CN104055797A - 蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蟾皮中两类组合物成分的检测及鉴定方法。本发明是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后，进行凝胶色谱分离、ODS纯化得到的，一种或N种多肽组成的组合物。运用HPLC-凝胶层析色谱法，结合已知标准品制备校正曲线，得到：该组合物成分分子量分布范围是1000~10000Da。本发明还涉及一种蟾皮中的脂溶性组合物，是以干蟾皮为原料经过水提醇沉的方法制成中间提取物后以溶剂或者层析色谱的方法得到的一种或N种脂溶性成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱（HPLC-MS），通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。

Description

蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定

技术领域

本发明属中药技术领域，具体涉及蟾皮提取物中两类组合物成分、及含有该一种或两种组合物制剂的检测及鉴定。

背景技术

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮,具有清热解毒、利水消胀之功效,临床用于治疗痈疽、肿毒、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等病症。蟾皮水溶性部位开发的药品已有多个上市, 尤其华蟾素注射液，是从中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂，治疗原发性肝癌和中晚期肺癌分别获得44%和56%的综合有效率，瘤体缩小率分别为10%和16%, 且对化疗和放疗具有协同作用。临床应用表明华蟾素注射液具有解毒、消肿、止痛之功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，其生理活性物质主要是蟾蜍毒素类(bufotoxins)及其水解产物蟾毒配基类(bufageins)、蟾蜍色胺类(bufoteinines)等。

从蟾蜍（主要是蟾皮）中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为：蟾毒配基类、蟾蜍毒素类、蟾毒色胺类三大类以及核苷酸、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分中，其主要蟾毒配基类成分的化学模式与蟾酥及其制剂存在较大差异。大量研究结果表明，蟾皮提取物中的蟾毒配基类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性。同时，发明人发现大量的多肽类成分存在于蟾皮的提取物中，经过试验证实，该类成分具有一定的抗肿瘤、增强免疫、以及很广泛的镇痛作用。可见，华蟾素系列制剂在肿瘤治疗方面的良好表现，不仅来源于蟾毒内酯类成分。

众所周知，从动物类中药原料中获得有价值的化合物极为困难，成本很高，一般不使用蟾皮中的纯化合物，而使用提取物直接用作药用原料。但蟾皮提取物的一个缺点是，成分复杂、有效成分及其含量不清楚，因此给药品的质量控制造成很大困难。为了保持蟾皮提取物及含有该提取物的药物、制剂的质量稳定，清楚知道其药效成分及其含量是十分重要的。目前，对于蟾皮提取物制剂多集中于其中总配基的含量检测，或者对其中常见毒配基类（如蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等）单体成分进行测定。基于缺乏蟾皮提取物中蟾毒配基类成分的化学模式全面而深入的研究，导致其临床发挥抗肿瘤作用的效应物质基础长期未予明确。另一方面，对于其中多种多肽成分的组合物的解析就更加复杂和困难。

本发明对蟾皮进行提取后得到蟾皮提取物，该提取物经过分离纯化制备得到多肽及脂溶性两类组合物。经过对该两类组合物的多种方法的检测，为阐明该组合物的组成，对其中化学成分进行分析和鉴定，为进一步深入研究其抗肿瘤效应机制、解析临床起效部位奠定了物质基础。

发明内容

本发明的目的是对蟾皮提取物进行分离解析，提出对其进行质量控制的新方法。本发明涉及的蟾皮提取物、蟾皮组合物、蟾皮制剂，具有解毒、消肿、止痛之功效，用于中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症的治疗。

本发明提供了一种或几种来源于蟾皮的组合物。包括多肽类组合物和脂溶性组合物。

本发明提供了一种或几种对于多肽类组合物的检测方法，指认了该种组合物分子量组成及区域，同时对于蟾皮组合物中多肽类组合物进行定量检测。测定方法排除了诸多干扰因素，方法简单易行，结果准确性强

本发明提供了一种或几种对于蟾皮中脂溶性组合物的检测方法，能够同时对组合物中多种成分进行指认和鉴别。测定方法干扰小，说服力强。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

本发明蟾皮组合物的检测方法包括如下检测方法中的一种或几种：

A 一种蟾皮提取物

一种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成的。

B 一种蟾皮中多肽组合物

一种蟾皮中的多肽类组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提取物后，进行凝胶色谱分离、烷基键合硅胶纯化得到的，一种或N种多肽组成的组合物。运用HPLC-凝胶层析色谱法，结合已知标准品制备校正曲线，得到：该组合物成分主要分子量分布范围是1000~10000Da。经过上述处理后，能够对蟾皮提取物及提取物制剂中的多肽组合物成分，使用常规多肽显色方法进行含量测定，方法简便，准确性高。

C 一种蟾皮中脂溶性组合物

一种蟾皮中的脂溶性组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提取物后，以溶剂或者层析色谱的方法得到的一种或N种脂溶性成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱（HPLC-MS），通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品比对，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。酯蟾毒配基、华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵和蟾毒灵等。

附图说明

图1 是“校准曲线及函数公式”

“校正曲线是 y = -0.5072x + 6.9794 R² = 0.9934”

图2 是“多肽样品谱图”

图3 是“多肽样品放大的谱图”

图4 是“洗脱曲线”

图5 是“多肽标准品标准曲线”

图6 是“HPLC（296nm）色谱图”

图7 是“LC-MS 离子流图”

具体实施方式

下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：本发明蟾皮提取物的制备

干蟾皮洗净，用5~15倍的水提取2次，浓缩至小体积后分别用50~70%、75~90%的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到蟾皮提取物；或者，干蟾皮洗净，用5~15倍的水提取2次，浓缩至相对密度为1.01~1.35（80℃）后，分别用 40~70%、75~90%的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到蟾皮提取物。

具体操作方法为：取干蟾皮进行修治后，加入8倍水（V/m），煎煮2次，每次30min，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积（相对密度在1.01~1.35，80℃），冷却至40℃，加入95%乙醇调节醇浓度为40~60%进行一次醇沉，后倾出上清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95%乙醇调节醇浓度为75~90%进行二次醇沉，静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24 h，离心，即得蟾皮提取物。

实验例2：本发明蟾皮提取物中多肽组合物的制备

使用葡聚糖凝胶Sephadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20对实施例1中所述蟾皮提取物进行分离纯化，装柱径高比1:15，上样体积比1:40，恒流速3ml/min去离子水洗脱，按照柱体积1/10进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽类组合物；

或者，使用聚甲基丙烯酸酯凝胶HW40、HW50或HW65对中间体进行分离纯化，装柱径高比1:15~20，上样体积比1: 10~ 40，恒流速3~10ml/min去离子水洗脱，按照柱体积1/10每份进行收集，采用双缩脲反应进行跟踪，收集反应阳性馏分合并后冷冻干燥，得到多肽类组合物。

实验例3：多肽组合物分子量值的估算

3.1 标准品分析条件及结果：

3.1.1 标准品及其配制：

标准品：生长抑制素 MW 1638

胸腺肽Alpha1 MW 3108

胰岛素：MW 5808

核糖核酸酶MW 13700

以上标准品加水溶解，配制成浓度为1mg/mL的溶液，待测。

3.1.2 分析条件：色谱柱：G2000SWXL（7.8mm*30cm）

柱 号：S0042

流动相： ACN:H2O=2:8(加0.05%TFA)

流 速：0.7mL/min

检测器：UV214nm

3.1.3 分析结果：（见表1，图1）

表 1 标准品保留时间，保留体积以及分子量对数表

3.2 多肽样品测定条件及结果

3.2.1 供试样品的制备：

多肽样品为本发明实施例2中所述蟾皮提取物中的多肽组合物。

取实施例2中多肽组合物，加水溶解，配制成样品浓度为0.1mg/ml的溶液，即为多肽供试品。

3.2.2 分析条件：色谱柱： TSKgel G2000SWXL (7.8mm×30cm)

柱 号： T01762

保护柱： 无

洗脱液： ACN:H2O =2:8(加0.1%TFA)

流速： 1.0 mL/min

检测条件： UV214nm

3.2.3 分析结果（见表2、图2、图3）

表 2 谱图积分结果

3.3 实验结论：根据以上实验结果可见，来源于蟾皮的多肽组合物是由N种多肽组合而成的混合物，分子量范围集中在1000~10000Da。

实验例4：华蟾素注射液多肽含量测定

4.1 方案

采用葡聚糖凝胶G-10对华蟾素注射液中的多肽进行分离、富集，浓缩至适当体积，再以标准肽做标曲，双缩脲法进行测定。

4.2 材料

仪器：紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）

试剂：CuSO₄5H₂O，NaOH，氯化钠，去离子水，酒石酸钾钠

多肽标准品：CL-705，序列 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH₂ ;

分子量 3297.69 ; 纯度 >95%。（ChinaPeptides, Co.,Ltd）

华蟾素注射液：由安徽金蟾生化有限公司提供。

4.3 实验步骤及结果

4.3.1 试剂配制

双缩脲试剂：称以1.50g硫酸铜（CuSO₄5H₂O）和6.0g酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆4H₂O），用500 ml水溶解，在搅拌下加入300ml10% NaOH溶液（g/ml），用水稀释到1L。

生理盐水：取36.0 g氯化钠，800 mL水溶解，稀释至1 L。

4.3.2 供试品制备：多肽分离、富集

采用葡聚糖凝胶G10进行供试品制备。考察了不同的柱型号（1.0*20cm/30ml，1.5*45cm/45ml）、上样量。并对收集方法进行了确定：上样后，生理盐水洗脱，每份1ml收集，220nm及275nm处测定吸收值，做洗脱曲线；根据峰合并（结合双缩脲反应检识）。图4为弃去前10ml后的洗脱曲线。多次结果表明，上样后洗脱，弃去前14ml，收集7ml，再浓缩后即得。

由以上结果得到供试品制备方法：精密取25 mL注射液进行减压浓缩至干，1-2ml 生理盐水复溶，上样至G10柱（柱型号：1.5*45cm；柱床体积：45ml），生理盐水洗脱，弃去前14ml，收集7ml洗脱液，再50℃减压浓缩至干，即得待测样品。

4.3.3 标准溶液配制

精密称取60 mg多肽标品，生理盐水溶解，定容至5mL。标品浓度为12 mg/mL，作为储备液。储存于4℃。

4.3.4 标准曲线制备

分别取多肽标准液0,0.133,0.337,0.500,0.666,0.867,1.000 mL，用生理盐水补足至1.0 mL，分别加入双缩脲试剂2mL，摇匀，以第一管作为空白，30 min后，在540 nm处测定吸光度值。

以浓度为x轴，吸光度值为Y轴，做标准曲线。标准曲线方程为：Y=0.04475X+0.01107；r=0.9985。线性范围为：2-12mg/ml。

表3 标准肽标准曲线测定结果

编号	0	1	2	3	4	5	6
								标准肽含量mg/ml	0	2.00	4.00	6.00	8.00	10.00	12.00
吸光度值/WL540nm	0	0.098	0.195	0.292	0.379	0.461	0.532

4.3.5 精密度

精密移取华蟾素注射液（批号：100615）25ml，按供试品制备项下操作得到待测样品，再按标准曲线制备项下操作，连续6次测定其吸光度值。结果表明，RSD为0，精密度很好。

表4 精密度实验结果

4.3.6 重复性

取同一华蟾素注射液（批号：100615），平行6份，按供试品制备项下操作，按标准曲线制备项下测定吸光度值。

表5 重复性实验结果

4.3.7 显色稳定性

取华蟾素注射液（批号：100613）25ml，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下于0,2,4,6,8,10min 后分别测定吸光度值。

表6 10min内稳定性结果

取华蟾素注射液（批号：100613）25ml，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下于10,20,30,40,50,60min 后分别测定吸光度值。

表7 60min内稳定性结果

4.3.8 加样回收率

取同一华蟾素注射液样品（批号：100615）15 mL, 平行6份，每份加入标准品4 mg，按供试品制备项下操作，再按标准曲线项下测定吸光度值。根据结果，计算回收率。

表8 加样回收率结果（n=6）

4.3.9 样品测定

各取9批次华蟾素注射液样品25ml，按供试品制备项下操作，再按标准曲线制备项下分别测定吸光度值。结果见表9。

表9 样品测定结果

实验例5：脂溶性组合物的定性鉴别

5.1 仪器与分析条件：

分析仪器：Solarix FT-ICR-MS 9.4T（德国Bruker公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱条件：Diamonsil C₁₈色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱程序：0-5 min，5-20% A；5-45 min，20-42% A；45-70 min，42%-100% A；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl；检测波长：296nm。

质谱条件：电喷雾离子源喷雾电压：+4000V，干燥气温度：180℃，干燥气流速：4.0 L/min，喷雾气压力：0.5 bar；正离子扫描模式采集，质谱扫描范围m/z：70~1500。

5.2 对照品制备

分别精确称量酯蟾毒配基，华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵对照品，加甲醇溶解，配置成以上给对照品0.2mg/ml的混合标准溶液 ，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

5.3 供试品的制备

取本发明实施例1制备得到的蟾皮提取物，按照1:1的比例与硅胶拌匀，分散，加热混合物至完全干燥。用二氯甲烷进行索氏回流提取，滤过得到提取液，减压干燥，得到脂溶性组合物部分。取该组合物8mg加2ml甲醇溶解， 0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品。

5.4 结果与讨论

通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，从组合物供试品色谱峰中推断出33个化合物。分别为日蟾毒他灵，沙蟾毒精，远华蟾毒精，蟾毒他灵，华蟾毒他灵，蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基等。结果见表10、图6。

表10 HPLC- MS 解析数据

Claims (14)

1.一种蟾皮提取物，其特征在于该蟾皮提取物由以下步骤制备得到：取干蟾皮，洗净，加5~15倍蒸馏水提取，第一次30~60分钟，第二次30~60分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.0~1.4（80℃）后，离心得到；或者取干蟾皮，洗净，加5~15倍蒸馏水提取，第一次30~60分钟，第二次30~60分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.0~1.4（80℃）后，分别用 40~70%、75~90%的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到。

2.一种蟾皮组合物，其特征在于由权利要求1中所述蟾皮提取物进一步分离纯化得到，其主要包括蟾皮中多肽组合物和脂溶性组合物。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于所述分离纯化方法是通过凝胶色谱分离、烷基键合硅胶纯化或溶剂分配结合层析色谱的方法得到的。

4.如权利要求2或3任一项所述的组合物，制备材料涉及：凝胶——包括葡聚糖凝胶和聚甲基丙烯酸基质凝胶；烷基键合硅胶——包括C₄、C₈、C₁₈键合硅胶的亲水及一般型；溶剂分配所用有机系溶剂涉及二氯甲烷、三氯甲烷，分配方法涉及溶剂萃取、超临界萃取。

5.权利要求1-4任一项提取物或组合物、含有所述组合物或提取物的制剂的检测方法，其特征在于：采用高效液相-凝胶色谱检测系统、紫外分光光度检测系统（UV）建立的多肽组合物的定性、定量方法。

6.权利要求2-3所述的组合物、含有所述组合物的制剂的检测方法，其特征在于：采用高效液相-质谱联用检测系统（HPLC-MS）对脂溶性组合物成分进行定性检测及成分指认。

7.根据权利要求2所述的多肽组合物主要是指蟾皮及其相关制剂中，分子量在1000-10000Da的小分子肽类。

8.根据权利要求5或6所述的检测方法，适合于混合多肽的快速定性、定量检测，特别是针对蟾皮及其制剂，包括注射剂、片剂、口服液、胶囊等中药产品。

9.根据权利要求2所述的脂溶性组合物主要是指蟾皮及其相关制剂中的毒配基类成分的混合物。

10.根据权利要求5所述发明方法，适合于混合毒配基类成分的同时、快速定性、定量检测，特别是针对蟾皮及其制剂，包括注射剂、片剂、口服液、胶囊等中药产品。

11.权利要求1所述蟾皮提取物中脂溶性成分的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱串联高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱测定，色谱柱为反相色谱柱，采用流动相为甲醇和水的梯度洗脱，紫外与质谱检测进行的。

12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于所述色谱柱为十八烷基键和硅胶色谱柱。

13.权利要求1-4任一项提取物或组合物、含有所述组合物或提取物的制剂的检测方法，其特征在于：对其中所含的多肽类成分进行检测，采用高效液相-凝胶色谱法，采用流动相为乙腈和水，紫外检测。

14.蟾皮提取物、及含有该组合物成分的制剂中多肽类组合物成分的含量测定方法，其特征在于：经过权利要求2-4所述方法的预处理，可采用多肽特征显色结合紫外比色的方法进行，该方法简单易行、干扰少、结果准确。