CN112213419A - 含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法 - Google Patents
含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法。该方法采用高效液相色谱串联质谱检测，包括以下步骤：(1)储备液的制备：脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于乙腈水溶液中，制得标准品储备溶液；(2)标准曲线溶液的制备；(3)待测样品溶液的制备；(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。本发明方法的检测过程中色谱峰形极佳，每个化合物的通道都只有唯一的目标峰，避免了其他如溶剂效应等的干扰，操作简单、分析快速、特异性高、分离度高。
Description
技术领域
本发明涉及中药分析技术领域，特别是涉及一种药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法。
背景技术
蟾皮为两栖纲蟾蜍属动物蟾蜍剖去内脏的干燥体，首载于《本草逢原》，性辛、凉，微毒，具有清热解毒、利水消肿等多种功效。药用蟾皮多来源于动物中华大蟾蜍。蟾素片(口服液、注射液)、鹤蟾片、大败毒胶囊、季德胜蛇药片等临床应用较广泛的中成药中均含有该药材。近年来随着研究的不断深入，蟾皮中重要活性成分——蟾蜍甾烯内酯出色的抗休克、抗病毒、抗肿瘤活性受到了国内外学者的广泛关注，成为该类中药二次开发利用的研究热点之一。
蟾皮至今未收载于历版《中国药典》，只在《江苏省中药材标准(1989年版)》《河南省中药材标准(1993)》、《江西省中药材标准(1996年版)》等地方标准中收载，而且仅对其性状、水分进行了规定。然而目前市场上流通的蟾皮类药材的质量参差不齐，采收、加工方式的差异导致药材中所含成分的差异较大。而研究表明蟾蜍甾烯内酯成分治疗量和致死量相近，中毒症状出现时间短，安全系数低，因此亟需针对蟾皮类药材中所含成分建立灵敏度高、专属性强、快速高效的分析方法，为蟾皮类药材的质量控制和评价提供依据，为蟾蜍甾烯内酯药物活性研究提供技术支持。
目前，有专利报道蟾皮药材或饮片的质量控制方法，都是利用HPLC建立特征峰的指纹图谱，针对某一类化合物进行指征，并没有具体到某几种成分，方法有待优化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法，该检测方法操作简单、分离度高、特异性好、分析速度快。
本发明的技术方案如下：
含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法，采用高效液相色谱串联质谱检测,包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备
取标准品脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于50±5％乙腈水溶液中，制得标准品溶液，将六种标准品溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)标准曲线溶液的制备
用50±5％乙腈水溶液分别稀释步骤(1)的混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线溶液；
(3)待测样品溶液的制备
取药材制剂，制成粉末状固体，加入50±5％乙腈水溶液，超声提取，之后用微孔滤膜过滤，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释，制得待测样品溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行高效液相色谱分离，分离后的样品再进行质谱分析。
上述的检测方法，其优选方案如下：
步骤(1)中，取标准品脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于50±5％乙腈水溶液中，制得浓度为1.00mg/ml的六种标准品溶液，将六种标准品溶液混合，用50±5％乙腈水溶液稀释，得到六种标准品的浓度均为0.100mg/ml的混合标准品储备溶液。
步骤(2)中，分别取步骤(1)的混合标准品储备溶液，用50±5％乙腈水溶液稀释，制得浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、50ng/mL和62.5ng/mL的混合标准曲线溶液。
步骤(3)中，取蟾皮类药材，制成粉末状固体，加入50±5％乙腈水溶液，超声提取30min，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释到0.25～62.5ng/ml，制得待测样品溶液。
步骤(4)中所述高效液相色谱分离采用梯度洗脱：以0.1±0.02％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。
进一步的，上述梯度洗脱的过程为：
0～0.3分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
0.3～0.5分钟，流动相B：40±5％→95±5％；
0.5～2.0分钟，流动相B：95±5％→95±5％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95±5％→40±5％；
2.2～3分钟，流动相B：40±5％→40±5％。
前述高效液相色谱串联质谱的检测方法，所述高效液相色谱优选采用如下的色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流速：0.3±0.05mL/min；
进样体积：3.00±0.5μL；
柱温：40±5℃；
自动进样器温度：4±4℃；
洗针液：50±5％乙腈水溶液；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
进一步的，前述的检测方法，其质谱分析优选采用如下的条件：
离子化模式：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi；
离子源喷雾电压：5500±10V；
离子源温度：500±10℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20±1msec；
质谱采集时间为3.00±0.2min。
质谱分析中，各成分的四级杆质谱优选条件为：
脂蟾毒配基：离子对：385.2→253.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
蟾毒灵：离子对：387.1→255.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：30.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾酥毒基：离子对：443.2→365.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾毒他灵：离子对：459.3→363.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
远华蟾蜍精：离子对：403.1→349.1；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：200.0msec；
沙蟾毒精：离子对：417.1→335.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：47.00eV；停留时间：200.0msec。
在前述的检测方法中，含蟾皮类药材制剂是指含有蟾皮的中药、中药制剂或由蟾皮制得的提取物、注射液。
与现有技术相比，本发明采用超高效液相色谱-质谱联用技术，由于仪器的灵敏度较高，只需要少量样本和极少的进样量进行分析就可以满足定量要求，本方法采用了柱效更高的色谱柱，同时使用梯度洗脱方法，因而色谱峰形极佳，同时由于系统压力更高，采用的色谱柱为短柱，每一个样本的进样时间为3分钟，分析快速；在空白溶剂中未发现待检测的化合物峰，特异性高；采用的是LC-MS/MS-MRM方法，每个化合物通道相互独立，都只有唯一的目标峰，避免了溶剂等其它效应的干扰，分离度高。本发明检测方法与其它检测方法相比，具有操作简单、分析快速、特异性高、分离度好、灵敏度高等优势。
附图说明
图1为脂蟾毒配基在样品溶液中的液质图(保留时间1.30min)；
图2为蟾毒灵在样品溶液中的液质图(保留时间1.32min)；
图3为华蟾酥毒基在样品溶液中的液质图(保留时间1.29min)；
图4为华蟾毒他灵在样品溶液中的液质图(保留时间1.18min)；
图5为远华蟾蜍精在样品溶液中的液质图(保留时间1.09min)；
图6为沙蟾毒精在样品溶液中的液质图(保留时间0.81min)。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本实施方式提供一种含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法，采用高效液相色谱串联质谱检测，包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备：
取标准品脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于(50±5)％乙腈水溶液中，制得标准品溶液；将六种标准品溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)标准曲线溶液的制备：
分别用(50±5)％乙腈水溶液稀释混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线溶液；
(3)待测样品溶液的制备：
待测样品溶液的制备：取蟾皮类药材，制成粉末状固体，加入适量的50±5％乙腈水溶液，超声提取30min，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释到浓度定量范围0.25～62.5ng/mL，制得待测样品溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行液相色谱分离；将液相色谱分离后的样品进行质谱分析。
其中，各成分的性质如下：
脂蟾毒配基游离态分子式与分子量为C18H12O/276.29，具体结构式如表1式(I)所示。
蟾毒灵游离态分子式与分子量为C19H18O3/294.34，具体结构式如表1式(II)所示。
华蟾酥毒基游离态分子式与分子量为C36H30O16/718.62，具体结构如表1式(III)所示。
华蟾毒他灵游离态分子式与分子量为C26H34O7/458.54，具体结构式如表1式(IV)所示。
远华蟾蜍精游离态分子式与分子量为C24H34O5/402.52，具体结构式如表1式(V)所示。
沙蟾毒精游离态分子式与分子量为C24H32O6/416.50，具体结构式如表1式(VI)所示。
表1
在其中一些实施例中，所述液相色谱分离所采用的洗脱方式为：以(0.1±0.02)％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的过程为：
0～0.3分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
0.3～0.5分钟，流动相B：40±5％→95±5％；
0.5～2.0分钟，流动相B：95±5％→95±5％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95±5％→40±5％；
2.2～3分钟，流动相B：40±5％→40±5％。
优选地，所述梯度洗脱的过程为：
0～0.3分钟，流动相B：40％→40％；
0.3～0.5分钟，流动相B：40％→95％；
0.5～2.0分钟，流动相B：95％→95％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95％→40％；
2.2～3分钟，流动相B：40％→40％。
在其中一些实施例中，所述液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流速为0.3±0.05mL/min；
进样体积为3.00±0.5μL；
柱温设置为40±5℃；
自动进样器温度为4±4℃；
洗针液：(50±5)％乙腈；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
在其中一些实施例中，所述质谱分析的条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi；离子源喷雾电压：5500±10V；离子源温度：550±10℃；分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；碰撞气：Medium；暂停时间：20±1msec；质谱采集时间为3.00±0.2min。
在其中一些实施例中，所述质谱分析中，各成分的四级杆质谱条件为：
脂蟾毒配基：离子对：385.2→253.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
蟾毒灵：离子对：387.1→255.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：30.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾酥毒基：离子对：443.2→365.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾毒他灵：离子对：459.3→363.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
远华蟾蜍精：离子对：403.1→349.1；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：200.0msec；
沙蟾毒精：离子对：417.1→335.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：47.00eV；停留时间：200.0msec。
在其中一些实施例中，所采用的液相色谱质谱联用仪的型号为ShimadzuLC30AD液相色谱仪联合SciexQtrap5500质谱仪，所采用的操作系统为Analyst1.6.3；所采用的液相色谱柱为：ACQUITY
BEHC18,Waters。其规格为1.7μm，2.1x50mm；本发明使用的SciexQtrap5500型质谱仪，其灵敏度较以前的仪器有了数量级的提升。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述混合标准曲线溶液中，脂蟾毒配基，蟾毒灵和华蟾酥毒基的浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、50ng/mL和62.5ng/mL。
在其中一些实施例中，所述蟾皮类药材是由蟾蜍科动物中华大蟾蜍制得的干燥皮，或含有蟾皮的中药成方，或由蟾皮制得的提取物或注射液等。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)溶液的配制
储备溶液的制备：
称取适量蟾皮类药材各主要成分脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精和沙蟾毒精的标准品，分别溶解于适量50％乙腈水溶液中，制得浓度分别为1.00mg/mL的标准品溶液。将三份浓度皆为1.00mg/mL的标准品溶液等体积混合，加入适量50％乙腈水溶液，制得六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分浓度皆为0.100mg/mL的混合标准品储备溶液。
标准曲线溶液的制备：
用50％乙腈水溶液稀释六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分浓度皆为0.100mg/mL混合标准品储备溶液，得到浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、50ng/mL和62.5ng/mL的混合标准曲线溶液；
(2)待测样品溶液的制备
取蟾皮类药材，制成粉末状固体，加入适量的50±5％乙腈水溶液，超声提取30min，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释到浓度定量范围为0.25～62.5ng/mL的进样溶液。
(3)液相色谱条件
仪器设备：ShimadzuLC-30AD液相色谱系统。
色谱柱：ACQUITY
BEHC18(2.1×50mm,1.7μm),Waters；柱温设置为40℃，自动进样器温度设置为4℃。
流动相A为0.1％甲酸水溶液；流动相B为100％乙腈。总流速为0.40mL/min。
流动相洗脱程序为：0～0.3分钟，流动相B：40％→40％；0.3～0.5分钟，流动相B：40％→95％；0.5～2.0分钟，流动相B：95％→95％；2.0～2.2分钟，流动相B：95％→40％；2.2～3分钟，流动相B：40％→40％。
洗针液：50％乙腈。洗针模式为外部冲洗；冲洗速度：35μL/sec；冲洗端口液体：R1；冲洗液体积：500μL；冲洗模式：进针前后冲洗；冲洗浸润时间：0秒；冲洗方法：仅端口冲洗；冲洗时间：2秒；
进样体积为3.00μL，脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精的保留时间分别为1.30、1.32、1.29、1.18、1.09、0.81min。
(4)质谱条件
仪器设备：SciexQtrap5500质谱系统。
离子化模式：电喷雾离子源(ESI)；正离子模式(Positive)；多反应监测(MRM)。
离子源参数：气帘气(CUR)：20psi；离子源气体1(Gas1)：30psi；离子源气体2(Gas2)：30psi；离子源喷雾电压(IS)：5500V；离子源温度(TEM)：500℃；分辨率Q1/Q3(ResolutionQ1/Q3)：Unit/Unit；碰撞气(CAD)：Medium；暂停时间(MRPause)：20msec；质谱采集时间为3.00min。
监测离子对四极杆参数：
脂蟾毒配基：离子对：385.2→253.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
蟾毒灵：离子对：387.1→255.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：30.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾酥毒基：离子对：443.2→365.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾毒他灵：离子对：459.3→363.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
远华蟾蜍精：离子对：403.1→349.1；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：200.0msec；
沙蟾毒精：离子对：417.1→335.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：47.00eV；停留时间：200.0msec。
(5)结果
1.方法学验证
①专属性
结果显示本方法专属性良好，空白溶剂在脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精处无色谱峰。
②最低定量限和线性范围
蟾皮类药材所含六种化合物的最低定量限为0.25ng/mL，线性范围为0.25-62.5ng/mL，六种化合物均表现出良好的线性关系，具体如表2所示。
表2六种化合物的线性
| 化合物名称 | 线性回归方程 | 相关系数 |
| 脂蟾毒配基 | y＝12200x+9467.2 | 0.9934 |
| 蟾毒灵 | y＝6034.8x+1209.1 | 0.9946 |
| 华蟾酥毒基 | y＝26711x+25202 | 0.9956 |
| 华蟾毒他灵 | y＝12311x+4222 | 0.9943 |
| 远华蟾毒灵 | y＝26854x+35419 | 0.9963 |
| 沙蟾毒精 | y＝26873x+17985 | 0.9921 |
③精密度
选取6种成分浓度均10.0ng/mL对照样本作为精密度实验样本，进行6次重复实验，脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精的精密度RSD分别为3.2％、2.0％、0.5％、4.5％、3.2％、1.8％，符合检测要求。
④加样回收率
选取三个浓度进行加样回收率实验，加样浓度分别为：0.625ng/mL、4.5ng/mL、10.0ng/mL。脂蟾毒配基加样回收率为93.5～112.8％，蟾毒灵为103.3～117.5％，华蟾酥毒基为90.5～111.7％，华蟾毒他灵加样回收率为94.8～114.5％、远华蟾蜍精加样回收率为91.8～102.4％、沙蟾毒精回收率加样回收率为95.1～116.3％，稳定且满足检测要求。
2.样品检测结果
采用上述方法，对2批蟾皮药材提取物(蟾皮乙醇提取物1、蟾皮乙醇提取物2)进行检测，测得样本中脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精的含量见表3。六种化合物标准品的液质图如图1-6所示。
表3两批蟾皮药材提取物中六种化合物的检测结果
| 样品1(ug/g) | 样品2(ug/g) | |
| 脂蟾毒配基 | 3.0 | 7.2 |
| 蟾毒灵 | 20.7 | 112.0 |
| 华蟾酥毒基 | 44.9 | 259.0 |
| 华蟾毒他灵 | 25.4 | NA |
| 远华蟾毒灵 | 0.021 | 0.031 |
| 沙蟾毒精 | 4.3 | NA |
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.含蟾皮类药材制剂中六种复杂蟾蜍甾烯内酯成分的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联质谱检测,包括以下步骤：
(1)储备溶液的制备
取标准品脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于50±5％乙腈水溶液中，制得标准品溶液，将六种标准品溶液混合，得到混合标准品储备溶液；
(2)标准曲线溶液的制备
用50±5％乙腈水溶液分别稀释步骤(1)的混合标准品储备溶液，制得混合标准曲线溶液；
(3)待测样品溶液的制备
取含蟾皮类药材制剂，制成粉末状固体，加入50±5％乙腈水溶液，超声提取，之后用微孔滤膜过滤，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释，制得待测样品溶液；
(4)将步骤(3)所得待测样品溶液进行高效液相色谱分离，分离后的样品再进行质谱分析。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，取标准品脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾酥毒基、华蟾毒他灵、远华蟾蜍精、沙蟾毒精，分别溶解于50±5％乙腈水溶液中，制得浓度为1.00mg/ml的六种标准品溶液，将六种标准品溶液混合，用50±5％乙腈水溶液稀释，得到六种标准品的浓度均为0.100mg/ml的混合标准品储备溶液。
3.如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，分别取步骤(1)的混合标准品储备溶液，用50±5％乙腈水溶液稀释，制得浓度分别为0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、6.25ng/mL、12.5ng/mL、50ng/mL和62.5ng/mL的混合标准曲线溶液。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)中，取蟾皮类药材，制成粉末状固体，加入50±5％乙腈水溶液，超声提取30min，之后过0.22μm的微孔滤膜，滤液用50±5％乙腈水溶液稀释到0.25～62.5ng/ml，制得待测样品溶液。
5.如权利要求1至4任一项所述的检测方法，其特征在于：步骤(4)中所述高效液相色谱分离采用梯度洗脱：以0.1±0.02％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的过程为：
0～0.3分钟，流动相B：40±5％→40±5％；
0.3～0.5分钟，流动相B：40±5％→95±5％；
0.5～2.0分钟，流动相B：95±5％→95±5％；
2.0～2.2分钟，流动相B：95±5％→40±5％；
2.2～3分钟，流动相B：40±5％→40±5％。
7.如权利要求1、5或6所述的检测方法，其特征在于：
所述高效液相色谱的色谱条件为：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
流速：0.3±0.05mL/min；
进样体积：3.00±0.5μL；
柱温：40±5℃；
自动进样器温度：4±4℃；
洗针液：50±5％乙腈水溶液；
洗冲速度：30-40μL/sec；
洗针液体积：400-600μL。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述质谱分析的条件包括：
离子化模式：电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测；
离子源参数：气帘气：20psi；离子源气体1：30psi；离子源气体2：30psi；
离子源喷雾电压：5500±10V；
离子源温度：500±10℃；
分辨率Q1/Q3：Unit/Unit；
碰撞气：Medium；
暂停时间：20±1msec；
质谱采集时间为3.00±0.2min。
9.如权利要求1或8所述的检测方法，其特征在于：所述质谱分析中，各成分的四级杆质谱条件为：
脂蟾毒配基：离子对：385.2→253.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
蟾毒灵：离子对：387.1→255.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：30.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾酥毒基：离子对：443.2→365.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：25.00eV；停留时间：200.0msec；
华蟾毒他灵：离子对：459.3→363.2；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：27.00eV；停留时间：200.0msec；
远华蟾蜍精：离子对：403.1→349.1；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：28.00eV；停留时间：200.0msec；
沙蟾毒精：离子对：417.1→335.3；去簇电压：50.0V；入口电压：10.00V；出口电压：25.00V；碰撞能量：47.00eV；停留时间：200.0msec。
10.如权利要求1-9任一项所述的检测方法，其特征在于：含蟾皮类药材制剂是指含有蟾皮的中药、中药制剂或由蟾皮制得的提取物、注射液。
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|---|---|---|---|---|
| JPS62187249A (ja) * | 1986-02-13 | 1987-08-15 | Koukandou:Kk | センソ又はセンソ含有物中のブフアジエノリドの迅速定量法 |
| CN104055797A (zh) * | 2014-06-17 | 2014-09-24 | 安徽华润金蟾药业股份有限公司 | 蟾皮提取物中两类组合物成分的检测及鉴定 |
| CN108982719A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-12-11 | 山东宏济堂制药集团股份有限公司 | 一种蟾酥中化合物的检测方法 |
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2020
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Patent Citations (3)
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