CN104997811A - 一种蟾皮中抗肿瘤活性组合物、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蟾皮具有抗肿瘤作用的组合物、其制备方法及用途。特别是该蟾皮提取物是由蟾皮提取，并利用葡聚糖凝胶、烷基键和硅胶等高分子填料进行分离纯化得到的。经过液相-质谱联用分析，鉴定出其中33个化合物，确定为水溶性蟾毒配基类成分部位。利用本方法制备的蟾毒配基类成分，经过药理学实验结果表明，本组合物具有很好的抗肿瘤作用，可用于抗癌治疗、辅助医药产品的开发。

Description

一种蟾皮中抗肿瘤活性组合物、其制备方法及用途

技术领域

本发明属中药技术领域，具体涉及一种蟾皮组合物、其制备方法及用途。其中特别涉及一种水溶性蟾毒配基类成分的蟾皮提取物，该类成分抗癌效果显著。

背景技术

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮,具有清热解毒、利水消胀之功效,临床用于治疗痈疽、肿毒、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等病症。蟾皮水溶性部位开发的药品已有多个上市,尤其华蟾素注射液，是从中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制剂，治疗原发性肝癌和中晚期肺癌分别获得44％和56％的综合有效率，瘤体缩小率分别为10％和16％,且对化疗和放疗具有协同作用。临床应用表明，华蟾素注射液具有解毒、消肿、止痛之功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，文献报道其生理活性物质主要是蟾蜍毒素类(bufotoxins)及其水解产物蟾毒配基类(bufageins)等。

从蟾蜍(主要是蟾皮)中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为：蟾毒配基类、蟾蜍毒素类、蟾毒色胺类三大类以及胆甾醇、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性。然而，众所周知华蟾素为水溶性制剂，基本不含有或极少量含有华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等脂溶性蟾毒配基类成分。因此该产品在肿瘤治疗方面的良好表现，根据我们的研究结果，主要来源于水溶性蟾毒配基类成分。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蟾皮提取物。

本发明的另一个目的是提供一种主要为蟾毒配基类成分的蟾皮提取物，其具有较好的水溶性，同时指认了其中多种成分。

本发明的另一个目的是提供所述蟾皮提取物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述蟾皮提取物的应用。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

本发明的目的是通过如下技术方案实现：

A一种蟾皮提取物

一种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成的。

B一种蟾皮组合物

一种蟾皮中的组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提取物后，以层析色谱的方法得到的一种或N种蟾毒配基类成分组合而成的组合物。照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，联用质谱(HPLC-MS)，通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品比对，指认出蟾皮脂溶性组合物中33个色谱峰代表的化合物。日蟾毒他灵、沙蟾毒精、嚏根草苷元等。其具有较好的水溶性。

C本发明所得到的组合物具有较好的抗肿瘤活性：

1.对肝癌：

(1)体外抗癌试验结果显示，本发明组合物的体外抗肝癌肿瘤细胞的效果好，毒性低；

(2)动物体内实验，本发明组合物对鼠源性肝癌有较好的治疗作用，效果优于华蟾素注射液；对人源肝癌荷瘤裸鼠也具有抗肿瘤作用，且抗肿瘤效果优于华蟾素注射液。

2.对胃癌：

(1)体外抗癌试验结果显示，本发明组合物的体外抗胃癌肿瘤细胞的效果好，毒性低；

(2)动物体内实验，本发明组合物对鼠源性胃癌有较好的治疗作用，效果优于华蟾素注射液；对人源胃癌荷瘤裸鼠也具有抗肿瘤作用，且抗肿瘤效果优于华蟾素注射液。

本发明的意义在于：本发明对蟾皮进行提取后制备得到水溶性较好的一类蟾毒配基类成分，该组合物在体内外实验中显示，具有比较显著的抗癌活性，同时与其他抗肿瘤药物相比毒副作用小，具有抗肿瘤类药物开发的良好前景。

附图说明

图1 HPLC(296nm)色谱图

图2 LC-MS离子流图

图3药物对HepG2肿瘤体积的影响

图4药物对荷HepG2肿瘤裸鼠体重的影响

图5药物对HepG2相对肿瘤体积的影响

图6药物对HepG2相对肿瘤增值率的影响

图7药物对MKN45肿瘤体积的影响

图8药物对荷MKN45肿瘤裸鼠体重的影响

图9药物对MKN45相对肿瘤体积的影响

图10药物对MKN45相对肿瘤增值率的影响

具体实施方式

下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：本发明蟾皮提取物的制备

干蟾皮洗净，用5～15倍的水提取2次，浓缩至小体积后分别用50～70％、75～90％的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到蟾皮提取物；或者，干蟾皮洗净，用5～15倍的水提取2次，浓缩至相对密度为1.01～1.35(80℃)后，分别用40～70％、75～90％的乙醇沉淀，滤过，将滤液回收乙醇得到蟾皮提取物。具体操作方法为：取干蟾皮进行修治后，加入8倍水(V/m)，煎煮2次，每次30min，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积(相对密度在1.01～1.35，80℃)，冷却至40℃，加入95％乙醇调节醇浓度为40～60％进行一次醇沉，后倾出上清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95％乙醇调节醇浓度为75～90％进行二次醇沉，静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24h，离心，即得蟾皮提取物。

实验例2：本发明蟾皮组合物的制备

使用葡聚糖凝胶Sephadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20对实施例1中所述蟾皮提取物进行分离纯化，装柱径高比1:15，上样体积比1:40，恒流速3ml/min去离子水洗脱，或者，使用聚甲基丙烯酸酯凝胶HW40、HW50或HW65对蟾皮提取物行分离纯化，装柱径高比1:15～20，上样体积比1:10～40，恒流速3～10ml/min去离子水洗脱，按照柱体积1/5进行收集，以假蟾毒精、日蟾毒它灵、沙蟾毒精为标志物，采用HPLC分析进行跟踪，收集反应阳性馏分合并。合并液用十八烷基键和硅胶进行纯化后，冷冻干燥，得到组合物。

实验例3：本发明组合物的定性鉴别

3.1仪器与分析条件：

分析仪器：Solarix FT-ICR-MS 9.4T(德国Bruker公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪；

色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱程序：0-5min，5-20％A；5-45min，20-42％A；45-70min，42％-100％A；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：296nm。

质谱条件：电喷雾离子源喷雾电压：+4000V，干燥气温度：180℃，干燥气流速：4.0L/min，喷雾气压力：0.5bar；正离子扫描模式采集，质谱扫描范围m/z：70～1500。

3.2对照品制备 

分别精确称量酯蟾毒配基，华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒他灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵对照品，加甲醇溶解，配置成以上给对照品0.2mg/ml的混合标准溶液，0.22μm滤膜过滤，即得对照品溶液。

3.3供试品的制备 

取本发明实施例1制备得到的蟾皮提取物，按照1:1的比例与硅胶拌匀，分散，加热混合物至完全干燥。用二氯甲烷进行索氏回流提取，滤过得到提取液，减压干燥，得到脂溶性组合物部分。取该组合物8mg加2ml甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜滤过，即得供试品。

3.4结果与讨论 

通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，从组合物供试品色谱峰中推断出33个化合物。分别为日蟾毒他灵，沙蟾毒精，远华蟾毒精，蟾毒他灵，华蟾毒他灵，蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基等。结果见表1、图1、2。

表1 HPLC-MS解析数据

实验例4：本发明组合物的体内外抗肝癌的药效研究

4.1实验材料

4.1.1实验药物及阳性药物

华蟾素注射液(批号131101-1，安徽华润金蟾药业股份有限公司)；华蟾素中间体、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、环磷酰胺；本发明组合物(蟾毒配基类，以下简称样品A)。

4.1.2细胞及动物 

4.1.2.1细胞：BEL7402(人肝癌细胞)，H22(小鼠肝癌细胞)，HepG2(人肝癌细胞)

4.1.2.2动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，20±2g；SPF级ICR小鼠，雌雄各半，20±2g；SPF级BALB/c-nu裸鼠，5周龄，雌雄各半(供应单位：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001)。

4.1.3试剂

二氯甲烷、甲醇(分析纯，北京化工公司)；乙腈(HPLC级，Fisher Scientific)，HW-40C凝胶(日本tosoh公司)；PRIM-1640培养基，DMEM/F12高糖培养基，胎牛血清，双抗(Gibco公司产品)；噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)；生理盐水。

4.1.4耗材及仪器 

戴安-Ultimate 3000，四元高压泵，DAD检测器，Thermo-Velos Pro双压线性离子阱串联静电场轨道阱质谱；96孔细胞培养板(Costar,3596)，水套式CO2细胞培养箱(Sanyo，日本)，Safire2高速多通道连续波长酶标仪(TECAN，奥地利)，电子天平(型号ML104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，游标卡尺(0.02mm精度，上海申量)；C₁₈色谱柱(Thermo公司)。

4.2实验方法

4.2.1体外抗肝癌细胞的活性筛选

4.2.1.1样品的配置 

将样品A配置成50、10、2、8、0.4、0.08、0.016μg/ml用于抗肿瘤评价(以上皆指样品加入筛选体系前浓度)。

4.2.1.2细胞培养

将BEL7402人肝癌细胞用含10％胎牛血清、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。

4.2.1.3药物体外抗肝癌细胞活性筛选

取对数生长期的BEL7402细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，计数调整细胞浓度至1×104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μL，待细胞贴壁生长18～24h后弃培养基，加入不同浓度的本发明组合物样品和阳性药5-Fu 50μL，另设细胞对照组(只加细胞不加药)和空白对照组(只加培养基)。每组设3个平行孔，每孔总体积为200μL。置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。孵育结束后，小心吸弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h后吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪(570nm)测定吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)值。实验重复3次。细胞生长抑制率＝[1-A_样品组/A_对照组]×100％

4.2.2体内抗肝癌细胞研究

4.2.2.1检测样品

将样品A用生理盐水稀释为1mg/ml的浓度作为初始浓度用于体内抗肝癌细胞的研究；

4.2.2.2药物的急性毒性试验

(1)预实验

将药物的初始浓度按组间剂量比0.5进行稀释，即1、0.5、0.025和0.00625mg/ml四个浓度组，按0.1-0.2ml/10g的剂量范围每组对K.M小鼠进行腹腔注射，于2h、4h、24h、48h和72h连续观察并记录小鼠死亡情况，找出引起0～100％的药物估计致死浓度。

(2)正式试验

取K.M小鼠60只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为6组，10只/组。根据预实验获得的药物剂量范围，按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6～0.9，设5个剂量组和一个空白对照组，腹腔注射药物，空白组给以生理盐水。给药后连续观察7d，记录不同剂量组小鼠死亡情况，通过改良寇氏法公式计算获得药物的LD50。

LD50＝lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]

Xm：最大剂量组剂量对数值

i：相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值)

P：各组动物死亡率，用小数表示(如果死亡率为80％应写成0.80)

∑P：各组动物死亡率之总和

n：每组动物数 

4.2.3药物对小鼠H22肝癌肿瘤生长的抑制作用研究

将H22肝癌细胞(腹水/肿瘤悬浮液)于37℃复苏后以生理盐水1:3稀释，腹腔注射于ICR小鼠，每只小鼠注射0.2ml。取接种肿瘤7～10天状态良好的荷瘤(腹水型)动物脱颈处死，于无菌环境下常规消毒后抽取少量腹水，推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤细胞数不少于75％后，相同条件下将腹水抽出，腹水与预冷生理盐水按1：4比例稀释，制备成肿瘤细胞混悬液。尽快吸取该混悬液0.2ml接种于同种异体小鼠右侧腋窝皮下，从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。24h后将小鼠随机分组给药，每组10只，雌雄各半，阳性药物环磷酰胺(CTX)腹腔注射给药1次，药物组每天腹腔注射给药1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水。末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。试验进行3次。

4.2.4对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植模型的治疗作用

HepG2肝癌细胞体外常规培养，待细胞生长至对数生长期后，稳定传代2-3次，收集细胞，台盼蓝染色计数细胞成活率大于95％时，调整细胞密度至5×106个/ml，皮下接种于裸鼠右侧腋下，接种体积为0.2ml/只。连续观察肿瘤生长情况，待体内成瘤后进行体内瘤块传代2-3次后取肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠，常规消毒后，处死剥离肿瘤，选取透亮肉色部分切成约2mm×2mm×2mm小块，接种于裸鼠右侧腋皮下，待肿瘤长至100mm3以上时，淘汰肿瘤体积过大或过小的裸鼠，按随机区组法将动物分为对照组、阳性药(华蟾素注射液)组，药物低剂量组、高剂量组，每组6只。随后腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药4周。给药期间用0.02mm精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周，按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积(V，mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm)×0.5；相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V0(V0为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积)。

于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率(T/C％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV，CRTV：对照组RTV)，肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％(式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。

4.2.5统计方法

计量数据以均值±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行检验分析。采用One-Way ANOVA(One-Way Analysis of Variance，单因素方差分析)评价整体性差异，方差齐性用LSD t-test分析方法进行组间比较，方差不齐用Dunnett’s T3分析方法进行组间比较，P<0.05为有显著性差异。

4.3实验结果

4.3.1体外抗肝癌细胞的活性筛选：结果见表2。

表2药物体外抗BEL7402肝癌细胞的抑制率

4.3.2本发明组合物的急性毒性试验

按表3的分组和给药后，连续7天观察小鼠的状况,给药后短时间内小鼠呼吸加快，呼吸幅度加大，后肢僵直，角弓反张，浑身抖动，剧烈挣扎，身体反应消失，10-15min后死亡，并且雌鼠对药物的耐受性略强于雄鼠，当给药量在10mg/g以下时，小鼠才无任何明显的不适反应。具体实验结果如表4所示。

表3样品A对KM小鼠的急性毒性实验结果(n＝10)

4.3.3药物对小鼠H22肝癌肿瘤生长的抑制作用研究

按表4所示，动物接种24小时后随机分组给药，每组10只，环磷酰胺(CTX)腹腔注射给药1次，华蟾素注射液腹腔注射给药1次，静脉滴注日用量为10-20ml，取最大值20ml，人体重以70kg，小鼠体重20g计算，小鼠等效剂量为3.4ml/kg，其余各组每天腹腔注射给药1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水，试验全部受试物均现用现配，末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率＝(1-T/C)×100％，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。

结果由表4可见，3次抑瘤试验显示，样品A在3mg/kg、1.5剂量下对H22肿瘤生长均有显著的抑制作用，抑瘤率近30％及以上。

表4药物对小鼠H22肿瘤生长的抑制作用

与对照组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

4.3.4药物对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植模型的治疗作用

试验时，待肿瘤长至100mm³左右，依肿瘤体积大小按随机区组法将动物分为对照组、阳性药(华蟾素)组，A低剂量(0.5mg/kg)组、高剂量(2mg/kg)组每组6只。现用现配，腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药6周；于给药期间用0.02mm精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周。按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积(V，mm³)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径²(mm)×0.5；相对肿瘤体积(RTV)＝V_t/V₀(V₀为给药前肿瘤体积，V_t为每次测量时的肿瘤体积)。于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率(T/C％)＝T_RTV/C_RTV×100％(T_RTV：治疗组RTV，C_RTV：对照组RTV)，肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％(式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。

从图3可知，华蟾素注射液和样品A对HepG2肿瘤体积有明显抑制作用(**P<0.01，*P<0.05)，给药2周后已显示对肿瘤生长速度体验延缓作用，样品A2mg/kg剂量组的抑制效果比华蟾素注射液明显(***P<0.001)；从图4药物对荷瘤裸鼠体重的影响可知，华蟾素注射液和样品A2mg/kg剂量组对裸鼠体重有一定影响，但没有统计学意义，0.5mg/kg剂量几乎无影响；药物对HepG相对肿瘤体积和增殖率计算的结果显示(图5，图6)，华蟾素注射液和样品A可抑制HepG2肿瘤的增殖，其中样品A2mg/kg给药6周后对肿瘤增值率的影响达44％。表5对肿瘤和脾脏的结果可知，给药6周后，给药组肿瘤的重量低于对照组，其中样品A2mg/kg剂量组的瘤重显著低于对照组和华蟾素注射液组，对肿瘤生长抑制率高达57.6％，脾重则低于对照组，而华蟾素注射液和样品A 0.5mg/kg剂量组的脾重高于对照组，尤其样品A 0.5mg/kg剂量组(**P<0.01)。

表5药物对HepG2肿瘤和脾脏的影响

与对照组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05

实验例5：本发明组合物的体内外抗胃癌的药效研究

5.1实验材料

5.1.1实验药物及阳性药物

华蟾素注射液(批号131101-1，安徽华润金蟾药业股份有限公司)；华蟾素中间体、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、环磷酰胺，本发明组合物(蟾毒配基类，以下简称样品A)。

5.1.2细胞及动物 

5.1.2.1细胞：BGC823(人胃癌细胞)，MFC(小鼠胃癌细胞)，MKN45(人胃癌细胞)

5.1.2.2动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，20±2g；SPF级ICR小鼠，雌雄各半，20±2g；SPF级BALB/c-nu裸鼠，5周龄，雌雄各半(供应单位：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001)

5.1.3试剂

二氯甲烷、甲醇(分析纯，北京化工公司)；乙腈(HPLC级，Fisher Scientific)，HW-40C凝胶(日本tosoh公司)；

PRIM-1640培养基，DMEM/F12高糖培养基，胎牛血清，双抗(Gibco公司产品)；噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司产品)；生理盐水； 

5.1.4耗材及仪器 

戴安-Ultimate 3000，四元高压泵，DAD检测器，Thermo-Velos Pro双压线性离子阱串联静电场轨道阱质谱；C₁₈色谱柱(Thermo公司)；

96孔细胞培养板(Costar,3596)，水套式CO₂细胞培养箱(Sanyo，日本)，Safire2高速多通道连续波长酶标仪(TECAN，奥地利)，电子天平(型号ML104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，游标卡尺(0.02mm精度，上海申量)。

5.2实验方法

5.2.1有效组分体外抗胃癌细胞的活性筛选

5.2.1.1检测样品

将样品A配置成50、10、2、8、0.4、0.08、0.016μg/ml用于抗肿瘤评价；以上皆指样品加入筛选体系前浓度。

5.2.1.2细胞培养

将人胃癌细胞BGC823用含10％胎牛血清、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

5.2.1.3药物体外抗胃癌细胞活性筛选

取对数生长期的BGC823细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，计数调整细胞浓度至1×10⁴个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μL，待细胞贴壁生长18～24h后弃培养基，加入不同浓度的样品和阳性药5-Fu50μL，另设细胞对照组(只加细胞不加药)和空白对照组(只加培养基)。每组设3个平行孔，每孔总体积为200μL。置于37℃、5％CO₂培养箱中培养48h。孵育结束后，小心吸弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h后吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪(570nm)测定吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率，Bliss法计算半数抑制浓度(IC50)值。实验重复3次。

细胞生长抑制率＝[1-A_样品组/A_对照组]×100％

5.2.2样品A抗胃癌细胞研究

5.2.2.1检测样品

将样品A用生理盐水稀释为1mg/ml的浓度作为初始浓度用于体内抗胃癌细胞的研究。

5.2.2.2药物的急性毒性试验

(1)预实验

.将药物的初始浓度按组间剂量比0.5进行稀释，即1、0.5、0.025和0.00625mg/ml四个浓度组，按0.1-0.2ml/10g的剂量范围每组对K.M小鼠进行腹腔注射，于2h、4h、24h、48h和72h连续观察并记录小鼠死亡情况，找出引起0～100％的药物估计致死浓度。

(2)正式试验

取K.M小鼠60只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为6组，10只/组。根据预实验获得的药物剂量范围，按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6～0.9，设5个剂量组和一个空白对照组，腹腔注射药物，空白组给以生理盐水。给药后连续观察7d，记录不同剂量组小鼠死亡情况，通过改良寇氏法公式计算获得药物的LD50。LD50＝lg-1[Xm-i(∑P-0.5)]

Xm：最大剂量组剂量对数值

i：相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数(相邻两组对数剂量的差值)

P：各组动物死亡率，用小数表示(如果死亡率为80％应写成0.80)

∑P：各组动物死亡率之总和

n：每组动物数 

5.2.3药物对小鼠MFC胃癌肿瘤生长的抑制作用研究

将MFC胃癌细胞(腹水/肿瘤悬浮液)于37℃复苏后以生理盐水1:3稀释，腹腔注射于ICR小鼠，每只小鼠注射0.2ml。取接种肿瘤7～10天状态良好的荷瘤(腹水型)动物脱颈处死，于无菌环境下常规消毒后抽取少量腹水，推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤细胞数不少于75％后，相同条件下将腹水抽出，腹水与预冷生理盐水按1：4比例稀释，制备成肿瘤细胞混悬液。尽快吸取该混悬液0.2ml接种于同种异体小鼠右侧腋窝皮下，从取出肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。24h后将小鼠随机分组给药，每组10只，雌雄各半，阳性药物环磷酰胺(CTX)腹腔注射给药1次，药物组每天腹腔注射给药1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水。末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。试验进行3次。

5.2.4对人胃癌细胞MKN45裸鼠移植模型的治疗作用

MKN45胃癌细胞体外常规培养，待细胞生长至对数生长期后，稳定传代2-3次，收集细胞，台盼蓝染色计数细胞成活率大于95％时，调整细胞密度至5×106个/ml，皮下接种于裸鼠右侧腋下，接种体积为0.2ml/只。连续观察肿瘤生长情况，待体内成瘤后进行体内瘤块传代2-3次后取肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠，常规消毒后，处死剥离肿瘤，选取透亮肉色部分切成约2mm×2mm×2mm小块，接种于裸鼠右侧腋皮下，待肿瘤长至100mm3以上时，淘汰肿瘤体积过大或过小的裸鼠，按随机区组法将动物分为对照组、阳性药(华蟾素注射液)组，药物低剂量组、高剂量组，每组6只。随后腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药4周。给药期间用0.02mm精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周，按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：

肿瘤体积(V，mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm)×0.5；

相对肿瘤体积(RTV)＝Vt/V0(V0为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积)。

于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率(T/C％)＝TRTV/CRTV×100％(TRTV：治疗组RTV，CRTV：对照组RTV)，肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％(式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。

5.2.5统计方法

计量数据以均值±标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行检验分析。采用One-Way ANOVA(One-Way Analysis of Variance，单因素方差分析)评价整体性差异，方差齐性用LSD t-test分析方法进行组间比较，方差不齐用Dunnett’s T3分析方法进行组间比较，P<0.05为有显著性差异。

5.3实验结果

5.3.1

样品A体外抗胃癌细胞的活性筛选：结果见表6，从表中可以看出，样品A的体外抑瘤IC₅₀为0.49±0.08(μg/ml)。

表6药物体外抗BGC823胃癌细胞的抑制率

5.3.2急性毒性试验 

按表7的分组和给药后，连续7天观察小鼠的状况,给药后短时间内小鼠呼吸加快，呼吸幅度加大，后肢僵直，角弓反张，浑身抖动，剧烈挣扎，身体反应消失，10-15min后死亡，并且雌鼠对药物的耐受性略强于雄鼠，当给药量在10mg/g以下时，小鼠才无任何明显的不适反应。具体实验结果如表7所示。

表7样品A对KM小鼠的急性毒性实验结果(n＝10)

5.3.3药物对小鼠MFC胃癌肿瘤生长的抑制作用研究

按表8所示，动物接种24小时后随机分组给药，每组10只，环磷酰胺(CTX)腹腔注射给药1次，华蟾素注射液腹腔注射给药1次，静脉滴注日用量为10-20ml，取最大值20ml，人体重以70kg，小鼠体重20g计算，小鼠等效剂量为3.4ml/kg，其余各组每天腹腔注射给药1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水，试验全部受试物均现用现配，末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率＝(1-T/C)×100％，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。

结果由表8可见，3次抑瘤试验显示，样品A在3mg/kg、1.5mg/kg剂量下对MFC肿瘤生长均有显著的抑制作用，抑瘤率在25％以上。

表8药物对小鼠MFC肿瘤生长的抑制作用

与对照组比较，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。

5.3.4药物对人胃癌细胞MKN45裸鼠移植模型的治疗作用

试验时，待肿瘤长至100mm³左右，依肿瘤体积大小按随机区组法将动物分为对照组、阳性药(华蟾素)组，A低剂量(0.5mg/kg)组、高剂量(2mg/kg)组每组6只。药物现用现配，腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药6周；于给药期间用0.02mm精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周。按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积(V，mm³)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径²(mm)×0.5；相对肿瘤体积(RTV)＝V_t/V₀(V₀为给药前肿瘤体积，V_t为每次测量时的肿瘤体积)。于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率(T/C％)＝T_RTV/C_RTV×100％(T_RTV：治疗组RTV，C_RTV：对照组RTV)，肿瘤生长抑制率＝(1－T/C)×100％(式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重)。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。

从图7可知，华蟾素注射液和酯蟾毒配基对MKN45肿瘤体积有明显抑制作用(*P<0.05)，给药2周后已显示对肿瘤生长速度起延缓作用，酯蟾毒配基2mg/kg剂量组的抑制效果比华蟾素注射液明显(*P<0.05)；从图8药物对荷瘤裸鼠体重的影响可知，华蟾素注射液和酯蟾毒配基2mg/kg剂量组对裸鼠体重有一定影响，但没有统计学意义，0.5mg/kg剂量几乎无影响；药物对MKN45相对肿瘤体积和增殖率计算的结果显示(图9，图10)，华蟾素注射液和酯蟾毒配基可抑制MKN45肿瘤的增殖，其中酯蟾毒配基2mg/kg给药4周后对肿瘤增值率的影响达63.1％。表9对肿瘤瘤重的结果可知，给药4周后，给药组肿瘤的重量低于对照组，其中酯蟾毒配基2mg/kg剂量组的瘤重显著低于对照组和华蟾素注射液组，对肿瘤生长抑制率高达33.0％(**P<0.01)。

表9药物对MKN45肿瘤的影响

与对照组比较，*P<0.05。

Claims (4)

1.一种蟾皮组合物，其特征在于该蟾皮提取物由以下步骤制备得到：(1)取干蟾皮，洗净，加5~15倍蒸馏水提取，第一次30~60分钟，第二次30~60分钟，合并水提液，滤过，滤液浓缩至含1g生药/ml，或浓缩至相对密度1.0~1.4（80℃）后，分别用40~70%、75~90%的乙醇沉淀1~3次，滤过，将滤液回收乙醇得到；

或以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，超滤，得到蟾皮提取物；

（2）以上述所得提取物为原料，进行凝胶色谱分离、烷基键合硅胶色谱纯化；或溶剂分配结合层析色谱的方法得到的蟾毒配基类成分为主的蟾皮组合物，该组合物具有较好的水溶性。

2.如权利要求1所述的组合物，制备材料涉及：凝胶——包括葡聚糖凝胶（Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、LH20等）和聚甲基丙烯酸基质凝胶（HW40、HW50、HW65等）；烷基键合硅胶——包括C4、C8、C18键合硅胶的亲水及一般型；溶剂分配所用有机系溶剂涉及二氯甲烷、三氯甲烷，分配方法涉及溶剂萃取、超临界萃取。

3.权利要求1所述的组合物、含有所述组合物的制剂的检测方法，其特征在于：采用高效液相-质谱联用检测系统（HPLC-MS）对该组合物成分进行定性检测及成分指认。

4.权利要求1任一项所述的蟾皮提取物/组合物，具有明显的抗肿瘤活性，应用于肿瘤治疗、辅助药物。