CN104502469A - 一种安替可胶囊的含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种安替可胶囊的含量测定方法，所述方法包括以下步骤：1)对照品溶液的制备；2)供试品溶液的制备；3)高效液相色谱法检测等步骤实现了对安替可胶囊中蟾皮含量的检测。同时，本发明的提供的检测方法还可以应用于蟾皮药材的检测。本发明的方法有效的提高了安替可胶囊的用药安全性，并建立了蟾皮药材的质量检测标准。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物制剂的含量测定方法，特别涉及一种安替可胶囊的含量测定方法。
背景技术
安替可胶囊是由当归、蟾皮制成的中药复方制剂，具有软坚散结，解毒定痛，养血活血的作用。用于食管癌瘀毒症，与放疗合用可增强对食管癌、胃癌和肝癌的疗效，可改善患者的临床症状、生存质量。
《中国药典》记载了一种安替可胶囊的含量测定方法，但是，该方法仅以阿魏酸为测定指标测定安替可胶囊中的当归有效成分，并没有提供测定蟾皮有效成分的方法。蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bu fo bufogargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的干燥皮，其具有清热解毒，利水消胀的功效，其有效成分的含量对于安替可胶囊的疗效至关重要。
《中国药典》仅收载了测定蟾酥的含量的方法，蟾酥的活性成分约有十余种，主要是蟾酥毒基(bufogenins)和其脂类(称为蟾酥毒(bufotoxins))，其主要化学成分为华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等。尽管经检测蟾皮中也含有华蟾酥毒基、酯蟾毒配基，但是蟾酥和蟾皮的组分有明显区别，两者的二烯内酯成分几乎相同，但蟾酥中的种类少且含量更集中；吲哚生物碱脱氢蟾蜍色胺在蟾皮中的相对含量较高，而在蟾酥中含量很低；蟾酥中甾醇类主要为β-谷甾醇，而蟾皮中主要为胆甾醇和胆甾醇棕榈酸酯，由于上述化学成分的差异，蟾酥的含量测定方法并不适用于蟾皮的含量测定。另外，安替可胶囊还含有来自当归药材的成分，会对蟾皮的测定造成干扰，而无法得到准确的结果。
因此，出于安替可胶囊质量检测的需要以及用药安全性考虑，需要对安替可胶囊进行有效成分的含量测定，尤其需要测定其中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量。目前，亟需一种适用于安替可胶囊的含量测定方法，以准确测定安替可胶囊中有效成分，如华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量。
发明内容
针对上述行业和市场的需要，本发明的目的在于提供一种快速、准确的安替可胶囊的含量测定方法，以及一种以华蟾酥毒基、酯蟾毒配基为蟾皮的指标，快速、准确地检测蟾皮有效成分含量的测定方法。
用于实现上述目的的技术方案如下：
一种安替可胶囊的含量测定方法，所述测定方法包括蟾皮的含量测定方法，所述蟾皮的含量测定方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，与甲醇混合制成每lml各含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基7.5μg/ml和2.5μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液的制备
a)将安替可胶囊内容物2g与甲醇100ml混合，加热回流1小时，滤过，残渣用适量甲醇洗涤并合并滤液；b)滤液蒸干，以少量甲醇溶解残渣，并将残渣的甲醇溶液与柱层析硅胶1g混合并拌匀，然后蒸干甲醇使供试品呈粉末状；c)取柱层析硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法装柱和上样，用洗脱液洗脱，收集洗脱液50ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至10ml，即得供试品溶液；
其中，步骤c)所述的洗脱液由环已烷、三氯甲烷、丙酮组成；优选地，环已烷、三氯甲烷与丙酮的体积比为V环已烷：V三氯甲烷：V丙酮＝4：3：3；
优选地，步骤b)和c)中所述柱层析硅胶为200～300目柱层析硅胶；
3)高效液相色谱法检测
采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以梯度洗脱法检测所述供试品溶液，检测波长为296nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％(g/ml)的磷酸二氢钾溶液，在洗脱0～70min时所述流动相A与流动相B体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；在洗脱70～90min时，流动相A的体积百分比逐渐升高到90％，而流动相B的体积百分比逐渐降至10％；在洗脱90～110min时，流动相A的体积百分比由90％逐渐降低到34.7％，而流动相B的体积百分比由10％逐渐升高至65.3％；在110～120min时，流动相A与流动相B的体积百分比为V流动相A：V流动相 B＝34.7％：65.3％；流速为0.8～1.0ml/min；
优选地，所述步骤3)中的进样体积为10～20μl；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱；
优选地，所述步骤3)中的柱温为30～40℃；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱的理论板数按华蟾酥毒基峰和酯蟾毒配基峰计算分别不低于4000；
优选地，所述步骤3)中的流动相B以甲酸调节pH值至2.50。
在根据本发明的一个实施方案中，所述检测方法中对照品的保留时间设定为70min。
在根据本发明的一个实施方案中，所述检测方法还包括当归的含量测定方法，所述当归的含量测定方法包括以下步骤：
Ⅰ)当归对照品溶液的制备
将适量的阿魏酸溶于甲醇中，使溶液中阿魏酸浓度为0.01mg/ml，制得当归对照品溶液；
Ⅱ)当归含量供试品溶液的制备
将安替可胶囊内容物0.6g与甲醇-甲酸溶液25ml混匀，所述甲醇-甲酸溶液中甲醇与甲酸的体积比为V甲醇：V甲酸＝95：5，密塞，超声提取30min，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为当归含量供试品溶液；
Ⅲ)高效液相色谱法测定
分别取所述当归对照品溶液和当归含量供试品溶液10μl上样，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，体积比为30：70的甲醇-1％冰醋酸混合溶液为流动相，检测波长320nm，理论板数以阿魏酸计不低于3500，测得阿魏酸峰面积，计算即得。
另一方面，本发明还提供了一种蟾皮有效成分的含量测定方法，所述蟾皮有效成分含量的测定方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，与甲醇混合制成每lml各含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基7.5μg/ml和2.5μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液的制备
a)将适量蟾皮药材粉末与适量甲醇混合，使混合溶液的蟾皮药材粉末的浓度为0.01g/ml，加热回流1小时，滤过，残渣用适量甲醇洗涤并合并滤液；b)滤液蒸干，以少量甲醇溶解残渣，并将残渣的甲醇溶液与柱层析硅胶1g混合并拌匀，然后蒸干甲醇使供试品呈粉末状；c)取柱层析硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法装柱和上样，用洗脱液洗脱，收集洗脱液50ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至25ml，即得供试品溶液；
其中，步骤c)所述的洗脱液由环已烷、三氯甲烷、丙酮组成；优选地，环已烷、三氯甲烷与丙酮的体积比为V环已烷：V三氯甲烷：V丙酮＝4：3：3；
优选地，步骤b)和c)中所述柱层析硅胶为200～300目柱层析硅胶；
优选地，步骤a)中将蟾皮药材粉末1g与甲醇100ml混合；
3)高效液相色谱法检测
采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以梯度洗脱法检测所述供试品溶液，检测波长为296nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸二氢钾溶液，在洗脱0～70min时，所述流动相A与流动相B体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；在洗脱70～90min时，流动相A的体积百分比逐渐升高到90％，而流动相B的体积百分比逐渐降至10％；在洗脱90～110min时，流动相A的体积百分比由90％逐渐降低到34.7％，而流动相B的体积百分比由10％逐渐升高至65.3％；在110～120min时，流动相A与流动相B的体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；流速为0.8～1.0ml/min；
优选地，所述步骤3)中的进样体积为10～20μl；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱；
优选地，所述步骤3)中的柱温为30～40℃；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱的理论板数按华蟾酥毒基峰和酯蟾毒配基峰计算分别不低于4000；
优选地，所述步骤3)中的流动相B以甲酸调节pH值至2.50。
在根据本发明的一个实施方案中，所述检测方法中对照品的保留时间设定为70min。
本发明提供了一种安替可胶囊的含量测定方法，成功地避免了安替可胶囊中当归有效成分对蟾皮有效成分含量测定的影响，可以准确、快速的获得安替可胶囊中蟾皮有效成分的含量，有效地提高了药品安全性。同时，本发明还针对药品行业对蟾皮有效成分测定方法的需求，建立了蟾皮的有效成分测定标准，为规范蟾皮的应用提供了参考。
附图说明
图1是华蟾酥毒基在200nm～400nm范围内的吸收值变化，显示华蟾酥毒基在294nm波长处有最大吸收；
图2是酯蟾毒配基在200nm～400nm范围内的吸收值变化，显示酯蟾毒配基在299nm波长处有最大吸收；
图3是以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至3.20)：乙腈＝65.0：35.0为流动相进行试验获得的色谱图数据；
图4是以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝65.0：35.0为流动相进行试验获得的色谱图数据；
图5是以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝64.5：35.5为流动相进行试验获得的色谱图数据；
图6是以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝65.5：34.5为流动相进行试验获得的色谱图数据；
图7是以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝65.3：34.7为流动相进行试验获得的色谱图数据；
图8是华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的甲醇溶液以安捷伦TC-C18色谱柱进行试验的色谱图数据；
图9是华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的甲醇溶液以安捷伦SB-C18色谱柱进行试验的色谱图数据；
图10a显示了柱温为30℃时对照品的色谱图数据；
图10b显示了柱温为30℃时供试品的色谱图数据；
图11a显示了柱温为40℃时对照品的色谱图数据；
图11b显示了柱温为40℃时供试品的色谱图数据；
图12是采用0.8ml/min的流速时得到的色谱图数据；
图13是采用1ml/min的流速时得到的色谱图数据；
图14是对设计的一种提取方法获得的提取物进行检测的色谱图数据；
图15是对设计的一种提取方法获得的提取物进行检测的色谱图数据；
图16是对设计的一种提取方法对阴性药物进行提取获得的提取物进行检测的色谱图数据；
图17是显示对照品的进样时间的色谱图；
图18是获得的华蟾酥毒基标准曲线；
图19是获得的酯蟾毒配基标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
在以下的实施例中，高效液相色谱仪采用日本岛津Lc-2010AHT高效液相色谱仪；
试剂：华蟾酥毒基购自中国药品生物制品检验所，批号：110803-200605，规格：供含量测定用；酯蟾毒配基购自中国药品生物制品检验所，批号：110718-200507，规格：供含量测定用；阿魏酸购自中国药品生物制品检验所，批号：110773-201012，规格：供含量测定用；蟾皮购自安国市振兴中药材有限公司，批号：101201-101203；柱层层析硅胶购自青岛海洋化工厂分厂，批号：0140026。
乙腈纯度为色谱纯；
水为纯化水；
如无特别指明，下文所涉冰醋酸、甲醇、甲酸、磷酸二氢钾均为商购分析纯试剂。
实施例1波长的选择：
分别取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品的甲醇溶液，经Cary50-Conc紫外分光光度计在200nm～400nm范围内进行扫描，华蟾酥毒基在294nm波长处有最大吸收(图1所示)，酯蟾毒配基在299nm波长处有最大吸收(如图2所示)，综合考虑之后选择296nm作为检测蟾皮中蟾酥毒基和酯蟾毒配基的测定波长。
实施例2流动相的选择
以乙腈(ACN)为流动相A，以0.5％磷酸二氢钾溶液为流动相B建立了以下五组方案(如表1所示)的流动相，其中，0.5％磷酸二氢钾溶液是将5g磷酸二氢钾溶于800ml纯水中，然后以甲酸调节至需要的pH值，最后加入纯水定容至1000ml即得。然后，对五组方案进行了试验筛选，方案中以下梯度为进样0～70min的比例，70～120min的比例均为加大有机相比例冲柱子比例。
表1流动相筛选方案
| 方案 | 内容 | 试验结果 |
| (1) | 0.5％KH2PO4(甲酸调PH值3.20):ACN＝65.0:35.0， | 如图3所示 |
| (2) | 0.5％KH2PO4(甲酸调PH值2.50):ACN＝65.0:35.0， | 如图4所示 |
| (3) | 0.5％KH2PO4(甲酸调PH值2.50):ACN＝64.5:35.5 | 如图5所示 |
| (4) | 0.5％KH2PO4(甲酸调PH值2.50):ACN＝65.5:34.5 | 如图6所示 |
| (5) | 0.5％KH2PO4(甲酸调PH值2.50):ACN＝65.3:34.7 | 如图7所示 |
如图3及表2所示，以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至3.20)：乙腈＝65.0：35.0为流动相进行试验，结果供试品的分离效果不佳，不适于蟾皮含量的测定。
表2
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 44.717 | 61507 | 19767 | -- | 1.029 |
| 2 | 49.722 | 10850 | 19911 | 3.733 | 1.016 |
| 3 | 51.873 | 9831 | 15766 | 1.405 | 1.373 |
| 总计 | 82187 |
如图4及表3所示，以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝65.0：35.0为流动相进行试验，结果供试品的分离效果不佳，不适于蟾皮含量的测定。
表3
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 44.617 | 58761 | 20493 | -- | 0.980 |
| 2 | 49.596 | 15729 | 16196 | 3.549 | 1.010 |
| 3 | 51.485 | 8445 | 24577 | 1.316 | 0.952 |
| 总计 | 82935 |
如图5及表4所示，以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝64.5：35.5为流动相进行试验，结果供试品的分离效果不佳，不适于蟾皮含量的测定。
表4
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 41.487 | 58340 | 20482 | -- | 1.024 |
| 2 | 44.019 | 3667 | 28042 | 2.290 | 0.894 |
| 3 | 45.375 | 364 | -- | -- | -- |
| 4 | 46.185 | 5815 | 27863 | -- | -- |
| 5 | 47.499 | 7604 | 27620 | 1.168 | 1.110 |
| 6 | 50.257 | 7260 | 30603 | 2.407 | 1.221 |
| 总计 | 83049 |
如图6及表5所示，以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.50)：乙腈＝65.5：34.5为流动相进行试验，结果供试品的分离效果尚可，但第二个峰峰形可进一步改善，可以用于蟾皮含量的测定。
表5
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 48.378 | 58324 | 19802 | -- | 1.021 |
| 2 | 53.555 | 10300 | 26907 | 3.862 | 0.940 |
| 总计 | 68624 |
如图7及表6所示，以0.5％KH2PO4(甲酸调pH值至2.5)：乙腈＝65.3：34.7为流动相进行试验，结果供试品的分离效果良好，除去了主峰前沿和拖尾的现象，可以用于蟾皮含量的测定。
表6
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 47.140 | 57961 | 20652 | -- | 1.002 |
| 2 | 52.263 | 14189 | 19963 | 3.671 | 1.088 |
| 3 | 54.383 | 10185 | 26443 | 1.505 | 0.956 |
| 总计 | 82335 |
实施例3色谱柱的考察
采用上述的流动相对C18反相色谱柱进行考察，以确定适用的色谱柱。进行对比的色谱柱分别为安捷伦TC-C18:5μm(200×4.6mm)和安捷伦SB－C18:5μm(200×4.6mm)。
图8所示为华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的甲醇溶液以安捷伦TC-C18色谱柱进行试验的结果，可见华蟾酥毒基和酯蟾毒配基并未能分开，因此，安捷伦TC-C18不适于蟾皮含量的测定。
图9和表7所示为华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的甲醇溶液以安捷伦SB-C18色谱柱进行试验的结果，可见华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别检测到为两个峰，因此，安捷伦SB-C18可以用于蟾皮含量的测定。
表7
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 48.397 | 62100 | 20479 | -- | 1.019 |
| 2 | 53.549 | 17415 | 24629 | 3.792 | 0.990 |
| 总计 | 79515 |
实施例4柱温的考察
分别以柱温30℃和40℃进行试验，以确定柱温对测定结果的影响，并确定较佳的柱温范围。
图10a显示了柱温为30℃时对照品的色谱图，图10b显示了柱温为30℃时供试品的色谱图；图11a显示了柱温为40℃时对照品的色谱图，图11b显示了柱温为40℃时供试品的色谱图。由上述色谱图可见，在柱温为30～40℃时，并未对蟾皮成分的分离效果造成显著的影响，但在柱温40℃时，供试品分离色谱图的峰形更好。
实施例5色谱流速的考察
现在，以0.8ml/min和1.0ml/min两种流速进行考察，以确定流速对分离效果的影响。图12和表8是采用0.8ml/min的流速时得到的色谱图表，图13和表9是采用1ml/min的流速时得到的色谱图表。如图12和表8、图13和表9所示，采用两种流速进行试验都取得了很好的分离效果，均能达到良好的分离度。
表8
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 58.783 | 75174 | 20527 | -- | 1.011 |
| 2 | 65.137 | 18656 | 19800 | 3.638 | 1.072 |
| 总计 | 93830 |
表9
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 47.436 | 57977 | 19618 | -- | 1.004 |
| 2 | 48.875 | 19 | 8277794 | 2.022 | 1.919 |
| 3 | 52.576 | 14837 | 21129 | 4.886 | 0.951 |
| 总计 | 72833 |
实施例6安替可胶囊中蟾皮活性成分的提取方法
安替可胶囊由当归和蟾皮两味中药成分组成，蟾皮中用作含量指示成分的华蟾酥毒基、酯蟾毒配基都是脂溶性成分，而当归中也含有大量的脂溶性成分，对安替可胶囊供试品中的华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的提取和分离造成严重的影响。本发明设计了以下提取方案，以获得较佳的分离效果。
(1)取装量差异项下的内容物，混匀，称取约2g，精密称定，加100ml甲醇，置水浴上加热回流1小时，用布氏漏斗抽滤滤过，残渣用适量甲醇洗涤三次，合并滤液，滤液置水浴上蒸干，残渣加少量甲醇溶解并用200-300目硅胶1g拌匀后蒸干甲醇使供试品呈粉末状，上硅胶柱(取200－300目硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法上样及装柱)，用环已烷：三氯甲烷：丙酮(4：3：3)洗脱，收集洗脱液50ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，完全移入10ml量瓶中，并用甲醇定容稀释至刻度，即得。
结论：分离结果如图14和表10所示，本方法达到了去除当归干扰的目的，并且取得了良好的效果。
表10
峰表
检测器A 296nm
| 峰号 | 保留时间 | 面积 | 理论塔板数(USP) | 分离度(USP) | 拖尾因子 |
| 1 | 47.707 | 53045 | 20164 | -- | 1.026 |
| 2 | 52.745 | 9926 | 25667 | 3.787 | 1.097 |
| 总计 | 62971 |
(2)取装量差异项下的内容物，混匀，称取约2g，精密称定，加100ml甲醇，置水浴上加热回流1小时，用布氏漏斗抽滤滤过，残渣用适量甲醇洗涤三次，合并滤液，滤液置水浴上蒸干，残渣加少量甲醇溶解并用200-300目硅胶1g拌匀后蒸干甲醇使供试品呈粉末状，上硅胶柱(取200－300目硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法上样及装柱)，用环已烷：三氯甲烷：丙酮(4：3：3)洗脱，弃去洗脱液前50ml，收集51-100ml的溶液，蒸干，残渣用甲醇溶解，完全移入10ml量瓶中，并用甲醇定容稀释至刻度，即得。
结论：本方法是用于考察硅胶柱层析的对两种主成分的是否洗脱完全，色谱结果如图15所示，硅胶柱层析51-100ml的洗脱液中没有主成分两个峰，从而证明了被测两个主成分均在收集洗脱液前50ml中。
(3)阴性对照试验
为进一步验证提取方法的合理性，取不蟾皮的阴性对照样品，依试验(1)的方法进行测定。结果如图16所示，阴性样品色谱在与华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰相应的保留时间(t≈49min为毒基成分、t≈53min为配基成分)附近无干扰峰检出。
实施例7对照品进样时间
由于对照品没有当归等成分的杂质峰干扰，0～120min的完整梯度洗脱应用于对照溶液可见华蟾酥毒基和酯蟾毒配基于0～70min内出峰(如图17所示)，在分析时可以考虑适当减少对照品的进样时间，对于梯度洗脱中0～70min为一个梯度，也是华蟾酥毒基和酯蟾毒配基出峰的时间范围，可以考虑在被测两个成分出峰后就停止数据采集。
实施例8标准曲线的绘制
精密称取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇制成每1ml各含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml的混合溶液，分别精密吸取10μl测定，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(如图18－19所示)，计算回归方程，数据如表11、表12所示。结果表明华蟾酥毒基、酯蟾毒配基在标准曲线范围内，呈线性关系，符合外标法定量测定的要求。
表11华蟾酥毒基标准曲线数据
表12酯蟾毒配基标准曲线数据
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (9)
1.一种安替可胶囊的含量测定方法，所述含量测定方法包括蟾皮的含量测定方法，所述蟾皮的含量测定方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，与甲醇混合制成每lml各含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基7.5μg/ml和2.5μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液的制备
a)将安替可胶囊内容物2g与甲醇100ml混合，加热回流1小时，滤过，残渣用适量甲醇洗涤并合并滤液；b)滤液蒸干，以少量甲醇溶解残渣，并将残渣的甲醇溶液与柱层析硅胶1g混合并拌匀，然后蒸干甲醇使供试品呈粉末状；c)取柱层析硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法装柱和上样，用洗脱液洗脱，收集洗脱液50ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至10ml，即得供试品溶液；
其中，步骤c)所述的洗脱液由环已烷、三氯甲烷、丙酮组成；优选地，环已烷、三氯甲烷与丙酮的体积比为V环已烷：V三氯甲烷：V丙酮＝4：3：3；
优选地，步骤b)和c)中所述柱层析硅胶为200～300目柱层析硅胶；
3)高效液相色谱法检测
采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以梯度洗脱法检测所述供试品溶液，检测波长为296nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸二氢钾溶液，在洗脱0～70min时，所述流动相A与流动相B体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；在洗脱70～90min时，流动相A的体积百分比逐渐升高到90％，而流动相B的体积百分比逐渐降至10％；在洗脱90～110min时，流动相A的体积百分比由90％逐渐降低到34.7％，而流动相B的体积百分比由10％逐渐升高至65.3％；在110～120min时，流动相A与流动相B的体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；流速为0.8～1.0ml/min。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的进样体积为10～20μl。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的柱温为30～40℃。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的色谱柱的理论板数按华蟾酥毒基峰和酯蟾毒配基峰计算分别不低于4000。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的流动相B以甲酸调节pH值至2.50。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中对照品的保留时间设定为70min。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括当归的含量测定方法，所述当归的含量测定方法包括以下步骤：
Ⅰ)当归对照品溶液的制备
将适量的阿魏酸溶于甲醇中，使溶液中阿魏酸浓度为0.01mg/ml，制得当归对照品溶液；
Ⅱ)当归含量供试品溶液的制备
将安替可胶囊内容物0.6g与甲醇-甲酸溶液25ml混匀，所述甲醇-甲酸溶液中甲醇与甲酸的体积比为V甲醇：V甲酸＝95：5，密塞，超声提取30min，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为当归含量供试品溶液；
Ⅲ)高效液相色谱法测定
分别取所述当归对照品溶液和当归含量供试品溶液10μl上样，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，体积比为V甲醇：V冰醋酸＝30：70的甲醇-1％冰醋酸混合溶液为流动相，检测波长320nm，理论板数以阿魏酸计不低于3500，测得阿魏酸峰面积，计算即得。
9.一种蟾皮有效成分的含量检测方法，所述测定方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，与甲醇混合制成每lml各含华蟾酥毒基和酯蟾毒配基7.5μg/ml和2.5μg/ml的溶液，即得对照品溶液；
2)供试品溶液的制备
a)将适量蟾皮药材粉末与适量甲醇混合，使混合溶液的蟾皮药材粉末的浓度为0.01g/ml，加热回流1小时，滤过，残渣用适量甲醇洗涤并合并滤液；b)滤液蒸干，以少量甲醇溶解残渣，并将残渣的甲醇溶液与柱层析硅胶1g混合并拌匀，然后蒸干甲醇使供试品呈粉末状；c)取柱层析硅胶10g，置长30cm，内径1.7cm的层析柱内，干法装柱和上样，用洗脱液洗脱，收集洗脱液50ml，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至25ml，即得供试品溶液；
其中，步骤c)所述的洗脱液由环已烷、三氯甲烷、丙酮组成；优选地，环已烷、三氯甲烷与丙酮的体积比为V环已烷：V三氯甲烷：V丙酮＝4：3：3；
优选地，步骤b)和c)中所述柱层析硅胶为200～300目柱层析硅胶；
优选地，步骤a)中将蟾皮药材粉末1g与甲醇100ml混合；
3)高效液相色谱法检测
采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以梯度洗脱法检测所述供试品溶液，检测波长为296nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.5％磷酸二氢钾溶液，在洗脱0～70min时，所述流动相A与流动相B体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；在洗脱70～90min时，流动相A的体积百分比逐渐升高到90％，而流动相B的体积百分比逐渐降至10％；在洗脱90～110min时，流动相A的体积百分比由90％逐渐降低到34.7％，而流动相B的体积百分比由10％逐渐升高至65.3％；在110～120min时，流动相A与流动相B的体积百分比为V流动相A：V流动相B＝34.7％：65.3％；流速为0.8～1.0ml/min；
优选地，所述步骤3)中的进样体积为10～20μl；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱为安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱；
优选地，所述步骤3)中的柱温为30～40℃；
优选地，所述步骤3)中的色谱柱的理论板数按华蟾酥毒基峰和酯蟾毒配基峰计算分别不低于4000；
优选地，所述步骤3)中的流动相B以甲酸调节pH值至2.50；
优选地，所述检测方法中对照品的保留时间设定为70min。
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Citations (2)
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| WO2009064657A1 (en) * | 2007-11-13 | 2009-05-22 | Phoenix Biotechnology Inc. | Method of determining the probability of a therapeutic response in cancer chemotherapy with cardiac glycoside |
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