分子量以及二级质谱分子离子碎片峰与对照品及相关文献分析推断比对，结果显示：1号峰(S峰):沙蟾毒精，2号峰：华蟾毒它灵，3号峰：蟾毒灵，4号峰：华蟾酥毒基。

(8)精密度试验

取同样品制备过滤后，连续测定6次，进行精密度试验，经测定RSD为0.0518％、0.0343％、0.0430|％、0.0284％，结果表明，该方法重复性良好。具体结果见表19。

表19.精密度试验中4个特征峰保留时间数据

(9)重复性试验

取蟾皮药材粗粉(过10目筛)约0.5g，精密称定，加甲醇25ml，称定重量，回流提取流90分钟，放至室温，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，进行重复性试验。试验结果表明，该方法重复性良好。结果见表20。

表20.重复性试验中4个特征峰保留时间数据

(10)样品稳定性试验

取提取过滤好的样品，室温下放置，于0、2.5、5.5、8、15、24小时，结果显示：样品溶液中被测成分的含量至少在24小时内稳定性良好。结果见下表21。

表21.稳定性试验中4个特征峰保留时间数据

4系统适应性试验

(1)色谱柱

使用相同品牌、相同型号色谱柱以及不同品牌的多根色谱柱对同一样品进行测定，观察测定的分离情况。见表22。

表22.使用不同色谱柱型号清单

(2)高效液相色谱仪

使用同品牌不同仪器以及不同品牌高效液相色谱仪(岛津LC-20AT 1号机、岛津LC-20AT 2号机、Agilent 1260)，相同色谱柱(phenomenex Gemini C₁₈S/N:759050-27)对同一样品进行测定，观察测定的分离情况。

(3)样品的测定

将提供的17批样品按照上述“供试品溶液的制备”进行样品处理后，进行HPLC测定，在样品图谱的相应位置应有4个特征峰，与参照峰相应峰S峰，计算各特征峰与S的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值1.000(峰S)、1.40(峰2)、1.53(峰3)、1.72(峰4)。结果见表23。

表23. 17批样品中各峰的保留时间值分析结果

结论：供试品特征图谱中应有4个特征峰，将第一个峰设定为参照峰S峰，计算各特征峰与S的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内。规定值1.00(峰S)、1.40(峰2)、1.53(峰3)、1.72(峰4)。

实施例5.总配基成分及10个配基类单体体外抗胰腺癌肿瘤药物筛选

1实验原理

实验以肿瘤细胞为研究对象，通过MTT比色法检测样品体外抗肿瘤活性。MTT比色法能够检测肿瘤细胞的存活和生长，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能够溶解细胞中的甲臜，以酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光值，通过吸光值的变化反应肿瘤细胞的存活和生长状况。

2实验方法

(1)实验材料：SW1990、PANC-1、BxPC-3、AsPC-1细胞，1640培养基，DMEM培养基，胎牛血清，噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，生理盐水，96孔细胞培养板(Corning,3596)，气套式CO₂细胞培养箱(Thermo，美国)，VVarioskan Flash多功能酶标仪(Thermo，美国)。

(2)样品处理及浓度配制：

样品16个，其中华蟾素注射液组分有4个，包括配基类、色胺类、多肽类和核酸类，各称取1mg，其中配基用DMSO作为助溶剂，其他直接用生理盐水进行溶解，配制母液浓度为1mg/ml；

配基类单体成分有12个，均用DMSO作为助溶剂，部分超声溶解，使起始浓度为1mg/ml。

3实验步骤：

肿瘤细胞于37℃、5％CO₂及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清1640(或DMEM)培养基中，细胞呈对数增长时进行传代，调整细胞浓度至2×104个/ml，接种100μl于96孔培养板。待细胞贴壁生长18～24h，加入检测样品及阳性对照药5-Fu 50μl，终浓度均为10μM，对照组同时加入等体积生理盐水，与细胞共同孵育48h。孵育结束后，小心吸弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪570nm处测量吸光值，测量吸光值后计算样品抑制率。

4计算方法：

样品抑制率＝[(对照-空白)-(样品-空白)]/(对照-空白)×100％

5实验结果：见表24.

表24. 16个样品的IC50结果，IC50值单位(μg/ml)

*由于嚏根草醇和嚏根草苷元是后期从配基类组分中分离获得，暂时还未做出对BxPC-3细胞株的药效。

6结果分析

从实验结果我们得出以下结论：

A、华蟾素注射液中分离出的4个组分中，配基类和色胺显示出一定的抗胰腺癌肿瘤细胞株的作用；核酸和多肽，尤其是多肽无杀死肿瘤细胞的作用，而核酸的作用也很低；

B、配基类单体成分中日蟾毒他灵、沙蟾毒精、蟾毒灵、蟾毒它灵、远华蟾毒精、嚏根草醇和嚏根草苷元均显示出对胰腺癌细胞株敏感的抑制率，且呈现一定的浓度依赖性特性；

C、药物对胰腺癌4个细胞株的毒性作用有一定差别，综合评价发现药物对PANC-1和BxPC-3的毒性作用更强。

D、结果显示，对于PANC-1细胞，总配基的效果强于单体配基成分。

实施例6.对移植肝癌HepG2裸鼠的治疗作用研究

1.实验方法

待肿瘤细胞生长至对数生长期后，稳定传代2-3次，收集肿瘤细胞，台盼蓝染色计数成活率大于95％时，调整细胞密度至4×10⁶个/ml，右侧腋下接种于裸鼠，每只0.2ml。连续观察肿瘤生长情况，取肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠，常规消毒后，处死剥离肿瘤，选取透亮肉色部分切成约2mm×2mm×2mm小块，右侧腋皮下接种，4-5周后待肿瘤长至300mm3左右时，体内传代3次后用于正式试验。正式试验时，待肿瘤长至100mm³左右，依肿瘤体积大小按随机区组法将动物分为对照组、阳性药(华蟾素)组，A(蟾毒配基类成分)低剂量(0.5mg/kg)组、高剂量(2mg/kg)组、A+B(多肽类成分)低剂量(0.5+10mg/kg)组、A+B高剂量(2+40mg/kg)组，每组6只。现用现配，静脉注射给药，一周给药3次，连续给药6周；于给药期间用0.02mm精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周。按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积(V，mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm)×0.5；相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V0(V0为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积)。于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率(T/C％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV，CRTV：对照组RTV)，肿瘤抑制率＝(1－T/C)×100％(式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。

2.实验结果

实验结果见表25-29。结果显示，样品A 0.5mg/kg、2mg/kg及A+B 2+40mg/kg给药2周已可延缓肿瘤生长速度，与对照组相比有统计意义，给药6周后治疗组最高相对肿瘤增殖率达44％，肿瘤重量显著低于对照组，肿瘤抑制率最高达到57.9％，且未对体重有明显影响。表明样品A具有抗肿瘤作用，样品B增效作用不明显(图6)。

表29对HepG2肿瘤瘤重的影响

与对照组比较，***p＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05

以上所述仅为本发明的较佳方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蟾皮药材或饮片或包含蟾皮制剂的质量控制方法，所述药材或饮片或制剂中含有蟾毒配基类成分，该蟾毒配基类成分即为蟾皮药材或饮片中抗癌活性组分群，其特征在于：

(1)对所述药材或饮片进行鉴别，包括：理化鉴别、水分灰分、浸出物含量、色胺类成分蟾蜍噻咛以及配基类成分沙蟾毒精的含量的鉴别，使其具有如下鉴别特征：

(a)水分含量不得超过17.0％；

(b)总灰分不得超过11.0％；

(c)本品按干法计算含量，含蟾蜍噻咛C₁₂H₁₄N₂O₄S不得少于0.1mg/g；

(d)本品按干法计算含量，含沙蟾毒精不得低于0.10％；

在上述一个或几个条件存在的情况下，

(2)对所述药材或饮片中含有的蟾毒配基类成分进行HPLC特征图谱分析，得到其HPLC特征图谱；重点控制所述HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中参照峰及各特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.2～1.6、1.3～1.7、1.5～1.9，且相对保留时间应在规定值的±15％之内。

(3)对所述制剂的检验及标准可参照上述药材或饮片。

2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：所述HPLC特征图谱中，重点控制该HPLC特征图谱中沙蟾毒精、华蟾毒它灵、蟾毒灵和华蟾酥毒基——4个色谱峰，编号分别为1-4；其中1号峰为沙蟾毒精，为参照峰，2号峰为华蟾毒它灵，3号峰为蟾毒灵，4号峰为华蟾酥毒基；上述特征图谱中参照峰及各特征峰与参照峰的相对保留时间分别规定为1.000、1.40、1.53、1.72；且相对保留时间应在规定值的±15％之内。

3.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：所述药材或饮片或制剂具有如下鉴别特征：

(1)取一定量的本品碎片，加有机溶剂，浸泡，滤过；滤液蒸干，残渣加醋酐少量使其溶解，滴加硫酸数滴初显蓝紫色，渐变蓝绿色；

(2)取一定量本品碎片，加有机溶剂，浸泡，滤过；取一部分滤液，加对二甲氨基苯甲醛固体少许，滴加硫酸数滴，即显蓝紫色；

(3)取本品少许，加水，水浸液置紫外光灯下观察，显蓝紫色萤光。

4.根据权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于：样品取样量可以是0.1-10g，甚至更多；所述有机溶剂包括：氯仿、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇等本领域通用有机溶剂；溶剂中水的加入量为溶剂质量1-100倍的体积；浸泡时间不得少于5分钟。

5.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：蟾皮中蟾蜍噻咛的测定方法为——反相高效液相法；具体方法如下：精密称取本品粉末，加入提取溶剂，称定重量，处理，补充减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过即得供试品溶液；将所述供试品注入高效液相色谱仪进行样品测定。

6.根据权利要求5所述的质量控制方法，其特征在于：所述供试品制备方法为：粉末的过筛目数为10-100目，提取溶剂涉及水、不同浓度的乙醇或甲醇溶液；提取溶剂添加倍数为样品重量的100倍或100倍以下体积；处理方法可以是超声提取或回流提取；提取时间可以是1小时或1小时以内的任何时间或更长；供试品过滤时使用的微孔滤膜为0.45或0.22μm；所述反相高效液相法涉及的色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料可以是3、4、5或10μm的ODS，色谱柱长度为150或250*4.6mm；流动相为甲醇或乙腈-水的混合溶液，并用226nm作为检测波长，或应用对照品的全波长扫描的结果对上述波长进行微调。

7.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：所述蟾皮中沙蟾毒精的测定方法为——反相高效液相法；具体方法如下：精密称取本品粉末，加入提取溶剂，称定重量，处理，补充减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过即得供试品溶液；将上述供试品注入高效液相色谱仪进行样品测定。

8.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于：所述供试品制备方法为：粉末的过筛目数为10-100目；提取溶剂涉及水、乙醇、甲醇及不同浓度的乙醇、甲醇或氯仿等有机溶液；提取溶剂添加倍数为样品重量的100倍以下体积；处理方法可以是超声提取或回流提取；提取时间可以是1小时以内的任何时间或更长；供试品过滤时使用的微孔滤膜为0.45或0.22μm；所述反相高效液相法涉及的色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料可以是3、4、5或10μm的ODS，色谱柱长度为150或250*4.6mm；流动相为甲醇或乙腈-水的混合溶液，并用296nm作为检测波长，或应用对照品的全波长扫描的结果对上述波长进行微调。

9.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于：所述特征图谱的制备方法为——反相高效液相法；具体方法如下：精密称取本品粉末，加入提取溶剂，称定重量，处理，补充减失重量，摇匀，用微孔滤膜滤过即得供试品溶液；将上述供试品注入高效液相色谱仪进行测定，得到特征图谱。

10.根据权利要求9所述的质量控制方法，其特征在于：所述供试品制备方法所述粉末的过筛目数为10-100目；提取溶剂涉及水、乙醇、甲醇及不同浓度的乙醇-水、甲醇-水或氯仿等有机溶液；提取溶剂添加倍数为样品重量的100倍以下体积；处理方法可以是超声提取、回流提取或浸泡+超声、浸泡+回流；浸泡时间可以是30分钟或更多时间；提取时间可以是2小时以内的任何时间或更长；供试品过滤时使用的微孔滤膜为0.45或0.22μm；所述反相高效液相法涉及的色谱条件为：十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，填料可以是3、4、5或10μm的ODS，色谱柱长度为150或250*4.6mm；流动相为甲醇或乙腈-水的混合溶液，并用296nm作为检测波长，或应用对照品的全波长扫描的结果对上述波长进行微调。